本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及樟柳堿在制備預(yù)防或治療腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腎纖維化是各種慢性腎臟疾病(ckd)發(fā)展至終末期腎衰竭的最終共同通路和病理基礎(chǔ)，是嚴(yán)重危害人類生命健康的重要疾病之一。腎間質(zhì)纖維化的特征是大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)成分進(jìn)行性地沉積于腎小管及小管周圍毛細(xì)血管間隙內(nèi)，破壞了正常的腎小管和腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致腎臟完全喪失臟器功能。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、多種細(xì)胞因子與細(xì)胞間相互作用等過(guò)程，阻止甚至于逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展對(duì)于ckd的治療具有十分重要意義。
目前臨床上尚缺少能有效治療腎間質(zhì)纖維化的藥物，現(xiàn)有的治療措施主要在于控制原發(fā)疾病及其惡化因素，如：降血糖、降血壓、控制感染、調(diào)脂以及改善腎臟局部的微循環(huán)等。但這些方式僅能非常有限地減緩疾病的發(fā)展，當(dāng)進(jìn)展至腎纖維化不可逆階段或出現(xiàn)嚴(yán)重的腎功能損傷時(shí)，患者只能通過(guò)血液透析、腹膜透析、腎移植來(lái)維持生命，這給患者及其家庭和社會(huì)都帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。臨床上現(xiàn)有的抗纖維化藥物存在毒性大、安全性低等問(wèn)題，在實(shí)際應(yīng)用中存在很大的局限，因此，從天然產(chǎn)物中尋找高效低毒的的潛在抗纖維化藥物具有重要意義。
樟柳堿(anisodine)，化學(xué)式為c17h21no5，相對(duì)分子量為319.35，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
是由我國(guó)科學(xué)家首次從唐古特山莨菪根中分離得到的一種新型抗膽堿能藥物，臨床上主要使用的是它的氫溴酸鹽。氫溴酸樟柳堿是白色結(jié)晶，易溶于水，不溶于氯仿、乙醚，無(wú)臭，味苦，具有解除平滑肌痙攣、抑制唾液分泌、散瞳等抗膽堿能作用。目前在臨床中樟柳堿可用于治療血管性頭痛、視網(wǎng)膜血管痙攣、中心性視網(wǎng)膜病變、缺血性視神經(jīng)病變、急性癱瘓、震顫麻痹、支氣管哮喘、暈動(dòng)病、有機(jī)磷中毒等。
目前已經(jīng)有關(guān)于氫溴酸樟柳堿的成品藥物或復(fù)方制劑的應(yīng)用，例如中國(guó)專利97120175公開了一種復(fù)方樟柳堿注射液，通過(guò)樟柳堿與普魯卡因、維生素b12、透明質(zhì)酸等聯(lián)用，克服了單用對(duì)眼缺血療效不好、不良反應(yīng)多的弊端，對(duì)眼缺血的有效率達(dá)到了90％以上。中國(guó)專利200410098938中公開了一種復(fù)方樟柳堿口服液，使用起來(lái)較注射液更為方便，減輕了患者的痛苦，隨時(shí)隨地可自行服用，大大提高了患者的依從性。中國(guó)專利200510132127中公開了一種樟柳堿和普魯卡因的復(fù)方制劑，能夠有效治療間質(zhì)性肺炎和肺纖維化、腦梗塞、缺血性心腦血管疾病、缺血性眼病等疾病。中國(guó)專利200810006924中公開了氫溴酸樟柳堿用于制備治療弱視的藥物中的用途，所制得的藥物可以是注射劑、滴眼劑，也可以是片劑、膠囊劑、口服液、滴丸等口服制劑。中國(guó)專利201210274372中公開了氫溴酸樟柳堿用于治療抑郁癥藥物中的用途，其對(duì)于興奮缺乏、快感消失、興奮程度降低、體重增加量降低等抑郁癥狀具有很好的治療效果。但現(xiàn)有技術(shù)中，沒(méi)有記載樟柳堿可以用于治療腎纖維化的文獻(xiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供樟柳堿的新用途，具體的是樟柳堿在制備預(yù)防或治療腎纖維化的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明活性成分樟柳堿優(yōu)選采用氫溴酸樟柳堿。其功效體現(xiàn)在氫溴酸樟柳堿可以降低血清中scr、bun的水平，抑制腎組織中α-sma，tgf-β蛋白的表達(dá)，證實(shí)了氫溴酸樟柳堿具有抗腎纖維化的作用。
應(yīng)用時(shí)預(yù)防或治療腎纖維化的藥物中可以含有0.1-99.9wt％的樟柳堿作為活性成分，也可以與其他藥物進(jìn)行復(fù)配制成復(fù)方藥物；按照藥學(xué)常規(guī)方法，加入藥學(xué)上可接受的載體制備成適宜的藥物劑型，具體的可以制成口服制劑或者注射劑，通過(guò)口服、肌肉注射、靜脈輸入或腹腔注射等方式給藥。例如軟膠囊劑、片劑、凍干粉劑或注射劑。
通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，氫溴酸樟柳堿具有預(yù)防或治療腎纖維化的作用，可通過(guò)抑制腎組織中肌成纖維細(xì)胞的增殖活化從而改善腎纖維化，為臨床預(yù)防、治療腎纖維化提供了一種新的選擇。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，說(shuō)明但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例：氫溴酸樟柳堿對(duì)腎纖維化模型大鼠的治療作用
一、實(shí)驗(yàn)方案
1、材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周齡清潔級(jí)健康雄性sd大鼠40只，購(gòu)買自北京華阜康科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心恒溫、恒濕與空氣全循環(huán)過(guò)濾環(huán)境中。
