本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥，是目前對(duì)人類健康威脅最為嚴(yán)重的疾病之一。據(jù)癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，中國(guó)每年約有四百萬(wàn)新發(fā)腫瘤病例和兩百萬(wàn)癌癥死亡病例。在中國(guó)，癌癥已成為疾病死因之首，發(fā)病率和死亡率還在攀升，已成為非常重要的公共健康問(wèn)題。癌癥治療常用的方法包括手術(shù)治療、化療和放療，其中，化療是治療癌癥最具開(kāi)發(fā)潛力的手段和研究方向之一。隨著有效化療藥物的增多、治療策略上的進(jìn)展，化療在癌癥綜合治療中的地位日益提高、比重日益增大。然而，目前臨床上多數(shù)化療藥物缺少靶向性，同時(shí)還存在較大的毒副作用，對(duì)患者的身體健康造成了嚴(yán)重的影響。因此，如何將抗癌藥物靶向輸送到腫瘤部位，減少正常組織對(duì)藥物的攝取，從而降低其副作用，提高藥物的療效，是當(dāng)前化療藥物的研究重點(diǎn)和難點(diǎn)。

金屬類抗癌藥物，尤其是釕類藥物，因其具有較高的抗腫瘤活性，且不易產(chǎn)生耐藥性，受到了人們的廣泛關(guān)注。其中，氮雜環(huán)卡賓-釕(RuNHC)類配合物一方面和金屬離子之間存在較穩(wěn)定的σ鍵；另一方面，易于修飾，可以很好的調(diào)控其理化性質(zhì)，因此該類配合物在金屬抗癌藥物方面具有很大優(yōu)勢(shì)。

為此，中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104650155A公開(kāi)了一種釕配合物及其制備方法和用途。該發(fā)明所述的釕配合物相較于順鉑毒副作用小，且具有藥物吸收好、抗癌活性強(qiáng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡能力強(qiáng)、與DNA鍵合能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，在腫瘤的治療中表現(xiàn)出良好的功效。盡管上述釕類配合物抗癌活性高，但申請(qǐng)人在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，其對(duì)正常細(xì)胞的毒性也很大，對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性較差。在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織細(xì)胞也造成很大損傷。因此，必須在確保釕類藥物較高的抗腫瘤活性的同時(shí)，降低其毒副作用，才能保證其在臨床上的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有釕類配合物腫瘤靶向性差、毒副作用高的問(wèn)題，進(jìn)而提供一種腫瘤靶向性強(qiáng)、毒副作用小的負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs及其制備和應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs，包括：納米介孔硅球MSNs，負(fù)載在所述納米介孔硅球MSNs上的釕配合物RuNHC，以及包覆所述負(fù)載有釕配合物的納米介孔硅球MSNs的生物素化殼聚糖CTS-Biotin；

其中，所述釕配合物的結(jié)構(gòu)如I所示：

所述的納米顆粒RuNPs，所述生物素化殼聚糖CTS-Biotin為所述殼聚糖CTS表面與聚乙二醇PEG一端連接，所述聚乙二醇PEG另一端與生物素Biotin連接。

所述的納米顆粒RuNPs，所述納米介孔硅球MSNs的釕配合物負(fù)載量為345-370μg/mg；所述納米介孔硅球MSNs的粒徑為85-95nm，孔徑為2.5-3.0nm。

優(yōu)選的，所述納米介孔硅球MSNs的釕配合物負(fù)載量為357μg/mg；所述納米介孔硅球MSNs的粒徑為90nm，孔徑為2.7nm。

本發(fā)明提供了一種制備所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs的方法，包括以下步驟：

(1)取所述納米介孔硅球MSNs加入含所述釕配合物RuNHC的乙腈溶液中，室溫下避光攪拌至所述釕配合物RuNHC負(fù)載在納米介孔硅球MSNs上，然后離心、真空干燥，得到負(fù)載所述釕配合物RuNHC的納米介孔硅球即RuNHC@MSNs，備用；

