本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及蓽茇明寧堿在制備治療帕金森病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是臨床上最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，其主要臨床表現(xiàn)是靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢不穩(wěn)，而造成這些癥狀的主要原因在于PD中后期累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，疾病選擇性的損害中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元，導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性變性缺失，從而導(dǎo)致一系列運動及非運動癥狀。

伴隨著全球人口老齡化，PD的人口發(fā)病率呈明顯上升趨勢。流行病學(xué)研究顯示在中國65歲以上人群帕金森病發(fā)病率已接近2％，并伴隨著高致殘率，這嚴(yán)重影響著老年人口的健康水平和生活質(zhì)量。由于PD病因復(fù)雜且致病機制尚不清楚，因此其治療手段也較為有限。目前PD的手段主要有：藥物治療、手術(shù)治療、細胞移植、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，而詢證醫(yī)學(xué)(evidence based medicine EBM)證據(jù)表明，目前藥物治療仍是最為常用且最為有效的治療方法。EBM證據(jù)表明臨床治療PD的首選藥物仍為以左旋多巴為主要成分的美多芭，其主要機制是補充多巴胺的不足而產(chǎn)生治療作用，本質(zhì)上仍然是一種對癥性的替代療法，但是治療本身有諸多的局限性，由于L-dopa能夠進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的量不足服用劑量的1％，大量的L-dopa在外周的代謝會產(chǎn)生諸多的藥物副作用，并且由于該藥物只能對癥治療以改善癥狀，對于患者的預(yù)后沒有明顯改善，因此仍然是一種治標(biāo)而不治本的治療手段，隨著該藥應(yīng)用時間的延長和劑量的加大，其治療作用越來越小，同時毒副反應(yīng)卻越來越大。因此研發(fā)一種具有更好療效且更低毒副作用的藥物是基礎(chǔ)和臨床中厄待解決的問題。

近年來,對傳統(tǒng)中醫(yī)藥開放利用日趨具有研究前景，大量研究證實了傳統(tǒng)中醫(yī)藥可以通過保護黑質(zhì)細胞、提高神經(jīng)遞質(zhì)含量、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低興奮性毒性等作用達到治療帕金森病的目的,并且與西藥相比，傳統(tǒng)中醫(yī)藥物具有較低的毒副作用。

蓽茇是一種胡椒科胡椒屬植物，其干燥近成熟的果穗是中、蒙、藏醫(yī)習(xí)慣用藥，味辛、性熱，臨床用于治療胃腹冷痛、食欲不振、消化不良、腎寒、寒瀉、嘔吐等癥狀。蓽茇中含有豐富的生物堿、酰胺類、木脂素類、萜類、甾醇類及其它類的化合物，其中生物堿和酰胺類約35種，其中蓽茇明寧堿是蓽茇中主要單體成分之一。目前文獻中還未見報道蓽茇明寧堿藥物單體在魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型中治療方面的相關(guān)研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供蓽茇明寧堿的一種藥物新用途。

本發(fā)明所提供的蓽茇明寧堿的藥物新用途是其在制備具有下述1)-4)中至少一種功能的藥物中的應(yīng)用：(請核實此處表述，并確保涵蓋了所有的范圍)

1)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病；

2)治療魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型；

3)抑制細胞凋亡；

4)減輕多巴胺神經(jīng)元損傷。

上述應(yīng)用中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具體可為帕金森病。

本發(fā)明還提供一種包含蓽茇明寧堿的具有下述1)-4)中至少一種功能的藥物制劑：

1)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾??；

2)治療魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型；

3)抑制細胞凋亡；

4)減輕多巴胺神經(jīng)元損傷。

上述藥物制劑可制成各種形式的口服制劑，包括：膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、丸劑、滴丸劑、緩控釋制劑、口服液、合劑和糖漿劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。

