本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，特別是涉及一種兩性霉素B立方液晶凝膠、納米粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

兩性霉素B(amphotericin B，AmB)是多烯類廣譜抗真菌抗生素，系鏈霉菌Streptomyces nodosus培養(yǎng)液中的分離產(chǎn)物，這一種的大環(huán)內(nèi)酯衍生物，分子結(jié)構(gòu)中含一個(gè)非極性庚烯和一個(gè)極性多元醇，不溶于水、乙醇，易被光、熱和酸破壞。兩性霉素B的抗菌機(jī)理為：選擇性地與真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成膜孔，增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鉀離子、核苷酸、氨基酸等多種小分子物質(zhì)外漏，破壞正常代謝造成細(xì)胞死亡。

臨床上兩性霉素B主要以注射劑的形式存在。國內(nèi)外醫(yī)藥工作者先后成功研制出兩性霉素B脫氧膽酸鹽注射劑、兩性霉素B脂質(zhì)復(fù)合體、兩性霉素B膠質(zhì)分散體以及兩性霉素B脂質(zhì)體共計(jì)4種注射劑供臨床使用。兩性霉素B脂質(zhì)注射液的出現(xiàn)是兩性霉素B注射液制劑研究中取得的重大突破，對(duì)早期開發(fā)兩性霉素B脫氧膽酸鈉注射液的完善，顯著降低兩性霉素B的輸液反應(yīng)和腎毒性。但是，仍然存在一定的毒副作用以及價(jià)格昂貴等問題，從而限制了兩性霉素B脂質(zhì)注射液在臨床推廣使用。因此，進(jìn)一步篩選高效、廣譜、低毒的新型藥物和合理設(shè)計(jì)藥物劑型解決兩性霉素B毒副作用仍然是一項(xiàng)十分迫切的任務(wù)

兩性霉素B口服給藥具有諸多優(yōu)點(diǎn)：無需在專業(yè)醫(yī)護(hù)人員指導(dǎo)下用藥，患者可自行方便在家中服用；口服給藥避免了長期注射的疼痛性和輸液不良反應(yīng)等問題，改善患者的順應(yīng)性和提高患者的生活質(zhì)量；兩性霉素B口服給藥研究顯示能保持兩性霉素B良好的抗真菌活性同時(shí)能顯著降低藥物的毒副作用。然而，兩性霉素B口服吸收面臨諸多技術(shù)難題，研究進(jìn)展緩慢。兩性霉素B口服吸收差的主要原因如下：兩性霉素B屬于生物藥劑學(xué)分類下的第四類藥物，溶解度小，滲透性差，在口服吸收過程中存在溶解屏障和吸收屏障。此外，兩性霉素B對(duì)光和熱敏感，易降解，口服生物利用度非常低。在早期一系列兩性霉素B口服制劑研究失敗之后，科研工作者得出兩性霉素B不宜制備口服制劑的結(jié)論。

立方液晶納米粒(Cubosomes)是指一定濃度的兩親性脂質(zhì)材料和表面活性劑分散在水溶液中自組裝成含雙連續(xù)水通道和閉合脂質(zhì)雙分子層的蜂窩狀或海綿狀結(jié)構(gòu)的納米粒子。該體系是以立方晶格為結(jié)構(gòu)單元,在立方晶格中有微小細(xì)孔通道(5～10nm)，含有兩條互不相通的雙連續(xù)水道，其中一條水道與外部連續(xù)相通，而另一條水道則是封閉的，雙連續(xù)水通道和閉合脂質(zhì)雙分子層在空間上三維延伸，有序堆疊，具有三維、循環(huán)排列和最小表面積特點(diǎn)的緊密結(jié)構(gòu)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明提供了一種兩性霉素B立方液晶凝膠，用于制備用于口服的兩性霉素B立方液晶納米粒，以克服兩性霉素B在口服吸收過程中存在的溶解屏障和吸收屏障，提高兩性霉素B的穩(wěn)定性，以提高其口服生物利用度。

具體技術(shù)方案如下：

一種兩性霉素B立方液晶凝膠，主要由以下質(zhì)量份的原料制備而成：

所述兩性霉素B與所述膠束材料的質(zhì)量比為1:0.3-2；

所述液晶材料與所述穩(wěn)定劑的質(zhì)量比為9:0.4-1.5；

所述膠束材料選自脫氧膽酸鈉、聚氧乙烯、聚乙二醇-殼聚糖共聚物、聚維酮、仿細(xì)胞膜磷酸膽堿、聚氨基酸、聚乳酸和聚乳酸-羥基乙酸共聚物中的至少一種；所述液晶材料為植烷三醇；所述穩(wěn)定劑為泊洛沙姆407。

