本發(fā)明涉及一種葡蟠提取物及其用途，屬于天然產(chǎn)物化學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡蟠(Broussonetia kaempferi)是落葉灌木，高可達3米。枝條細長，有時常帶蔓狀，小枝細長疏生，略呈"之"字形，幼時有短柔毛，不久即變光滑，呈暗紫色。葉互生，卵狀橢圓形或卵狀批針形，長4～9厘米，寬3～5厘米?；科?，圓形或稍呈心臟性，先端長尖，具2～3個乳頭狀腺體，三出羽狀脈，邊緣有鋸齒，不裂或深裂。表面綠色，具粗糙伏毛，背面淡綠色，有細毛，葉柄長7～12毫米。花綠色，單性同株，雄花序茅荑狀，近橢圓形，生于新枝葉腋，萼4裂，雄蕊4枚，雌花生新枝上部葉腋，成球形頭狀花序，花萼管狀，3～4齒，子房上位，有柄。復(fù)果球形，紅色。產(chǎn)我國中部和南部各??；多生于山坡和溝谷叢林或巖石邊。葡蟠以根、葉入藥，能清涼解毒，治跌打損傷，腰痛。但是，目前尚未見有關(guān)于葡蟠在美容護膚方面，尤其是抗衰老和美白方面的研究和應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種葡蟠提取物及其用途，旨在將葡蟠中的活性提取物應(yīng)用于皮膚外用劑中，以起到美容護膚的作用。
本發(fā)明葡蟠提取物，是以葡蟠為原料提取后獲得，包括如下步驟：
1、將葡蟠原料浸漬入有機溶劑中，室溫下超聲提取后過濾，減壓濃縮后獲得葡蟠粗提物；
2、將所述葡蟠粗提物經(jīng)過吸附樹脂吸附和有機溶劑洗脫，干燥后獲得葡蟠活性富集提取物，即為葡蟠提取物。
將提取所得葡蟠粗提物和葡蟠提取物分別進行抗衰老作用和美白作用的實驗研究。
步驟1和步驟2中所述有機溶劑是指含有羥基或羰基等極性基團的有機溶劑，例如但不限于：水、甲酰胺、二甲基甲酰胺、三乙胺、三丁胺、乙腈、甲酸甲酯、乙酸乙酯、碳酸二甲酯、二甲亞砜、丙酮、甲乙酮、二氧六環(huán)、吡啶、四氫呋喃、甲醇、乙醇溶液、醋酸纖維、三氯甲烷、丙三醇、丙二醇、丙烯二醇、異丙醇、正丁醇、乙醚中的一種或幾種，其中優(yōu)選乙醇溶液。
步驟1中有機溶劑優(yōu)選為乙醇溶液，進一步優(yōu)選為體積濃度70％的乙醇溶液。
步驟2中洗脫時所用有機溶劑優(yōu)選為乙醇溶液，進一步優(yōu)選為體積濃度60％的乙醇溶液。
步驟1中葡蟠原料與有機溶劑的料液比為1g:8-15mL，優(yōu)選為1g:10mL。
所述吸附樹脂即大孔吸附樹脂，優(yōu)先選擇弱極性或中等極性的吸附樹脂，例如：X-5、 AB-8、D101、XDA-6、LX-21、NK-9、D3520、WLD等，其中優(yōu)選AB-8樹脂，AB-8為聚苯乙烯型非極性吸附樹脂，表面有一定的酯基，為疏水性吸附。該樹脂的比表面積和孔徑較大，適合于吸附各類具有一定疏水性的成分，吸附量較大，洗脫容易，吸附動力學性能良好。對熱、有機溶劑和一般使用條件下的酸、堿穩(wěn)定，因此使用壽命較長。對蛋白、糖類、無機酸、堿、鹽、小分子親水性有機物均不吸附，從而達到分離目的。
本發(fā)明葡蟠提取物中總黃酮含量為0.9-57％。
本發(fā)明葡蟠提取物在美白和抗衰老方面都具有很好的功效，可以作為活性成分添加到化妝品配方中，這里所指的活性成分在某些情況下可以提供一種或一種以上的功效。
本發(fā)明葡蟠提取物可應(yīng)用于皮膚外用劑、保健食品和醫(yī)藥，尤其是可應(yīng)用于化妝品中，根據(jù)制劑的不同類型添加不同的用量。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1：提取溶劑(乙醇)的濃度選取
1、取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末20g，室溫下以純水200ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液，減壓回收溶劑至干，獲得葡蟠粗提物；取所得葡蟠粗提物配制成0.05mg/ml的溶液備用。