(2)取所述殼聚糖CTS懸浮于四氫呋喃中，攪拌下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS，室溫下反應(yīng)至所述生物素Biotin連接在所述殼聚糖表面上，然后離心、真空干燥，得到所述生物素化殼聚糖即CTS-Biotin，備用；

(3)取步驟(2)制備的所述CTS-Biotin溶于醋酸溶液中，調(diào)節(jié)pH值到5.5-6.5，然后加入步驟(1)制備的所述RuNHC@MSNs，室溫下避光攪拌至所述CTS-Biotin包覆所述RuNHC@MSNs，然后離心、水洗、真空干燥，即得所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米藥物顆粒RuNPs。

所述的制備方法，包括以下步驟：

(1)取所述納米介孔硅球MSNs 50-150重量份，加入到5-15體積份的含5-15mg/mL所述釕配合物RuNHC的乙腈溶液中，室溫避光下攪拌12-36h，然后離心、真空干燥，得到負(fù)載所述釕配合物RuNHC的納米介孔硅球即RuNHC@MSNs，備用；

(2)取所述殼聚糖CTS 20-80重量份懸浮于5-15體積份的四氫呋喃中，攪拌條件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 5-15重量份，室溫反應(yīng)12-36h，然后經(jīng)離心、真空干燥得所述生物素化殼聚糖即CTS-Biotin；

(3)取步驟(2)制備的所述CTS-Biotin溶于體積濃度為5-15％的醋酸溶液中制備成所述CTS-Biotin質(zhì)量濃度為1％-3％的混合物，取上述混合物15-25體積份，調(diào)節(jié)pH值為5.8-6.2，然后加入步驟(1)制備的所述RuNHC@MSNs 50-100重量份，室溫下避光攪拌12-36h，然后離心、水洗、真空干燥，即得所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米藥物顆粒RuNPs；

所述重量份與體積份的關(guān)系為mg/mL的關(guān)系。

所述的制備方法，包括如下步驟：

(1)取所述納米介孔硅球MSNs 100重量份，加入到10體積份的含10mg/mL所述釕配合物RuNHC的乙腈溶液中，室溫避光下攪拌24h，然后離心、真空干燥，得到負(fù)載所述釕配合物RuNHC的納米介孔硅球即RuNHC@MSNs，備用；

(2)取殼聚糖CTS 50重量份懸浮于10體積份的四氫呋喃中，攪拌條件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 10重量份，室溫反應(yīng)24h，然后經(jīng)離心、真空干燥得所述生物素化殼聚糖即CTS-Biotin；

(3)取步驟(2)制備的所述CTS-Biotin溶于體積濃度為10％的醋酸溶液中制備成所述CTS-Biotin質(zhì)量濃度為2％的混合物，取上述混合物20體積份，調(diào)節(jié)pH值為6，然后加入步驟(1)制備的所述RuNHC@MSNs 70重量份，室溫下避光攪拌24h，然后離心、水洗、真空干燥，即得所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米藥物顆粒RuNPs。

所述的制備方法，還包括納米介孔硅球MSNs的制備步驟，具體包括如下步驟：取十六烷三甲基溴化銨1000-3000重量份和三乙胺0.02-0.1體積份于10-30體積份的水中90-100℃下攪拌1h，然后逐滴加入正硅酸乙酯1-2體積份，繼續(xù)攪拌0.5-1.5h，離心，將收集的固體產(chǎn)物在甲酸醇溶液中回流3-9h，離心，真空干燥，即得納米介孔硅球MSNs。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包括有效治療量的負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs，以及藥學(xué)上接受的輔料。

本發(fā)明所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs在制備抗腫瘤藥物中的用途。

所述的用途，包括所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs在制備抗肺癌、抗宮頸癌、卵巢癌、抗前列腺癌、抗乳腺癌或抗食管癌藥物中的用途。