在其中一些實(shí)施例中，所述兩性霉素B立方液晶凝膠主要由以下質(zhì)量份的原料制備而成：

在其中一些實(shí)施例中，所述膠束材料選自脫氧膽酸鈉、聚乳酸和聚乳酸-羥基乙酸共聚物中的至少一種。

在其中一些實(shí)施例中，所述兩性霉素B與所述膠束材料的質(zhì)量比為1:0.6-1.3。

在其中一些實(shí)施例中，所述兩性霉素B與所述膠束材料的質(zhì)量比為1:0.7-1.0。

在其中一些實(shí)施例中，所述液晶材料與所述穩(wěn)定劑的質(zhì)量比為9:0.8-1.2。

在其中一些實(shí)施例中，所述兩性霉素B立方液晶凝膠，主要由以下質(zhì)量份的原料制備而成：

所述兩性霉素B與所述脫氧膽酸鈉的質(zhì)量比為1:0.7-0.9；

所述植烷三醇與所述泊洛沙姆407的質(zhì)量比為9:0.8-1.2。

本發(fā)明還提供了上述兩性霉素B立方液晶凝膠的制備方法。

具體技術(shù)方案如下：

一種上述的兩性霉素B立方液晶凝膠的制備方法，包括以下步驟：

兩性霉素B膠束的制備：將兩性霉素B和膠束材料加入到蒸餾水中，滴加濃度為0.08-0.12mol·L^-1的氫氧化鈉溶液，直至兩性霉素B完全溶解，再用pH6-6.4的磷酸緩沖溶液稀釋，再將所得溶液進(jìn)行冷凍干燥，即得所述兩性霉素B膠束；

兩性霉素B立方液晶凝膠的制備：將所述兩性霉素B膠束溶于權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的水中，得兩性霉素B的水溶液；將穩(wěn)定劑和液晶材料加熱熔融，漩渦混勻，再加入所述兩性霉素B的水溶液，漩渦混勻，室溫放置，即得所述兩性霉素B立方液晶凝膠。

在其中一些實(shí)施例中，所述加熱熔融的溫度為40-70℃。

本發(fā)明還提供了上述兩性霉素B立方液晶凝膠的應(yīng)用。

具體技術(shù)方案如下：

上述兩性霉素B立方液晶凝膠在制備兩性霉素B立方液晶納米粒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種兩性霉素B立方液晶納米粒。

具體技術(shù)方案如下：

一種兩性霉素B立方液晶納米粒，由上述的兩性霉素B立方液晶凝膠分散在水中制備而成。

本發(fā)明還提供了一種兩性霉素B立方液晶納米粒的制備方法。

具體技術(shù)方案如下：

一種上述的兩性霉素B立方液晶納米粒的制備方法，包括以下步驟：

將兩性霉素B立方液晶凝膠加入水中，用超聲波細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行超聲分散，得兩性霉素B立方液晶粗分散體系；

將兩性霉素B立方液晶粗分散體系進(jìn)行高壓均質(zhì)，均質(zhì)壓力為300-1800bar，循環(huán)次數(shù)為3-13次，即得所述兩性霉素B立方液晶納米粒。

在其中一些實(shí)施例中，所述均質(zhì)壓力為1100-1300bar，循環(huán)次數(shù)為8-10次。

在其中一些實(shí)施例中，所述超聲分散的條件為分散時(shí)間為10-15min，功率為150-400w，工作時(shí)間為4-6s，間斷時(shí)間為8-12s。

本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶凝膠、立方液晶納米粒及其制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)將兩性霉素B與膠束材料制備成兩性霉素B膠束后再與特定的液晶材料以及穩(wěn)定劑以特定比例配合制備的立方液晶凝膠，可用于制備藥物包封率高、粒徑較小且分布均勻的兩性霉素B立方液晶納米粒。立方液晶納米粒是一種新型納米脂質(zhì)藥物載體，其巨大的膜表面積和獨(dú)特的三維晶格結(jié)構(gòu)對(duì)難溶的藥物具有良好的增溶效果和緩釋性能。因而本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶納米粒能夠克服口服給藥過程中的溶解屏障和滲透屏障，顯著提高兩性霉素B的口服生物利用度。