2、取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末20g，室溫下以體積濃度30％的乙醇溶液200ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液，減壓回收溶劑至干，獲得葡蟠粗提物；取所得葡蟠粗提物配制成0.05mg/ml的溶液備用。
3、取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末20g，室溫下以體積濃度70％的乙醇溶液200ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液，減壓回收溶劑至干，獲得葡蟠粗提物；取所得葡蟠粗提物配制成0.05mg/ml的溶液備用。
4、取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末20g，室溫下以體積濃度95％的乙醇溶液200ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液，減壓回收溶劑至干，獲得葡蟠粗提物；取所得葡蟠粗提物配制成0.05mg/ml的溶液備用。
將上述4種配制好的溶液分別進行自由基清除作用的試驗。
試驗原理：根據(jù)DPPH自由基有單電子，在517nm處有一強吸收，其醇溶液呈紫色的特性，當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其 接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計進行快速的定量研究，來檢測自由基清除情況，從而判斷樣品是否具有抗氧化能力。
試驗方法：將不同待測樣品溶液2ml加入試管中，再加入2ml 76μmol/L DPPH乙醇溶液，混勻，室溫下避光在黑暗處反應(yīng)60min。在525nm處測定吸光度Abs。每個濃度重復(fù)三次，取平均值作為擬合數(shù)據(jù)，以保證實驗結(jié)果的準確性。
清除率I(％)＝[1-(T-T0)/(C-C0)]×100％
式中：T0：2ml水或DMSO加2mlDPPH溶液的吸光度；
T：2ml樣品液加2mlDPPH溶液的吸光度；
C0：2ml水或DMSO加2ml 95％乙醇的吸光度；
C：2ml樣品液加2ml 95％乙醇的吸光度。
按照上面公式計算清除率。試驗結(jié)果如表1所示：
表1
由上表可見，當采用70％體積濃度的乙醇溶液為提取溶劑時，葡蟠提取物的清除自由基活性最好。
實施例2：料液比的選取
1、取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末20g，室溫下以體積濃度70％的乙醇溶液160ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液，減壓回收溶劑至干，獲得葡蟠粗提物；取所得葡蟠粗提物配制成0.05mg/ml的溶液備用。
2、取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末20g，室溫下以體積濃度70％的乙醇溶液200ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液，減壓回收溶劑至干，獲得葡蟠粗提物；取所得葡蟠粗提物配制成0.05mg/ml的溶液備用。
3、取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末20g，室溫下以體積濃度70％的乙醇溶液240ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液，減壓回收溶劑至干，獲得葡蟠粗提物；取所得葡蟠粗提物配制成0.05mg/ml的溶液備用。
4、取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末20g，室溫下以體積濃度70％的乙醇溶液300ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液，減壓回收溶劑至干，獲得葡蟠粗提物；取所得葡蟠粗提物配制成0.05mg/ml的溶液備用。
