本發(fā)明屬于抗病毒應(yīng)用領(lǐng)域，涉及抗豬流行性腹瀉病毒藥物甘草素的應(yīng)用。

二、

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種以水樣腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的豬傳染性疾病。該病常在冬季爆發(fā)大流行，各年齡段的豬都可感染PEDV，但哺乳期的仔豬最易感，發(fā)病率高達(dá)100％，死亡率為80％-100％。在臨床上其與豬傳染性胃腸炎，豬輪狀病毒腹瀉共存混合感染。雖然PED首次在歐洲發(fā)生，但是目前已經(jīng)成為包括中國(guó)，日本，韓國(guó)，泰國(guó)以及菲律賓等亞洲國(guó)家養(yǎng)豬業(yè)中嚴(yán)重的傳染性疾病，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然有一定的措施可防止PED的流行，但效果不理想。自從2013年，PED分別在美國(guó)、德國(guó)、葡萄牙等出現(xiàn)大流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。最近幾年中國(guó)各地也出現(xiàn)不同程度的流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV是一種有囊膜的正股單鏈RNA病毒，屬于尼多病毒目(idovirales)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)?，F(xiàn)有的冠狀病毒約有15種，分三個(gè)亞型，PEDV、TGEV和PRCoV等屬于亞型I，MHV、HEV和SARS-CoV等屬于亞型II，而IBV、PhCoV和TCoV屬于亞型III。

PEDV病毒粒子外包裹著囊膜，具有多種形態(tài)，其中多為球形。病毒粒子的直徑為95-190nm(平均130nm)。PEDV表面有纖突，呈花瓣?duì)?，由核心向四周呈放射狀分布，長(zhǎng)約18-23nm。PEDV病毒粒子對(duì)熱不是很敏感，在4℃pH 5.0-9.0和37℃pH 6.5-7.5之間均能穩(wěn)定存在，但病毒粒子在60℃條件下30min就能失去感染能力。此外，PEDV對(duì)脂溶性液體敏感。PEDV不具備血凝活性。

PEDV是不分節(jié)段的具有感染性的RNA病毒，其基因組大小不一，全長(zhǎng)約為27-33kb，包含5′帽子結(jié)構(gòu)和3′poly A尾。目前已測(cè)定了PEDV-CV777、PEDV-DR13 PEDV-CH/FJND-3/2011、PEDV-CH/S等的全基因組序列。PEDV全基因組包括至少7個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(復(fù)制酶1a和1b，及ORF3)和4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白(S，150-220kDa)，小包膜糖蛋白(E，7kDa)，糖基化膜蛋白(M，20-30kDa)，核衣殼蛋白(N，58kDa)；5’-非翻譯區(qū)(UTR)和3′-非翻譯區(qū)(UTR)。研究發(fā)現(xiàn)，病毒通過(guò)蛋白受體氨基肽酶N和N-乙酰神經(jīng)氨酸入侵細(xì)胞。值得注意的是，這些受體也存在于人、猴和蝙蝠等物種。因而，PEDV存在跨物種感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究抗PEDV的藥物有重要作用。

甘草素(GLYcyrrhizin，GLY)是傳統(tǒng)中藥甘草提取物的主要成分，主要由甘草次酸組成。甘草素是甘草中研究最多的具有生物活性的化合物。甘草素是個(gè)糖基化的皂苷，包括一個(gè)結(jié)構(gòu)類(lèi)似于氫化可的松的甘草次酸和兩個(gè)分子的葡糖醛酸。甘草素具有抗炎癥的性質(zhì)，可以用來(lái)治療肝炎。數(shù)千年以來(lái)，甘草素被廣泛的用作天然的甜味劑和佐料。甘草素具有多個(gè)有益的藥理作用，包括祛痰、抗炎、抗?jié)儭⒖惯^(guò)敏、抗氧化、抗病毒活性和抗腫瘤活性。但是甘草素如何產(chǎn)生這些效應(yīng)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。先前有許報(bào)道稱(chēng)甘草素有抑制多種病毒感染的效應(yīng)，這些病毒包括人巨細(xì)胞病毒、流感病毒、嚴(yán)重呼吸綜合征病毒(SARS)、單純皰疹病毒1(HSV-1)、甲型肝炎和乙型肝炎病毒。然而甘草素抑制PEDV的感染沒(méi)有報(bào)道過(guò)。因此我們驗(yàn)證甘草素在抑制豬流行性腹瀉病毒感染宿主細(xì)胞而發(fā)揮抗病毒作用的效果。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)豬流行性腹瀉病毒流行的問(wèn)題，提供一種具有抗豬流行性腹瀉病毒感染藥物的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明所述的抗病毒藥物在抗豬流行性腹瀉病毒感染的效果及應(yīng)用。