藥物顆粒大小，藥物與溶出介質(zhì)的接觸面積，以及溶出層與介質(zhì)之間的藥物濃度差是影響難溶性藥物溶出速率的關(guān)鍵參數(shù)。本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶納米粒將兩性霉素B包載進(jìn)液晶結(jié)構(gòu)中后，藥物由晶體顆粒轉(zhuǎn)變成無定型的分子態(tài)，均勻分布于親脂域中，雙連續(xù)水通道與脂質(zhì)雙分子層的巨大交界面積顯著增加了兩性霉素B的溶出表面積。同時(shí)兩性霉素B在親脂域中有較大的溶解度，在溶出層和介質(zhì)之間形成較大的藥物濃度差，可進(jìn)一步增大藥物的溶出度，有效克服藥物溶解屏障。

立方液晶納米粒獨(dú)具的原位生物黏附特性，能吸附在胃腸道表面，增加藥物與胃腸道作用時(shí)間。此外，立方液晶晶格單元中的脂質(zhì)雙分子層具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞有很強(qiáng)的親和性，能夠促進(jìn)胃腸道上皮細(xì)胞對(duì)藥物的內(nèi)吞攝取，跨越小腸胃腸道黏膜屏障，增加藥物吸收。兩性霉素B立方液晶納米粒的生物黏附性和獨(dú)特的類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)能夠有效克服兩性霉素B口服給藥的滲透屏障。

兩性霉素B對(duì)光和熱敏感，易降解，物理化學(xué)穩(wěn)定性差。本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶納米粒的晶格結(jié)構(gòu)對(duì)包載的兩性霉素B具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，將兩性霉素B包載在立方液晶納米粒三維網(wǎng)絡(luò)晶格結(jié)構(gòu)中，可以有效地解決上述穩(wěn)定性問題。將兩性霉素B包載在液晶晶格結(jié)構(gòu)內(nèi)部，可以減少藥物與外界破壞性因素(比如光、熱、酸堿、化學(xué)和生物酶等)的接觸，避免兩性霉素B在溶媒介質(zhì)或生物體內(nèi)被降解而失去生物活性，隔離外界破壞性因素對(duì)兩性霉素B結(jié)構(gòu)的破壞，有效保持兩性霉素B結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及相應(yīng)的藥理活性，增加兩性霉素B的穩(wěn)定性。

另外，本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶納米粒，粒徑較小，且粒徑均一性好，有利于腸上皮細(xì)胞內(nèi)吞并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。

因此，本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶納米粒能夠克服口服給藥過程中的溶解屏障和滲透屏障，保護(hù)兩性霉素B結(jié)構(gòu)和活性，增加兩性霉素B的穩(wěn)定性，有效提高兩性霉素B的口服生物利用度。

本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶納米粒顯著提高了兩性霉素B的口服相對(duì)生物利用度，同時(shí)能使兩性霉素B緩慢釋放，具有24小時(shí)緩釋的效果，為兩性霉素B提供了一種能夠緩慢釋放、吸收良好、生物利用度高的兩性霉素B新型口服制劑，同時(shí)納米粒溶液也有利于口服，能夠提高患者的順應(yīng)性。

本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶納米粒的制備方法工藝簡單，包封率高，使制備得到的兩性霉素B立方液晶納米粒粒徑小且分布均勻，工藝的重復(fù)性良好，生產(chǎn)成本較低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景，同時(shí)有利于推進(jìn)液晶納米的工業(yè)化發(fā)展。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中兩性霉素B立方液晶納米粒制備流程圖；

圖2為實(shí)施例5中兩性霉素B立方液晶納米粒冷凍透射電鏡圖；

圖3為實(shí)施例5中兩性霉素B立方液晶納米粒SAXS譜圖；

圖4為實(shí)施例5中空白立方液晶納米粒SAXS譜圖(A：1200bar，均質(zhì)9次；B：1800bar，均質(zhì)9次)；

圖5為實(shí)施例6中兩性霉素B立方液晶納米粒在模擬腸液中的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n＝6)；

圖6為實(shí)施例8中兩性霉素B立方液晶納米粒的體外釋放曲線(n＝6)；

圖7為實(shí)施例9中兩性霉素B口服后的血藥濃度(n＝6)。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施例以及附圖對(duì)本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶凝膠、立方液晶納米粒及其制備方法做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1:兩性霉素B立方液晶納米粒的制備

