本發(fā)明涉及一種治療糖尿病的中藥復(fù)方，具體涉及一種補(bǔ)脾健膵飲及其制備方法。
背景技術(shù)：
：胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能缺陷是2型糖尿病的兩大基本病理特證和發(fā)病基礎(chǔ)。胰島素作用的經(jīng)典靶器官是肝臟、骨骼肌和脂肪。骨骼肌及脂肪的胰島素抵抗稱為胰島素的外周抵抗。肝臟既是利用葡萄糖又是產(chǎn)生葡萄糖的器官，胰島素抵抗時(shí)，肝臟對(duì)葡萄糖的攝取和利用降低，導(dǎo)致血糖的增高。近來一些研究提示胰島β細(xì)胞上同樣存在胰島素受體及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；胰島細(xì)胞不僅是胰島素的分泌細(xì)胞，同時(shí)也是胰島素作用的靶細(xì)胞。胰島素抵抗的發(fā)生及胰島β細(xì)胞分泌功能的障礙可能與β細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻有關(guān)，即胰島細(xì)胞自身的胰島素抵抗。因此，胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能受損在胰島細(xì)胞水平的這種直接關(guān)聯(lián)可能是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，胰島細(xì)胞自身的胰島素抵抗，尤其在2型糖尿病早期，可能是糖尿病防治的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。但目前對(duì)胰島細(xì)胞水平胰島素抵抗的分子生物學(xué)機(jī)制以及中西醫(yī)藥物干預(yù)的深入研究報(bào)道較少。近年來許多研究證實(shí)大鼠β細(xì)胞上存在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子IRc、IRS-1、IRS-2以及各種蛋白激酶PI3K、PKB、PKC、MAPK、MAK，提示β細(xì)胞也存在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。β細(xì)胞上IRc的活化可激活I(lǐng)RS，然后激活兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：(1)通過PI3K激活下游AKT/PKB，調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、β細(xì)胞存活、胰島素基因轉(zhuǎn)錄等過程；(2)通過生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(GYb2)/信號(hào)蛋白GDP-GTP交換因子(SOS)復(fù)合體，激活ras、raf及絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)，通過磷酸化激活下游的轉(zhuǎn)錄因子elk、c-fos等，調(diào)節(jié)胰島素基因轉(zhuǎn)錄及β細(xì)胞增殖。胰十二指腸同源盒因子(PDX)-1對(duì)胰腺的發(fā)育和β細(xì)胞的分化及功能的維護(hù)起著重要作用。小鼠和人類PDX-1或其上游信號(hào)肝細(xì)胞核因子(Hnf3β)基因突變可以導(dǎo)致青少年發(fā)病的成人糖尿病或使患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)增加。研究發(fā)現(xiàn)IRS-2-/-小鼠在發(fā)展為2型糖尿病以前，PDX-1表達(dá)就已經(jīng)減少，轉(zhuǎn)基因表達(dá)PDX-1可恢復(fù)β細(xì)胞的數(shù)量和功能，并推遲2型糖尿病的發(fā)生，說明PDX-1可以發(fā)揮獨(dú)立作用以調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能，維持β細(xì)胞的增殖與存活。PDX-1的作用受轉(zhuǎn)錄因子FOXO-1調(diào)節(jié)，抑制IRS-2-/-小鼠的FOXO-1活性可使PDX-1表達(dá)增加，促進(jìn)β細(xì)胞增殖，避免2型糖尿病的發(fā)生。同外周組織一樣，β細(xì)胞胰島素信號(hào)途徑任何環(huán)節(jié)的障礙均可能導(dǎo)致β細(xì)胞功能的減低，即在β細(xì)胞水平上的胰島素抵抗，它直接導(dǎo)致了胰島細(xì)胞功能的障礙。β細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)胰島素的分泌和合成具有正反饋調(diào)節(jié)作用，選擇性β細(xì)胞IRc基因敲除鼠也表現(xiàn)為GSIS的1相分泌障礙，提示β細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的障礙可能是GSIS的1相分泌障礙的重要原因之一。