本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種靶向肺癌的偶聯(lián)藥物cdGIGPQc-ScFvαvβ3。

背景技術(shù)：

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見、致死人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率增長速度亦高居各惡性腫瘤之首。目前肺癌的主要治療模式還是多學(xué)科的綜合治療，但總體效果不盡人意。分子靶向治療已成為當(dāng)今肺癌臨床治療學(xué)的重要研究課題之一。

分子靶向治療，是指在細(xì)胞分子水平上，針對已經(jīng)明確的致癌位點(該位點可以是腫瘤細(xì)胞的一個蛋白分子，也可以是一個基因片段)，來設(shè)計相應(yīng)的治療藥物，藥物進入體內(nèi)會特異地選擇致癌位點相結(jié)合發(fā)生作用，使腫瘤細(xì)胞特異性死亡，而不會波及腫瘤周圍的正常組織細(xì)胞。

研究證實整合素αvβ3在肺癌等病理性血管生成的過程中發(fā)揮了重要的作用，而新生血管的形成是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。因此以整合素αvβ3為靶點，抑制腫瘤血管生成，使腫瘤細(xì)胞無法得到所需的血液、氧和其它養(yǎng)分，從而促進了細(xì)胞凋亡。針對αvβ3的單克隆抗體新藥已進入臨床試驗階段，然而由于單克隆抗體分子較大，難以進入實體瘤內(nèi)部；體內(nèi)清除慢，易產(chǎn)生抗-抗體，副作用較大等缺點，因而研發(fā)更易透過毛細(xì)血管，能進入實體腫瘤內(nèi)部的小分子腫瘤抑制劑具有重大意義。

本發(fā)明是利用單鏈抗體(scFvαvβ3)替代上述單克隆抗體，并將小分子肽cdGIGPQc和整合素αvβ3單鏈抗體ScFvαvβ3結(jié)合起來，得到靶向肺癌的偶聯(lián)藥物cdGIGPQc-ScFvαvβ3來解決上述問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種靶向肺癌的偶聯(lián)藥物cdGIGPQc-ScFvαvβ3。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種靶向肺癌的偶聯(lián)藥物，是小分子肽cdGIGPQc和整合素αvβ3的單鏈抗體ScFvαvβ3通過偶聯(lián)得到，記名為cdGIGPQc-ScFvαvβ3。

優(yōu)選的，小分子肽cdGIGPQc中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I代表L型異亮氨酸，P代表L型脯氨酸，Q代表L型谷氨酰胺。

優(yōu)選的，整合素αvβ3單鏈抗體ScFvαvβ3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

優(yōu)選的，編碼整合素αvβ3單鏈抗體ScFvαvβ3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

優(yōu)選的，所述肺癌為非小細(xì)胞肺癌。

偶聯(lián)藥物cdGIGPQc-ScFvαvβ3在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述癌癥為肺癌。

優(yōu)選的，所述肺癌為非小細(xì)胞肺癌。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明利用整合素αvβ3的單鏈抗體(scFvαvβ3)替代單克隆抗體。本發(fā)明中整合素αvβ3的單鏈抗體是把單克隆抗體重鏈的可變區(qū)(VH)和輕鏈的可變區(qū)(VL)基因在DNA水平克隆出來，再用一段連接肽(GGGGS)3的基因把VH和VL的羧基端和氨基端以VH-linker-VL的形式連接起來，表達后即得到單鏈抗體ScFvαvβ3片段，記名為ScFvαvβ3。此外，利用小分子肽cdGIGPQc與整合素αvβ3單鏈抗體ScFvαvβ3進行偶聯(lián)，得到靶向肺癌的偶聯(lián)藥物cdGIGPQc-ScFvαvβ3。

