本發(fā)明屬于生物技術(shù)、生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及到一種可用于抑制寨卡病毒感染的小分子藥物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)屬于黃病毒科黃病毒屬，具有包膜蛋白的二十面體病毒。其基因組為一條正向單鏈RNA,共有約10800個(gè)核苷酸，編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(PrM、Env、Capsid)和七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。ZIKV是蟲媒病毒中的一種，主要由白天活動(dòng)的伊蚊叮咬傳播，但其傳播方式還有母嬰垂直傳播、性傳播及輸血傳播。

第一株ZIKV于1947年在烏干達(dá)寨卡森林的恒河猴中被首次分離得到，第二株病毒于1948年在同一地區(qū)的白線斑蚊(Aedes.Africanus)分離得到。在2007年前，只偶爾出現(xiàn)人類感染病例。2007年4月，ZIKV在西太平洋密克羅尼西亞的雅浦(Yap)島上首次爆發(fā)，出現(xiàn)49例ZIKV感染確診病例，59例ZIKV感染疑似病例。2013年-2014年，ZIKV在法國波利尼西亞、復(fù)活節(jié)群島、庫克群島、新蘇格蘭再次暴發(fā)流行。2015年4月在巴西的爆發(fā)導(dǎo)致目前(2016年5月18日)全球60個(gè)國家出現(xiàn)ZIKV的感染。

ZIKV感染導(dǎo)致發(fā)燒、疹子、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉疼痛、頭痛和結(jié)膜炎等癥狀，但癥狀多較溫和，為自限性疾病，一般2～7天后自行好轉(zhuǎn)。人感染后可獲得持久的終生免疫，目前沒有感染后再次感染的報(bào)道。

但是目前已證實(shí)ZIKV感染孕婦后，病毒可穿透胎盤屏障，或可導(dǎo)致嬰兒出現(xiàn)小頭癥或其他比較嚴(yán)重的腦損傷，尤其是在懷孕的前3個(gè)月。同時(shí)，ZIKV感染可能還與吉蘭-巴雷(Guillain-Barre)綜合征有關(guān)。

然而，目前國際上尚未有效預(yù)防和/或治療ZIKV感染的疫苗或藥物，預(yù)防ZIKV感染的主要措施是防止蚊蟲的叮咬，而對(duì)ZIKV感染的治療是對(duì)癥治療，緩解其疾病癥狀。所以亟需研究針對(duì)ZIKV的特效藥物，希望能夠?yàn)楦腥綵IKV的孕婦提供特異性治療，以減少小頭癥嬰兒的出生，同時(shí)也為了防止預(yù)防和/或治療吉蘭-巴雷綜合征。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可以抑制寨卡病毒(ZIKV)感染的小分子藥物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ZIKV感染的預(yù)防和/治療。

在第一方面，本發(fā)明提供了一種抑制寨卡病毒感染的方法，包括給予有效量的孟魯司特鈉。

在第二方面，本發(fā)明提供了孟魯司特鈉在制備用于抑制寨卡病毒感染的藥物中的用途。

在第三方面，本發(fā)明提供了孟魯司特鈉在制備用于治療和/或預(yù)防寨卡病毒感染相關(guān)病癥或疾病的藥物中的用途。

通過使用孟魯司特鈉，無論是在細(xì)胞水平上還是在動(dòng)物水平上，ZIKV感染均可以被有效地抑制。同時(shí)毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，孟魯司特鈉對(duì)細(xì)胞沒有明顯毒性。

附圖說明

圖1示出孟魯司特鈉對(duì)ZIKV毒株SZ01感染BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制SZ01對(duì)BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞的感染，IC50值分別約為0.33μM和1.21μM。

圖2示出孟魯司特鈉對(duì)ZIKV毒株FLR感染BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制FLR對(duì)BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞的感染，IC50值分別約為2.45μM和2.96μM。

圖3示出孟魯司特鈉對(duì)ZIKV毒株MR766感染BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞的抑制；從圖中可以看出，孟魯司特鈉可以有效抑制MR766對(duì)BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞的感染，IC50值分別約為1.78μM和1.92μM。

圖4示出孟魯司特鈉對(duì)BHK21細(xì)胞的毒性；從圖中可以看出，孟魯司特鈉無明顯毒性，其半數(shù)毒性濃度CC50>20000nM。

圖5示出孟魯司特鈉對(duì)AG6小鼠感染ZIKV毒株SZ01的抑制；從圖中可以看出，與Vehicle(DMSO)相比，孟魯司特鈉明顯改善AG6小鼠的生存率。

具體實(shí)施方式

下面通過下文的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體技術(shù)方案作進(jìn)一步清楚和完整的描述。需要理解的是，下文中具體描述的技術(shù)方案僅用于示例目的，無意于以任何方式對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行限制。在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改。本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附的權(quán)利要求書來進(jìn)行限定。

