本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及吡啶類衍生物(e)-mstc（(e)-methyl4-styryl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline-2-carboxylate，（e）-4-苯乙烯基-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸甲酯，簡稱（e）-mstc）在制備治療卵巢癌藥物中的用途。

背景技術(shù)：

據(jù)相關(guān)統(tǒng)計研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌是導(dǎo)致全球女性死亡率最高的婦科疾病。2012年，全球有239000例病人被確診為卵巢癌，其中152000例死亡。在我國的婦科惡性腫瘤中，卵巢癌的發(fā)病率位居第三位，但死亡率卻列居首位。導(dǎo)致卵巢癌高死亡率和低存活率的主要原因是其早期臨床癥狀不明顯以及晚期治療失敗率較高。卵巢癌的傳統(tǒng)治療手段為腫瘤細胞減滅術(shù)配合紫杉烷類(如紫杉醇)及鉑類（卡鉑、順鉑等）藥物進行化療。然而，長期使用傳統(tǒng)的化療手段除了會出現(xiàn)耐藥性之外，還會因其缺乏專一性而對正常組織細胞造成極大的傷害，這使得超過70%的患者術(shù)后壽命少于5年，嚴(yán)重威脅患者生命健康。目前，對卵巢癌治療呈現(xiàn)多元化的發(fā)展趨勢，除主要的手術(shù)治療，化療，放療外，還有分子靶向和免疫療法等，但上述治療方法大多不是毒副作用太大就是技術(shù)不成熟，無法有效的應(yīng)用于臨床。因此，開發(fā)出一種能夠?qū)β殉舶┘毎哂懈咝芰Χ鴮θ梭w正常組織細胞無傷害的化合物，從而提高患者存活率是生物醫(yī)藥工作者努力的方向。

本發(fā)明涉及的化合物（e）-mstc為吡啶類衍生物。吡啶類化合物的研究應(yīng)用范圍十分廣泛，主要運用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、飼料、染料等領(lǐng)域，其中在醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用十分重要，如結(jié)核病藥異煙肼，中樞興奮藥尼可剎米等。本發(fā)明所涉及的化合物的制備方法已在2016年報道與tetrahedron雜志上。本發(fā)明所涉及的化合物為白色粉末，熔點為123-124℃，呈弱堿性。本發(fā)明所涉及的化合物的生物學(xué)效應(yīng)，尤其在抗卵巢癌活性方面的活性尚未見到相關(guān)研究報道。因此本發(fā)明就該化合物在制備治療卵巢癌的藥物時，抗卵巢癌方面的活性進行研究。研究表明，該化合物對正常人成纖維細胞無明顯影響，但可以影響卵巢癌細胞的細胞周期及凋亡，使其無法進行正常的生長，并促使卵巢癌細胞的凋亡。因此，本發(fā)明涉及的吡啶類衍生物在抗卵巢癌活性方面具有非常大的作用，并對今后卵巢癌的治療具有很大的價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，為更好的治愈或為資料卵巢癌提供一種可行的選擇，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量創(chuàng)造性的勞動，篩選出一種化合物（e）-mstc，在抗卵巢癌活性方面的具有很好的抑制作用，進而為治療卵巢癌或誘導(dǎo)卵巢癌細胞的凋亡提供了新的療法或手段。

本發(fā)明首先提供一種吡啶類衍生物在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用，其中所述的吡啶類衍生物為(e)-methyl4-styryl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline-2-carboxylate，（e）-4-苯乙烯基-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸甲酯，簡稱（e）-mstc，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

。

其中，上面所述的癌癥為卵巢癌；

其中所述應(yīng)用為抑制癌細胞增殖，具體的，所述應(yīng)用為阻滯細胞周期；

其中所述應(yīng)用還有促進癌細胞凋亡；具體的，所述的應(yīng)用為促進卵巢癌細胞晚期凋亡。

本發(fā)明還提供一種治療癌癥的藥物，所述藥物中的有效成分為吡啶類衍生物為7-methyl-2,4-diphenyl-5,6,7,8-tetrahydroquinoline，7-甲基-2,4-二苯基-5,6,7,8-四氫喹啉,簡稱7-mdt。

