本發(fā)明涉及軟骨細(xì)胞組合物。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨(articular cartilage，AC)損傷是骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)發(fā)生的一個主要危險因素，OA是不可逆的，當(dāng)病情發(fā)展到晚期時要通過關(guān)節(jié)置換來減輕痛苦和恢復(fù)功能。由于關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)能力是有限的，必須早期干預(yù)以防止發(fā)展成為OA。當(dāng)前的治療方式旨在通過主要治療、鄰近組織刺激和移植來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨。通過合理的修復(fù)治療可以在短期到中期獲得較理想的結(jié)果，但較長一段時間后，容易復(fù)發(fā)。近年來，基于生物工程組織的細(xì)胞水平的組織工程技術(shù)得到廣泛的研究，這種生物工程組織可以重現(xiàn)透明軟骨的特性，并與原來的組織融為一體，對于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷意義重大。
然而，目前的生物工程組織修復(fù)軟骨損傷方面的研究仍有待加強。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種方便獲得、安全可靠，能夠有效修復(fù)軟骨損傷的手段。
需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
目前應(yīng)用較廣泛的細(xì)胞水平的軟骨修復(fù)技術(shù)之一是自體軟骨細(xì)胞移植(Autologous chondrocyte implantation，ACI)技術(shù)。該技術(shù)包含體內(nèi)手術(shù)治療和體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：首先，在受損關(guān)節(jié)的非承重區(qū)域進(jìn)行手術(shù)獲取軟骨切片，并將其轉(zhuǎn)移到可儲存及運輸?shù)臒o菌營養(yǎng)液中；然后，在細(xì)胞培養(yǎng)室中使用膠原酶消化軟骨組織，得到軟骨細(xì)胞，采用單層培養(yǎng)將軟骨細(xì)胞培養(yǎng)擴增至可用于移植的數(shù)量，由外科醫(yī)生來進(jìn)行軟骨缺陷的填充。在該手術(shù)過程中，將體外擴增的軟骨細(xì)胞注射到缺陷處。為了使軟骨細(xì)胞停留在移植部位，防止大量漂走，可以進(jìn)一步將滑膜瓣縫合在損傷部位。然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，自體軟骨細(xì)胞移植存在以下缺陷：1、自體軟骨細(xì)胞移植需要兩次侵入性手術(shù)，對病人傷害較大。2、軟骨細(xì)胞在體外單層擴增期間，這些細(xì)胞群失去了它的表型，膠原蛋白的生產(chǎn)由II型(典型的透明軟骨)向I型和III型(典型的纖維軟骨)的轉(zhuǎn)變。這些表型的改變的結(jié)果是具有較差的生物機械性能的細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。3、供體部位提供大量的軟骨細(xì)胞的能力有限。4、供體部分的發(fā)病率也是自體軟骨細(xì)胞的主要障礙。
而自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植也是目前應(yīng)用較廣泛的細(xì)胞水平的軟骨修復(fù)技術(shù)。該技術(shù)在病人的髂骨進(jìn)行骨髓穿刺，收集骨髓；將樣品轉(zhuǎn)移至潔凈室進(jìn)行細(xì)胞分離；向骨髓穿刺液中添加磷酸鹽緩沖液，然后轉(zhuǎn)移至淋巴細(xì)胞分離液中，離心并收集單個核細(xì)胞并計數(shù)，用PBS洗滌，然后接種至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以便將所得細(xì)胞擴增培養(yǎng)，傳到第二代準(zhǔn)備移植；移植前采用集落形成單位(Colony-forming unit,CFU)以及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的克隆形成能力以及細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)；然后，將第二代的MSCs用胰酶消化下來，并重懸于生理血清中，并裝載到無菌注射器中，透視下，將細(xì)胞注射到病人的膝蓋損傷處。然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植存在以下缺陷：1、骨髓穿刺給病人帶來痛苦。2、細(xì)胞直接注射到損傷處，沒有做其他措施，細(xì)胞可能會大量漂走。3、短中期效果理想，但長時間之后病人的損傷處疼痛有所上升，行動能力也有所下降。
而間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是一種很有前景的策略，因為MSCs具有高增殖能力并且具有分化為軟骨細(xì)胞的潛能，進(jìn)而形成軟骨。MSCs是梭形細(xì)胞，具有快速增殖和自我更新能力，存在于大量組織中，包括骨髓、滑膜組織、血液、脂肪組織和骨膜組織。它們具有多系分化潛能，可以分化為多種細(xì)胞類型以創(chuàng)建和修復(fù)間充質(zhì)組織。MSCs可以向成軟骨、成骨、脂肪發(fā)生途徑分化。調(diào)節(jié)因子可以促進(jìn)MSC的軟骨發(fā)生，例如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)和地塞米松，這已經(jīng)用簡單的體外模型得到了證實。