如上所述，本發(fā)明的目的在于提供一種可以抑制寨卡病毒(ZIKV)感染的小分子藥物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ZIKV感染的預(yù)防和/治療。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人以小分子藥物庫為基礎(chǔ)進(jìn)行了篩選工作，目的是篩選出具有抑制ZIKV病毒活性的小分子，用于對(duì)ZIKV感染的預(yù)防和/或治療。經(jīng)篩選，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，孟魯司特鈉表現(xiàn)出良好且特異的抑制ZIKV的活性。

具體地，本發(fā)明人首先在細(xì)胞水平上研究了孟魯司特鈉對(duì)幾種ZIKV毒株感染BHK21和Vero細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藥物可以有效抑制ZIKV的活性，其中抑制毒株SZ01對(duì)BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞感染的半數(shù)抑制濃度IC50分別約為0.33μM和1.21μM，抑制毒株FLR對(duì)BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞感染的IC50分別約為2.45μM和2.96μM，抑制毒株MR766對(duì)BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞感染的IC50分別約為1.78μM和1.92μM。

其次，本發(fā)明人還在動(dòng)物水平上研究了孟魯司特鈉對(duì)ZIKV的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)孟魯司特鈉對(duì)SZ01毒株感染AG6小鼠也具有抑制作用，能明顯改善AG6小鼠的生存率。

另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，孟魯司特鈉不具有明顯細(xì)胞毒性。在本發(fā)明中，發(fā)明人以BHK21細(xì)胞為例對(duì)孟魯司特鈉的細(xì)胞毒性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞無明顯毒性，半數(shù)毒性濃度CC50>20000nM。因此，孟魯司特鈉具有較好的安全性。

基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人由此達(dá)成了本申請(qǐng)要求保護(hù)的發(fā)明。

在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述之前，首先對(duì)孟魯司特鈉作簡單介紹。

孟魯司特鈉的英文名為Montelukast sodium，其分子式為C₃₅H₃₅ClNO₃S·Na，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：

孟魯司特鈉目前是一種已經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于臨床治療哮喘和過敏性鼻炎的藥物，為口服的白三烯受體拮抗劑，能特異性抑制氣道中的半胱氨酰白三烯(CysLT1)受體，改善氣道炎癥，有效控制哮喘癥狀。孟魯司特鈉在FDA制定的藥物對(duì)妊娠的危險(xiǎn)性等級(jí)分類中為B類，具有較好的安全性，并且有文獻(xiàn)報(bào)道其還具有降低神經(jīng)炎癥，提升海馬神經(jīng)發(fā)生，改善老年動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶的作用。

因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種抑制寨卡病毒感染的方法，包括給予有效量的孟魯司特鈉。

所述方法可以直接在動(dòng)物體或者人體上實(shí)施，用于直接抑制寨卡病毒，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)寨卡病毒感染相關(guān)病癥或疾病的預(yù)防和/或治療。所述方法也可以在組織或者細(xì)胞水平上實(shí)施，用于例如進(jìn)行科學(xué)研究之目的。換言之，所述方法可以實(shí)施用于預(yù)防目的和/或治療目的，也可以實(shí)施用于非預(yù)防目的和/或非治療目的。

在此使用的術(shù)語“有效量”是指孟魯司特鈉能夠有效地抑制寨卡病毒感染的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、給藥方式等因素來確定所述有效量。

在第二方面，本發(fā)明提供了孟魯司特鈉在制備用于抑制寨卡病毒感染的藥物中的用途。

在一個(gè)實(shí)施方案中，孟魯司特鈉與其它藥物聯(lián)合用于制備所述用于抑制寨卡病毒感染的藥物。

所述其它藥物可以是，例如，恩利卡生(emricasan)、7-去氮-2’-C-甲基腺苷(7-deaza-2’-C-methyladenosine，7-deaza-2’-CMA)、2’-C-甲基腺苷(2’-C-methyladenosine，2’-CMA)、2’-C-甲基胞苷(2’-C-methylcytidine,2’-CMC)、2’-C-甲基鳥苷(2’-C-methylguanosine,2’-CMG)、2’-C-甲基尿苷(2’-C-methyluridine,2’-CMU)、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate,EGCG)、氯硝柳胺(Niclosamide)，但不限于此。

在第三方面，本發(fā)明提供了孟魯司特鈉在制備用于治療和/或預(yù)防寨卡病毒感染相關(guān)病癥或疾病的藥物中的用途。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寨卡病毒感染相關(guān)病癥或疾病是寨卡病毒感染引起的小頭癥或吉蘭-巴雷綜合征。