其中所述的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體或輔料，所述載體和/或輔料為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉，在此不做贅述。

其中所述藥物為抑制癌細胞增殖的藥物，具體的，所述藥物為阻滯癌細胞周期的藥物；

其中所述藥物還可以為促進癌細胞凋亡的藥物；具體的，所述的藥物為促進卵巢癌細胞晚期凋亡的藥物。

本發(fā)明通過對一系列化合物進行生物學(xué)活性篩選，篩選出候選化合物，并研究其在抗卵巢癌活性方面的相關(guān)作用。本發(fā)明所涉及的篩選細胞為卵巢癌a2780細胞。通過篩選，得到對卵巢癌細胞具有明顯抑制作用的化合物（e）-mstc。

本發(fā)明篩選出的化合物（e）-mstc進一步通過體外mtt抗腫瘤活性實驗和細胞周期檢測進行凋亡活性測定，得到其對卵巢癌細胞和人正常成纖維細胞的增殖、細胞周期凋亡和的影響。結(jié)果表明，該化合物的抗癌活性非常顯著。

本發(fā)明篩選出的化合物（e）-mstc可以有效抑制卵巢癌細胞生長，且對正常人成纖維細胞生長影響較小。

本發(fā)明通過體外mtt抗腫瘤活性實驗證實，該化合物對正常人成纖維細胞的增殖影響不大，但對卵巢癌a2780和skov3細胞的增殖抑制十分明顯，其1c50值作用濃度分別為83.0μm和105.8μm(ibmspssstatistics19)，在同等實驗條件下，正常人成纖維imr90細胞無較大影響（細胞死亡率小于20%）。細胞周期檢測結(jié)果表明，該化合物作用于卵巢癌a2780細胞時，使其g0/g1期過程受阻，細胞在g1期明顯減少,并在g2/m期堆積，從而影響正常的細胞周期，抑制細胞增殖；細胞凋亡結(jié)果顯示，該化合物作用于a2780細胞時，可引起細胞的早期凋亡明顯增多，晚期凋亡也受到一定的影響，從而促進細胞的凋亡。以上研究證明化合物（e）-mstc具有明顯的抑癌活性，在對卵巢癌的研究和治療方面具有非常大的潛在價值，可以進一步對其進行抗卵巢癌藥物的制備。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明中所述的化合物（e）-mstc在抑制卵巢癌細胞增殖的同時，對正常細胞的增殖影響很小或無影響。相比于傳統(tǒng)化療藥物對正常細胞的毒副作用（導(dǎo)致患者存活率低的一個主要因素），（e）-mstc對正常細胞的毒性大大減小。本發(fā)明所述化合物是通過改變卵巢癌細胞的細胞周期及促進細胞早期晚期凋亡來達到抑制卵巢癌細胞的增殖的。相對于紫杉醇主要作用于g2/m期及順鉑主要誘導(dǎo)細胞凋亡而言，本發(fā)明所述化合物可同時作用于細胞周期和細胞凋亡，具有明顯優(yōu)勢。綜上所述，本發(fā)明具有明顯優(yōu)于傳統(tǒng)治療的優(yōu)勢，在未來研究制備抗卵巢癌藥物過程中具有更大的潛力。

附圖說明

圖1：不同化合物對卵巢癌a2780細胞的影響。

圖2：（e）-mstc作用于卵巢癌a2780細胞，三次平行實驗后統(tǒng)計所得的生長抑制曲線。其中，橫坐標(biāo)為化合物作用濃度，單位為μm，縱坐標(biāo)為細胞存活率。

圖3：（e）-mstc作用于卵巢癌skov3細胞，三次平行實驗后統(tǒng)計所得的生長抑制曲線。其中，橫坐標(biāo)為化合物作用濃度，單位為μm，縱坐標(biāo)為細胞存活率。

圖4：（e）-mstc作用于正常人成纖維imr90細胞后，三次平行實驗后統(tǒng)計所得的生長抑制曲線。其中，橫坐標(biāo)為化合物作用濃度，單位為μm，縱坐標(biāo)為細胞存活率。