進(jìn)而，發(fā)明人通過一系列研究發(fā)現(xiàn)，采用臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical Cord Mesenchymal stem cells,UCMSC)移植到病人的膝關(guān)節(jié)損傷處，能夠有效治療軟骨損傷。并且，目前已有成熟的UCMSC分離培養(yǎng)方法，并且臍帶易獲取，不需要對病人采取侵入性手術(shù)，也不需要在其它位置提取軟骨，能夠有效減少病人的痛苦。且MSC能夠快速增殖和自我更新，具有成軟骨分化的潛能，能夠保證新生軟骨細(xì)胞的活力，并且不存在發(fā)病率的隱患。
進(jìn)一步，發(fā)明人在移植前，對部分UCMSC進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)分化，以促進(jìn)UCMSC向軟骨方向分化，并將UCMSC和誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞與膠原以及溫敏型水凝膠復(fù)合，結(jié)果能夠有效防止細(xì)胞大面積遷移，達(dá)到長期治療的效果。其中，溫敏型聚乳酸水凝膠在37℃以下為液體，在達(dá)到37℃后將形成凝膠，起著外源性細(xì)胞載體的作用，可以促進(jìn)細(xì)胞的移動、黏附、增殖及分化，并提供結(jié)構(gòu)支持，使得細(xì)胞在缺損處活動，不會大面積移動。
因而，在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種軟骨細(xì)胞組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該軟骨細(xì)胞組合物包括：細(xì)胞懸液和溫敏型水凝膠，其中細(xì)胞懸液是通過將間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞混合并重懸于膠原溶液形成的。
發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的軟骨細(xì)胞組合物方便獲得、安全可靠，并且，向軟骨細(xì)胞分化的效率高，能夠為軟骨損傷部位提供組織修復(fù)所必需的細(xì)胞，而溫敏型水凝膠具有很好的外源性細(xì)胞載體的作用，能夠使組合物中的細(xì)胞充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移，從而能夠有效促進(jìn)軟骨損傷部位快速、有效地修復(fù)及愈合。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，在所述細(xì)胞懸液中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞和所述軟骨細(xì)胞的混合比例為1:1～4:1。由此，軟骨分化效率高，能夠為軟骨損傷部位提供組織修復(fù)所必需的細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，在所述細(xì)胞懸液中，膠原的含量為1質(zhì)量％～8質(zhì)量％。由此，細(xì)胞混合物與膠原以及溫敏型水凝膠的復(fù)合效果好，能夠有效防止細(xì)胞大面積遷移，從而可以達(dá)到長期治療的效果。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述膠原為Ⅱ型膠原蛋白。由此，細(xì)胞混合物與膠原以及溫敏型水凝膠的復(fù)合效果好，能夠有效防止細(xì)胞大面積遷移，從而可以達(dá)到長期治療的效果。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述膠原溶液的濃度為1質(zhì)量％～8質(zhì)量％。由此，細(xì)胞混合物與膠原以及溫敏型水凝膠的復(fù)合效果好。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述細(xì)胞懸液和所述溫敏型水凝膠的體積比為1:1～2。由此，溫敏型水凝膠對細(xì)胞懸液中的間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞混合物的承載效果好，進(jìn)而能夠使組合物中的細(xì)胞充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移，從而能夠有效促進(jìn)軟骨損傷部位快速、有效地修復(fù)及愈合。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述溫敏型水凝膠為溫敏型聚乳酸水凝膠。由此，能夠有效承載間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞混合物，并使其充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述溫敏型聚乳酸水凝膠為MPEG-PLGA。由此，其作為外源性細(xì)胞載體的作用好，能夠使組合物中的細(xì)胞充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移，從而能夠有效促進(jìn)軟骨損傷部位快速、有效地修復(fù)及愈合。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。由此，間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，易獲得，安全無害，且向軟骨分化的效率高。
