本發(fā)明涉及基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種miR-214納米基因復(fù)合物及其制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率逐年上升。超過60％的結(jié)直腸癌患者都會(huì)出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，其中約10％～25％的患者首診時(shí)就已經(jīng)存在肝轉(zhuǎn)移(同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移)，可見肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌主要的死亡原因之一。為了能夠有效治療結(jié)直腸癌、降低肝轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)率，基因治療已經(jīng)成為越來越受到重視的治療方法。

miRNA是小分子非編碼RNA家族的重要成員，許多研究表明，miRNA表達(dá)譜在惡性腫瘤中會(huì)發(fā)生改變。如果能夠通過基因治療的方法，改變腫瘤中miR-214的基因的表達(dá)，這將為結(jié)直腸癌的治療提供新的思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開一種miR-214納米基因復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，以通過基因治療降低結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

第一方面，本發(fā)明公開一種miR-214納米基因復(fù)合物，所述miR-214納米基因復(fù)合物是聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇-DNA納米基因聚合物，其中DNA是嵌有miR-214的DNA。

在本發(fā)明中，miR-214是miRNA-214，嵌有miR-214的DNA可通過商業(yè)購買得到，也可通過本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段制得，例如通過基因修飾技術(shù)將miR-214嵌入到DNA中。嵌有miR-214的DNA材料屬于現(xiàn)有技術(shù)，在本發(fā)明中不作進(jìn)一步描述。

進(jìn)一步地，所述miR-214納米基因復(fù)合物是通過將聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇聚合物與嵌有miR-214的DNA進(jìn)行孵育得到的。

進(jìn)一步地，所述聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇聚合物是以聚乙烯咪唑?yàn)榇蠓肿右l(fā)劑，通過開環(huán)聚合反應(yīng)合成聚天冬氨酸主體化合物，通過化學(xué)連接將膽固醇分子引入所述主體化合物末端，再通過氨解反應(yīng)及化學(xué)鏈接將胱胺和R8多肽引入所述主體化合物主體的側(cè)鏈形成的。

其中，R₈多肽是指具有八個(gè)精氨酸的多肽結(jié)構(gòu)，可以通過商業(yè)購買獲得，例如R₈多肽可購自于上海吉爾生化有限公司。

第二方面，本發(fā)明公開一種上述miR-214納米基因復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

制備聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物溶液；

將所述聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物溶液與嵌有miR-214的DNA溶液進(jìn)行孵育，通過靜電作用力形成所述納米基因復(fù)合物。

進(jìn)一步地，在所述納米基因復(fù)合物的制備方法中，制備聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物溶液的步驟為：將所述聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物溶解在二甲基亞砜中，得到濃度為5mg/mL的母液，再用pH為5.2、濃度為25mM的乙酸鈉緩沖液稀釋，得到濃度為1mg/mL的所述聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物溶液；所述聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物溶液與所述DNA溶液的孵育時(shí)間為30min。

第三方面，本發(fā)明公開一種上述miR-214納米基因復(fù)合物的應(yīng)用，所述miR-214納米基因復(fù)合物用于制備預(yù)防癌癥和/或治療癌癥的藥物。

進(jìn)一步地，所述癌癥是結(jié)直腸癌和/或結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移。

第四方面，本發(fā)明公開一種具有預(yù)防結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和/或治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移功能的藥物，所述藥物包含上述的miR-214納米基因復(fù)合物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下有益效果：

第一，本發(fā)明中的miR-214納米基因復(fù)合物能夠改變結(jié)直腸癌中miR-214基因的表達(dá)，通過上調(diào)miR-214的表達(dá)來抑制細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移，侵襲以及體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和向肝臟的轉(zhuǎn)移，可有效減少結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。

第二，本發(fā)明的聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物具有較高的自組裝能力及穩(wěn)定性，其自組裝形成的納米基因載體具有較強(qiáng)的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力，能夠提高DNA分子的核靶向能力，使得納米基因載體具有高效的體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染效率。