圖5：分別用0μm、60μm劑量的（e）-mstc處理卵巢癌a2780細胞48h后pi染色的流式細胞檢測圖（圖5上半部分）及三次平行實驗后細胞周期統(tǒng)計圖（圖5下半部分）。

圖6：分別0μm、60μm劑量的（e）-mstc處理卵巢癌a2780細胞96h后經(jīng)pi/annexinv染色的流式細胞檢測圖（圖6上半部分）及三次平行實驗后細胞凋亡統(tǒng)計圖（圖6下半部分）。

具體實施方式

本發(fā)明所涉及的具體化合物為吡啶類衍生化合物（e）-mstc，通過下面的實施例做進一步詳細的說明，下述非限制性實施例不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從化學(xué)試劑公司購買。

本發(fā)明所涉及的具體化合物（e）-mstc的制備方法請參見chunyinzhu*,benweibi,yading,tezhang,qiu-yunchen.iodine-catalyzedaerobicoxidativeformal[4+2]annulationfortheconstructionofpolyfunctionalizedpyridines.tetrahedron.2016,72(5),779.本發(fā)明涉及的化合物均由該論文作者提供。

實施例1.細胞的培養(yǎng)和傳代

卵巢癌a2780、skov3細胞(購于americantypeculturecollection)體外分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清及青霉素（100u/ml）-鏈霉素（100μg/ml）的dmem(購于lifetechnologies公司，美國)培養(yǎng)基和含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的rmpi-1640培養(yǎng)基中；人成纖維imr90細胞(購于americantypeculturecollection)培養(yǎng)于含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的專用dmem培養(yǎng)基中。中。每天定期觀察細胞生長狀態(tài)，待長滿培養(yǎng)皿時及時傳代（一般在貼壁細胞表面積占80%及以上時傳代）。當(dāng)細胞培養(yǎng)和傳代效果良好時進行下一步實驗。

其中所述專用dmem培養(yǎng)基500ml=1ml維生素(100×，購于lifetechnologies，美國)+5ml丙酮酸酯(100nm，購于lifetechnologies，美國)+2ml氨基酸(50×，購于lifetechnologies，美國)+1ml非必需氨基酸(100×，購于lifetechnologies，美國)+491mldmem培養(yǎng)基。

實施例2.mtt檢測不同化合物對細胞存活率的影響

第一步：在底面直徑為6cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)卵巢癌a2780細胞，傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的dmem，取溶液200g離心5min，棄上清，加含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的dmem培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5ml到ep管，用移液槍吸取10μl于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應(yīng)倍數(shù)后計數(shù)。每孔種2×10⁴個細胞，一共11組孔，每組3個復(fù)孔，將細胞種到24孔板中，每孔吹打混勻。放入co2恒溫培養(yǎng)箱（thermoscientific，37℃）靜止培養(yǎng)24h，使其貼壁。

第二步：加入濃度約為100μm的表1所示化合物的dmso溶液。將一定量的化合物溶解于無菌干凈的dmso溶液中，保持每孔所加的化合物溶液的體積保持不變，空白對照加等體積的培養(yǎng)液。放入co2恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)48h。

表1中所示化合物分別為：

a：4-（2-氟苯基）-5,6,7,8-四氫喹啉-2-羧酸甲酯；

b：4-苯基吡啶-2,6-二羧酸2-乙基-6-甲酯；

c：正丁醛；

d：3，5-二甲基-1-甲苯磺?；?1-氫-吡唑；

e：3,5-二甲基-1h-吡唑-1-羧酸叔丁酯；

f：5-氨基-4-氰基-3-苯基-1h-吡唑-1-羧酸芐酯；

g：5-氨基-1-甲基-3-（4-硝基苯基）-1h-吡唑-4-甲腈；

h：5-氨基-1,3-二苯基-1h-吡唑-4-甲腈；

i：1-甲基-5-氧代-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-4-羧酸乙酯；

和（e）-mstc。各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如表1。所選化合物多為吡唑類和吡啶類化合物，這些化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用比較廣泛，并且所篩選化合物多數(shù)未進行生物學(xué)評價。

