本發(fā)明涉及一種組合物，特別涉及一種治療肝損傷的復(fù)方葛花組合物，以及該組合物的制備方法和用途。該組合物由葛花、密蒙花和菊花有效成分提取物組成，屬于中藥有效成分提取物領(lǐng)域。本復(fù)方制劑在治療肝損傷上有很好的療效。
背景技術(shù)：
肝臟是人體的重要器官，其主要負責(zé)機體代謝、解毒和膽汁生成等生理活動。肝損傷是多種肝臟疾病共有的一種病理狀態(tài)，其損傷機制主要為氧化應(yīng)激、細胞凋亡、細胞因子過表達、微循環(huán)障礙和非特異性炎癥細胞肝內(nèi)聚集等。肝損傷患者約占世界人口總數(shù)10％，損傷類型主要包括機械性肝損傷、藥物性肝損傷和酒精性肝損傷，其嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量并危害生命健康。因此，對肝損傷的預(yù)防與治療成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)的重要研究領(lǐng)域。目前，用于治療肝損傷的藥物主要為西藥，如：肝泰樂、肌苷片等，但其在使用過程中存在毒副作用大和治療靶點單一等劣勢。中藥復(fù)方治療肝損傷多是根據(jù)辯證論治佐以組方遣藥，其合理的組方在治療肝損傷方面效果顯著。復(fù)方提取液具有成分多樣，治療靶點分散且毒副作用低的特點。本復(fù)方組合物以中醫(yī)理論與現(xiàn)代藥理學(xué)研究成果為指導(dǎo)，結(jié)合臨床實踐，以葛花與密蒙花和菊花相互配伍，發(fā)揮協(xié)同作用提高肝損傷的治療效果，藥理學(xué)研究顯示配伍后抗肝損傷作用優(yōu)于單味藥物。本發(fā)明所涉及的復(fù)方葛花組合物包括葛花、密蒙花和菊花三味藥的有效成分提取物，三者配伍用于肝損傷的治療目前還未見報道。
葛花，豆科植物葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥花。味甘、性平，功效護肝解毒、解酒醒脾。
密蒙花，馬錢科植物密蒙花Buddleja officinalis Maxim.的干燥花蕾及花序。味甘、性寒，功效清熱養(yǎng)肝、明目退翳。
菊花，菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序。味苦甘、性寒，功效平肝明目、清熱解毒。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種治療肝損傷的復(fù)方葛花組合物。該組合物由葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物以及藥學(xué)上可接受的輔料組成。該組合物中葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物的重量配比為2∶(2～0.5)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，上述重量配比優(yōu)選為2∶(0.5～1)，更優(yōu)選為2∶1。
密蒙花、菊花有效成分混合提取物由密蒙花和菊花按1∶1等重量混合提取。
藥學(xué)上可接受的輔料為淀粉、環(huán)糊精、微晶纖維素和/或水。
本發(fā)明還提供了上述復(fù)方葛花組合物的制備方法，包括以下步驟：
將葛花粉碎成粉末狀，采用水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，將藥渣用10～12倍量體積濃度95％乙醇溶液加熱回流提取3次，每次2小時，合并濾液，回收乙醇溶液得到乙醇溶液提取物。乙醇溶液提取物用水溶解后，經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附，分別用水、體積濃度50％乙醇溶液、體積濃度95％乙醇溶液洗脫，收集體積濃度50％乙醇溶液洗脫液，濃縮、干燥后與揮發(fā)油部分混合均勻，即得葛花有效成分提取物。