本發(fā)明技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs，包括：納米介孔硅球MSNs，負(fù)載在所述納米介孔硅球MSNs上的釕配合物RuNHC，以及包覆所述負(fù)載有釕配合物的納米介孔硅球MSNs的生物素化殼聚糖CTS-Biotin。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)試，本發(fā)明所述納米顆粒RuNPs較現(xiàn)有技術(shù)中的RuNHC相比，實(shí)現(xiàn)了對(duì)RuNHC配合物的控釋及靶向運(yùn)輸，同時(shí)具有pH響應(yīng)性控釋性能，不僅提高了其抗腫瘤活性，還提高了對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，降低了對(duì)正常組織細(xì)胞的毒副作用。

2.本發(fā)明所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs制備方法，通過(guò)在載藥納米顆粒表面修飾生物素，介導(dǎo)了其在癌細(xì)胞中較高的攝取量，使得納米藥物具有較高的抗癌活性，較低的細(xì)胞毒性，提高了RuNHC對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs合成示意圖；

圖2為MSNs與RuNPs納米顆粒透射電鏡圖；

圖3為MSNs與RuNPs納米顆粒粒徑分布及zeta電位圖；其中，圖3(a)為MSNs的粒徑分布圖；圖3(b)為RuNPs的粒徑分布圖；圖3(c)為MSNs與RuNPs的Zeta電位圖；

圖4為RuNPs、RuNHC和MSNs的紅外光譜和紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖；其中，圖4(a)為RuNPs、RuNHC和MSNs的紅外光譜圖；圖4(b)為RuNPs、RuNHC和MSNs的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖；

圖5為不同pH值的PBS緩沖溶液中RuNPs的釋放曲線；

圖6為FITC標(biāo)記的RuNPs在HeLa細(xì)胞中的熒光成像；其中，圖6(a)為RuNPs在細(xì)胞中的攝??；圖6(b)為生物素提前處理2h后，RuNPs在細(xì)胞中的攝?。?/p>

圖7為RuNPs和RuNHC細(xì)胞攝取圖；其中，圖7(a)為RuNPs和RuNHC的細(xì)胞攝取；圖7(b)為生物素提前處理2h后，RuNPs在HeLa細(xì)胞中的攝?。?**P<0.001vs RuNHC組；

圖8為RuNPs和RuNHC抗腫瘤活性示意圖；圖8(a)為RuNPs和RuNHC對(duì)癌細(xì)胞及正常細(xì)胞的毒性；圖8(b)為RuNPs靶向作用機(jī)理示意圖；圖8(c)為RuNPs對(duì)A549細(xì)胞處理48h后的細(xì)胞形態(tài)圖；圖8(d)為RuNPs對(duì)HeLa細(xì)胞處理48h后的細(xì)胞形態(tài)；***P<0.001vs RuNHC組。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。此外，下面所描述的本發(fā)明不同實(shí)施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互結(jié)合。

下述實(shí)施例中涉及到的試劑均為市售產(chǎn)品，不同廠家及型號(hào)的試劑對(duì)于結(jié)果并不會(huì)帶來(lái)明顯的差別，如生物素、殼聚糖CTS、異硫氰酸熒光素FITC均購(gòu)自阿拉?。会懪浜衔颮uNHC為按照中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104650155A中的方法制備。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供一種負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs合成方法，如圖1所示，包括如下步驟：

S1、納米介孔硅球MSNs的制備：取十六烷三甲基溴化銨2.0g和三乙胺50μL于20mL的水中95℃下回流反應(yīng)1h，然后逐滴加入正硅酸乙酯1.5mL，繼續(xù)回流反應(yīng)1h，抽濾，水洗，將得到的固體產(chǎn)物在甲酸醇溶液中回流6h，離心，真空干燥，即得納米介孔硅球MSNs。