本發(fā)明以魚藤酮(Rotenone)損傷模型，即100nM魚藤酮處理SK-N-SH細胞系和原代神經(jīng)元形成的細胞模型為細胞模型。

實驗證明：加入Rotenone(終濃度100nM)2小時，后加入蓽茇明寧堿(終濃度100nM)與Rotenone共培養(yǎng)24h。通過MTT、LDH的方法檢測細胞活力，結(jié)果顯示蓽茇明寧堿能夠顯著緩解Rotenone引起的細胞活力下降；通過PI/Hochest染色的方法檢測細胞死亡率，結(jié)果顯示蓽茇明寧堿能夠顯著緩解Rotenone引起的細胞死亡率升高；對Caspase 3、Caspase 9活力進行檢測，結(jié)果顯示蓽茇明寧堿能夠顯著緩解細胞凋亡。

為了進一步確定蓽茇明寧堿通過抑制細胞凋亡從而對魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型起到治療作用，本發(fā)明采用魚藤酮口服給藥C57BL小鼠動物模型。

上述模型制作是通過10mg/kg魚藤酮口服6周形成的模型。蓽茇明寧堿治療組是在魚藤酮口服6周后，分別用2mg/kg和4mg/kg口服給藥4周進行治療。

實驗證明：對C57BL小鼠進行行為學(xué)檢測，結(jié)果顯示蓽茇明寧堿可以顯著緩解魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠運動功能障礙以及嗅覺減退、抑郁的非運動癥狀；在紋狀體和中腦，對多巴胺能神經(jīng)元特異性標(biāo)志物酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)進行免疫組織化學(xué)染色及蛋白免疫印跡方法檢測，結(jié)果顯示蓽茇明寧堿可以抵抗魚藤酮誘導(dǎo)的模型小鼠TH陽性神經(jīng)元缺失以及神經(jīng)末梢的減少；通過高效液相(HPLC)的方法對紋狀體多巴胺含量進行檢測，結(jié)果顯示，蓽茇明寧堿可以減緩魚藤酮誘導(dǎo)的模型小鼠紋狀體多巴胺含量的下降；對模型小鼠腦組織進行Caspase 3、Caspase 9活力檢測，結(jié)果顯示蓽茇明寧堿可以緩解魚藤酮誘導(dǎo)的細胞凋亡。

上述實驗表明，蓽茇明寧堿可以抑制細胞凋亡，保護多巴胺能神經(jīng)元，從而來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

附圖說明

圖1為在SK-N-SH細胞和原代神經(jīng)元上檢測蓽茇明寧堿對的細胞活力的保護作用。圖示為魚藤酮處理2h，使用100nM蓽茇明寧堿PLG進行治療，共培養(yǎng)24h后，通過MTT、LDH方法檢測不同藥物處理組的細胞活力和細胞毒性。

圖2為在SK-N-SH細胞和原代神經(jīng)元上，檢測各組細胞死亡率。圖示為魚藤酮處理2h，使用100nM蓽茇明寧堿PLG進行治療，共培養(yǎng)24h后，對細胞進行PI/Hochest染色，PI染死細胞為紅色，Hochest染總細胞為藍色，統(tǒng)計紅色/藍色的值可以用來評估細胞死亡率。

圖3為在C57BL小鼠上，檢測小鼠運動行為以及嗅覺、抑郁等非運動行為。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。后對小鼠進行轉(zhuǎn)棒檢測，爬桿檢測評估小鼠的運動行為，嗅覺檢測，糖水偏好試驗檢測來評估小鼠的非運動行為。

圖4為取C57BL小鼠的紋狀體和中腦檢測TH陽性神經(jīng)元及其末梢。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。取小鼠紋狀體和中腦，通過免疫組織化學(xué)染色的方法檢測TH陽性神經(jīng)元和神經(jīng)末梢含量。

圖5為取C57BL小鼠的紋狀體和中腦檢測TH蛋白含量。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。取小鼠紋狀體和中腦，通過western blot的方法檢測TH蛋白水平。

圖6為取C57BL小鼠紋狀體檢測多巴胺含量。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。取小鼠紋狀體，通過高效液相的方法檢測多巴胺含量。