本發(fā)明所獲得的偶聯(lián)藥物cdGIGPQc-ScFvαvβ3是小分子，容易透過毛細(xì)血管，能迅速在肺癌靶細(xì)胞集聚；cdGIGPQc和ScFvαvβ3無免疫原性，不會產(chǎn)生抗-抗體，不存在過敏的危險，安全性好；體內(nèi)清除快，對機體無毒副作用；cdGIGPQc-ScFvαvβ3對非小細(xì)胞肺癌的靶向性強，小分子肽能與體內(nèi)任何部位的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞發(fā)生特異性的結(jié)合，療效不受腫瘤的生長部位的限制，更適合于遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的晚期肺癌患者，而對正常細(xì)胞無影響。

本發(fā)明所獲得的偶聯(lián)藥物cdGIGPQc-ScFvαvβ3對肺癌移植瘤的抑制率約為ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3的1.40倍和1.56倍，也優(yōu)于αvβ3單克隆抗體(mAb)。

附圖說明

圖1為小分子肽cdGIGPQc的合成及分析；

圖2為小分子肽cNAQAEQc的合成及分析；

圖3為ScFvαvβ3蛋白的表達與純化；

圖4為體外分析cdGIGPQc-ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3對肺癌細(xì)胞的結(jié)合能力；

圖5為cdGIGPQc-ScFvαvβ3體外的抗原結(jié)合能力及腫瘤生長抑制作用；

圖6為cdGIGPQc-ScFvαvβ3的體內(nèi)抗腫瘤療效；

圖7為H&E染色和免疫組化結(jié)果；

圖8為A549動物移植瘤模型經(jīng)治療后重要臟器的H&E染色；

圖9為L78動物移植瘤模型經(jīng)治療后重要臟器的H&E染色。

具體實施方式

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

(1)、cdGIGPQc-ScFvαvβ3的設(shè)計和合成

發(fā)明人利用PCR方法及分子生物學(xué)基因克隆技術(shù)，構(gòu)建cdGIGPQc-ScFvαvβ3，初步闡明其對肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響。

(2)、小分子肽-ScFvαvβ3的靶向性分析

將熒光素Alexa標(biāo)記小分子肽(前期工作已完成)，構(gòu)建Alexa-cdGIGPQc-ScFvαvβ3。建立人裸鼠肺癌動物模型，于鼠尾靜脈注射Alexa-cdGIGPQc-ScFvαvβ3，利用熒光掃描儀動態(tài)觀察在荷瘤小鼠各臟器中的分布，分析其特異性。

(3)、cdGIGPQc-ScFvαvβ3的生物相容性及毒性分析

①選擇SD大鼠和實驗犬通過異常毒性或急性毒性試驗觀察分子探針體內(nèi)靜脈給藥的安全性。

②選擇大鼠和實驗犬通過長期毒性試驗觀察cdGIGPQc-ScFvαvβ3體內(nèi)靜脈給藥的安全性。

③觀察記錄的內(nèi)容包括皮膚、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循環(huán)、自主及中樞神經(jīng)系統(tǒng)行為表現(xiàn)等。

④對所有實驗動物的重要組織器官如心臟、肝臟、肺臟、腎臟等作常規(guī)病理組織學(xué)和電鏡檢查，觀察分子探針對細(xì)胞有無毒性作用。

⑤分析常規(guī)血液指標(biāo)如紅、白細(xì)胞計數(shù)及血紅蛋白等改變；血液生化自動儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等常規(guī)生化指標(biāo)。

(4)、cdGIGPQc-ScFvαvβ3對體內(nèi)抑瘤療效

通過比較cdGIGPQc-ScFvαvβ3與對照組(ScFvαvβ3、cNAQAEQc-ScFvαvβ3、空白組)對肺癌細(xì)胞和人裸鼠肺癌動物模型的瘤體治療效果，評價cdGIGPQc-ScFvαvβ3對肺癌瘤體的抑瘤療效。