表1.各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

第三步：將培養(yǎng)48h后的細胞取出，吸去培養(yǎng)基，分別加入100μl含10%mtt的dmem培養(yǎng)基（mtt濃度為5mg/ml），放入co2恒溫培養(yǎng)箱（37℃）反應(yīng)1.5~2h，待細胞染成藍紫色后吸去培養(yǎng)基，加入0.5ml的dmso并輕輕震蕩使結(jié)晶溶解。選擇550nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，并計算細胞存活率：細胞存活率=（實驗組od值/對照組od值）×100%。

不同化合物對卵巢癌a2780細胞作用后的吸光度值見表2所示。

表2.不同化合物對卵巢癌a2780細胞作用后的吸光度值

三次平行實驗后統(tǒng)計結(jié)果如圖1所示：不同的化合物對卵巢癌a2780細胞的增殖影響不同，在作用濃度約為100μm時，其中（e）-mstc化合物對卵巢癌a2780細胞的增殖抑制效果最明顯。

實施例3.mtt檢測細胞存活率

第一步：在底面直徑為6cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)卵巢癌a2780、skov3細胞和正常人成纖維imr90細胞，傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的dmem(或rmpi-1640,imr90專用dmem)培養(yǎng)基吹打混勻，取溶液200g離心5min，棄上清，加含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的dmem(或rmpi-1640，imr90專用dmem)培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5ml到ep管，用槍吸取10μl于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應(yīng)倍數(shù)后計數(shù)。每孔種3500個細胞（imr90細胞每孔2000個），一共7組孔，每組3個復(fù)孔，將細胞種到96孔板中,每孔吹打混勻。并設(shè)立空白對照組，加等體積的細胞培養(yǎng)液。放入co2恒溫培養(yǎng)箱（thermoscientific，37℃）靜止培養(yǎng)24h，使其貼壁。

第二步：加不同濃度的（e）-mstc化合物dmso溶液。將化合物按不同比例稀釋于無菌干凈的dmso溶液中，保持每孔所加的化合物稀釋液的體積保持不變，所加濃度分別為10μm、20μm、50μm、100μm、200μm、300μm，對照加等體積的dmso溶液。放入co2恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)48h。

第三步：將培養(yǎng)48h后的加藥細胞取出，吸去培養(yǎng)基，分別加入10μlmtt（5mg/ml），放入co2恒溫培養(yǎng)箱（37℃）反應(yīng)1.5~2h，待細胞染成藍紫色后吸去培養(yǎng)基，加入0.1ml的dmso并輕輕震蕩使結(jié)晶溶解。選擇550nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，并計算細胞存活率：細胞存活率=（實驗組od值/對照組od值）×100%，用spss軟件計算求出ic50值(細胞數(shù)量減少一半時所需化合物濃度)。

（e）-mstc作用于卵巢癌a2780、skov3細胞及人正常纖維imr90細胞后的mtt結(jié)果吸光度值分別如表3、4、5所示。

表3.（e）-mstc作用于卵巢癌a2780后的mtt結(jié)果吸光度值

表4.（e）-mstc作用于卵巢癌skov3細胞后的mtt結(jié)果吸光度值

表5.（e）-mstc作用于人正常纖維imr90細胞后的mtt結(jié)果吸光度值

三次平行實驗后統(tǒng)計所得的生長抑制曲線實驗結(jié)果顯示：化合物對卵巢癌細胞及正常人成纖維細胞的增殖影響不同。如圖2所示，化合物（e）-mstc對卵巢癌a2780細胞生長的抑制呈濃度依賴關(guān)系，ic50為83.0μm。如圖3所示，化合物（e）-mstc對卵巢癌skov3細胞生長的抑制也同樣呈濃度依賴關(guān)系，ic50為105.8μm。如圖4所示，該化合物對正常人成纖維imr90細胞生長無明顯影響。

實施例4.流式細胞儀檢測細胞周期

第一步：底面直徑6cm培養(yǎng)皿的卵巢癌a2780細胞培養(yǎng)和傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的dmem培養(yǎng)基吹打混勻，200g離心5min，棄上清，加含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的dmem培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5ml到ep管，用槍吸取10μl于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應(yīng)倍數(shù)后計數(shù)。取底面直徑6cm的細胞培養(yǎng)皿，每碟種1.5×10⁵個細胞,每組3碟。放入co2恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)24h，使其貼壁。