圖7為在SK-N-SH細胞和原代神經(jīng)元上檢測細胞凋亡水平。圖示為魚藤酮處理2h，使用100nM蓽茇明寧堿PLG進行治療，共培養(yǎng)24h后，收集細胞通過使用caspase-3和caspase-9活力檢測試劑盒檢測細胞caspase-3和caspase-9活力，從而評估細胞凋亡水平。

圖8為取C57BL小鼠中腦，檢測Caspase 3、Caspase 9活力。圖示為C57BL小鼠魚藤酮10mg/kg口服6周后，口服蓽茇明寧堿PLG進行治療4周，劑量分別為2mg/kg和4mg/kg。取小鼠中腦，使用caspase-3和caspase-9活力檢測試劑盒檢測細胞caspase-3和caspase-9活力，從而評估細胞凋亡水平。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明并不局限于此。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中所用的試劑、生物材料等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中使用的細胞系如下：

SH-SY5Y細胞系：人多巴胺能神經(jīng)母細胞瘤細胞(ATCC，本室凍存)(American Type Culture Collection)貨號CRL-2266^TM；

SPF級SD胎鼠：胎齡13.5d的SD胎鼠，購自北京維通利華實驗動物公司。

下述實施例中的試驗方法如下：

1.細胞活力的測定(MTT法)

(1)用胰蛋白酶消化細胞；

(2)用吸管充分吹打細胞，使其離壁，制備成單細胞懸液；

(3)或利用白細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)；

(4)按照2-3×10⁴/孔的密度，將細胞用排槍將SK-N-SH的單細胞懸液加到96孔板中，以進行MTT實驗做準(zhǔn)備；

(5)對個組進行相應(yīng)處理后，向各孔加入MTT(5mg/ml)10μl，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h；

(6)吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100μl DMSO，振蕩10分鐘，使顆粒完全溶解；

(7)將孔板置于酶標(biāo)儀中，讀取490nm波長處的吸光度值，統(tǒng)計作圖。

2.乳酸脫氫酶釋放率測定(LDH法)

(1)調(diào)整細胞濃度根據(jù)實驗設(shè)計種植于96孔板的相應(yīng)孔板。1‐1.5×10⁴個細胞/孔，每孔50μl；

(2)待細胞貼壁后，用assay medium洗細胞2次后每孔加入assay medium50μl；

(3)取待測藥物原液稀釋至實驗設(shè)計的濃度，向各個實驗設(shè)計孔中加入相應(yīng)濃度的藥物50μl；

(4)37℃、5％CO₂孵育12小時；

(5)加入Rotenone 100nM繼續(xù)孵育24小時；

(6)在高對照組加入lysis solution 5μl反應(yīng)15min；

(7)每孔加入100μl reaction mixture(現(xiàn)配250μl catalyst+11.25ml dye solution)室溫反應(yīng)30min，避光；

(8)每孔加入50μl stop solution終止反應(yīng)；

(9)酶標(biāo)儀490nm讀取吸光度值分析。

3.PI/Hochest染色

(1)細胞從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，在無菌超凈臺內(nèi)用巴斯德管吸棄培養(yǎng)基；

(2)以PBS液洗滌細胞，以去除殘余培養(yǎng)基及血清成分，吸棄PBS液；

(3)向培養(yǎng)瓶中加入預(yù)熱37℃的0.5ml細胞消化液，使其充分與細胞接觸，吸棄消化液，倒置顯微鏡下觀察細胞，待細胞突起回縮，胞體開始變圓時，立即加入1ml DMEM，以終止胰酶消化作用；

(4)用吸管充分吹打細胞，使其離壁，制備成單細胞懸液；

(5)根據(jù)細胞密度，將細胞接種于96孔板，37℃孵育；

(6)至細胞密度達到70％，魚藤酮組加入100nM Rotenone每孔100μl，PLG組和CSA組在Rotenone處理后兩小時進行治療，37℃孵育24小時；