中醫(yī)藥從整體調(diào)節(jié)入手治療糖尿病，靈活辨證施治，可以改善患者的臨床癥狀，延緩和阻止胰島細(xì)胞損害的病程進(jìn)展，提高患者生存質(zhì)量，而且毒副作用小，在糖尿病的早期防治方面已經(jīng)顯現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢(shì)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為：糖尿病的發(fā)生，正如《靈樞·本臟篇》指出：“脾脆善病消癉”?？梢娝伢w脾臟等臟氣虛弱是本病發(fā)病的基礎(chǔ)?！端貑枴て娌≌摗氛f；“此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴”。近代名醫(yī)張錫純?cè)谄渲鳌夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》中有“至謂其癥起于中焦，是誠(chéng)有理，因中焦膵病，而累及于脾也。蓋膵為脾之副臟，在中醫(yī)書中，名為散膏?！?膵即為胰腺)。而《醫(yī)門法律》中更指出“肥而且貴，醇酒厚味，孰為限量哉，久之食飲釀成內(nèi)熱，津液干涸，……愈消愈渴，且膏粱愈無已。而中消之病遂成矣”?？梢娺^食肥甘，醇酒厚味，則內(nèi)蘊(yùn)濕熱，灼津傷脾，成為2型糖尿病的重要發(fā)病因素。糖尿病的發(fā)生“其本在脾”?，F(xiàn)代研究亦顯示脾虛與2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。糖尿病的發(fā)生與胰腺中的胰島β細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路障礙，胰島β功能減退，分泌胰島素相對(duì)或絕對(duì)減少，而對(duì)脂肪、蛋白質(zhì)、糖類代謝功能低下有關(guān)。與中醫(yī)“脾運(yùn)不健”、“脾脆善病消癉”等極為吻合。消渴既發(fā)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，脾運(yùn)不健，痰濕內(nèi)生；病程較久，病勢(shì)纏綿者繼而氣機(jī)郁滯，血脈失疏，血液黏滯，運(yùn)行不暢，瘀郁化熱；最終久病入絡(luò)，導(dǎo)致絡(luò)熱血瘀、阻于心脈。病久可見氣陰兩虛，終致陰損及陽(yáng)、陰陽(yáng)兩虛。脾虛血瘀貫穿2型糖尿病及并發(fā)癥整個(gè)病程。此即在病因病理上為糖尿病“從脾施治”提供了理論依據(jù)。目前對(duì)糖尿病的中醫(yī)治療有從肝、脾、腎、三消、瘀熱等論治，眾說紛紜，而“從脾施治”多停留在理論階段或簡(jiǎn)單的臨床經(jīng)驗(yàn)，沒有固定的中藥復(fù)方制劑，且沒有現(xiàn)代藥理研究支持。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種依據(jù)“方從法立”的組方原則及經(jīng)發(fā)明人多年臨床驗(yàn)證，反復(fù)篩選研制的治療2型糖尿病的補(bǔ)脾健膵飲及其制備方法，從胰島β細(xì)胞自身保護(hù)的角度去探討中醫(yī)藥在胰島β細(xì)胞功能方面的干預(yù)作用，為中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多效應(yīng)性的特點(diǎn)提供一條新的研究思路，凸顯糖尿病“從脾論治”的指導(dǎo)思想。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種補(bǔ)脾健膵飲，由下列重量配比的原料，經(jīng)加水煎煮再提取藥液制備而成，原料為生曬參5-15g，生黃芪20-40g，蒼術(shù)15-25g，山藥20-40g，天花粉15-30g，葛根15-30g，黃連6-15g，佩蘭15-30g，雞內(nèi)金10-30g，生山楂15-30g，水蛭5-15g，鬼箭羽15-40g，荔枝核15-40g。所述原料重量份配比優(yōu)選為生曬參5-10g，生黃芪30-40g，蒼術(shù)15-20g，山藥20-30g，天花粉15-20g，葛根15-20g，黃連6-10g，佩蘭15-20g，雞內(nèi)金10-20g，生山楂15-20g，水蛭5-10g，鬼箭羽15-30g，荔枝核15-30g。所述原料重量份配比更優(yōu)選為生曬參10g，生黃芪30g，蒼術(shù)20g，山藥30g，天花粉20g，葛根20g，黃連10g，佩蘭20g，雞內(nèi)金15g，生山楂20g，水蛭10g，鬼箭羽30g，荔枝核15g。本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)方案為：一種制備上述補(bǔ)脾健膵飲的方法，具體步驟如下：按上述重量份配比，將原料置入砂鍋中，加原料總重量3.5-4.5倍量的水，浸泡20-40min，大火煮沸，文火煎煮1-2h，取加水量35％-45％的藥液，過濾后保存，藥渣再加原料總重量3.5-4.5倍量的水，無需浸泡，用上法煎取加水量35％-45％藥液，兩次煎取的藥液混勻，即為一種補(bǔ)脾健膵飲。兩次煎得的藥液是總加水量的35-45％。方中所用的生曬參、黃芪、蒼術(shù)、山藥諸藥皆入脾經(jīng)，能大補(bǔ)元?dú)?，扶補(bǔ)脾膵之虛?