第二步：分別取0μm、60μm化合物（e）-mstc劑量加入實驗組細胞中，對照組加入等體積的dmso和培養(yǎng)基。放入co2恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)48h。

第三步：將培養(yǎng)48h后的細胞取出，吸去培養(yǎng)基，分別取0.5ml的pbs清洗，吸去pbs，加0.5ml胰酶消化，加0.5ml相應(yīng)培養(yǎng)基終止消化，延孔壁吹洗，轉(zhuǎn)至ep管，重復(fù)用0.5ml培養(yǎng)基洗一次，減少細胞殘余。轉(zhuǎn)至4℃冰盒，并在4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。每管加300μl4℃預(yù)冷的pbs，混勻，4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。每管滴加0.5ml-20℃預(yù)冷的70%的乙醇，混勻，放入4℃冰箱保存至少24h。

第四步：從4℃取出待處理的細胞，4℃冷凍離心機中500g離心5min，棄上清，刮勻。每管加300μl4℃預(yù)冷的pbs,混勻，4℃冷凍離心機中500g離心5min。棄上清，刮勻，每管加500μlpi染色液（485μlpbs+10μl1mg/ml的pi+5μl1mg/ml的rnase），吹打4-5次混勻，轉(zhuǎn)至周期檢測管，避光中37℃水浴鍋中孵育1h。流式細胞儀檢測細胞周期。

實驗結(jié)果顯示：化合物（e）-mstc對卵巢癌a2780細胞周期有一定的阻滯作用，如圖5所示，在60μm濃度下，a2780細胞的g0/g1期略微受到阻滯，使其停留在g2/m期，證明該化合物對卵巢癌a2780細胞具有一定的周期阻滯能力，從而抑制細胞的增殖。

實施例5.流式細胞檢測細胞凋亡檢測

第一步：底面直徑6cm培養(yǎng)皿的卵巢癌a2780細胞培養(yǎng)和傳代良好后，棄原培養(yǎng)液，用2mlpbs清洗，0.5ml胰酶消化，加2ml含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的dmem培養(yǎng)基吹打混勻，200g離心5min，棄上清，加含10%胎牛血清及青霉素-鏈霉素的dmem培養(yǎng)基吹打混勻，取0.5ml到ep管，用槍吸取10μl于細胞計數(shù)板上計數(shù)或稀釋相應(yīng)倍數(shù)后計數(shù)。取底面直徑6cm的細胞培養(yǎng)皿，每碟種1.5×10⁵個細胞,每組3碟。放入co2恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)24h，使其貼壁。

第二步：分別取0μm、60μm劑量的化合物（e）-mstc加入實驗組細胞中。放入co2恒溫培養(yǎng)箱（37℃）靜止培養(yǎng)96h。

第三步：將a2780細胞從6cm碟消化離心，收集所有的上清液。轉(zhuǎn)至4℃冰盒，并在4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。將上清離心后的細胞和相應(yīng)消化下來的細胞全部合并，用0.5ml預(yù)冷pbs洗滌，4℃冷凍離心機中300g離心5min，吸去上清，刮勻。每管加500ul4℃預(yù)冷的pbs，混勻，重復(fù)上述操作。加入100μl1×bindingbuffer重懸細胞，加入5μlannexinv-fitc和5μlpistainingsolution，輕輕搖勻(細胞凋亡試劑盒，上海翊圣生物科技有限公司)。避光，室溫反應(yīng)10min，加入400μl1×bindingbuffer，混勻，1h內(nèi)送流式細胞儀檢測。

實驗結(jié)果顯示，化合物（e）-mstc對卵巢癌a2780細胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用，如圖6所示，在60μm的化合物濃度下，誘導(dǎo)卵巢癌a2780細胞的早期凋亡及晚期凋亡，從而可以得出結(jié)論，該化合物是通過誘導(dǎo)細胞的晚期凋亡來抑制癌細胞生長的。