在本文中，當(dāng)述及用于治療和/或預(yù)防寨卡病毒感染引起的小頭癥時(shí)，是指將有效量的所述藥物直接給予寨卡病毒感染的孕婦，從而間接地治療該孕婦腹中胎兒所患小頭癥和/或間接地預(yù)防胎兒患上小頭癥。

小頭癥是指頭部遠(yuǎn)小于其他同齡和同性嬰兒頭部的新生兒畸形。若伴有腦發(fā)育不良，小頭癥嬰兒可能會(huì)有發(fā)育障礙。小頭癥從輕微到嚴(yán)重不等。造成小頭癥可能有許多原因，其中包括寨卡病毒感染。

吉蘭-巴雷綜合征是一種很少見但是很嚴(yán)重的疾病，往往發(fā)生在病毒或者細(xì)菌感染后的幾天到幾周內(nèi)，會(huì)造成嚴(yán)重的神經(jīng)損傷，常見癥狀包括肌肉無力、疼痛、感官障礙，在相當(dāng)嚴(yán)重的情況下會(huì)造成癱瘓。吉蘭-巴雷綜合征是以周圍神經(jīng)和神經(jīng)根的脫髓鞘病變及小血管炎性細(xì)胞浸潤為病理特點(diǎn)的自身免疫性周圍神經(jīng)病，經(jīng)典型的吉蘭-巴雷綜合征被稱為急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(AIDP)，臨床表現(xiàn)為急性對(duì)稱性弛緩性肢體癱瘓。

在一個(gè)實(shí)施方案中，孟魯司特鈉與其它藥物聯(lián)合用于制備所述用于抑制寨卡病毒感染的藥物。

所述其它藥物可以是，例如，恩利卡生、7-去氮-2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基腺苷、2’-C-甲基胞苷、2’-C-甲基鳥苷、2’-C-甲基尿苷、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯或氯硝柳胺，但不限于此。

本申請(qǐng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無論是在細(xì)胞水平上還是在動(dòng)物水平上，孟魯司特鈉均可以有效地抑制寨卡病毒感染。同時(shí)毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，孟魯司特鈉對(duì)細(xì)胞沒有明顯毒性。因此，可以使用孟魯司特鈉抑制寨卡病毒感染，進(jìn)而預(yù)防和/或治療寨卡病毒感染相關(guān)病癥或疾病。

實(shí)施例

實(shí)施例1.孟魯司特鈉在體外對(duì)ZIKV感染的抑制

孟魯司特鈉抑制ZIKV感染的實(shí)驗(yàn)操作可以參考文獻(xiàn)：Zhiwu Sun,et al.,Intranasal Administration of Maleic Anhydride-Modified Human Serum Albumin for Pre-Exposure Prophylaxis of Respiratory Syncytial Virus Infection；Viruses 2015,7,798-819；doi:10.3390/v7020798，具體如下：

(1)從38歲中國男性患者體內(nèi)分離ZIKV，并將分離得到的ZIKV通過接種C6/36細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增(Sci China Life Sci,doi:10.1007/s11427-016-5043-4)。

(2)使用無血清DMEM在96孔板中梯度稀釋孟魯司特鈉，使其濃度分別為10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.156μM、0.078μM，每孔加藥體積為50μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

(3)使用無血清DMEM稀釋ZIKV(毒株分別為SZ01、MR766、FLR)，使得ZIKV的終濃度為3TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量),按照每孔50μL的量將ZIKV加入(2)中的96孔板，同時(shí)設(shè)置病毒感染的陽性組和無病毒無藥物的陰性組。病毒與藥物37℃條件下孵育1小時(shí)30分鐘。

(4)使用EDTA-EGTA消化液消化處理BHK21或Vero細(xì)胞，使用含2％FBS的DMEM將該細(xì)胞稀釋為2*10⁵/mL，并按100μL/孔的量加入(3)中的96孔板。之后在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)。

(5)至陽性組細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE(致細(xì)胞病變效應(yīng))導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡時(shí)，使用CCK8檢測(cè)孟魯司特鈉對(duì)病毒的抑制活性。CCK8檢測(cè)的具體操作如下：

a)小心吸棄96孔板中的培養(yǎng)基，加入新鮮的含2％FBS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)。

b)將1mL CCK8溶液加入9mL含2％FBS的DMEM中(一塊96孔板的用量)，顛倒混勻，得到CCK8反應(yīng)液。

c)小心吸棄96孔板中的培養(yǎng)基，將b)中所述的CCK8反應(yīng)液加入96孔中，每孔100μL。

d)37℃條件下培養(yǎng)1小時(shí)，之后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的OD₄₅₀吸光度值。