(7)吸棄培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基稀釋PI，hochest至10μM/ml，每孔加100μl，孵育30分鐘，利用高內(nèi)涵分析系統(tǒng)檢測。

4.免疫組化步驟：

(1)動物經(jīng)灌注固定，立即取腦，先后放入含20％、30％蔗糖的4％多聚甲醛溶液內(nèi)后固定4℃過夜；

(2)冰凍切片，40μm，切片放入0.01M PBST液(pH7.2-7.5)內(nèi)待染；

(3)切片入0.01M PBST液中浸洗三次，5min；

(4)切片入1N鹽酸，抗原修復(fù)30min，室溫；

(5)切片入PBST浸洗三次10min；

(6)切片入3％H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性10min；

(7)切片入PBST浸洗三次，每次10min；

(8)切片入5％正常羊血清封閉1h，室溫(抑制非特異性染色)，棄血清，切片不清洗，直入適當(dāng)稀釋的一抗TH(0.01M PBST稀釋)，孵育4℃過夜；

(9)切片入PBST浸洗三次，每次5min；

(10)切片入1:300生物素標(biāo)記的Ⅱ抗(0.01M PBST稀釋)2-3h，室溫；

(11)切片入PBST浸洗三次，每次5min；

(12)切片入1:300辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素Ⅲ抗(0.01M PBST稀釋)2-3h，室溫；

(13)切片入PBST浸洗三次，每次5min；

(14)切片入DAB顯色，5-10min，室溫；

(15)切片入流水，充分浸洗；

(16)切片入0.01M PB液中裱片，自然干燥；

(17)切片上行脫水，透明，封固。

實施例1、蓽茇明寧堿PLG抑制魚藤酮誘導(dǎo)的細胞損傷。

1、通過MTT的方法檢測原代神經(jīng)元細胞活力。

MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在540nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細胞數(shù)成正比，即吸光值越大，其活性越強。

2、通過LDH的方法檢測原代神經(jīng)元細胞毒性。

LDH(乳酸脫氫酶)是穩(wěn)定的胞漿酶，存在所有的細胞中，當(dāng)胞膜損傷時快速釋放到細胞培養(yǎng)液中。LDH活性通過兩個酶催化反應(yīng)：LDH氧化乳酸鹽生成丙酮酸鹽，然后丙酮酸鹽和四唑鹽INT反應(yīng)生成甲(formazan)結(jié)晶。甲(formazan)結(jié)晶量在培養(yǎng)液中的增加，與裂解的細胞數(shù)增加直接相關(guān)。甲(formazan)結(jié)晶染料是水溶的，可以用分光光度計在500nm波長檢測。通過檢測細胞培養(yǎng)上清中LDH的活性，可判斷細胞受損的程度此分析靈敏、方便、精確，適用于許多種細胞毒性分析。

3、通過PI/Hochest染色的方法檢測原代神經(jīng)元細胞死亡率。

Hochest33342是一種能與細胞DNA結(jié)合的藍色特異性染料，能穿透活細胞膜，故能標(biāo)記活細胞和死細胞。而PI染料是不能進入細胞膜完整的細胞中，即活細胞對PI(碘化丙啶)染料拒染，而壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI染料染色發(fā)出紅色熒光。根據(jù)這些特性，用PI/Hoechst雙染色經(jīng)常被用于檢測細胞死亡比例。其比值越大，表明細胞死亡率越高。

4、實驗結(jié)果

用100nM魚藤酮處原代神經(jīng)元2h后，用100nM蓽茇明寧堿PLG進行治療，再共同孵育24h，后進行MTT細胞活力檢測和LDH細胞毒性檢測。實驗結(jié)果顯示，魚藤酮處理后原代神經(jīng)元的細胞活力均明顯降低且細胞毒性明顯增加，而PLG治療組則有明顯改善。