1.2材料：氫溴酸樟柳堿(99％純)，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體、兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β抗體購(gòu)自杭州華安生物。
1.3方法：
1.31動(dòng)物模型的建立：大鼠以2％戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后取右側(cè)臥位固定，手術(shù)區(qū)域備皮，消毒。于左側(cè)肋腰點(diǎn)下方，脊柱旁左側(cè)作一縱行切口，分離輸尿管，5-0號(hào)絲線結(jié)扎輸尿管兩端，在兩結(jié)扎點(diǎn)中間剪斷輸尿管，逐層縫合制作uuo模型。假手術(shù)組僅開腹后左側(cè)游離輸尿管，不接扎和剪斷。
1.32實(shí)驗(yàn)分組：將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(10只)、uuo模型組(10只)、uuo模型+氫溴酸樟柳堿2.5mg/kg治療組(樟柳堿低劑量組，10只)、uuo模型+氫溴酸樟柳堿5mg/kg治療組(樟柳堿高劑量組，10只)。于術(shù)后當(dāng)日開始給藥，每天給藥一次。
1.33檢測(cè)項(xiàng)目：于術(shù)后第14天收集血標(biāo)本，分離血清進(jìn)行血肌酐(scr)和尿素氮(bun)檢測(cè)，處死動(dòng)物，取手術(shù)側(cè)腎臟，1/3保存于4％多聚甲醛固定液中以備后續(xù)he、masson及免疫組織化學(xué)染色使用，其余2/3平均分為10塊，在液氮中迅速冷凍后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱中保存，用于后續(xù)進(jìn)行α-sma，tgf-β的免疫組化及westernblot檢測(cè)。
1.4數(shù)據(jù)處理：計(jì)量資料以
2、結(jié)果
2.1大鼠scr和bun的變化情況，見表1。
表1各組大鼠bun、scr水平(mmol/l、umol/l
注：與假手術(shù)組比較：#p＜0.05；與模型組比較*p＜0.05
表1結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，其余各組大鼠血清中scr、bun水平均明顯升高(p＜0.05)；與模型組相比較，經(jīng)氫溴酸樟柳堿治療后血清中scr、bun水平均出現(xiàn)不同程度降低，以樟柳堿高劑量組效果更為明顯(p＜0.05)。
2.2大鼠腎組織病理學(xué)觀察
①肉眼觀察：假手術(shù)組腎臟呈暗紅色，表面光滑，兩側(cè)腎臟對(duì)比無(wú)明顯差異，其余各組腎臟體積明顯增大，顏色蒼白，皮質(zhì)變薄。②光鏡檢測(cè)：假手術(shù)腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)內(nèi)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，masson染色僅腎小球和腎小管基底膜處可見少量的膠原藍(lán)染區(qū)。模型組腎小管上皮細(xì)胞萎縮，空泡樣變，管腔擴(kuò)張明顯，部分管腔內(nèi)可見蛋白管型，部分腎小管壞死，壞死區(qū)域可見纖維組織增生，腎間質(zhì)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，masson染色可見大面積的膠原藍(lán)染區(qū)，腎間質(zhì)內(nèi)纖維組織增生較假手術(shù)組明顯增多。兩治療組病變較模型組有不同程度的改善，尤其以樟柳堿高劑量組更為明顯，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。
表2各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)、腎間質(zhì)膠原相對(duì)面積評(píng)分(
注：與假手術(shù)組比較：#p＜0.05、；與模型組比較*p＜0.05
2.3α-sma，tgf-β蛋白的表達(dá)
假手術(shù)組大鼠腎間質(zhì)內(nèi)幾乎不表達(dá)α-sma，其余各組在腎間質(zhì)及部分腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)可見不同程度的陽(yáng)性表達(dá)；與模型組相比較，樟柳堿高、低劑量組表達(dá)量明顯降低(p＜0.05)；樟柳堿高劑量組與低劑量組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，見表3。
在假手術(shù)組中tgf-β僅少量表達(dá)在腎小管、腎間質(zhì)細(xì)胞的胞漿內(nèi)；模型組腎組織中tgf-β的表達(dá)量明顯增加(p＜0.05)，主要以腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)區(qū)域?yàn)橹?。?jīng)樟柳堿治療后tgf-β的表達(dá)量較模型組明顯降低(p＜0.05)，樟柳堿高劑量與低劑量組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，見表3。
表3各組大鼠腎組織α-sma，tgf-β蛋白的表達(dá)
注：與假手術(shù)組比較：#p＜0.05、；與模型組比較*p＜0.05
3結(jié)論
與模型組相比，經(jīng)氫溴酸樟柳堿治療后大鼠的scr、bun水平明顯將降低(p＜0.05)，腎間質(zhì)纖維化程度明顯減輕(p＜0.05)，腎組織中α-sma、tgf-β的表達(dá)量明顯降低，提示氫溴酸樟柳堿對(duì)uuo所致大鼠腎間質(zhì)纖維化具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制腎內(nèi)tgf-β的表達(dá)，減少腎間質(zhì)中固有成纖維細(xì)胞的增殖活化，從而改善腎間質(zhì)纖維化。