下面結(jié)合具體實驗對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

一、cdGIGPQc-ScFv的構(gòu)建與分析

采用自動多肽合成儀常規(guī)固相法(SPPS)合成肺癌特異性小分子肽cdGIGPQc(簡寫為cd)和非相關(guān)小分子肽cNAQAEQc(簡寫為cN)，小分子肽由8個不同的氨基酸組成的短肽。其中，c表示D型半胱氨酸，d表示D型天冬氨酸，G表示L型甘氨酸，I代表L型異亮氨酸，P代表L型脯氨酸，Q代表L型谷氨酰胺，N代表L型天冬酰胺，A代表L型丙氨酸，E代表L型谷氨酸。

小分子肽經(jīng)固相合成法(SPPS)合成后，利用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析其結(jié)構(gòu)，并通過高效液相層析(HPLC)加以純化。cdGIGPQc和cNAQAEQc的分子結(jié)構(gòu)及純度見圖1和圖2，cdGIGPQc(圖1)和cNAQAEQc(圖2)的HPLC報告中的峰值，提示其純度分別為96.45％、95.08％。

本發(fā)明利用整合素αvβ3的單鏈抗體(scFvαvβ3)替代單克隆抗體，所述單鏈抗體是把單克隆抗體重鏈的可變區(qū)(VH)和輕鏈的可變區(qū)(VL)基因在DNA水平克隆出來，再用一段連接肽(GGGGS)3的基因把VH和VL的羧基端和氨基端以VH-linker-VL的形式連接起來，表達后即得到ScFv片段，記名為ScFvαvβ3。

整合素αvβ3單鏈抗體ScFvαvβ3的氨基酸序列下所示：

QVQLQQSGAELARPGTSVKWSCRTSGYTFTSFGIAWVKQRSGQGLEWIGEIFPRSGNTYYNEKFTGKATLTADTSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCATYTSYGAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPTTMAASRGEKITITCSANSSISSNHLHWYQQKSGFSPKFLIYRTSILASGVPARFSGSGSGTSYSLTIDTMEAEDVATYYCQQGSSKPYTFGGGTKLEIKRAHHHHHH(SEQ ID NO：1)。

編碼整合素αvβ3單鏈抗體ScFvαvβ3的核苷酸序列如下所示：

CAGGTGCAGTTACAGCAGTCTGGTGCTGAATTAGCCCGTCCGGGTACAAGCGTTAAGTGGAGTTGTCGCACGTCAGGCTATACCTTTACGAGCTTTGGCATTGCCTGGGTTAAACAGCGCTCTGGCCAGGGCTTAGAGTGGATCGGCGAAATCTTTCCTCGCTCAGGCAATACTTATTATAACGAAAAGTTCACGGGCAAAGCCACACTGACCGCCGATACAAGTAGCTCAACCGCATATATGGAACTGCGTAGCCTGACGAGTGAAGATTCTGCTGTGTATTTTTGTGCGACATATACGAGCTATGGTGCGATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGTGTGACCGTGTCTTCAGGTGGCGGTGGTAGCGGTGGTGGCGGTTCAGGCGGCGGTGGTTCAGAAATCGTGTTAACACAGAGTCCGACAACGATGGCCGCGTCACGCGGCGAAAAAATTACAATCACATGTAGTGCTAATAGTTCAATCTCTAGTAATCATCTGCATTGGTATCAGCAGAAAAGTGGCTTTTCTCCTAAATTTCTGATCTATCGCACCTCTATCTTAGCAAGCGGCGTTCCTGCACGCTTTTCTGGCAGCGGCTCAGGCACCTCTTATAGTTTAACCATTGATACGATGGAAGCCGAAGATGTTGCCACATATTATTGCCAGCAGGGCTCAAGTAAACCGTATACGTTTGGCGGTGGGACAAAACTGGAAATTAAACGCGCCCATCATCATCATCATCATTAA(SEQ ID NO：2)。

為了獲得純化的ScFvαvβ3蛋白，在轉(zhuǎn)染E.coli BL21(DE3)之前，先通過限制性酶切分析鑒定重組質(zhì)粒pET-28a-ScFv(圖3A)。篩選出具有卡那霉素抗性的克隆進一步培養(yǎng)，利用鎳柱親和層析純化上清中的ScFvαvβ3蛋白。純化后的ScFvαvβ3經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果見圖3B。