，F(xiàn)代藥理研究，生曬參所含人參皂甙和人參多糖、多肽等主要成分，能刺激胰島素釋放，具有降低血糖、調(diào)節(jié)肝糖原、減少酮體生成的藥理作用；黃芪所含黃芪總黃酮、黃芪苷、黃芪總多糖等，既能改善微循環(huán)，增加胰島β細(xì)胞供血，改善β細(xì)胞分泌功能，又能減輕胰島素抵抗；蒼術(shù)益氣健脾化濕，可芳化醒脾，主含蒼術(shù)甙有降血糖作用，并能降肌、肝糖原及抑制糖原生成；山藥具有健脾、補(bǔ)肺、固腎、養(yǎng)精等功效，尤其能補(bǔ)脾膵之氣陰虧虛，主含薯蕷皂甙，對(duì)糖尿病有預(yù)防和治療作用，作為本方的“主藥”。方中所用的天花粉能入脾、胃、肺經(jīng)，能清熱生津潤(rùn)燥止渴。現(xiàn)代藥理研究天花粉蛋白有降低血糖作用；葛根能入脾、胃、肺經(jīng)，能鼓舞脾胃陽(yáng)氣，布津止渴，葛根黃酮有降血糖、血壓，擴(kuò)張冠脈等藥效，能輔助人參、黃芪、山藥、蒼術(shù)主藥健補(bǔ)脾膵、生津止渴，故作為“輔藥”應(yīng)用。方中所用的黃連能入胃經(jīng)，其具苦寒藥性，能瀉胃火，能燥濕濁，具有顯著降糖、降低糖化血紅蛋白的功效；佩蘭能入脾胃經(jīng)，芳香化濁，對(duì)濕阻中焦者，用之可醒脾助運(yùn)、生津止渴，歷代醫(yī)家也多用治消渴；雞內(nèi)金能入脾胃經(jīng)，具有健脾胃、消積滯、化瘀血等功效；生山楂能入脾、胃、肝經(jīng)，對(duì)脾虛運(yùn)弱的積滯，尤其“肉積”消化力強(qiáng)，還可化瘀滯，對(duì)糖尿病多進(jìn)酒辣肥甘厚味以致形體超重、肥胖，易于產(chǎn)生胰島素抵抗者，尤宜用之；水蛭是一味強(qiáng)力活血化瘀藥，具有破血逐瘀通經(jīng)脈之功效，其含水蛭素、肝素、抗血栓素等具有抗凝及擴(kuò)張毛細(xì)血管等藥效，故用水蛭活血化瘀通經(jīng)脈及胰管等，可增強(qiáng)胰島分泌胰島素的功能，也能活血化瘀通經(jīng)脈，提供諸多臟腑組織充足的血氧供給，以減緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展；鬼箭羽能入脾、肝經(jīng)，也具有活血化瘀通經(jīng)脈的功效，其所含草酰葉酸鈉能刺激胰島β細(xì)胞，增強(qiáng)其分泌胰島素的功能，而有降低血糖之效?，F(xiàn)方中黃連、佩蘭；雞肉金、生山楂；水蛭、鬼箭羽這三組藥分別具有清熱燥濕、消積導(dǎo)滯、活血化瘀等功效，是針對(duì)糖尿病的發(fā)病和病程中常因熱、濕、積、瘀的病理產(chǎn)物存在而致發(fā)病，或產(chǎn)生胰島素抵抗，或致諸多并發(fā)癥而設(shè)的“佐藥”，它們既可協(xié)助主、輔藥治療糖尿病，又可防治糖尿病的并發(fā)癥，是本方不可或缺的藥物。所用荔枝核，能入肝、腎經(jīng)，具有行氣活血通經(jīng)止痛功效，其核中之種子所含的皂甙、甘氨酸具有顯著的降血糖和肝糖原的藥理效用。本品性溫，行氣活血，通經(jīng)絡(luò)，故用之可調(diào)和方中黃連、天花粉、葛根等寒涼之性，并在諸多補(bǔ)益氣陰藥中略佐調(diào)氣之品，能充分發(fā)揮其生津止渴效用，且本品也有降糖藥效，故作“使藥”用之，甚為合拍，可謂“一藥多得”。本方所用藥物如此配伍，確也符合中醫(yī)的“君、臣、佐、使”的傳統(tǒng)配伍原則，更是凸顯糖尿病“從脾論治”的指導(dǎo)思想。本發(fā)明的有益效果為：1、本發(fā)明通過增加胰島β細(xì)胞供血，改善β細(xì)胞分泌功能，減輕胰島素抵抗，從而達(dá)到降低血糖、降低血脂的功效；具有減輕胰島病變、防治糖尿病并發(fā)癥的作用。2、本發(fā)明具有益氣生津、清熱燥濕、化濁消積、活血化瘀等作用，藥味精簡(jiǎn)，針對(duì)性強(qiáng)。共奏補(bǔ)脾健膵、化痰祛瘀之功，藥精而力專，一藥多效，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，切合病機(jī)，既治療已病，又可未病先防，是防治2型糖尿病的有效方劑。附圖說明圖1為實(shí)施例4各藥物組作用STZ致大鼠糖尿病后大鼠胰腺組織顯微鏡圖；圖2為實(shí)施例4各藥物組對(duì)STZ致大鼠糖尿病在胰腺中IRS-1及PDX-1的表達(dá)的影響柱狀圖；圖3為實(shí)施例4補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病在胰腺中IRS-1表達(dá)的影響顯微鏡圖；圖4為實(shí)施例4補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病在胰腺中PDX1表達(dá)的影響顯微鏡圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1取生曬參10g，生黃芪30g，蒼術(shù)20g，山藥30g，天花粉20g，葛根20g，黃連10g，佩蘭20g，雞內(nèi)金15g，生山楂20g，水蛭10g，鬼箭羽30g，荔枝核15g置入砂鍋中，加水1000ml，浸泡20-40min，大火煮沸，文火煎煮1-2h，取400ml藥液，過濾后保存，藥渣再加水1000ml，無需浸泡，用上法煎取400ml藥液，兩次煎取的藥液混勻，即為一種補(bǔ)脾健膵飲。