本發(fā)明屬于醫(yī)療材料的制備技術領域，具體涉及一種脫細胞角膜的制備方法。

背景技術：

角膜病是我國第二大致盲性眼病，我國現(xiàn)有約400萬角膜盲患者，每年角膜盲病人新增約10萬余人，但目前國內每年僅能實現(xiàn)大約5000-8000例角膜移植手術。角膜供體嚴重不足的現(xiàn)實國情，導致絕大多數(shù)角膜盲患者在黑暗中排隊等待，有的甚至錯過最佳治療機會，導致永久失明。角膜移植分為穿透性角膜移植、板層角膜移植和角膜內皮移植。其中板層角膜移植對供體材料的要求較低，適合于角膜內皮無明顯病變的所有患者，板層角膜移植約占角膜移植總算的1/2，如解決了板層角膜移植的供體角膜材料，就解決了我國一半的角膜病盲人的手術復明問題。近年來，隨著生物組織工程學的廣泛和深入研究，脫細胞處理和病毒滅活等工藝制備的異種角膜基質材料在動物水平和臨床應用中取得了初步的治療效果，但角膜基質經(jīng)脫細胞后，存在透明度差，部分力學結構破壞所致的抵抗力下降、厚度逐漸變薄等問題仍沒有很好解決，故應用脫細胞基質的角膜在臨床上仍不能替代人的角膜，沒有解決我國角膜供體材料嚴重匱乏的問題，故優(yōu)化脫角膜基質細胞的工藝，使經(jīng)過脫細胞的角膜能保持透明和力學結構是目前研究的熱點，也是為我國角膜盲患者重建光明帶來的希望。

以往報道的角膜脫細胞方法多使用基本緩沖液，如PBS、HBSS、細胞培養(yǎng)液等對角膜進行溶脹，通過物理、化學或生物學方法將細胞破碎后進行洗脫，短時間處理不能有效清除細胞成分，一般需要24-72小時的脫細胞過程，當長時間處理往往會導致角膜有序膠原結構的破壞，伴隨著角膜透明性喪失，光學效果差，達不到臨床復明的手術要求。雖然經(jīng)過甘油脫水后可再次恢復透明，但移植后會逐漸變薄或長期不透明，不能達到長期復明的目的。針對上述問題，研發(fā)新型的脫細胞角膜制備方法，避免因物理、化學和生物學等處理對角膜膠原纖維結構造成的破壞，使脫細胞后的角膜保持透明和應用的力學特性是目前亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了避免現(xiàn)有技術存在的缺點，提供一種始終保持角膜透明特性的脫細胞方法，制備過程中保持角膜膠原結構和透明度，避免現(xiàn)有方法對角膜膠原結構和透明性的影響。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明在于整個脫細胞過程使用一種角膜保護劑，維持角膜的正常厚度和透明性；采用靜高壓技術破碎細胞，避免角膜溶脹破壞角膜基質的顯微結構；脫細胞處理采用去垢劑復合核酸酶聯(lián)合作用有效去除細胞核成分，最后漂洗去除脫細胞用試劑和細胞碎片；在脫細胞步驟保持合適的壓力條件、去垢劑、消化酶濃度和處理時間，最終實現(xiàn)脫細胞處理后的角膜保持其原有的透明度和有序的角膜基質顯微結構。

本發(fā)明的方法，包括如下的步驟：

1)將角膜板層置于保護液中，并置于容器中密封；

2)采用高靜壓處理破碎細胞；

3)將角膜取出后，置于添加了去垢劑和核酸酶的保護劑中進行震蕩脫細胞處理；

4)將脫細胞后的角膜置于保護劑中漂洗2小時以上完成制備。

所述的脫細胞角膜制備用保護液，是添加有5-12g/L透明質酸、5～20g/L硫酸軟骨素、3～10g/L低分子量右旋糖酐的PBS或HBSS緩沖液；

上述的脫細胞角膜保護液，其pH值調至7.2～7.4；

上述的脫細胞角膜保護液，其滲透壓為300-400mOsm

作為優(yōu)選，本發(fā)明的脫細胞角膜保護液中還添加有妥布霉素，其添加量優(yōu)選為1-3ml/L。

進一步的，步驟2)中高靜壓處理破碎細胞的條件為200-600MP，時間不超過10分鐘；

步驟3)中的去垢劑為十二烷基硫酸鈉，濃度為0.1-0.5％，消化酶為DNase I，濃度為500-2000U/ml，

脫細胞處理的條件如下：溫度20-30℃，時間2小時。

本發(fā)明的方法使用的保護液通過組分與配比的選擇使制備的保護液能維持脫細胞角膜制備液體的膠體滲透壓，與傳統(tǒng)的脫細胞角膜制備液體相比，可以顯著降低膠原等細胞外基質成分在后期脫細胞處理過程中過度溶脹、丟失導致的角膜透明度下降；而且添加妥布霉素等抗生素成分，抑制易感染角膜的細菌滋生，如綠膿桿菌、克雷白桿菌、腸桿菌屬、變形桿菌等，避免處理過程中的污染幾率。在破碎細胞的同時，避免長時間高壓對角膜基質膠原破壞引起的透明度下降。其次，去垢劑和核酸酶同時作用，更快速有效地去除細胞碎片和核酸成分，避免去垢劑和其他成分長時間處理對角膜膠原等蛋白成分破壞引起的角膜透明性下降。