圖3B中，M：蛋白分子量標(biāo)志(KDa)；BI：誘導(dǎo)前；AI：誘導(dǎo)后；P：沉淀；FT：穿透；E1、E2、E3：純化后條帶；R：復(fù)性后。在分子量26.5KDa處出現(xiàn)單一條帶，為純化后的ScFvαvβ3條帶。

小分子肽cdGIGPQc和ScFvαvβ3之間的偶聯(lián)，是通過偶聯(lián)劑SMCC實現(xiàn)的。蛋白和多肽偶聯(lián)SDS-PAGE檢測結(jié)果見圖3C，其中1,2：ScFvαvβ3-非相關(guān)肽偶聯(lián)產(chǎn)物；3,4：ScFvαvβ3-相關(guān)肽偶聯(lián)產(chǎn)物；5：蛋白分子量標(biāo)志(KDa)；6：ScFvαvβ3。重組的cdGIGPQc-ScFv經(jīng)SDS-PAGE分析，其分子量略高于ScFvαvβ3。

非相關(guān)小分子肽cNAQAEQc與ScFvαvβ3的偶聯(lián)，也是通過同樣的方法完成的，其分子量與cdGIGPQc-ScFvαvβ3相似。

二、cdGIGPQc-ScFvαvβ3的肺癌細(xì)胞結(jié)合特性

為了探究cdGIGPQc-ScFvαvβ3是否保留了cdGIGPQc原有的肺癌細(xì)胞結(jié)合特性，利用免疫熒光試驗加以驗證。首先，將A549和L78細(xì)胞以5000個/孔的密度接種在96孔板中，孵箱孵育24h使其貼壁。次日，經(jīng)4％多聚甲醛固定30min、5％BSA封閉1h后，避光加入100μl FITC-cdGIGPQc-ScFvαvβ3(15μg/mL)或FITC-cNAQAEQc-ScFvαvβ3(15μg/mL)4℃孵育過夜。PBS洗3次，去除未結(jié)合的熒光抗體。用DAPI(1:200，復(fù)能基因，廣州，中國)復(fù)染核后，PBS洗3次，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。等體積的PBS和FITC-cdGIGPQc(1μg/mL)分別作為陰性對照和陽性對照。以上實驗重復(fù)3次。

另外，又利用流式細(xì)胞術(shù)，進一步評估重組蛋白對肺癌細(xì)胞的結(jié)合能力。經(jīng)PBS洗3次后，收集并重懸2×10⁶的A549和L78細(xì)胞，避光加入100μl FITC-cdGIGPQc-ScFv(15μg/mL)或FITC-cNAQAEQc-ScFv(15μg/mL)，室溫孵育20min，同樣以PBS和FITC-cdGIGPQc作為對照。用BD FACSVerseTM檢測，并用FlowJo軟件分析試驗結(jié)果。結(jié)果見圖4。

圖4中，免疫熒光圖片反映了FITC-cdGIGPQc-ScFvαvβ3和FITC-cNAQAEQc-ScFvαvβ3與A549細(xì)胞(A)及L78細(xì)胞(B)的結(jié)合。比例尺：100μm；用流式細(xì)胞術(shù)定量分析cdGIGPQc-ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3對肺癌細(xì)胞A549(C)及L78(D)的親和性；其中，紅線代表陰性對照，藍(lán)線代表經(jīng)FITC-cdGIGPQc，F(xiàn)ITC-cdGIGPQc-ScFvαvβ3或FITC-cNAQAEQc-ScFvαvβ3處理過的肺癌細(xì)胞。