參見圖1，本實(shí)施例的兩性霉素B立方液晶納米粒的制備方法包括如下步驟：

兩性霉素B脫氧膽酸鈉膠束的制備：稱取0.5g兩性霉素B原料藥和0.41g脫氧膽酸鈉(質(zhì)量比為1：0.82)，加入到30mL蒸餾水中，再滴加0.1mol·L^-1氫氧化鈉溶液，直至兩性霉素B原料藥完全溶解，再用pH 6.2的0.01mol·L^-1磷酸緩沖溶液稀釋至總體積為100mL。所得溶液放置冷凍干燥機(jī)中避光，-50℃冷阱溫度，真空度為0.1Mbar條件下冷凍48h，即得黃色兩性霉素B脫氧膽酸鈉膠束粉末。避光、密閉、4℃冰箱保存。

兩性霉素B立方液晶凝膠的制備：按表1所示原料處方稱取各原料，將F127和植烷三醇在100mL塑料離心管中，水浴60℃加熱熔融，每30min漩渦混懸器混勻30s，1小時(shí)后加入兩性霉素B脫氧膽酸鈉膠束的60℃的水溶液(用2g水溶解表1所示處方量的兩性霉素B脫氧膽酸鈉膠束，現(xiàn)配現(xiàn)用)，漩渦混懸器混勻1min，室溫放置48h，即得兩性霉素B立方液晶凝膠。

兩性霉素B立方液晶納米粒的制備：室溫下在所得兩性霉素B立方液晶凝膠中加入超純水至總重量為20g，48h后用超聲波細(xì)胞粉碎儀超聲分散5min，所用超聲功率為200W，超聲工作時(shí)間5s，間斷時(shí)間10s，得兩性霉素B立方液晶粗分散體系；再將兩性霉素B立方液晶粗分散體系用高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行高壓均質(zhì)(均質(zhì)壓力為1200bar，均質(zhì)次數(shù)為9次)，即得乳黃色的兩性霉素B立方液晶納米粒。

表1兩性霉素B立方液晶凝膠的原料處方

實(shí)施例2:兩性霉素B立方液晶納米粒的制備

本實(shí)施例的兩性霉素B立方液晶納米粒的制備方法包括如下步驟：

兩性霉素B膠束的制備：按表2所示組成，稱取兩性霉素B原料藥和膠束材料，按實(shí)施例1的方法制備兩性霉素B膠束。

兩性霉素B立方液晶凝膠的制備：按實(shí)施例1中的處方1-9稱取各原料，按實(shí)施例1的方法制備。

兩性霉素B立方液晶納米粒的制備：同實(shí)施例1

表2兩性霉素B膠束的制備原料

對(duì)比例1

本對(duì)比例的兩性霉素B立方液晶納米粒的原料處方基本與實(shí)施例1中的處方1-9相同，區(qū)別在于F127的用量為0.4g。其制備方法同實(shí)施例1。

對(duì)比例2

本對(duì)比例的兩性霉素B立方液晶納米粒的原料處方基本與實(shí)施例1中的處方1-9相同，區(qū)別在于不添加F127。其制備方法同實(shí)施例1。

對(duì)比例3

本對(duì)比例的兩性霉素B立方液晶納米粒的原料處方基本與實(shí)施例1中的處方1-9相同，區(qū)別在于所用穩(wěn)定劑為泊洛薩姆188。其制備方法同實(shí)施例1。

對(duì)比例4

本對(duì)比例的兩性霉素B立方液晶納米粒的原料處方基本與實(shí)施例1中的處方1-9相同，區(qū)別在于所用液晶材料為二油酸甘酸酯(DGMO)。其制備方法同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

對(duì)實(shí)施例1-2以及其對(duì)比例1-4制備的兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑以及包封率進(jìn)行測(cè)定。

粒徑測(cè)定方法如下:立方液晶納米粒用超純水稀釋100倍后，取1mL樣品加入到樣品池，25℃平衡1min、分散粘度為0.8872cPa，Zetasizer Nano ZS90測(cè)定立方液晶納米粒的粒徑參數(shù)，粒徑分析儀軟件計(jì)算立方液晶納米粒的粒子大小和多分散系數(shù)(PDI)。PDI是反映粒子大小分布范圍變化的指標(biāo)，PDI越小表示粒子大小越均勻、集中分布，PDI越大表示粒子大小不均勻、差異顯著。

包封率測(cè)定方法：取1mL兩性霉素B立方液晶納米粒溶液用超純水定溶至5mL，取0.5mL在YM-100的超濾管中，15000r/min離心30min，收集兩性霉素B立方液晶納米粒和下層液體，用甲醇洗滌后，二甲基亞砜定溶至5mL，取0.2mL用甲醇定容至10mL，高效液相色譜測(cè)定兩性霉素B含量。