S2、取步驟S1所述納米介孔硅球MSNs 100mg加入到10mL的含10mg/mL所述釕配合物RuNHC的乙腈溶液中，室溫避光下攪拌24h，然后離心、真空干燥，得到負(fù)載所述釕配合物RuNHC的納米介孔硅球，即RuNHC@MSNs，備用；

S3、取所述殼聚糖CTS 50mg懸浮于10mL的四氫呋喃中，攪拌條件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 10mg，室溫反應(yīng)24h，然后經(jīng)離心、真空干燥得所述生物素化殼聚糖即CTS-Biotin，備用；

S4、取步驟S3所述的CTS-Biotin溶于體積濃度為10％的醋酸溶液中制備成所述CTS-Biotin質(zhì)量濃度為2％的混合物，取上述混合物20mL，用1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6，然后加入步驟S2制備的所述RuNHC@MSNs 70mg，室溫下避光攪拌24h，然后離心，水洗3次，隨后真空干燥，即得所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米藥物顆粒RuNPs。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供一種負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs合成方法，如圖1所述，包括如下步驟：

S1、納米介孔硅球MSNs的制備：取十六烷三甲基溴化銨1.0g和三乙胺20μL于10mL的水中90℃下回流反應(yīng)1.5h，然后逐滴加入正硅酸乙酯1.0mL，繼續(xù)回流反應(yīng)0.5h，抽濾，水洗1次，將收集的固體產(chǎn)物在甲酸醇溶液中回流3h，離心，真空干燥，即得納米介孔硅球MSNs。

S2、取步驟S1所述納米介孔硅球MSNs 150mg加入到15mL的含15mg/mL所述釕配合物RuNHC的乙腈溶液中，室溫避光下攪拌36h，然后離心、真空干燥，得到負(fù)載所述釕配合物RuNHC的納米介孔硅球，即RuNHC@MSNs，備用；

S3、取所述殼聚糖CTS 80mg懸浮于15mL的四氫呋喃中，攪拌條件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 15mg，室溫反應(yīng)36h，然后經(jīng)離心、真空干燥得所述生物素化殼聚糖即CTS-Biotin，備用；

S4、取步驟S3所述的CTS-Biotin溶于體積濃度為15％的醋酸溶液中制備成所述CTS-Biotin質(zhì)量濃度為3％的混合物，取上述混合物25mL，用1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.2，然后加入步驟S2制備的所述RuNHC@MSNs 50mg，室溫下避光攪拌12h，然后離心、水洗、真空干燥，即得所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米藥物顆粒RuNPs。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供一種負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs合成方法，如圖1所述，包括如下步驟：

S1、納米介孔硅球MSNs的制備：取十六烷三甲基溴化銨3.0g和三乙胺100μL于30mL的水中100℃下下回流反應(yīng)1h，然后逐滴加入正硅酸乙酯2.0mL，回流反應(yīng)1.5h，抽濾，水洗2次，將得到的固體產(chǎn)物在甲酸醇溶液中回流9h，離心，真空干燥，即得納米介孔硅球MSNs。

S2、取步驟S1所述納米介孔硅球MSNs 50mg加入到5mL的含5mg/mL所述釕配合物RuNHC的乙腈溶液中，室溫避光下攪拌12h，然后離心、真空干燥，得到負(fù)載所述釕配合物RuNHC的納米介孔硅球，即RuNHC@MSNs，備用；

S3、取所述殼聚糖CTS 20mg懸浮于5mL的四氫呋喃中，攪拌條件下加入Biotin-PEG₂₀₀₀-NHS 5mg，室溫反應(yīng)12h，然后經(jīng)離心、真空干燥得所述生物素化殼聚糖即CTS-Biotin，備用；

S4、取步驟S3所述的CTS-Biotin溶于體積濃度為5％的醋酸溶液中制備成所述CTS-Biotin質(zhì)量濃度為1％的混合物，取上述混合物15mL，用1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為5.8，然后加入步驟S2制備的所述RuNHC@MSNs 100mg，室溫下避光攪拌36h，然后離心、水洗、真空干燥，即得所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米藥物顆粒RuNPs。