免疫熒光組圖(圖4A、4B)說明：FITC-cdGIGPQc-ScFvαvβ3可以同陽性對照FITC-cdGIGPQc一樣，特異性結(jié)合A549(圖4A)和L78(圖4B)肺癌細(xì)胞，其親和性明顯高于FITC-cNAQAEQc-ScFvαvβ3。在流式細(xì)胞術(shù)中，也得出了一致的的結(jié)果：加入FITC-cdGIGPQc-ScFvαvβ3和FITC-cdGIGPQc孵育的細(xì)胞，呈現(xiàn)出相似的近100％的陽性率，而FITC-cNAQAEQc-ScFvαvβ3處理組的陽性率約50％，其無論在陽性率或熒光強度上均明顯低于前兩者(圖4C、4D)。由此可見，與cdGIGPQc偶聯(lián)后，ScFvαvβ3與非小細(xì)胞肺癌的結(jié)合能力約提高了1倍。cdGIGPQc-ScFvαvβ3靶向非小細(xì)胞肺癌時，cdGIGPQc結(jié)合非小細(xì)胞肺癌上的整合素α3,ScFvαvβ3結(jié)合非小細(xì)胞肺癌的整合素αvβ3，拮抗αvβ3，使αvβ3失去生物學(xué)功能，從而抑制腫瘤新生血管的形成，使瘤細(xì)胞得不到充分養(yǎng)分而凋亡，同時通過血液轉(zhuǎn)移也受到抑制.綜上所述，這些結(jié)果表明：cdGIGPQc與ScFvαvβ3的偶聯(lián)，不但沒有影響cdGIGPQc部分的肺癌細(xì)胞結(jié)合特性，還增強了ScFvαvβ3對肺癌細(xì)胞的結(jié)合。

三、ScFvαvβ3和cdGIGPQc-ScFvαvβ3與αvβ3抗原的結(jié)合能力

利用Western Blot實驗，驗證ScFvαvβ3和cdGIGPQc-ScFvαvβ3對人整合素αvβ3的抗原識別能力。首先，將人整合素αvβ3蛋白(抗原)和上樣緩沖液混合煮沸，在10％SDS-PAGE上電泳并轉(zhuǎn)到PVDF膜。作為一抗，ScFvαvβ3和cdGIGPQc-ScFvαvβ3均能通過抗原抗體反應(yīng)，有效地識別整合素αvβ3，表現(xiàn)為與αvβ3單抗一致的條帶(圖5A)。

這些結(jié)果清楚地表明：重組后的ScFvαvβ3片段，并未丟失其作為單克隆抗體時原有的抗原結(jié)合能力，這一能力也同樣未因與cdGIGPQc偶聯(lián)而有所影響。

四、cdGIGPQc-ScFvαvβ3在體外抑制肺癌細(xì)胞增殖

cdGIGPQc-ScFvαvβ3對肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，是通過CCK8實驗驗證的。將A549和L78細(xì)胞以5000個/孔的密度接種到96孔板中，24h后更換為無血清培養(yǎng)基饑餓12h。以等分子量的ScFvαvβ3為陽性對照，加入從50pM到5μM不同濃度的cdGIGPQc-ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3作用24h。PBS洗滌之后，加入CCK8溶液37℃孵育1-4h，用酶標(biāo)儀讀出OD450值，用SPSS 20.0軟件計算對腫瘤細(xì)胞增殖的相對抑制率和半數(shù)抑制濃度IC50。實驗重復(fù)三次。

圖5B、5C分別代表A549和L78細(xì)胞三次重復(fù)實驗的一次結(jié)果。cdGIGPQc-ScFvαvβ3的IC50值較低，說明有活力的細(xì)胞較少，也就意味著更顯著的抑瘤效應(yīng)。ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3具有相似的濃度效應(yīng)曲線及抑瘤作用。在相同濃度下，與ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3相比，cdGIGPQc-ScFvαvβ3可以更顯著地抑制腫瘤生長。微摩爾濃度的cdGIGPQc-ScFvαvβ3即可有效抑制肺癌細(xì)胞增殖。由圖可知，在5μM的濃度下，ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3僅能抑制約40％的肺癌細(xì)胞，而cdGIGPQc-ScFvαvβ3則可達到大于90％的抑制率。