包封率公式：EE％＝(W_total－W_free)/W_total×100％。

W_total：兩性霉素B投藥量；W_free：游離的兩性霉素B

高效液相色譜條件：色譜柱：Phenomenex luna C18(250x4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈：0.01mol pH6.20磷酸緩沖液＝40:60，柱溫35℃，檢測(cè)波長406nm，流速：1.0mL·min-1，進(jìn)樣量：20μL。

測(cè)定結(jié)果如表3所示：

表3兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑以及包封率

兩性霉素B的溶出速率非常慢，溶出速率成為限制兩性霉素B在磷脂中溶解性的關(guān)鍵。根據(jù)Noyes-Whitney溶出方程：dc/dt＝DA(Cs-C)/Vh

dc/dt：溶出速率，D：藥物的擴(kuò)散系數(shù)，A：溶出界面面積，Cs：藥物飽和溶解度，C：溶液中藥物的濃度，V：溶出介質(zhì)質(zhì)量，h:擴(kuò)散層厚度。

可知，通過以下兩個(gè)方面可增加兩性霉素B的溶出速率：1、降低兩性霉素B粒徑，增加藥物溶出表面積A，增加藥物溶出速率；2、減小載體粒徑，降低藥物擴(kuò)散層厚度h，增加藥物溶出速率。本發(fā)明制備兩性霉素B立方液晶納米粒的方法中，首先由脫氧膽酸鈉增溶兩性霉素B形成膠束，粒徑從原料藥的大顆粒降到納米級(jí)的膠束，增加溶出表面積。其次，通過高壓均質(zhì)減小載體粒徑，降低藥物擴(kuò)散層厚度，加速兩性霉素B的溶解速率。

此外，不同大小的粒子在腸上皮細(xì)胞的攝取不同，導(dǎo)致不同口服吸收效果。粒徑小的粒子能被腸上皮細(xì)胞吞噬轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，而粒徑大的粒子不易被細(xì)胞吞噬。

由表3結(jié)果可知：隨著穩(wěn)定劑的含量增大，兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑有一個(gè)明顯降低的趨勢(shì)，符合本專利降低納米粒粒徑的要求，結(jié)合對(duì)比例1-3可以知道，與未加穩(wěn)定劑的處方相比，穩(wěn)定劑確實(shí)可以顯著減小納米粒粒徑，但是過高的穩(wěn)定劑含量同時(shí)也能破壞液晶的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，反而使得粒徑增大，植烷三醇與F127的最優(yōu)質(zhì)量比為9：1。此外，穩(wěn)定劑的種類也有一定的影響，同樣條件下，穩(wěn)定劑為泊洛薩姆188的處方粒徑更大，包封率更低。投藥量對(duì)兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑和包封率沒有十分明顯的影響，不同投藥量的包封率均達(dá)到了90％左右。另外，固定藥物含量，膠束材料為0.41g(藥物與膠束質(zhì)量比1:0.82)時(shí)有最大的包封率，膠束材料含量較小時(shí)，難以達(dá)到臨界膠束濃度，因此包封率大大降低；過高含量的膠束材料則會(huì)使得制備的膠束相互粘連，甚至?xí)茐哪z束的結(jié)構(gòu)，造成藥物包封率降低。而膠束材料的種類也對(duì)包封效果有影響，但影響比其用量的影響小，PLGA和PLA也均有較好的效果，取得較高的包封率。不同的液晶材料也會(huì)影響納米粒粒徑和包封率，二油酸甘油酯的包封率較低，粒徑較大，效果不如植烷三醇。

實(shí)施例4:均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)對(duì)兩性霉素B立方液晶納米粒粒徑的影響

按實(shí)施例1的處方1-9制備兩性霉素B立方液晶納米粒，制備方法同實(shí)施例1，區(qū)別高壓均質(zhì)的條件不同，具體見表4。

測(cè)定本實(shí)施例制備的兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑，測(cè)定方法同實(shí)施例1，測(cè)定結(jié)果見表4。