有益效果：

本發(fā)明采用藥物甘草素進(jìn)行抗豬流行性腹瀉病毒感染的研究，該藥物作為潛在的抗病毒藥物與傳統(tǒng)的抗病毒化學(xué)藥物相比有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

A安全、副作用少：甘草素作為中成藥，主要成分是皂苷類(lèi)，不同于激素、抗生素、化學(xué)合成藥等，對(duì)機(jī)體生理功能無(wú)明顯損傷等毒副作用。

B藥物殘留低、無(wú)污染：該藥物容易被動(dòng)物機(jī)體所代謝和吸收，動(dòng)物排泄物對(duì)壞境無(wú)污染。

C抗病毒作用明顯：該藥物具有抗炎、抗氧化等活性，同時(shí)能激發(fā)機(jī)體抗感染的免疫功能。該藥物具有較好的抗病毒活性，在0.4mM濃度下，其在Vero細(xì)胞上具有半數(shù)抵抗豬流行性腹瀉病毒(MOI＝0.1)感染的作用。

D具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值：此抗病毒藥物具備較好的潛在抗豬流行性腹瀉病毒感染的活性，因此為該病毒引起疾病的治療和防制提供可靠的依據(jù)。

四、附圖說(shuō)明

圖1甘草素在Vero細(xì)胞上細(xì)胞毒性的測(cè)定結(jié)果。

圖2 Western blot測(cè)定甘草素在Vero細(xì)胞上抑制豬流行性腹瀉病毒感染的活性。

0.1mM-0.8mM甘草素預(yù)處理Vero細(xì)胞2h后，感染豬流行性腹瀉病毒且甘草素一直存在，24h后收取細(xì)胞進(jìn)行Western blot。

圖3熒光定量PCR測(cè)定甘草素在Vero細(xì)胞上抑制豬流行性腹瀉病毒感染的活性。

0.2mM與0.8mM甘草素預(yù)處理Vero細(xì)胞2h后，感染豬流行性腹瀉病毒且甘草素一直存在，24小時(shí)后收取細(xì)胞樣品，并提取RNA，進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定。

圖4噬斑形成試驗(yàn)測(cè)定甘草素在Vero細(xì)胞上抑制豬流行性腹瀉病毒感染的活性。

0.2mM與0.8mM甘草素預(yù)處理Vero細(xì)胞2h后，感染豬流行性腹瀉病毒(MOI＝0.1)且甘草素一直存在，24h后取上清用噬斑形成試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度。

圖5 Western blot測(cè)定甘草素對(duì)豬流行性腹瀉病毒入胞的影響

用0.1mM-0.8mM甘草素預(yù)處理細(xì)胞2h后，感染豬流行性腹瀉病毒1h且有甘草素存在，然后收取細(xì)胞進(jìn)行Western blot。

圖6 Western blot測(cè)定甘草素對(duì)豬流行性腹瀉病毒復(fù)制的影響

豬流行性腹瀉病毒感染Vero細(xì)胞1h后，加入0.4mM甘草素處理細(xì)胞。感染4h、8h、12h收樣，通過(guò)Western blot檢測(cè)病毒蛋白的變化。

圖7 Western blot測(cè)定甘草素對(duì)豬流行性腹瀉病毒組裝和釋放的影響。

豬流行性腹瀉病毒感染Vero細(xì)胞1h后，加入0.2mM和0.8mM的甘草素處理細(xì)胞。感染24h后收取上清與細(xì)胞，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)上清與細(xì)胞中病毒RNA的比值，進(jìn)行噬斑形成試驗(yàn)檢測(cè)上清與細(xì)胞中病毒滴度的比值。