五、cdGIGPQc-ScFvαvβ3的體內(nèi)抑瘤療效

為了評估cdGIGPQc-ScFvαvβ3在體內(nèi)的抑瘤效果，構(gòu)建了A549(圖6A,B)和L78((圖6C,D))兩種肺癌裸鼠移植瘤模型。當(dāng)瘤子的平均體積達到100mm³，將裸鼠隨機分為4組(n＝6)，每四天經(jīng)尾靜脈注射10μg的ScFvαvβ3(ScFv組)、cdGIGPQc-ScFvαvβ3(cd-ScFv組)和cNAQAEQc-ScFvαvβ3(cN-ScFv組)，每4天1次，共3次；注射等體積的PBS作為陰性對照，定期用游標(biāo)卡尺測量瘤子大小，并用公式：體積＝(長×寬2)/2計算瘤子體積；用分析天平稱量瘤子的最后質(zhì)量；結(jié)果用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；利用非配對t檢驗分析實驗數(shù)據(jù)；*,p<0.05。

給藥兩周后，A549和L78模型的腫瘤生長曲線如圖6A、6C所示，與PBS組相比，ScFv、cd-ScFv和cN-ScFv三組的瘤子體積均明顯縮小。在A549模型中，各組的平均最終瘤重分別為982.9±111mg(PBS組)、636.3±30.42mg(ScFv組)、429.9±85.32mg(cd-ScFv組)、631.1±141.07mg(cN-ScFv組)(圖6B)。各給藥組相對于PBS組，對腫瘤生長的抑制率分別為：35.26％(ScFv組)、56.27％(cd-ScFv組)、35.80％(cN-ScFv組)。同樣地，在L78模型中，平均最終瘤重分別為530.8±72.50mg(PBS組),250.1±28.68mg(ScFv組),185.8±48.99mg(cd-ScFv組)and 305.5±100.45mg(cN-ScFv組)(圖6D)。各給藥組相對于PBS組，對腫瘤生長的抑制率分別為：52.89％(ScFv組)、64.99％(cd-ScFv組)、42.45％(cN-ScFv組)。

總而言之，ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3具有相近的抗腫瘤活性，而cdGIGPQc-ScFvαvβ3則呈現(xiàn)出更優(yōu)于兩者的療效，其對肺癌移植瘤的抑制率約為ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3的1.40倍和1.56倍。除此之外，當(dāng)瘤子尚小就出現(xiàn)明顯破潰的現(xiàn)象僅見于cdGIGPQc-ScFvαvβ3，也就是在腫瘤尚小的時候cdGIGPQc-ScFvαvβ3就開始起抑瘤作用。已經(jīng)有文獻報道過：ScFvαvβ3的抑瘤效果相當(dāng)于αvβ3的單克隆抗體mAbαvβ3(Liu D,Wang C,Li C,Zhang X,Zhang B,Mi Z,An X,Tong Y:Production and characterization of a humanized single-chain antibody against human integrin alphav beta3protein.J BIOL CHEM 2011；286:24500-24507.)，則可以推測本發(fā)明的偶聯(lián)藥物cdGIGPQc-ScFvαvβ3效果優(yōu)于mAbαvβ3。

綜上所述，ScFvαvβ3偶聯(lián)肺癌特異性小分子肽cdGIGPQc，而非cNAQAEQc之類的非相關(guān)肽，可以增強ScFvαvβ3的抗腫瘤效應(yīng)，體現(xiàn)為更小的腫瘤體積及質(zhì)量。另外，與傳統(tǒng)的化療藥物不同的是，在使用cdGIGPQc-ScFvαvβ3治療的過程中，裸鼠的體重及一般情況均無明顯變化。在A549模型中，cdGIGPQc-ScFvαvβ3組裸鼠給藥前的平均體重為17.13g，給藥2周后平均體重為18.57g；L78模型中，給藥前的平均體重為19.37g，給藥2周后平均體重為20.8g。從而提示了其在體內(nèi)具有良好耐受性。