根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述軟骨細(xì)胞是通過間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的。并且，軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)方法不受特別限制，只要能夠從間充質(zhì)干細(xì)胞優(yōu)選臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞有效誘導(dǎo)獲得軟骨細(xì)胞即可。由此，軟骨細(xì)胞組合物，向軟骨細(xì)胞分化的效率高，能夠為軟骨損傷部位提供組織修復(fù)所必需的細(xì)胞。
此外，還需要說明的是，本發(fā)明具有下列優(yōu)點的至少之一：
1、本發(fā)明由廢棄物臍帶獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，來源廣泛，可大量獲取，且不會對病人造成傷害。
2、本發(fā)明對部分UCMSC進(jìn)行軟骨細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化，促進(jìn)了UCMSC向軟骨分化的效率。
3、溫敏型水凝膠能夠起到很好的外源性細(xì)胞載體的作用，使得細(xì)胞能夠充分填充軟骨損傷處，而又不向其它地方遷移。
本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
具體實施方式
下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實施例1
按照以下步驟制備軟骨細(xì)胞組合物，并對軟骨損傷病人進(jìn)行移植修復(fù)：
1、UCMSC的分離培養(yǎng)
將取到的新鮮臍帶送入GMP生產(chǎn)車間，分離得到UCMSC。將UCMSC培養(yǎng)擴增；并取出部分細(xì)胞進(jìn)行成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)，得到一定數(shù)量的軟骨細(xì)胞后擴增，準(zhǔn)備移植。
2、移植前準(zhǔn)備
將上述得到的UCMSC與誘導(dǎo)分化得到的軟骨細(xì)胞，用0.25％的胰酶消化下來，并用生理鹽水洗滌，然后將UCMSC與軟骨細(xì)胞按照1:1～4:1的比例混合并重懸于Ⅱ型膠原蛋白溶液(膠原蛋白溶液的濃度為1-8質(zhì)量％)中，以便得到細(xì)胞懸液，其中細(xì)胞懸液中膠原的含量為1-8質(zhì)量％。將該細(xì)胞懸液與溫敏型聚乳酸水凝膠MPEG-PLGA以1∶1～2的體積比混合，置于搖床一段時間使其充分混勻，以便得到本發(fā)明的軟骨細(xì)胞組合物。
然后，對本發(fā)明的軟骨細(xì)胞組合物中的細(xì)胞取樣進(jìn)行微生物、病毒五項、支原體、內(nèi)毒素以及細(xì)胞功能檢測，以確保安全性。
3、移植
采用關(guān)節(jié)腔注射法。其中，病人在接受注射前進(jìn)行關(guān)節(jié)鏡檢查，確定關(guān)節(jié)損傷處的大小、厚度等，以每平方厘米5×106細(xì)胞的密度進(jìn)行注射。
4、移植后效果觀察
治療后，定期采用核磁共振成像檢查膝關(guān)節(jié)功能的改善情況。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的軟骨細(xì)胞組合物中的細(xì)胞能夠充分填充軟骨損傷處且不向其它地方遷移，軟骨損傷部位修復(fù)愈合快速、有效。
對比例1
按照實施例1的方法制備軟骨細(xì)胞組合物，并對軟骨損傷病人進(jìn)行移植修復(fù)，區(qū)別僅在于：
不對UCMSC進(jìn)行軟骨誘導(dǎo)，即細(xì)胞懸液中的細(xì)胞全部采用UCMSC。
移植后觀察到，病人軟骨損傷部位軟骨樣組織，病人疼痛緩解，損傷有一定程度愈合。
對比例2
按照實施例1的方法制備軟骨細(xì)胞組合物，并對軟骨損傷病人進(jìn)行移植修復(fù)，區(qū)別僅在于：
細(xì)胞懸液中的UCMSC與軟骨細(xì)胞的比例為1：3。
移植后觀察到，病人軟骨損傷部位修復(fù)愈合速度慢。
對比例3
按照實施例1的方法制備軟骨細(xì)胞組合物，并對軟骨損傷病人進(jìn)行移植修復(fù)，區(qū)別僅在于：
細(xì)胞懸液與溫敏型聚乳酸水凝膠MPEG-PLGA的比例為1∶3。
移植后觀察到，病人軟骨損傷部位軟骨細(xì)胞形成效率較低，從而修復(fù)愈合速度慢。
對比例4
按照實施例1的方法制備軟骨細(xì)胞組合物，并對軟骨損傷病人進(jìn)行移植修復(fù)，區(qū)別僅在于：
細(xì)胞懸液與溫敏型聚乳酸水凝膠MPEG-PLGA的比例為1：3。
移植后觀察到，病人軟骨損傷部位軟骨細(xì)胞形成效率較低，修復(fù)愈合速度慢。
對比例5
按照實施例1的方法制備軟骨細(xì)胞組合物，并對軟骨損傷病人進(jìn)行移植修復(fù)，區(qū)別僅在于：
不采用溫敏型聚乳酸水凝膠MPEG-PLGA(即僅采用細(xì)胞懸液進(jìn)行注射移植)。
移植后觀察到，組合物中的細(xì)胞大量漂走，病人軟骨損傷部位軟骨細(xì)胞形成效率較低，修復(fù)愈合速度慢。
對比例6
按照實施例1的方法制備軟骨細(xì)胞組合物，并對軟骨損傷病人進(jìn)行移植修復(fù)，區(qū)別僅在于：
采用生理鹽水替代膠原溶液。
移植后觀察到，組合物中的細(xì)胞大量漂走，病人軟骨損傷部位軟骨細(xì)胞形成效率較低，修復(fù)愈合速度慢。
在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。