Zetasizer Nano ZS90測(cè)定的平均粒徑結(jié)果(表4)顯示兩性霉素B立方液晶納米粒的平均粒徑不是隨著高壓均質(zhì)的壓力增大而減小，而是隨著高壓均質(zhì)壓力增加基本保持不變。但是PDI顯示隨著高壓均質(zhì)的壓力增大而減小，從超聲分散制備立方液晶納米粒的PDI 0.250降低到1200bar高壓均質(zhì)9次條件下制備的兩性霉素B立方液晶納米粒的PDI 0.107。PDI是反映粒子大小分布范圍變化的指標(biāo)，PDI越小表示粒子大小越均勻、集中分布，PDI越大表示粒子大小不均勻、差異顯著。Zetasizer Nano ZS90測(cè)定的Intensity圖顯示高壓均質(zhì)增加到1200bar 9次時(shí)，兩性霉素B立方液晶納米粒未見微米大小粒子，全部粒子大小分布在納米范圍內(nèi)。Zetasizer Nano ZS90測(cè)定的Intensity圖提示兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑隨著高壓均質(zhì)的壓力增大而減小，當(dāng)高壓均質(zhì)達(dá)到一定范圍后，增加高壓均質(zhì)壓力也不能降低兩性霉素B立方液晶納米粒的粒子大小。平均粒徑是粒子大小的一個(gè)平均值，反映粒子部分信息，而PDI、Intensity參數(shù)能全面反映立方液晶納米粒的粒徑大小和分布，因此確定均質(zhì)壓力1200bar均質(zhì)9次為最佳的均質(zhì)條件。

表4制備工藝對(duì)兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑的影響(n＝3)

實(shí)施例5:兩性霉素B立方液晶納米粒液晶結(jié)構(gòu)的表征(Cryo-TEM、SAXS)

采用冷凍透射電鏡(Cryo-TEM)和X射線小角散射觀察實(shí)施例1處方1-9中制備的兩性霉素B立方液晶納米粒的形態(tài)和粒子大小。

冷凍透射電鏡。將4μL實(shí)施例1中處方1-9的兩性霉素B立方液晶納米粒溶液滴加到銅網(wǎng)上，濾紙吸取液體大約3s，直至立方晶納米粒完全吸附固定在銅網(wǎng)上形成薄膜，用磷鎢酸負(fù)染后，迅速放到液態(tài)乙烷中速凍，速凍后的銅網(wǎng)放置在冷阱，-172℃下透射電鏡觀察立方液晶納米形態(tài)，CCD拍攝照片。

結(jié)果見圖2，兩性霉素B立方液晶納米粒冷凍電鏡圖顯示平均粒徑在250nm左右，與Zetasizer Nano ZS90測(cè)得粒子大小基本一致；大量有序的立方液晶納米粒，呈現(xiàn)圓整的形狀，圖中右上角3個(gè)亮點(diǎn)代表立方液晶內(nèi)部空隙通道，顯示納米粒子具有典型的立方液晶結(jié)構(gòu)。

X射線小角散射。將空白的立方液晶納米粒與實(shí)施例1處方1-9中的兩性霉素B立方液晶納米粒溶液填充到直徑1mm的石英毛細(xì)管中，射線照射60min。采用Anton Paar小角X-散射儀，散射光源為Cu，X射線波長為0.1542nm，散射角測(cè)量范圍為q＝0.05～6nm-¹。

結(jié)果見圖3和4，圖3顯示1200bar均質(zhì)9次后的兩性霉素B立方液晶納米粒在出現(xiàn)譜線峰，對(duì)應(yīng)于密勒指數(shù)h k l＝110,111和200，顯示60mg的兩性霉素B制備的兩性霉素B立方液晶納米粒仍具有Pn3m立方液晶結(jié)構(gòu)。兩性霉素B立方液晶納米粒的X-小角衍射在出現(xiàn)衍射峰的峰寬明顯大于圖4中的空白立方液晶納米粒的X-小角衍射在出現(xiàn)衍射峰的峰寬，且兩性霉素B立方液晶納米粒的X-小角衍射在的衍射峰消失，顯示兩性霉素B參與影響立方液晶的形成。

實(shí)施例6:兩性霉素B立方液晶納米粒的腸液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

考察兩性霉素B立方液晶納米粒在腸液中的穩(wěn)定性。

人工模擬腸液的配制:取磷酸二氫鉀6.8g，加水500～800mL使之溶解，用1mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至7.5，另取胰酶10g加水適量使溶解。將兩液混合后，加蒸餾水定溶至1000mL，即得人工腸液，備用。

準(zhǔn)確量取0.5mL實(shí)施例1處方1-9制備的兩性霉素B立方液晶納米粒溶液，用人工模擬腸液定容至50mL，避光放置于恒溫震蕩器中，37℃水浴，振搖速度100r/min。分別在30min、60min、120min、240min取0.5ml樣品，甲醇稀釋定溶至5ml，0.22μm濾膜過濾，高效液相色譜測(cè)定兩性霉素B含量，方法同實(shí)施例3。