六、cdGIGPQc-ScFv的療效及毒性

通過H&E染色，直觀地描述了A549和L78兩種移植瘤的腫瘤本質(zhì)，結(jié)果見圖7，其中左邊代表A549模型，右邊代表L78模型。

圖7A中，裸鼠經(jīng)ScFvαvβ3,cdGIGPQc-ScFvαvβ3和cNAQAEQc-ScFvαvβ3處理2周后，腫瘤的病理學(xué)特征及抗CD31和抗Ki67的代表性組化圖片，免疫組化CD31反映腫瘤血管生成情況，Ki67則反映腫瘤細(xì)胞增殖。比例尺：100μm。

圖7B中，抗CD31和抗Ki67組化圖片的IOD/Area值，是利用Image-Pro Plus軟件分析計算得出的。每組至少包括9張圖片用以定量分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用非配對t檢驗進行數(shù)據(jù)分析。*,p<0.05。cdGIGPQc-ScFv組CD31和Ki67的IOD/Area值明顯低于其他組(圖7B)。CD31和Ki67的同步減少趨勢，進一步明確了cdGIGPQc-ScFv的抗腫瘤機制。該實驗表明：cdGIGPQc-ScFvαvβ3能夠更顯著地降低腫瘤的微血管密度并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而說明其療效更優(yōu)于ScFvαvβ3和cN-ScFvαvβ3。圖8、圖9為動物移植瘤模型經(jīng)治療后重要臟器的H&E染色結(jié)果，顯示cdGIGPQc-ScFv對重要臟器無明顯影響或毒性作用，僅少數(shù)個體存在輕微的炎癥反應(yīng)，從而反映了其低毒性。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院

<120> 一種靶向肺癌的偶聯(lián)藥物cdGIGPQc- ScFvαvβ3

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Trp Ser Cys Arg Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe

20 25 30

Gly Ile Ala Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Phe Pro Arg Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Thr Tyr Thr Ser Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met

130 135 140

Ala Ala Ser Arg Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Asn Ser

145 150 155 160

Ser Ile Ser Ser Asn His Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Phe

165 170 175

Ser Pro Lys Phe Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

195 200 205

Ile Asp Thr Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

210 215 220

Gly Ser Ser Lys Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

225 230 235 240

Lys Arg Ala His His His His His His

245

<210> 2

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggtgcagt tacagcagtc tggtgctgaa ttagcccgtc cgggtacaag cgttaagtgg 60

agttgtcgca cgtcaggcta tacctttacg agctttggca ttgcctgggt taaacagcgc 120

tctggccagg gcttagagtg gatcggcgaa atctttcctc gctcaggcaa tacttattat 180

aacgaaaagt tcacgggcaa agccacactg accgccgata caagtagctc aaccgcatat 240

atggaactgc gtagcctgac gagtgaagat tctgctgtgt atttttgtgc gacatatacg 300

agctatggtg cgatggatta ttggggtcag ggcaccagtg tgaccgtgtc ttcaggtggc 360

ggtggtagcg gtggtggcgg ttcaggcggc ggtggttcag aaatcgtgtt aacacagagt 420

ccgacaacga tggccgcgtc acgcggcgaa aaaattacaa tcacatgtag tgctaatagt 480

tcaatctcta gtaatcatct gcattggtat cagcagaaaa gtggcttttc tcctaaattt 540

ctgatctatc gcacctctat cttagcaagc ggcgttcctg cacgcttttc tggcagcggc 600

tcaggcacct cttatagttt aaccattgat acgatggaag ccgaagatgt tgccacatat 660

tattgccagc agggctcaag taaaccgtat acgtttggcg gtgggacaaa actggaaatt 720

aaacgcgccc atcatcatca tcatcattaa 750