在原代神經(jīng)元上，使用PI/Hochest雙染的方法檢測了細胞死亡率，PI可以染死細胞，呈紅色，Hochest可以染總細胞數(shù)，成藍色，計算紅色/藍色可以得到細胞死亡率。結(jié)果顯示，魚藤酮處理細胞后，細胞死亡率明顯增加，而PLG治療后均有改善。

實施例2、蓽茇明寧堿PLG緩解魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠的行為學(xué)障礙和多巴胺缺失

1、通過轉(zhuǎn)棒檢測、爬桿檢測、嗅覺檢測、糖水偏好檢測評估魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病模型小鼠的行為學(xué)

轉(zhuǎn)棒實驗和爬桿實驗常用于檢測小鼠運動協(xié)調(diào)能力和抗疲勞能力。轉(zhuǎn)棒儀實驗是將動物放置在粗糙滾筒上避免滑落，轉(zhuǎn)動滾筒后，如果動物滑落下來，就會停止下面對應(yīng)的傳感器并自動記錄結(jié)果。爬桿實驗是將一個直徑為2.5cm的塑料球固定于一個長60cm，粗1cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布防止打滑。將小鼠放置于木桿頂端，記錄小鼠從木桿頂端回到地面的時間。時間越短，表示小鼠運動協(xié)調(diào)能力越強。

食物埋藏實驗常用于小鼠嗅覺檢測。小鼠在進行嗅覺檢測前進食14h，檢測時，將1mm³食物埋藏于待檢測鼠籠墊料下0.5cm處，將小鼠放入待檢測鼠籠中央，記錄小鼠從放入鼠籠到找到食物的時間。尋找食物時間越短，表示小鼠嗅覺能力越好。

糖水偏好實驗常用于檢測小鼠抑郁。實驗時，將兩瓶水放入鼠籠中，一瓶為自來水，另一瓶為1％的蔗糖水，由小鼠自行飲用1h，后記錄兩瓶水分別的飲用量，計算SP值＝糖水量/(糖水量+純水量)*100％，SP值越小，表示老鼠抑郁程度增加。

2、通過高效液相的方法檢測紋狀體多巴胺水平

去小鼠斷頭后迅速取腦組織，分離紋狀體組織，用于檢測DA含量。測定時，準(zhǔn)確稱取腦組織重量，按質(zhì)量體積比1:19加入19倍樣品處理液(500ml水+14.35ml高氯酸+5.5ml 200μg/ml DHBA+90mg EDTA)，冰上勻漿制備5％的組織勻漿液，12000r/min 4℃離心20min，取上清過0.22μm濾膜用于檢測。

3、通過免疫組化的方法檢測中腦和紋狀體的TH陽性神經(jīng)元和神經(jīng)末梢

免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原，對其進行定位、定性及相對定量的研究。本實驗中，通過免疫組化對小鼠中腦和紋狀體TH染色，來評估中腦和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元和神經(jīng)末梢含量。

4、實驗結(jié)果

本實驗動物為C57BL小鼠，魚藤酮口服給藥劑量為10mg/kg，給藥六周，每兩周進行一次行為學(xué)檢測。行為學(xué)結(jié)果顯示，魚藤酮處理后，老鼠體重較對照組降低，且出現(xiàn)運動能力下降，抑郁，嗅覺減退等癥狀。

小鼠魚藤酮口服給藥六周后，口服給蓽茇明寧堿PLG進行治療，劑量為2mg/kg,4mg/kg,給藥4周。每兩周進行一次行為學(xué)檢測。而PLG治療后，治療組老鼠較損傷組運動障礙，嗅覺減退，抑郁均有不同程度緩解。

通過高效液相的方法對老鼠紋狀體多巴胺含量進行了檢測，結(jié)果顯示損傷組老鼠DA含量較對照組明顯降低，而PLG治療組有所改善。

通過免疫組化的方法對紋狀體和中腦黑質(zhì)兩個部位進行TH染色，結(jié)果顯示魚藤酮處理后，小鼠腦組織紋體和黑質(zhì)部位TH水平較對照組明顯降低，而PLG治療有明顯改善。