本發(fā)明的聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物分子結(jié)構(gòu)中末端具有膽固醇基團(tuán)沒能夠增強(qiáng)該高分子聚合物的自組裝能力及穩(wěn)定性。該高分子聚合物自組裝形成納米基因載體后，由于納米基因載體的聚乙烯咪唑片段中具有咪唑環(huán)基團(tuán)，其不僅可以提高該納米基因載體的質(zhì)子緩沖作用，還可以實(shí)現(xiàn)其表面電位在腫瘤部位由負(fù)向正的翻轉(zhuǎn)，從而增強(qiáng)了該納米基因復(fù)合物的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力。這主要是由于咪唑環(huán)基團(tuán)的pKa值為6.5，具有在弱酸性環(huán)境中質(zhì)子化的特性。這一特性一方面可以使納米基因載體在進(jìn)入溶酶體后，通過質(zhì)子緩沖作用逃離溶酶體，避免核酸分子在溶酶體中被降解；另一方面，咪唑環(huán)的質(zhì)子化作用可使納米基因載體在弱酸性的腫瘤微環(huán)境中實(shí)現(xiàn)表面電位由負(fù)向正的翻轉(zhuǎn)，從而增強(qiáng)了納米載體與細(xì)胞膜的相互作用及其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

R₈多肽通過二硫鍵連接在聚合物的側(cè)鏈，可使納米基因載體在溶酶體中經(jīng)谷胱甘肽(GSH)還原后快速釋放出DNA分子，而被釋放的DNA分子可繼續(xù)與R8多肽結(jié)合，并通過R8多肽與核定位信號(hào)蛋白的結(jié)合能力，提高DNA分子的核靶向能力，從而最終使該納米基因載體具有高效的體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)染效率。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明制備例中聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇聚合物的氫核磁譜圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例miR-214納米基因復(fù)合物對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例miR-214納米基因復(fù)合物用于治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的效果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

除非特別說明，以下實(shí)施例所述試劑和材料均為市購。

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種miR-214納米基因復(fù)合物及其制備方法、應(yīng)用，能夠降低結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生。以下進(jìn)行結(jié)合附圖進(jìn)行詳細(xì)描述。

制備例

本制備例提供一種高分子聚合物，該高分子聚合物為聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇聚合物，其制備方法包括如下步驟：

合成聚乙烯咪唑(PVIm)：以偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，半胱胺為鏈轉(zhuǎn)移引發(fā)劑，乙烯基咪唑?yàn)閱误w，通過自由基聚合合成理論分子量為5000的聚乙烯咪唑。

合成N-羧基-L-天冬氨酸-芐脂-環(huán)內(nèi)酸酐(BLA-NCA)：采用Fuchs-Farthing法進(jìn)行N-羧基-L-天冬氨酸-芐脂-環(huán)內(nèi)酸酐的合成。具體步驟如下：稱取摩爾比為1:2.5的L-天冬氨酸-芐脂和三光氣溶于無水四氫呋喃以形成反應(yīng)液，在50攝氏度、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌0.5-1h。當(dāng)反應(yīng)液澄清透亮?xí)r，滴加入無水正己烷，直至反應(yīng)液中出現(xiàn)白色沉淀并迅速消失。將反應(yīng)液置于-20攝氏度冰箱靜置過夜，通過重結(jié)晶得到N-羧基-L-天冬氨酸-芐脂-環(huán)內(nèi)酸酐的粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物溶于無水乙酸乙酯，過濾，將濾液滴加入無水正己烷中進(jìn)行重沉淀，重復(fù)2次后真空干燥得到N-羧基-L-天冬氨酸-芐脂-環(huán)內(nèi)酸酐。

合成聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-芐脂(PVIm-PBLA)：以聚乙烯咪唑?yàn)榇蠓肿右l(fā)劑，以N-羧基-L-天冬氨酸-芐脂-環(huán)內(nèi)酸酐為單體，通過開環(huán)聚合反應(yīng)合成聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-芐脂。

