本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于抗衰老的干細(xì)胞嫩膚液的制備方法。
背景技術(shù)：
衰老是指隨年齡增長(zhǎng)機(jī)體發(fā)生的功能性和器質(zhì)性衰退的漸進(jìn)過程。衰老一方面受機(jī)體的基因程序調(diào)控，另一方面由內(nèi)外“磨損”和“消耗”所引起，二者同時(shí)作用于細(xì)胞和分子水平。皮膚位于體表，是最早顯現(xiàn)機(jī)體衰老的組織，易于觀察，已成為衰老的重要靶器官。
由于皮膚是直接與外界環(huán)境接觸并長(zhǎng)期受到不同外界因素的作用，皮膚與身體的其他器官不同，它不僅隨著自然的老化其生物功能發(fā)生一系列的變化，而且，老年皮膚生物功能的改變與其他器官不同之處在于，其變化主要體現(xiàn)在生物和物理兩方面特性的變化，與青年?duì)顟B(tài)的皮膚相比，老年性皮膚的共振傳導(dǎo)速度加快、ph值升高、彈性下降、皮脂分泌明顯減少、角質(zhì)層含水量減少以及表皮通透屏障功能降低。
間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于中胚層的一種多能干細(xì)胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和免疫調(diào)控等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下可分化為多種組織細(xì)胞，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種用于抗衰老的干細(xì)胞嫩膚液的制備方法，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相具有無腫瘤污染、增殖能力強(qiáng)、采集方便、免疫活性低、無需配型等許多優(yōu)點(diǎn)，所制備的細(xì)胞制劑具有延緩衰老的功效。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種用于抗衰老的干細(xì)胞嫩膚液制備方法，該方法包括如下步驟：
s1、將獲取的臍帶組織清洗后剪碎成1mm3臍帶組織塊；
s2、用ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液和胰蛋白酶對(duì)臍帶組織塊進(jìn)行消化處理，離心后加入dmem培養(yǎng)液重懸；
s3、將間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
s4、將傳代培養(yǎng)后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與二甲基氨基乙醇及黃芪混合后制備細(xì)胞制劑。
進(jìn)一步地，s1中所述臍帶組織的清洗步驟為：將獲取的臍帶組織塊用含有雙抗的磷酸緩沖溶液清洗2-3次后，剪碎成為1-1.5mm3的臍帶組織塊，所述含有雙抗的磷酸緩沖溶液中青霉素濃度為100u/ml，鏈霉素濃度為100u/ml。
進(jìn)一步地，s2中所述消化處理的步驟為：將s1中得到的臍帶組織塊加入ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化60-80min，取出臍帶組織塊用磷酸緩沖溶液清洗2-3次后加入1.25g/l胰蛋白酶溶液中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化20min，取出后加入含有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基終止消化。
進(jìn)一步地，所述ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液為2.4mg/mlⅰ型膠原酶和1mg/ml透明質(zhì)酸酶以體積比1：1混合。
進(jìn)一步地，s2中離心后重懸的步驟為：取消化后的臍帶組織塊用200目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后，收集濾液于1000-1500r/min離心10min后棄去上清液，收集沉淀加入dmem培養(yǎng)液制成間充質(zhì)干細(xì)胞懸液。
進(jìn)一步地，所述dmem培養(yǎng)液中含有體積分?jǐn)?shù)10％的胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素。
進(jìn)一步地，s3中所述原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)的步驟為：將s2中得到的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于無菌培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后第一次換液并去除貼壁細(xì)胞，之后每隔2d換液一次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％后以1：2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
進(jìn)一步地，s4中所述制備細(xì)胞制劑的步驟為：將s3中傳代培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與生理鹽水混合后加入二甲基氨基乙醇和黃芪制備細(xì)胞制劑，其中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為1x105個(gè)/ml，二甲基氨基乙醇濃度為0.2％-0.3％，黃芪濃度0.15％-0.2％。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明通過將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，并將培養(yǎng)的干細(xì)胞與二甲基氨基乙醇和黃芪混合后制備細(xì)胞制劑，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞相具有無腫瘤污染、增殖能力強(qiáng)、采集方便、免疫活性低、無需配型等許多優(yōu)點(diǎn)，并且臍帶作為醫(yī)療廢棄物，對(duì)供者無不利影響，不受倫理問題的限制，所制備的細(xì)胞制劑具有延緩衰老的功效。
當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有優(yōu)點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
本發(fā)明為一種用于抗衰老的干細(xì)胞嫩膚液的制備方法，該方法具體步驟如下：
實(shí)施例1
s1、將獲取的臍帶組織清洗后剪碎成1mm3臍帶組織塊；
具體的，將獲取的臍帶組織塊用含有雙抗的磷酸緩沖溶液清洗2次后，剪碎成為1mm3的臍帶組織塊，所述含有雙抗的磷酸緩沖溶液中青霉素濃度為100u/ml，鏈霉素濃度為100u/ml；
s2、用ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液和胰蛋白酶對(duì)臍帶組織塊進(jìn)行消化處理，離心后加入dmem培養(yǎng)液重懸；
具體的，將s1中得到的臍帶組織塊加入ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化60min，取出臍帶組織塊用磷酸緩沖溶液清洗2次后加入1.25g/l胰蛋白酶溶液中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化20min，取出后加入含有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基終止消化；
其中，所述ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液為2.4mg/mlⅰ型膠原酶和1mg/ml透明質(zhì)酸酶以體積比1：1混合；
取消化后的臍帶組織塊用200目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后，收集濾液于1000r/min離心10min后棄去上清液，收集沉淀加入dmem培養(yǎng)液制成間充質(zhì)干細(xì)胞懸液；