(6)計(jì)算孟魯司特鈉的抑制活性，使用的公式為：孟魯司特鈉的抑制活性＝(A_藥物孔-A_病毒孔)*100/(A_無藥物孔-A_病毒孔)，其中A_藥物孔是指含有藥物、病毒、細(xì)胞和CCK8的孔的吸光度，A_病毒孔是指含有病毒、細(xì)胞和CCK8的孔的吸光度，A_無藥物孔是指只含有細(xì)胞和CCK8的孔(無藥物無病毒)的孔的吸光度。

抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示：孟魯司特鈉可以較好地抑制ZIKV的感染，抑制毒株SZ01對(duì)BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞感染的半數(shù)抑制濃度IC50分別約為0.33μM和1.21μM(圖1)；抑制毒株FLR對(duì)BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞感染的IC50分別約為2.45μM和2.96μM(圖2)；抑制毒株MR766對(duì)BHK21細(xì)胞和Vero細(xì)胞感染的IC50分別約為1.78μM和1.92μM(圖3)。

實(shí)施例2 孟魯司特鈉對(duì)BHK21細(xì)胞的毒性檢測(cè)

孟魯司特鈉對(duì)BHK21細(xì)胞的毒性檢測(cè)操作可以參考文獻(xiàn)：Zhiwu Sun,et al.,Intranasal Administration of Maleic Anhydride-Modified Human Serum Albumin for Pre-Exposure Prophylaxis of Respiratory Syncytial Virus Infection.Viruses 2015,7,798-819；doi:10.3390/v7020798)，具體如下：

(1)使用無血清DMEM稀釋孟魯司特鈉，使其濃度分別為20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.156μM，每孔加藥體積為100μL，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)重復(fù)。

(2)使用EDTA-EGTA消化液消化處理BHK21細(xì)胞，使用含2％FBS的DMEM將細(xì)胞稀釋為4*10⁵/mL，并按100μL/孔的量加入(1)中的96孔板。之后在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)4天。

(3)小心吸棄96孔板中的培養(yǎng)基，加入新鮮的含2％FBS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)2-4小時(shí)。

(4)將1mL CCK8溶液加入9mL含2％FBS的DMEM中(一塊96孔板的用量)，顛倒混勻，得到CCK8反應(yīng)液。

(5)小心吸棄96孔板中的培養(yǎng)基，將(4)中所述的CCK8反應(yīng)液加入96孔中，每孔100μL。

(6)37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)1小時(shí)，之后在酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD₄₅₀吸光度值。

(7)計(jì)算細(xì)胞的活性，使用的計(jì)算方法為：細(xì)胞活性＝(A_藥物孔-A_{無細(xì)胞孔})*100/(A_無藥物孔-A_{無細(xì)胞孔})，其中A_藥物孔是指含有藥物、細(xì)胞和CCK8的孔的吸光度，A_{無細(xì)胞孔}是指不含藥物和細(xì)胞、只含有CCK8的孔的吸光度，A_無藥物孔是指不含藥物、只含細(xì)胞和CCK8的孔的吸光度。

毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：孟魯司特鈉對(duì)BHK21細(xì)胞無明顯毒性，其半數(shù)毒性濃度CC50>20000nM(圖4)。

實(shí)施例3.孟魯司特鈉在小鼠模型中對(duì)ZIKV感染的抑制

孟魯司特鈉在小鼠模型中對(duì)ZIKV感染的抑制實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行：

(1)將20只AG6小鼠分成兩組(藥物組和對(duì)照組)，每組10只，藥物組以45mg/kg腹腔注射給藥，對(duì)照組腹腔注射DMSO。

(2)8小時(shí)后，每只AG6小鼠腹腔注射1000PFU(空斑形成單位)的SZ01病毒。病毒注射完畢后，藥物組以45mg/kg腹腔注射給藥，對(duì)照組腹腔注射DMSO。

(3)藥物組連續(xù)7天以相同方式給藥，對(duì)照組連續(xù)7天以相同方式注射DMSO，并每天觀測(cè)小鼠生存率。

小鼠模型抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示：孟魯司特鈉可以較好地抑制ZIKV毒株SZ01對(duì)AG6小鼠的感染，從圖5中可以看出，與Vehicle(DMSO)相比，孟魯司特鈉明顯改善AG6小鼠的生存率。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，本發(fā)明并不限于上述示例的細(xì)節(jié)，在不背離本發(fā)明的精神和宗旨的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到本文所描述技術(shù)方案的變化方案，并且該變化方案也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍由隨附權(quán)利要求所限定。

另外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書通過實(shí)施方式來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但是并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案。本說明書的這種敘述方案僅為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將本說明書當(dāng)作一個(gè)整體，各個(gè)實(shí)施方式中的技術(shù)方案可以適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其它實(shí)施方式。