合成聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-芐脂-膽固醇(PVIm-PBLA-Cholesteryl)：將合成好的聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-芐脂溶于無水四氫呋喃與無水二甲基亞砜的混合溶劑中，形成第一混合溶液，其中無水四氫呋喃與無水二甲基亞砜的體積比為1:1；將膽固醇甲酰氯溶于無水四氫呋喃中，并加入三乙胺，形成第二混合溶液，且聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-芐脂與所述膽固醇甲酰氯的摩爾比為1:5；將第二混合溶液緩慢滴加至第一混合溶液中，先在冰上反應(yīng)30min，再在室溫下反應(yīng)24h，得到所述聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-芐脂-膽固醇。

合成聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物(PPCRC)：以胱胺為胺解試劑，通過胺解反應(yīng)使合成的聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-芐脂-膽固醇中的芐脂基團(tuán)被胱胺取代；再通過化學(xué)連接將R₈多肽連接在胱胺末端的氨基上，形成聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物。

具體的胺解反應(yīng)包括以下步驟：將胱胺溶于無水二甲基亞砜并加入三乙胺進(jìn)行脫質(zhì)子化反應(yīng)15min，其中胱胺的用量為聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-芐脂-膽固醇中芐脂基團(tuán)摩爾數(shù)的50倍；將脫質(zhì)子化反應(yīng)后的溶液滴加至聚乙烯咪唑-聚L-天冬氨酸-芐脂-膽固醇 的二甲基亞砜溶液中，在40攝氏度、氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24h；將反應(yīng)后的液體滴加至冷的鹽酸水溶液中，再將其置于至5000Da的透析袋中，分別在0.01M的鹽酸水溶液及超純水中進(jìn)行透析，之后冷凍干燥得到聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺)-膽固醇(PPCC)。

具體的化學(xué)連接包括以下步驟：稱取R₈多肽和聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺)-膽固醇(PPCC)溶解至無水二甲基亞砜，并加入EDC和NHS，且EDC和NHS的摩爾數(shù)是R₈多肽的2倍，在室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至3500Da的透析袋中，分別在二甲基亞砜及超純水中進(jìn)行透析，并通過冷凍干燥得到產(chǎn)物聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇(PPCRC)聚合物。

本實(shí)施例制備的聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

其中，x為正整數(shù)，y為正整數(shù)，z為正整數(shù)。

采用氫核磁共振譜儀對(duì)聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇聚合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。具體氫核磁譜圖如圖1所示。

實(shí)施例

本實(shí)施例提供一種miR-214納米基因復(fù)合物，其制備方法包括以下步驟：將制備例中制備的聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R₈多肽)-膽固醇聚合物溶解在二甲基亞砜中，得到濃度為5mg/mL的母液，再用pH為5.2、濃度為25mM的乙酸鈉緩沖液稀釋，得到濃度為1mg/mL的聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇聚合物溶液；

根據(jù)不同的聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇聚合物與DNA的質(zhì)量比，將聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇聚合物溶液與DNA溶液在室溫下孵育30min，通過靜電作用力形成聚乙烯咪唑-(聚天冬氨酸-胱胺-R8多肽)-膽固醇-DNA納米基因復(fù)合物(以下簡(jiǎn)稱PPCRC/DNA納米基因復(fù)合物)。其中，DNA是嵌有miR-214的DNA，可通過商業(yè)購買得到。

將制備好的PPCRC/DNA納米基因復(fù)合物稀釋在1mL的超純水中，并采用納米激光粒度分析儀，在25攝氏度條件下對(duì)PPCRC/DNA納米基因復(fù)合物的粒徑及Zeta電位進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如下表1所示：

表1：PPCRC/DNA納米基因復(fù)合物的粒徑電位表

通過表1可知，PPCRC/DNA納米基因復(fù)合物的平均粒徑分布在160nm-230nm，Zeta電位則隨著聚合物/DNA質(zhì)量比的增加而增加，并主要分布在19mV～34mV。

測(cè)試?yán)籱iR-214納米基因復(fù)合物對(duì)體外細(xì)胞功能學(xué)的影響

1、miR-214的轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)低表達(dá)miR-214的結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪六孔板，并在含10％FBS(v/v)的RPIM-1640培養(yǎng)基中孵育，使其貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至30％-40％，吸去培養(yǎng)基，在無血清培養(yǎng)基條件下用商用轉(zhuǎn)染試劑(脂質(zhì)體lipofactamine 2000)、本發(fā)明制備例自組裝形成的納米基因載體(以下簡(jiǎn)稱本發(fā)明納米基因載體)分別轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA，6小時(shí)后換成正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞。