將上述4種配制好的溶液分別進行自由基清除作用的試驗，試驗方法同上。試驗結(jié)果如表2所示：
表2
由上表可見，當采用70％體積濃度的乙醇溶液為提取溶劑且料液比為1:10時，葡蟠提取物的清除自由基活性最好。
實施例3：葡蟠提取物的制備
葡蟠粗提物的制備：取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末20g，室溫下以體積濃度70％的乙醇溶液200ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液，減壓回收溶劑至干，得葡蟠粗提物，用于功效研究。
葡蟠活性富集提取物的制備：取葡蟠莖葉干燥粉碎后的粉末100g，室溫下以體積濃度70％的乙醇溶液1000ml浸漬并超聲提取2次，每次60min(500W)，過濾后合并濾液(約1800ml)，減壓回收溶劑至無醇味，過AB-8樹脂，依次以30％乙醇，60％乙醇和90％乙醇洗脫，分別收集各流份(各約400ml)，蒸干，分別得到葡蟠30％乙醇洗脫部位(5.16g)、葡蟠60％乙醇洗脫部位(2.04g)和葡蟠90％乙醇洗脫部位(0.77g)，用于功效研究。
實施例4：葡蟠提取物的自由基清除作用研究
將實施例3制備的葡蟠粗提物、30％乙醇洗脫部位、60％乙醇洗脫部位和90％乙醇洗脫部位分別進行自由基清除作用的試驗，試驗方法同上。試驗結(jié)果如表3所示：
表3
由上表可見，葡蟠的各種提取物對自由基均具有很好的清除自由基的作用，尤其是60％乙醇洗脫部位對自由基的清除作用最好。
實施例5：葡蟠提取物的彈性蛋白酶抑制作用研究
試驗方法按照文獻(Am.J.Pharmacol.Toxicol.,2009,4,127-129)中的方法進行，步驟為：在96孔板中加入10uL樣品溶液和130uL含有1.015mM反應(yīng)底物Succ-Ala-Ala-Ala-p-硝基酰替苯胺的0.1M Tris-Cl緩沖溶液(PH＝8.0)，在25℃下溫育5分鐘，加入15uL彈性蛋白酶溶液(0.5U/ml)，繼續(xù)在25℃下溫育60min，然后用酶標儀測定410nm波長的吸光度。用去離子水替換樣品水溶液，作為參比溶液，測定吸光度，通過與對照組的比較得到樣品組的相對抑制率。試驗結(jié)果見表4：
表4
由上表可見，葡蟠的各種提取物對彈性蛋白酶均具有很好的抑制作用，尤其是60％乙醇洗脫部位對彈性蛋白酶的抑制作用最好。
實施例6：葡蟠提取物的酪氨酸酶抑制作用研究
試驗方法：在樣品管和樣品對照管中各加入1ml不同濃度的樣品溶液，陽性和陰性對照管以磷酸緩沖液代替。在樣品管和陽性對照管中加入0.5ml酪氨酸酶溶液(酶活單位125u/ml)，樣品對照和陰性對照管以0.5ml磷酸緩沖液(pH＝6.8)代替，振搖所有試管，使樣品和酪氨酸酶充分混勻，37℃水槽孵育10分鐘，加入2ml的0.03wt％酪氨酸溶液，反應(yīng)10分鐘，即刻在475nm處測定吸光度。
抑制率I(％)＝[1-(T-T0)/(C-C0)]×100％
式中：T0：樣品溶劑對照；
T：樣品對照；
C：陽性對照；
C0：陽性對照溶劑對照。
試驗結(jié)果如表5所示：
表5
由上表可見，葡蟠的各種提取物對酪氨酸酶均具有很好的抑制作用，尤其是60％乙醇洗脫部位對酪氨酸酶的抑制作用最好。
實施例7：葡蟠提取物的總黃酮含量檢測
移取樣品和蘆丁對照各1mL于10mL具塞試管中，加入1mL1％的三氯化鋁/甲醇溶液，用甲醇定容，搖勻，放置15min。同法制備空白液。在200～500nm波長范圍內(nèi)進行掃描，記錄紫外可見吸收光譜。樣品最大吸收峰和蘆丁最大吸收峰的重合度好，因此選擇蘆丁為測定時的標準品。掃描結(jié)果顯示于355nm處進行總黃酮含量測定。檢測結(jié)果如表6所示：
表6
由上表可見，葡蟠的各種提取物中均含有一定的總黃酮，其中60％乙醇洗脫部位中的總黃酮含量最高。