實(shí)驗(yàn)例

為驗(yàn)證本發(fā)明所述的負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs的效果，采用實(shí)施例1中合成的MSNs和RuNPs以及按照中國(guó)專利文獻(xiàn)CN104650155A中的方法制備的釕配合物RuNHC進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：

測(cè)試?yán)?RuNPs的粒徑分布及Zeta電位

通過(guò)透射電鏡(TEM)、Zeta電位及粒徑分析MSNs和RuNPs納米粒子粒徑分布及Zeta電位(粒徑分布及Zeta電位的測(cè)定參見(jiàn)ACS Appl.Mater.Interfaces 2015,7,9078-9087，馬爾文公司NanoSight NS300)，結(jié)果如圖2和圖3所示。

從圖2結(jié)果可知，MSNs納米顆粒呈現(xiàn)較高的單分散性，顆粒粒徑集中分布于85nm，與圖3(a)所示粒徑分析結(jié)果相同。同時(shí)，圖2與圖3(b)所示的RuNPs粒徑分布約為90nm，表明介孔納米硅球載藥前后，納米粒子的粒徑變化不大。

Zeta電位分析表明，如圖3(c)，納米介孔硅球負(fù)載釕配合物即RuNHC@MSNs的電位為-8.2mV，而修飾生物素化殼聚糖CTS-Biotin后，RuNPs的Zeta電位為12.0mV。Zeta電位的變化，是因?yàn)樾揎椛锼鼗瘹ぞ厶荂TS-Biotin后，殼聚糖表面含有大量未反應(yīng)的氨基，使得納米粒子呈正電性。

測(cè)試?yán)?RuNPs、RuNHC和MSNs的紅外和紫外-可見(jiàn)吸收光譜

通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法(UV-vis)和紅外光譜(FT-IR)表征(紅外和紫外-可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定參見(jiàn)Dalton Trans.,2015,44,7324–7331，TENSOR27,Bruker)，結(jié)果如圖4所示。

與MSNs紅外光譜相比，RuNPs紅外光譜中1667cm^-1處的峰可歸屬為CTS-Biotin中的C＝O振動(dòng)峰，如圖4(a)。2966cm^-1，1560cm^-1和1480cm^-1歸屬為RuNHC中苯環(huán)的C-H及C＝C振動(dòng)峰，表明納米藥物合成成功。同時(shí)，RuNPs的紫外吸收光譜中220nm處的RuNHC的吸收峰，也說(shuō)明納米藥物合成成功，如圖4(b)。

測(cè)試?yán)?RuNPs對(duì)腫瘤微環(huán)境的響應(yīng)

大量研究表明，腫瘤部位呈現(xiàn)酸性環(huán)境，因此測(cè)試了在不同pH條件下負(fù)載釕配合物介孔硅納米顆粒RuNPs的釋放情況。

取5mg RuNPs懸浮于pH值分別為7.4、6.0、5.5、5.0和4.0的20mL PBS緩沖液中，37℃下避光攪拌。分別在0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h的時(shí)間點(diǎn)，取0.5mL上清液，用UV-vis檢測(cè)配合物釋放量(測(cè)定方法參見(jiàn)Dalton Trans.,2015,44,7324–7331，PE/Lambda 25)。