實(shí)施例2取生曬參5g，生黃芪40g，蒼術(shù)15g，山藥20g，天花粉15g，葛根15g，黃連6g，佩蘭15g，雞內(nèi)金10g，生山楂15g，水蛭5g，鬼箭羽15g，荔枝核30g置入砂鍋中，加水1000ml，浸泡20-40min，大火煮沸，文火煎煮1-2h，取400ml藥液，過濾后保存，藥渣再加水1000ml，無需浸泡，用上法煎取400ml藥液，兩次煎取的藥液混勻，即為一種補(bǔ)脾健膵飲。實(shí)施例3取生曬參15g，生黃芪40g，蒼術(shù)25g，山藥40g，天花粉30g，葛根30g，黃連15g，佩蘭30g，雞內(nèi)金30g，生山楂30g，水蛭15g，鬼箭羽40g，荔枝核40g置入砂鍋中，加水1000ml，浸泡20-40min，大火煮沸，文火煎煮1-2h，取400ml藥液，過濾后保存，藥渣再加水1000ml，無需浸泡，用上法煎取400ml藥液，兩次煎取的藥液混勻，即為一種補(bǔ)脾健膵飲。實(shí)施例4補(bǔ)脾健脺飲對(duì)高脂高糖喂養(yǎng)結(jié)合鏈脲佐菌素所致大鼠2型糖尿病的治療作用。1、實(shí)驗(yàn)用藥物補(bǔ)脾健脺飲，由本發(fā)明實(shí)施例1方法制得；鹽酸吡格列酮：由江蘇德源藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1511035；檸檬酸：QCBio，批號(hào)：5949-29-1；檸檬酸三鈉：QCBio，批號(hào)：6132-04-3；鏈脲佐菌素(STZ)：sigma，批號(hào)：SLBB7526V。2、實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物SD大鼠：由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：scxk(蘇)2014-0001。3、實(shí)驗(yàn)用飼料全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料：由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)：20160215；高糖高脂飼料：(配方：基礎(chǔ)飼料：蛋黃：豬油：膽酸鈉：蔗糖＝63.5：10：8：0.5：18)，由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào)：20160215。4、實(shí)驗(yàn)條件室溫20±2℃，濕度55-65％，光照適度，通風(fēng)潔凈良好。5、實(shí)驗(yàn)用儀器及試劑血糖試紙：拜耳醫(yī)藥保健有限公司血糖儀：BayerHealthCareLLC，型號(hào)：1455FA1004電子分析天平：上海精科天平廠LDZ5-2型離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司AU480全自動(dòng)生化分析儀：貝克曼公司6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用X±S表示，采用t檢驗(yàn)，用spss16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。7、藥物配制STZ溶液:精密稱取STZ溶于0.1mol/L檸檬酸--檸檬酸鈉緩沖液(pH4.5)中，配成2％STZ溶液?，F(xiàn)配現(xiàn)用，避光。0.1mol/L檸檬酸--檸檬酸鈉緩沖液配制：①精密稱取檸檬酸2.1g，溶于100ml的雙蒸水中，配成0.1mol/L的檸檬酸溶液。②精密稱取2.94g檸檬酸三鈉溶于100ml雙蒸水中，配成0.1mol/L的檸檬酸鈉溶液。③精密量取0.1mol/L檸檬酸溶液28ml，精密量取0.1mol/L檸檬酸鈉溶液22ml,混勻，配成0.1mol/L檸檬酸--檸檬酸鈉緩沖液(PH值約為4-4.5)。鹽酸吡格列酮：規(guī)格：30mg/片，臨床人用量為0.5mg/kg，大鼠用量設(shè)為臨床人用量的10倍，大鼠用量為5mg/kg。取鹽酸吡格列酮50片，加入蒸餾水至300ml，配成0.5mg/ml的藥液，按1ml/100g灌胃給藥。補(bǔ)脾健脺飲高劑量41.67g/kg：大鼠用量設(shè)為臨床人用量的10倍，取補(bǔ)脾健脺飲原液加蒸餾水配制成2.08g/ml的藥液，按1ml/100g灌胃給藥，每天2次。補(bǔ)脾健脺飲中劑量20.84g/kg：大鼠用量設(shè)為臨床人用量的5倍，取補(bǔ)脾健脺飲原液加蒸餾水配制成2.08g/ml的藥液,按1ml/100g灌胃給藥，每天1次。補(bǔ)脾健脺飲低劑量10.42g/kg：大鼠用量設(shè)為臨床人用量的2.5倍，取補(bǔ)脾健脺飲原液加蒸餾水配制成1.042g/ml的藥液，按1ml/100g灌胃給藥，每天1次。8、實(shí)驗(yàn)過程健康雄性SD大鼠60只，正常組10只、其余分為5組，模型組、鹽酸吡格列酮組、補(bǔ)脾健脺飲高劑量、補(bǔ)脾健脺飲中劑量、補(bǔ)脾健脺飲低劑量。健康雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，正常組給予基礎(chǔ)飼料，其余50只大鼠給予高脂高糖飼料，飼喂4周后，禁食12h后按40mg/kg的劑量左下腹腔一次性注射2％STZ誘導(dǎo)糖尿病模型，72h后尾靜脈采血，以血糖≧13.1mmol/L作為糖尿病大鼠模型建立標(biāo)準(zhǔn)。