五、具體實(shí)施方式

試驗(yàn)材料

豬流行性腹瀉病毒HLJBY毒株為任曉峰實(shí)驗(yàn)室分離，由本人完成測(cè)序。Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)購(gòu)自上海然泰生物科技有限公司。CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒購(gòu)自promega公司，其他所用化學(xué)試劑、實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR)引物及試劑盒均購(gòu)自Takara公司。甘草素(Glycyrrhizin)購(gòu)于sigma公司。

實(shí)施例1甘草素在Vero細(xì)胞上細(xì)胞毒性的測(cè)定結(jié)果

Vero細(xì)胞記數(shù)后用含10％胎牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)?shù)拿芏?，?×10³/孔的濃度滴加到96孔板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁成單層(約17-18h)后，用DMEM營(yíng)養(yǎng)液對(duì)甘草素進(jìn)行稀釋?zhuān)?.1mM、0.2mM、0.4mM和0.8mM，每個(gè)濃度做六個(gè)重復(fù)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上將稀釋的甘草素樣品以100μl/孔處理Vero細(xì)胞24h后，分別取50μl上清，離心5min(250×g)，然后轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板孔中，然后用CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒(promega公司)進(jìn)行檢測(cè)，在OD490nm，讀取數(shù)據(jù)(圖1)，由圖1可見(jiàn)經(jīng)不同濃度甘草素處理的細(xì)胞釋放到上清中的LDH(乳酸脫氫酶)的量與未經(jīng)甘草素處理的細(xì)胞釋放到上清中的量相比，兩者沒(méi)有明顯的差別，說(shuō)明該濃度甘草素在Vero細(xì)胞上不具有明顯的細(xì)胞毒性，因此甘草素對(duì)Vero細(xì)胞的最大無(wú)毒性濃度為0.8mM。

實(shí)施例2甘草素在Vero細(xì)胞上抑制豬流行性腹瀉病毒感染的活性(Western blot和熒光定量PCR，噬斑形成試驗(yàn))

(1)Western blot測(cè)定甘草素在Vero細(xì)胞上抑制豬流行性腹瀉病毒感染的活性

Vero細(xì)胞記數(shù)后用含10％小牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)?shù)拿芏?，?×10⁵/孔的濃度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁成單層(約17-18h)。甘草素用無(wú)血清DMEM稀釋到特定濃度后：0.1mM-0.8mM，預(yù)先與Vero細(xì)胞37℃孵育2h后，接豬流行性腹瀉病毒HLJBY毒株(MOI＝0.1)于Vero細(xì)胞，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱孵育1小時(shí)并有甘草素存在，用PBS洗三遍，加2％小牛血清的DMEM維持夜2ml并有甘草素存在，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞樣品，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示甘草素能夠顯著抑制豬流行性腹瀉病毒的感染，并且具有明顯的計(jì)量依賴(lài)性(圖2)

(2)熒光定量測(cè)定甘草素在Vero細(xì)胞上抑制豬流行性腹瀉病毒感染的活性

Vero細(xì)胞記數(shù)后用含10％小牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)?shù)拿芏?，?×10⁵/孔的濃度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁成單層(約17-18h)。甘草素用無(wú)血清DMEM稀釋到特定濃度后：0.2mM和0.8mM，預(yù)先與Vero細(xì)胞37℃孵育2h后，接豬流行性腹瀉病毒HLJBY毒株(MOI＝0.1)于Vero細(xì)胞，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱孵育1h并有甘草素存在，用PBS洗三遍，加2％小牛血清的DMEM維持夜2ml并有甘草素存在，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，用Trizon收集細(xì)胞樣品，提取RNA。溶于20μl超純水中，反轉(zhuǎn)成cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。在ABI公司7300型全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增并檢測(cè)熒光。同時(shí)采用GAPDH基因作為內(nèi)參。所用的PCR引物：