2、細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞，將300-500個(gè)細(xì)胞加入到六孔板中，培養(yǎng)1-2周待肉眼可見克隆時(shí)中止培養(yǎng)，染色固定，結(jié)果如圖2中的A圖和B圖所示。

通過圖2中的A圖和B圖可知：采用商用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA可抑制HCT116單細(xì)胞克隆形成，而采用本發(fā)明的納米基因載體轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA后對(duì)HCT116單細(xì)胞克隆形成抑制更為明顯，說明本發(fā)明的納米基因載體轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA后對(duì)HCT116的克隆形成的抑制作用要優(yōu)于商用轉(zhuǎn)染試劑。

此外，對(duì)照組DNA采用商用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的克隆形成率要低于本發(fā)明的納米基因載體轉(zhuǎn)染組，說明本發(fā)明的納米基因載體的毒性要低于商用轉(zhuǎn)染試劑載體的毒性。

3、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲和轉(zhuǎn)移能力

轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)12-24小時(shí)，將細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞，加入Transwell板中，12-18小時(shí)后終止培養(yǎng)，用棉簽擦去未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，并染色固定。結(jié)果如圖2中的C圖和D圖所示，其中C圖是鏡下未轉(zhuǎn)染以及不同載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組DNA和嵌有miR-214的DNA后結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的侵襲轉(zhuǎn)移的結(jié)果，D圖為相應(yīng)的每個(gè)視野中侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)。

結(jié)合圖2中的C圖和D圖可知：本發(fā)明的納米基因載體轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA后的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力下降了59％，而商用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA后的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力下降了78％，說明本發(fā)明的納米基因載體轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA后對(duì)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的抑制作用要明顯優(yōu)于商用轉(zhuǎn)染試劑。

4、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力變化

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用胰酶消化后加入6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80％密度時(shí)劃痕，每6小時(shí)用顯微鏡記錄細(xì)胞的變化。結(jié)果如圖2中的E圖和F圖所示。

通過圖2中的E圖和F圖可知：未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞劃痕48小時(shí)后，劃痕已近彌合，而兩種載體轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA后，細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)均被明顯抑制，比較起來采用本發(fā)明納米基因載體轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA對(duì)細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的抑制較商用轉(zhuǎn)染試劑更為明顯。同時(shí)也可觀察到本發(fā)明的納米基因載體轉(zhuǎn)染嵌有miR-214的DNA后細(xì)胞的增殖也被明顯抑制。

通過本測(cè)試?yán)梢缘贸鼋Y(jié)論，當(dāng)本發(fā)明制備例的高分子聚合物自組裝形成納米基因載體后，其負(fù)載嵌有miR-214的DNA形成的納米基因復(fù)合物能顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其轉(zhuǎn)染效率要優(yōu)于商用轉(zhuǎn)染試劑。

測(cè)試?yán)簃iR-214納米基因復(fù)合物對(duì)體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移治療作用

1、建立裸鼠荷結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移模型：將結(jié)腸癌細(xì)胞注射入裸鼠脾臟，10天后癌細(xì)胞將轉(zhuǎn)移至肝臟，以用于肝轉(zhuǎn)移作用的研究。

2、采用負(fù)載有miR-214的納米基因復(fù)合物對(duì)裸鼠荷結(jié)腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移模型進(jìn)行治療。分別于腫瘤接種后10、13、16、19、21、25天尾靜脈給予負(fù)載miR-214的納米基因復(fù)合物或空載的納米基因載體治療，第28天處死裸鼠，觀察脾臟和肝臟轉(zhuǎn)移瘤情況，計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)圖3可以看出，治療組的肝轉(zhuǎn)移數(shù)目明顯少于對(duì)照組，表明負(fù)載有miR-214的納米基因載體能夠顯著抑制結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移，對(duì)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移具有顯著的療效，可用于制備治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的藥物。

以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施例公開的一種miR-214納米基因復(fù)合物及其制備方法、應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。