棄去血糖<13.1mmol/L，隨機(jī)分為5組，每組10只。分組如下：正常組：等量蒸餾水1ml/100g模型組：等量蒸餾水1ml/100g鹽酸吡格列酮組：5mg/kg，1ml/100g補(bǔ)脾健脺飲高劑量：41.67g/kg1ml/100g補(bǔ)脾健脺飲中劑量：20.84g/kg1ml/100g補(bǔ)脾健脺飲低劑量：10.42g/kg1ml/100g以上各組大鼠灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，給藥容量為10ml/kg，1次/天(除高劑量組2次/天外)，連續(xù)灌胃4周。正常組和模型組給予等量蒸餾水，于第4周末，每組大鼠經(jīng)眼內(nèi)眥取血清測(cè)CHOL、TG、HDL和LDL的含量。實(shí)驗(yàn)期間每周記錄大鼠體重和攝食量；觀察大鼠的一般狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)期間均不限制進(jìn)食及飲水，取胰腺固定于10％中性福爾馬林中、石蠟包埋、制成4um厚切片。9、觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法給藥4周后測(cè)定空腹血糖、葡萄糖負(fù)荷后2小時(shí)血糖評(píng)價(jià)補(bǔ)脾健膵飲對(duì)2型糖尿病模型大鼠糖脂代謝的影響；組織病理學(xué)檢測(cè)：采用HE染色方法于光學(xué)顯微鏡下觀察胰腺的組織形態(tài)學(xué)變化。免疫組織化學(xué)染色：取固定好的石蠟切片，常規(guī)脫蠟、水化，用3％H2O2室溫15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶、微波加復(fù)合蛋白酶修復(fù)暴露抗原，滴加正常兔血清封閉液，室溫10min滴加稀釋的一抗(1：100)4℃過夜，滴加生物素化二抗37℃15min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染脫水透明中性樹脂封片，顯微鏡觀察。檢測(cè)各組大鼠胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子IRS-1以及胰十二指腸同源盒因子PDX-1的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)胰島細(xì)胞中IRS-1mRNA、PDX-1mRNA的表達(dá)。10、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)高脂高糖飼料2周及給予STZ后對(duì)大鼠血糖的影響，結(jié)果見表1表1：實(shí)驗(yàn)前各組大鼠血糖與正常組比較，**p＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示：實(shí)驗(yàn)前，模型組大鼠血糖與正常組比較無明顯差別。給予STZ后血糖明顯增高，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)。(2)飼喂高脂高糖飼料及給予STZ后對(duì)大鼠體重的影響，結(jié)果見表2表2高脂高糖飼料2周及給予STZ后對(duì)大鼠體重的影響與正常組比較，**p＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示：實(shí)驗(yàn)前，正常組大鼠給予普通飼料，模型組大鼠給予高脂高糖飼料后，體重明顯增長(zhǎng)，與正常組大鼠比較未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。給予STZ造模后，模型組大鼠體重明顯下降，與正常組比較具有顯著性差異(p＜0.01)；提示：模型組大鼠給予STZ后，體重明顯下降，呈現(xiàn)糖尿病體癥。(3)補(bǔ)脾健脺飲干預(yù)對(duì)STZ致糖尿病腎病大鼠體重的影響結(jié)果見表3、表4。表3：補(bǔ)脾健脺飲干預(yù)對(duì)STZ致糖尿病腎病大鼠體重的影響(1-4周)與正常組比較，△△p＜0.01，△p＜0.05；與模型組比較＊＊p＜0.01，＊p＜0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示：通過飼喂高脂高糖飼料，4周后注射2％鏈脲佐菌素造成糖尿病模型的大鼠，經(jīng)過補(bǔ)脾健脺飲干預(yù)后，給藥1周-4周，模型組大鼠體重與正常組相比明顯降低，與正常組比較具有顯著性差異(p＜0.01)；補(bǔ)脾健脺飲高劑量組、中劑量組、低劑量組大鼠與模型組相比體重有較為明顯的升高趨勢(shì)，給藥1周-3周與模型組比較無顯著性差異。給藥4周后補(bǔ)脾健脺飲各劑量組與模型組比較具有顯著性差異。提示給與藥物干預(yù)后，補(bǔ)脾健脺飲高劑量、中劑量、低劑量對(duì)于STZ致糖尿病模型大鼠體重下降的癥狀有一定的控制作用。