具體的，所述dmem培養(yǎng)液中含有體積分?jǐn)?shù)10％的胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
s3、將間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
具體的，將s2中得到的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于無菌培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后第一次換液并去除貼壁細(xì)胞，之后每隔2d換液一次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％后以1：2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
s4、將傳代培養(yǎng)后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與二甲基氨基乙醇及黃芪混合后制備細(xì)胞制劑；
具體的，將s3中傳代培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與生理鹽水混合后加入二甲基氨基乙醇和黃芪制備細(xì)胞制劑，其中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為1x105個(gè)/ml，二甲基氨基乙醇濃度為0.2％，黃芪濃度0.15％。
實(shí)施例2
s1、將獲取的臍帶組織清洗后剪碎成1mm3臍帶組織塊；
具體的，將獲取的臍帶組織塊用含有雙抗的磷酸緩沖溶液清洗3次后，剪碎成為1.5mm3的臍帶組織塊，所述含有雙抗的磷酸緩沖溶液中青霉素濃度為100u/ml，鏈霉素濃度為100u/ml；
s2、用ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液和胰蛋白酶對(duì)臍帶組織塊進(jìn)行消化處理，離心后加入dmem培養(yǎng)液重懸；
具體的，將s1中得到的臍帶組織塊加入ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化80min，取出臍帶組織塊用磷酸緩沖溶液清洗3次后加入1.25g/l胰蛋白酶溶液中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化20min，取出后加入含有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基終止消化；
其中，所述ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液為2.4mg/mlⅰ型膠原酶和1mg/ml透明質(zhì)酸酶以體積比1：1混合；
取消化后的臍帶組織塊用200目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后，收集濾液于1500r/min離心10min后棄去上清液，收集沉淀加入dmem培養(yǎng)液制成間充質(zhì)干細(xì)胞懸液；
具體的，所述dmem培養(yǎng)液中含有體積分?jǐn)?shù)10％的胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
s3、將間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
具體的，將s2中得到的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于無菌培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后第一次換液并去除貼壁細(xì)胞，之后每隔2d換液一次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％后以1：2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
s4、將傳代培養(yǎng)后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與二甲基氨基乙醇及黃芪混合后制備細(xì)胞制劑；
具體的，將s3中傳代培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與生理鹽水混合后加入二甲基氨基乙醇和黃芪制備細(xì)胞制劑，其中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為1x105個(gè)/ml，二甲基氨基乙醇濃度為0.3％，黃芪濃度0.2％。
實(shí)施例3
s1、將獲取的臍帶組織清洗后剪碎成1mm3臍帶組織塊；
具體的，將獲取的臍帶組織塊用含有雙抗的磷酸緩沖溶液清洗2-3次后，剪碎成為1.25mm3的臍帶組織塊，所述含有雙抗的磷酸緩沖溶液中青霉素濃度為100u/ml，鏈霉素濃度為100u/ml；
s2、用ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液和胰蛋白酶對(duì)臍帶組織塊進(jìn)行消化處理，離心后加入dmem培養(yǎng)液重懸；
具體的，將s1中得到的臍帶組織塊加入ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化70min，取出臍帶組織塊用磷酸緩沖溶液清洗2次后加入1.25g/l胰蛋白酶溶液中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化20min，取出后加入含有10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基終止消化；
其中，所述ⅰ型膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合溶液為2.4mg/mlⅰ型膠原酶和1mg/ml透明質(zhì)酸酶以體積比1：1混合；
取消化后的臍帶組織塊用200目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后，收集濾液于1200r/min離心10min后棄去上清液，收集沉淀加入dmem培養(yǎng)液制成間充質(zhì)干細(xì)胞懸液；
具體的，所述dmem培養(yǎng)液中含有體積分?jǐn)?shù)10％的胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml鏈霉素；
s3、將間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)皿中進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
具體的，將s2中得到的間充質(zhì)干細(xì)胞懸液接種于無菌培養(yǎng)皿中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后第一次換液并去除貼壁細(xì)胞，之后每隔2d換液一次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80％后以1：2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
s4、將傳代培養(yǎng)后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與二甲基氨基乙醇及黃芪混合后制備細(xì)胞制劑；
具體的，將s3中傳代培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與生理鹽水混合后加入二甲基氨基乙醇和黃芪制備細(xì)胞制劑，其中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的濃度為1x105個(gè)/ml，二甲基氨基乙醇濃度為0.25％，黃芪濃度0.18％。
以上內(nèi)容僅僅是對(duì)本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。