兩性霉素B脫氧膽酸鈉模擬腸液實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：取兩性霉素B脫氧膽酸鈉用蒸餾水定溶至2mg·mL^-1。取稀釋液0.5mL，人工模擬腸液定溶至50mL，其余步驟同上。

結(jié)果見圖5。兩性霉素B立方液晶納米粒和兩性霉素B脫氧膽酸鈉中的兩性霉素B含量在模擬人工腸液中溫浴0.5小時(shí)后分別降到81.83±2.51％和78.56±8.96％，兩組數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；但隨著作用時(shí)間增加到1小時(shí)，兩性霉素B立方液晶納米粒與兩性霉素B脫氧膽酸鈉中的兩性霉素B分別是82.40±3.92％和69.30±6.70％(P<0.05)，兩性霉素B立方液晶納米粒中的兩性霉素B的穩(wěn)定性明顯高于對(duì)照組兩性霉素B脫氧膽酸鈉；當(dāng)作用時(shí)間增加到3小時(shí)，兩性霉素B穩(wěn)定性差異更為顯著。以上結(jié)果說明本發(fā)明的兩性霉素B立方液晶納米粒在人工腸液中具有保護(hù)兩性霉素B的作用，避免兩性霉素B的降解。

實(shí)施例7:兩性霉素B立方液晶納米粒的穩(wěn)定性

考察實(shí)施例1處方1-9以及對(duì)比例1、2和3中所制備的兩性霉素B立方液晶納米粒的穩(wěn)定性。在室溫下放置1個(gè)月，分別在15天、30天取樣，測(cè)定兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑和包封率。方法分別同實(shí)施例3。

結(jié)果見表5。兩性霉素B立方液晶納米粒在室溫下放置30天，外觀乳黃均勻溶液，未見聚集、絮凝，顯示良好的物理穩(wěn)定性。結(jié)果顯示第15天兩性霉素B立方晶納米粒的粒徑和包封率基本沒有變化，第30天兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑有輕微增加，同時(shí)包封率有下降趨勢(shì)。未加穩(wěn)定劑的對(duì)比例2制備的兩性霉素B立方液晶納米粒在30天內(nèi)出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的聚集現(xiàn)象，由于納米粒不穩(wěn)定，因此包封率也出現(xiàn)明顯的下降。穩(wěn)定劑含量過高的對(duì)比例1由于立方液晶結(jié)構(gòu)的破壞，也出現(xiàn)聚集和包封率下降的情況。對(duì)比例3中采用了泊洛薩姆188作為穩(wěn)定劑，同樣可觀察到穩(wěn)定性的下降。實(shí)施例1-9和對(duì)比例制備的兩性霉素B立方液晶納米粒的穩(wěn)定性結(jié)果與實(shí)施例3中的粒徑和包封率的結(jié)果一致。

表5兩性霉素B立方液晶納米粒的粒徑分布與包封率(n＝3)

實(shí)施例8:載兩性霉素B立方液晶納米粒的體外釋放行為

采用透析袋法考察載藥立方液晶納米粒的體外釋放。取實(shí)施例1處方1-9中的兩性霉素B立方液晶納米粒1mL和0.25％十二烷基硫酸鈉溶液1mL共同置于透析袋內(nèi)(SMI公司,截留相對(duì)分子質(zhì)量3500Da)，密封后將其放置于15mL釋放介質(zhì)的50mL塑料離心管中。兩性霉素B不溶于水，采用0.25％十二烷基硫酸鈉溶出介質(zhì)滿足兩性霉素B體外釋放實(shí)驗(yàn)的漏槽條件。然后置于37℃、100rpm的恒溫震蕩器中，分別于1、2、4、8、12、24、48、72、96h取樣，塑料離心管中的釋放介質(zhì)全部取出，并同時(shí)加入同體積的新鮮釋放介質(zhì)。取不同時(shí)間點(diǎn)1mL的釋放介質(zhì)用甲醇定溶至5mL，高效液相色譜法測(cè)定釋放介質(zhì)中的兩性霉素B含量，條件同實(shí)施例3，繪制釋放曲線。

兩性霉素B脫氧膽酸鈉體外釋放實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：取兩性霉素B脫氧膽酸鈉用蒸餾水定溶至2mg·mL^-1。取兩性霉素B脫氧膽酸鈉的稀釋液1mL和0.25％十二烷基硫酸鈉溶液1mL共同置于透析袋內(nèi)，其余步驟同上。