(4)補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致糖尿病大鼠攝食量的影響結(jié)果見表4表4：補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致糖尿病大鼠攝食量的影響與正常組比較，△△p＜0.01，△p＜0.05；與模型組比較＊p＜0.05，**p＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示：通過飼喂高脂高糖飼料，4周后注射2％鏈脲佐菌素造成糖尿病模型的大鼠，模型組大鼠攝食量明顯增高，與正常組大鼠比較具有顯著性差異(p＜0.01)。補(bǔ)脾健脺飲高、中、低劑量組大鼠，經(jīng)過藥物干預(yù)后攝食量比模型組大鼠明顯降低，給藥1周-3周與模型組比較無顯著性差異。給藥4周后補(bǔ)脾健脺飲高劑量組與模型組比較具有顯著性差異。提示：經(jīng)過補(bǔ)脾健脺飲干預(yù)后，對(duì)于改善STZ致糖尿病大鼠的多食癥狀有一定的作用。(5)補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致糖尿病大鼠攝水量的影響結(jié)果見表5表5補(bǔ)脾健脺飲干預(yù)對(duì)STZ致糖尿病大鼠攝水量的影響(1-4周)與正常組比較，△△p＜0.01，△p＜0.05；與模型組比較＊＊p＜0.01，＊p＜0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示：通過飼喂高脂高糖飼料，4周后注射2％鏈脲佐菌素造成糖尿病模型的大鼠，模型組大鼠的飲水量比正常組大鼠明顯增多，與正常組比較具有顯著性差異(p＜0.01)。經(jīng)過藥物干預(yù)后脾健脺飲高、中、低劑量組大鼠，在給藥后第一周，飲水量比模型組有減少，與模型組大鼠比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；補(bǔ)脾健脺飲高劑量和中劑量組大鼠，在給藥后第三—四周，飲水量比模型組有減少，與模型組大鼠比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(p＜0.05)。提示：經(jīng)過補(bǔ)脾健脺飲干預(yù)后，對(duì)于改善STZ致大鼠糖尿病模型的多飲的癥狀具有一定的作用。(6)補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病血糖的影響結(jié)果見表6表6補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病模型血糖的影響與正常組比較，△△p＜0.01；與模型組比較＊＊p＜0.01，＊p＜0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示：通過飼喂高脂高糖飼料，4周后注射2％鏈脲佐菌素造成糖尿病模型的大鼠，經(jīng)過藥物干預(yù)4周后，尾靜脈取血測(cè)血糖，模型組大鼠血糖值與正常組相比仍然持續(xù)升高，與正常組比較具有顯著性差異(p＜0.01)；補(bǔ)脾健脺飲高、中劑量組大鼠血糖與模型組比較明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異(p＜0.05；p＜0.01)。補(bǔ)脾健脺飲低劑量組大鼠血糖與模型組相比有降低的趨勢(shì)，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示：補(bǔ)脾健脺飲對(duì)于STZ致大鼠糖尿病模型具有降低血糖的作用。(7)補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病葡萄糖耐量的影響結(jié)果見表7表7:補(bǔ)脾健脺飲對(duì)糖尿病大鼠葡萄糖耐量的影響*P<0.05，**P<0.01與假手術(shù)組比較；#P<0.05，##P<0.01與模型組比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示：通過飼喂高脂高糖飼料，4周后注射2％鏈脲佐菌素造成糖尿病模型的大鼠，經(jīng)過藥物干預(yù)4周后，尾靜脈取血測(cè)空腹血糖，模型組大鼠血糖值與正常組相比仍然持續(xù)升高，與正常組比較具有顯著性差異(p＜0.01)；補(bǔ)脾健脺飲高、中、低劑量組大鼠血糖與模型組比較明顯降低，其中補(bǔ)脾健脺飲高劑量組空腹血糖、0.5小時(shí)血糖、2小時(shí)血糖與模型組比較具有顯著性差異(p＜0.05；p＜0.01)，補(bǔ)脾健脺飲各劑量組大鼠血糖曲線下面積與模型組相比有降低的趨勢(shì)，與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示：補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病模型具有降低葡萄糖耐量的作用。