GAPDH-F：5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTT-3′；

GAPDH-R：5′-TAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3′；

PEDV-ORF3-F：5′-TTTGCACTGTTTAAAGCGTCT-3′；

PEDV-ORF3-R：5′-AGTAAAAGCAGACTAAACAAAGCCT-3′；

25μl PCR反應(yīng)體系中含2×PCR MasterMix 12.5μl，10pmol/l的上、下游引物各1μl，cDNA 2μl，2.5mM dNTP 2μl，TaqDNA聚合酶0.25μl，超純水6.25μl。擴(kuò)增參數(shù)為：95℃ 30s、95℃10s、72℃31s共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線的測(cè)定，反應(yīng)條件為：95℃15s、60℃1min、95℃15s、60℃15s。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)ABI PRISM7300SDS software(Applied Biosystems)軟件分析數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中采用2^-ΔΔCt法進(jìn)行PEDV ORF3基因的相對(duì)定量。結(jié)果顯示甘草素在Vero細(xì)胞能產(chǎn)生明顯抑制PEDV感染，并且具有明顯的計(jì)量依賴(lài)性(圖3)。

(3)噬斑形成試驗(yàn)測(cè)定甘草素在Vero細(xì)胞上抑制豬流行性腹瀉病毒感染的活性

Vero細(xì)胞記數(shù)后用含10％小牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)?shù)拿芏龋?×10⁵/孔的濃度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁成單層(約17-18h)。甘草素用無(wú)血清DMEM稀釋到特定濃度后：0.2mM和0.8mM，預(yù)先與Vero細(xì)胞37℃孵育2h后，接豬流行性腹瀉病毒HLJBY毒株(MOI＝0.1)于Vero細(xì)胞，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱孵育1h并有甘草素存在，用PBS洗三遍，加2％小牛血清的DMEM維持夜2ml并有甘草素存在，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取上清，進(jìn)行10倍比稀釋后，接種到鋪有單層Vero細(xì)胞的6孔板中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱孵育1h，用PBS洗三遍，加入含有4％小牛血清的2×DMEM與2.5％低熔點(diǎn)瓊脂糖的1∶1混合液2ml，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)噬斑，然后用1％的結(jié)晶紫染色。結(jié)果顯示甘草素能明顯抑制豬流行性腹瀉病毒的感染，并且具有明顯的計(jì)量依賴(lài)性(圖4)。

實(shí)施例3甘草素對(duì)豬流行性腹瀉病毒感染過(guò)程的影響(Western blot，熒光定量PCR和噬斑形成試驗(yàn))

(1)甘草素對(duì)豬流行性腹瀉病毒入胞和復(fù)制的影響(Western blot)

Vero細(xì)胞記數(shù)后用含10％小牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)?shù)拿芏?，?×10⁵/孔的濃度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁成單層(約17-18h)。甘草素用無(wú)血清DMEM稀釋到特定濃度后：0.1mM-0.8mM，預(yù)先與Vero細(xì)胞37℃孵育2h后，接豬流行性腹瀉病毒HLJBY毒株(MOI＝0.1)于Vero細(xì)胞，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱孵育1h并有甘草素存在，用PBS洗三遍，加2％小牛血清的DMEM維持夜2ml，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)后，收取細(xì)胞樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示甘草素抑制豬流行性腹瀉病毒的入胞(圖5)。豬流行性腹瀉病毒感染Vero細(xì)胞1h后，加入0.4mM的甘草素處理，分別在感染后4h、8h、12h后收樣進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示甘草素抑制PEDV的復(fù)制(圖6)。

(2)甘草素對(duì)豬流行性腹瀉病毒組裝和釋放的影響(熒光定量PCR和噬斑形成試驗(yàn))

Vero細(xì)胞記數(shù)后用含10％小牛血清的DMEM營(yíng)養(yǎng)液稀釋到適當(dāng)?shù)拿芏?，?×10⁵/孔的濃度滴加到6孔板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁成單層(約17-18h)。接種豬流行性腹瀉病毒(MOI＝0.1)1小時(shí)。甘草素用無(wú)血清DMEM稀釋到特定濃度后：0.2mM和0.8mM，與感染病毒的Vero細(xì)胞孵育，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，收取上清寺和細(xì)胞，進(jìn)行熒光定量PCR和噬斑形成試驗(yàn)。熒光定量PCR結(jié)果顯示甘草素不影響豬流行性腹瀉病毒的組裝(圖7A)，噬斑形成試驗(yàn)結(jié)果顯示甘草素不影響豬流行性腹瀉病毒的釋放(圖7B)。