如圖5所示，酸性條件下(pH＝5.0)，RuNPs的藥物釋放速度較快，12h后，藥物釋放量為28.55％；120h后，最終的藥物釋放量約為59.71％。但是，中性條件下(pH＝7.4)，僅有8.57％的RuNHC從RuNPs納米藥物顆粒中釋放。這是由于RuNPs納米顆粒外層包裹了CTS導(dǎo)致的。中性條件下，CTS比較穩(wěn)定，可以有效的封堵介孔硅的孔道，防止藥物釋放；而酸性條件下，CTS表面的氨基被質(zhì)子化，使得分子間氫鍵減弱，進(jìn)而導(dǎo)致CTS分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變，不能有效的封堵孔道，藥物釋放量明顯增加。因此，RuNPs納米顆粒可以通過(guò)調(diào)節(jié)pH值控制藥物的釋放。所有的結(jié)果表明，RuNPs可以在酸性條件下控釋RuNHC，由于腫瘤部位微環(huán)境為酸性條件，因此，RuNPs可以控制藥物在腫瘤部位釋放。同時(shí)，RuNPs還可以緩釋藥物，使其具有較長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，從而有更高的活性。

測(cè)試?yán)?FITC標(biāo)記的RuNPs在HeLa細(xì)胞中的熒光成像

為了定性的說(shuō)明RuNPs在細(xì)胞中的攝取，我們利用FITC標(biāo)記納米藥物RuNPs，通過(guò)其在HeLa(宮頸癌)細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供)中的熒光成像，直觀的觀察藥物在細(xì)胞中的攝取。具體過(guò)程如下：

取實(shí)施例3中步驟S3所述的CTS-Biotin溶于體積濃度為5％的醋酸溶液中取上述混合物15mL，用1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為7.4，使得CTS-Biotin的最終濃度為2mg/mL，然后加入0.75mL 1mg/mL FITC(異硫氰酸熒光素)的DMSO溶液，避光室溫下，反應(yīng)4h，然后加入步驟S2制備的所述RuNHC@MSNs 100mg，室溫下避光攪拌36h，然后離心、水洗、真空干燥，即得所述的FITC標(biāo)記的納米藥物顆粒RuNPs，F(xiàn)ITC標(biāo)記率為34.94μg/mg。

將HeLa細(xì)胞接種于5cm玻璃底的培養(yǎng)皿中，接種數(shù)目為10⁵個(gè)細(xì)胞，加入1mL培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基+10％的胎牛血清，)，孵化24h。然后用上述FITC標(biāo)記的RuNPs處理4h，F(xiàn)ITC最終濃度為50ng/mL。棄掉上清液，PBS洗滌三次后，用Hoechst 33258染液染色15min，以突出顯示細(xì)胞核。棄掉上清，PBS洗滌三次后，熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)觀察藥物攝取情況。

生物素抑制實(shí)驗(yàn)，同上述實(shí)驗(yàn)步驟，不同之處在于，在上述FITC標(biāo)記的RuNPs處理前，先用生物素處理2h。

如圖6所示，其中第一列圖片為白光下的細(xì)胞形態(tài)；Hoechst列為Hoechst染色細(xì)胞后的熒光，以便于定位細(xì)胞核；FITC列為細(xì)胞攝取標(biāo)記藥物后，F(xiàn)ITC在細(xì)胞內(nèi)的熒光；Merge列為三張圖片疊加；圖中箭頭表示攝取標(biāo)記RuNPs的細(xì)胞。由圖中比較可知，F(xiàn)ITC標(biāo)記的RuNPs處理4h后，細(xì)胞中FITC熒光較為明顯，這表明藥物已經(jīng)進(jìn)入了細(xì)胞；而提前加入生物素抑制后，細(xì)胞中的FITC熒光明顯減弱，這表明生物素可以明顯的抑制RuNPs在癌細(xì)胞中的攝取。

測(cè)試?yán)?RuNPs和RuNHC的細(xì)胞攝取以及生物素抑制實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞攝取量是影響藥物活性的重要因素之一，為了說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)，測(cè)試RuNPs和RuNHC在A549(肺癌細(xì)胞)，HeLa(宮頸癌細(xì)胞)，L02(正常細(xì)胞)中的攝取，其中A549(肺癌細(xì)胞)，HeLa(宮頸癌細(xì)胞)，L02(正常細(xì)胞)，上述細(xì)胞均由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。藥物攝取量通過(guò)ICP-MS測(cè)定Ru含量來(lái)表示，具體過(guò)程如下：