(8)補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病血脂的影響結(jié)果見表8表8：補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病血脂的影響*P<0.05，**P<0.01與假手術(shù)組比較；#P<0.05，##P<0.01與模型組比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示：通過飼喂高脂高糖飼料，4周后注射2％鏈脲佐菌素造成糖尿病模型的大鼠，經(jīng)過藥物干預(yù)4周后，取血測(cè)定CHOL、TG、HDL和LDL的含量，模型組大鼠CHOL、TG和LDL的含量明顯增高，與正常組比較具有顯著性差異(p＜0.01)；補(bǔ)脾健脺飲高、中、低劑量組大鼠CHOL、TG和LDL的含量明顯降低，與模型組比較具有顯著性差異(p＜0.05；p＜0.01)，提示：補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病具有降低血脂水平的作用。(9)補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病病理組織學(xué)結(jié)果見附圖1圖中顯示，正常組胰腺組織中可見的胰島分散在胰腺腺泡中，胰島內(nèi)細(xì)胞大小一致，排列整齊。模型組可見胰島內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞空泡樣變，部分細(xì)胞核固縮。吡格列酮組組與模型組相比，胰島病變有所減輕，部分細(xì)胞空泡樣變。低劑量組與模型組相比，胰島病變有所減輕，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞核固縮。中劑量組與模型組相比，胰島病變有所減輕，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞核固縮。高劑量組與模型組相比，胰島病變有所減輕，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞核固縮。結(jié)論模型組的胰腺組織主要表現(xiàn)為胰島內(nèi)部分細(xì)胞空泡樣變，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞核固縮。各藥物組均有減輕胰島病變的作用。(10)補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子IRS-1以及胰十二指腸同源盒因子PDX-1的表達(dá)的影響采用Q-PCR方法檢測(cè)補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病各組大鼠對(duì)PDX1及IRS1基因表達(dá)情況，具體方法如下：總RNA提取步驟:剪取約20mg組織于EP管中，加入1ml的Trizol試劑，組織均漿機(jī)將組織打碎，4℃12000rpm離心5min，取上清液加入200ul的氯仿，用力搖勻15S，靜置10分鐘，4℃12000rpm離心15min取上層水相于新的EP管中，加入等體積的異丙醇，輕微的上下巔倒混勻后靜置10min，4℃12000rpm離心20min，棄上清液加入1ml的75％乙醇洗滌，4℃12000rpm離心10min，棄上清液，風(fēng)干10min，加入適量純水溶解RNA，測(cè)定RNA濃度、純度及完整性，分裝備用，-80℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(cDNA)RT反應(yīng)液的配制(總體積20μl)：輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下：37℃15min85℃5sec4℃10min熒光定量PCR反應(yīng)體系的配制(總體積20μl)：熒光定量PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置：擴(kuò)增曲線：95℃5min1cycle；95℃5s，60℃30s40cycles。熔解曲線：95℃15s，60℃30s，95℃15s。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下：PDX1PDX1平均PDX1IRS1IRS1平均IRS1正常111111模型0.2227250.0934280.1580763.9358273.1674753.551651陽(yáng)性藥0.4352750.4942570.4647660.6299610.7596110.694786低劑量0.3660210.4362820.4011520.563830.9460580.754944中劑量0.763130.7882180.7756740.5046420.7202980.61247高劑量1.06931.6207561.3450280.3462770.4931160.419697引物序列：基因名：PDX1，GENBANK：NM_022852.3，片段大小：113bp上游引物：GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAATCCC下游引物：GACTTCCCTGTTCCAGCGTTCC基因名：IRS1，GENBANK：NM_012969.1，片段大小:168bp上游引物：CGCCTGGAGTATTATGAGAACGAG下游引物：ATCCGCCGCAATGGCAAAGTGT基因名：GAPDH，GENBANK：NM_017008.4，片段大小:104bp上游引物：CGGAGCCATGGATTGCACATT下游引物：CTGTCTCACCCCCAGCATAG實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖2所示：在STZ致大鼠糖尿病模型組PDX1表達(dá)量下調(diào)。