結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示兩性霉素B立方液晶納米粒的體外釋放比較慢，1小時(shí)為2.64±0.61％，96h僅為12.37±3.87％，而對(duì)照組兩性霉素B脫氧膽酸鈉在1小時(shí)的體外釋放為12.80±2.16％，96h體外釋放達(dá)61.64±3.60％。兩性霉素B立方液晶納米粒體外釋放顯著低于兩性霉素B脫氧膽酸鈉對(duì)照組，顯示藥物沒有從納米粒中釋放，而是與載體一起穿越胃腸道的屏障，被攝取吸收，避免了其在胃腸道中釋放，遭遇降解或析出晶體沉淀。

實(shí)施例9:兩性霉素B立方液晶納米粒的藥代動(dòng)力學(xué)研究

考察實(shí)施例1處方1-9制備的兩性霉素B立方液晶納米粒的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。取SD雄性大鼠，給藥前禁食12h，自由飲水。24只大鼠隨機(jī)分成4組：第一組以10mg/kg劑量的實(shí)施例1處方1-9的兩性霉素B立方液晶納米粒給予大鼠灌胃作為實(shí)驗(yàn)組1；第二組以20mg/kg劑量的實(shí)施例1處方1-9的兩性霉素B立方液晶納米粒給予大鼠灌胃作為實(shí)驗(yàn)組2；第三組以10mg/kg劑量的對(duì)比例4的兩性霉素B立方液晶納米粒給予大鼠灌胃作為對(duì)照組1；第四組以10mg/kg劑量的兩性霉素B脫氧膽酸鈉給予大鼠灌胃作為對(duì)照組2。給藥后1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h眼眶取血約0.5mL，全血置于涂有肝素的干燥離心管中，8000rpm離心l0min分離血漿，-20℃保存至分析測(cè)定。準(zhǔn)確吸取血漿0.1mL于1.5mL離心管中，加入甲醇100μl，旋渦混合30s，加入乙腈100μl，旋渦混合30s后，4℃冰箱放置5min充分沉淀蛋白,16000pm離心10min,取上清液200μl，25μl進(jìn)樣測(cè)定。HPLC測(cè)定兩性霉素B的含量。

HPLC條件如下：色譜柱：Phenomenex luna C18(250x4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈：0.01mol/L pH6.2磷酸緩沖液40:60，柱溫35℃，檢測(cè)波長406nm，流速：1.0mL·min-1，進(jìn)樣量：25μl。血藥濃度數(shù)據(jù)采用PKSolver V2.1藥代動(dòng)力學(xué)軟件包(中國藥科大學(xué))進(jìn)行處理。根據(jù)血藥濃度，計(jì)算出兩性霉素B口服后的血漿藥物峰濃度C_max、達(dá)峰時(shí)間T_max、消除半衰期t_1/2、藥時(shí)曲線下面積AUC_0-120等動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表6。血藥濃度曲線見圖7。結(jié)果表明，SD大鼠體內(nèi)血藥濃度結(jié)果顯示兩性霉素B立方液晶納米?？诜o藥后與同劑量的兩性霉素B脫氧膽酸鈉對(duì)照組相比，口服生物利用度提高了285％。血藥中兩性霉素B的達(dá)峰時(shí)間由兩性霉素B脫氧膽酸鈉對(duì)照組口服給藥后的6.3h提高到兩性霉素B立方液晶納米?？诜o藥后的26h。兩性霉素B血藥檢測(cè)時(shí)間由兩性霉素B脫氧膽酸鈉對(duì)照組口服給藥后的2天延長到兩性霉素B立方液晶納米粒口服給藥后的5天，顯示兩性霉素B立方液晶納米粒能夠粘附在胃腸壁起到一定緩釋作用。兩性霉素B立方液晶納米?？诜┝坑?0mg/kg增加到20mg/kg，血藥濃度增加不明顯。采用二油酸甘油酯作為液晶材料與統(tǒng)計(jì)量的植烷三醇液晶納米粒相比，其藥時(shí)曲線下面積相對(duì)較低，達(dá)峰時(shí)間也提前。

表6兩性霉素B口服后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n＝6)

C_max：血漿藥物峰濃度，T_max：達(dá)峰時(shí)間，t_1/2：消除半衰期，AUC_0-120：藥時(shí)曲線下面積。

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。