將A549，HeLa和L02細(xì)胞接種于10cm的培養(yǎng)皿中，接種數(shù)目為10⁶個(gè)細(xì)胞，加入10mL培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基+10％的胎牛血清，)，孵化24h。然后分別用RuNHC和RuNPs處理4h，藥物最終濃度為10μM。收集細(xì)胞，180℃下王水處理2h，離心，取上清液。ICP-MS測(cè)定溶液中Ru的含量，(測(cè)定方法參見(jiàn)Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,12532–12536，安捷倫7700x)。

生物素抑制實(shí)驗(yàn)，同上述攝取實(shí)驗(yàn)步驟，不同之處在于，在藥物處理前，先用生物素處理2h。

結(jié)果如圖7(a)所示，4h后，RuNPs在A549及HeLa中的攝取量分別為0.16μg/10⁶和0.17μg/10⁶細(xì)胞，而在L02細(xì)胞中的攝取量為0.019μg/10⁶細(xì)胞。RuNHC在兩種癌細(xì)胞中的攝取量分別為0.044μg/10⁶和0.035μg/10⁶細(xì)胞，約納米顆粒的1/3；而在正常細(xì)胞L02中，RuNHC的攝取量為0.038μg/10⁶細(xì)胞，約為納米顆粒的兩倍。這表明，納米藥物RuNPs在癌細(xì)胞中有相對(duì)較高的攝取量，而在正常細(xì)胞中攝取量較低，即增加了對(duì)癌細(xì)胞的選擇性。為了證明RuNPs的靶向性，我們開(kāi)展了生物素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。如圖7(b)所示，生物素明顯的抑制了RuNPs在癌細(xì)胞中的攝取。這說(shuō)明，RuNPs對(duì)癌細(xì)胞的高選擇性是由生物素介導(dǎo)的。

測(cè)試?yán)?RuNPs和RuNHC的抗腫瘤活性

RuNPs和RuNHC的抗腫瘤活性測(cè)試采用MTT法進(jìn)行試驗(yàn)(MTT法參見(jiàn)Dalton Trans.,2015,44,7324–7331，多功能酶標(biāo)儀-PerkinElmer)。

結(jié)果表明(圖8(a))，與RuNHC相比，RuNPs對(duì)癌細(xì)胞具有較高的活性，兩者對(duì)A549細(xì)胞的IC₅₀值分別為6.88±0.49μM和2.08±0.19μM；對(duì)HeLa細(xì)胞的IC₅₀值分別為9.72±1.21μM和1.88±0.19μM。RuNPs對(duì)正常細(xì)胞的毒性較RuNHC明顯降低，IC₅₀值分別為19.35±0.96μM和7.60±0.53μM。這表明，RuNPs對(duì)癌細(xì)胞具有較高的抗癌活性，對(duì)正常細(xì)胞具有較低的細(xì)胞毒性。

根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，盡管RuNHC具有較高的抗癌活性，但它就像一個(gè)缺少靶標(biāo)的炸彈，殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也殺死了正常細(xì)胞(圖8(b))。而RuNPs一方面可以控制藥物在腫瘤部位釋放；另一方面，其在腫瘤細(xì)胞中具有較高的攝取量，其就像靶標(biāo)明確的導(dǎo)彈，僅對(duì)癌細(xì)胞有殺傷作用。所有結(jié)果表明，RuNPs提高了RuNHC的抗癌活性及對(duì)癌細(xì)胞的選擇性。圖8(c)為RuNPs對(duì)A549細(xì)胞處理48h后的細(xì)胞形態(tài)圖；圖8(d)為RuNPs對(duì)HeLa細(xì)胞處理48h后的細(xì)胞形態(tài)圖。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。