與正常組比較有差異。給與補(bǔ)脾健脺飲各劑量組干預(yù)后可明顯使STZ致糖尿病大鼠PDX1表達(dá)量上調(diào)。與糖尿病模型組比較差異顯著，且呈劑量依賴性。以補(bǔ)脾健脺飲高劑量組上調(diào)PDX1最為明顯。相反STZ致大鼠糖尿病模型組IRS1表達(dá)量上調(diào)。與正常組比較有極顯著差異。給與補(bǔ)脾健脺飲各劑量組干預(yù)后可明顯使STZ致糖尿病大鼠IRS1表達(dá)量下調(diào)。與糖尿病模型組比較差異顯著，且呈劑量依賴性。以補(bǔ)脾健脺飲高劑量組下調(diào)最為明顯。提示補(bǔ)脾健脺飲治療STZ致大鼠糖尿病是有效抑制IRS1表達(dá)，以及增加PDX1表達(dá)。(11)補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病在胰腺中胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子IRS-1以及胰十二指腸同源盒因子PDX-1的表達(dá)的影響采用免疫組化考察IRS1和PDX1在實(shí)驗(yàn)大鼠的表達(dá)情況，具體方法如下：a.白片37℃烤過夜b.二甲苯1，2，3各10min，乙醇100％，95％，90％，80％，70％，50％各2min，蒸餾水1minc.TBS洗3次，每次5mind.抗原修復(fù)(高火至沸，轉(zhuǎn)為低火20min)，自然冷卻e.TBS洗3次，每次5minf.切片放入3％H2O2溶液，室溫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。g.TBS洗3次，每次5min，甩干后5％BSA封閉20minh.去除BSA液，，每張切片加入50μl稀釋的一抗覆蓋組織，4℃過夜i.TBS洗3次，每次5minj.去除PBS液，每張切片加50μl-100μl相應(yīng)種屬的二抗，4℃孵育50min。k.TBS洗3次，每次5minl.去除TBS液，每張切片加50-100μl新鮮配制DAB溶液，顯微鏡控制顯色，用蒸餾水沖洗m.蘇木素染色25s，用自來水流水沖洗3-5min返藍(lán)n.用蒸餾水洗1min，然后50％，70％，80％，90％，100％浸泡1min，二甲苯1，2浸泡幾分鐘，晾干，滴加中性樹膠，封片注：評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)陰性(-)，0分；(2)弱陽(yáng)性(+)，1分；(3)中度陽(yáng)性(++)，2分；(4)強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，3分。補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病在胰腺中胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子IRS-1表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖3所示：正常組呈現(xiàn)淡棕黃色，IRS-1呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)；模型組呈現(xiàn)棕黃色，IRS-1表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；給與藥物干預(yù)后，吡格列酮組呈現(xiàn)棕黃色，IRS-1呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)；補(bǔ)脾健脺飲各劑量組呈現(xiàn)棕黃色，IRS-1呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，以補(bǔ)脾健脺飲中劑量和高劑量組陽(yáng)性表達(dá)較弱。補(bǔ)脾健脺飲對(duì)STZ致大鼠糖尿病在胰腺中胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子PDX1表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖4所示：正常組呈現(xiàn)棕黃色，PDX1呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；模型組呈現(xiàn)淡黃色，PDX1表達(dá)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)；給與藥物干預(yù)后，吡格列酮組呈現(xiàn)棕黃色，PDX1呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；補(bǔ)脾健脺飲各劑量組呈現(xiàn)棕黃色，PDX1呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，以補(bǔ)脾健脺飲中劑量和高劑量組陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3