具體實施方式

我國及其他東南亞國家都面臨著角膜供體匱乏的難題，嚴重影響了角膜盲患者的復明，角膜供體的來源也成為目前角膜病治療過程中最為棘手的問題，尋找適合于人體的角膜替代物已成為當前眼科和組織工程領域研究的熱點。豬角膜來源廣泛，角膜厚度和屈光方面與人角膜最為接近，經(jīng)脫細胞處理和病毒滅活等工藝制備的豬角膜基質材料在動物水平或臨床應用中也取得了較好的治療效果，部分解決了我國角膜供體材料嚴重匱乏的問題，為角膜盲患者重見光明帶來希望。

申請人對已有的角膜保存液進行了組合和配比的優(yōu)化，從而再使用盡可能少組分的情況下取得了更好的效果，同時采用靜高壓技術破碎細胞，避免角膜溶脹破壞角膜基質的顯微結構；脫細胞處理采用去垢劑復合核酸酶聯(lián)合作用有效去除細胞核成分，最后漂洗去除脫細胞用試劑和細胞碎片；在脫細胞步驟保持合適的壓力條件、去垢劑、消化酶濃度和處理時間，最終實現(xiàn)脫細胞處理后的角膜保持其原有的透明度和有序的角膜基質顯微結構。

下面通過實例對本發(fā)明進行具體的描述。

實施例1：脫細胞角膜制備用保護液的制備

組分1：

保護液成分為PBS緩沖液中添加8g/L透明質酸、10g/L硫酸軟骨素、5g/L右旋糖苷，調整pH值為7.2，滲透壓為320mOsm。

組分2：

保護液成分為PBS緩沖液中添加5g/L透明質酸、15g/L硫酸軟骨素、3g/L右旋糖苷，調整pH值為7.2，滲透壓為320mOsm。

組分3：

保護液成分為PBS緩沖液中添加5g/L透明質酸、13g/L硫酸軟骨素、10g/L右旋糖苷，調整pH值為7.2，滲透壓為340mOsm。

組分4：

保護液成分為PBS緩沖液中添加7g/L透明質酸、15g/L硫酸軟骨素和10g/L右旋糖苷，調整pH值為7.2，滲透壓為350mOsm。

組分5：

保護液成分為HBSS緩沖液中添加6g/L透明質酸、12g/L硫酸軟骨素和10g/L右旋糖苷、3ml/L妥布霉素，調整pH值為7.2，滲透壓為350mOsm。

實施例2：使用上述的保護液來制備脫細胞角膜

1)將角膜轉入盛有含保護液的塑料袋中密封；

2)600MP高靜壓處理10分鐘；

3)將角膜取出后，置于含0.1％十二烷基硫酸鈉+1000U/ml DNA酶的保護液中，溫度為25℃，消化2小時去除角膜中的DNA成分；

4)將角膜取出后，置于保護液中漂洗2小時以上。

其中保護液選用實施例1中的組分2的保護液。

脫細胞角膜分別采用直觀觀察脫細胞角膜的透明度和柔軟度，使用微量測厚儀測量脫細胞角膜厚度。

經(jīng)試驗，使用上述保護液制備的脫細胞角膜保持與正常未脫細胞角膜相似的厚度(650±50μm VS 600±20μm)，而未使用上述保護液制備的脫細胞角膜厚度達到1000-2000μm。使用上述保護液制備的脫細胞角膜保持與正常未脫細胞角膜相似的柔軟度，用顯微鑷夾持邊緣，未見明顯彎曲，而未使用上述保護液制備的脫細胞角膜明顯變軟，明顯彎曲。此外，使用上述保護液制備的脫細胞角膜保持與正常未脫細胞角膜相似的透明度，置于打印有黑色A字紙上可見明顯字母，而未使用上述保護液制備的脫細胞角膜明顯變白，黑色A字不可見。

上述其它組分的保護液的使用效果與組分2的類似。

實施例3

本實施例的步驟如下：

1)將角膜轉入盛有含保護劑緩沖液的塑料袋中密封；

2)400MP高靜壓處理8分鐘；

3)將角膜取出后，置于含0.1％十二烷基磺酸鈉+1000U/ml核酸酶的保護液中，設定搖床速度為100轉/分鐘，溫度25℃，消化2小時去除角膜中的DNA成分；

4)將角膜取出后，置于含保護劑的液體中漂洗2小時以上。保護液選用實施例1的組分5的配方。

結果表明，本實施例方法進行角膜脫細胞處理快速，總體時間只需5-6小時，避免了長時間處理對角膜板層顯微結構的破壞；使用本方法進行角膜脫細胞處理，整個過程角膜始終處于透明狀態(tài)，未發(fā)生溶脹和變白等現(xiàn)象，避免了角膜溶脹導致的角膜板層膠原纖維結構破壞；使用本方法處理的脫細胞角膜仍保持與正常角膜相似的透明性、強度和韌性，且角膜板層膠原纖維結構未見明顯破壞；使用本方法處理的脫細胞角膜具有良好的相容性，板層移植到兔角膜后發(fā)現(xiàn)術后5-7天角膜上皮生長完好。

實施例4

申請人將上述組分2中的透明質酸或硫酸軟骨素替換為甘油，含量不變；制成的保護液使用在脫細胞角膜的制備中，結果發(fā)現(xiàn)，含甘油的保護液處理后角膜內的DNA成分未完全去除干凈，有一定的殘留；同時角膜硬度明顯增加，失去角膜原有的柔軟特性；角膜的透明度下降明顯。同樣，使用低分子右旋糖苷替換透明質酸或硫酸軟骨素制成的保護液的效果也不如本發(fā)明的保護液。