將密蒙花和菊花等重量混合后粉碎成粉末狀，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，將藥渣用8～10倍量體積濃度75％乙醇溶液加熱回流提取3次，每次3小時，合并濾液，回收乙醇溶液得到乙醇溶液提取物。乙醇溶液提取物用水溶解后，經(jīng)D-101大孔樹脂吸附，分別用水、體積濃度20％乙醇溶液、體積濃度50％乙醇溶液、體積濃度95％乙醇溶液洗脫，收集體積濃度20％和體積濃度50％乙醇溶液的洗脫液，濃縮、干燥后與揮發(fā)油部分混合均勻，即得密蒙花、菊花有效成分混合提取物。
將葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物按2∶(2～0.5)的重量配比組合即得到治療肝損傷的復(fù)方葛花組合物，其中，上述重量配比優(yōu)選為2∶(0.5～1)，更優(yōu)選為2∶1。
本發(fā)明復(fù)方葛花組合物在制備治療肝損傷藥物中的應(yīng)用，加入藥學(xué)上可接受的輔料可進一步制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、丸劑、口服液等口服制劑。
本發(fā)明的有益效果為：葛花具有護肝解毒作用，以此為君藥，配伍具有養(yǎng)肝清熱作用的密蒙花和具有平肝清熱作用的菊花，發(fā)揮協(xié)同作用，增強保肝、護肝的功效，配伍合用較之單味藥物的作用更佳，可以發(fā)揮中醫(yī)藥的配伍優(yōu)勢，綜合改善肝損傷的各種癥狀。本發(fā)明是發(fā)掘祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫，在肝損傷治療基礎(chǔ)上，選用純中藥按照中醫(yī)基礎(chǔ)理論組方，經(jīng)嚴(yán)格篩選，結(jié)合現(xiàn)代先進工藝制法組合而成。該組合物可達到治療肝損傷的藥效，具有療效顯著、毒副作用小和操作簡便等特點。
具體實施方式
一、組合物制劑制備方法最佳實施例
1.制備方法優(yōu)選實施例
粉碎的葛花藥材經(jīng)水蒸汽蒸餾法提取揮發(fā)油，干燥后的藥渣用10倍量體積濃度95％乙醇溶液加熱回流提取3次，每次2小時，合并濾液，回收乙醇溶液得到乙醇溶液提取物。乙醇溶液提取物用水溶解后，經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附，分別用水、體積濃度50％乙醇溶液、體積濃度95％乙醇溶液各洗脫8倍柱體積，收集體積濃度50％乙醇溶液洗脫液，濃縮干燥后與揮發(fā)油部分混合均勻，即得葛花有效成分提取物。
粉碎的密蒙花和菊花藥材(1∶1等重量混合)經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，干燥后的藥渣用10倍量75％乙醇溶液加熱回流提取3次，每次3小時，合并濾液，回收乙醇溶液得到乙醇溶液提取物。乙醇溶液提取物用水溶解后，經(jīng)D-101大孔樹脂吸附，分別用水、體積濃度20％乙醇溶液、體積濃度50％乙醇溶液、體積濃度95％乙醇溶液各洗脫8倍柱體積，收集體積濃度20％和體積濃度50％乙醇溶液洗脫液，濃縮干燥后與揮發(fā)油部分混合均勻，即得密蒙花、菊花有效成分混合提取物。
按上述制備方法得到的葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物按重量比為2∶(2～0.5)，優(yōu)選為2∶(0.5～1)，更優(yōu)選為2∶1組合，加入藥學(xué)上可接受的輔料可進一步制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、丸劑、口服液。葛花與密蒙花和菊花的有效提取物在上述重量比范圍內(nèi)的組合形成的復(fù)方組合物，達到了相互配伍，發(fā)揮協(xié)同作用提高肝損傷的治療效果，藥理學(xué)研究顯示配伍后抗肝損傷作用優(yōu)于單味藥物。
2.制劑實施例
實施例：復(fù)方葛花組合物片劑的制備
葛花有效成分提取物與密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比組合，加入淀粉、環(huán)糊精、微晶纖維素。將上述組分混合均勻，加滑石粉適量，壓片，制成片劑。
實施例：復(fù)方葛花組合物膠囊劑的制備
葛花有效成分提取物與密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比組合，加入淀粉、環(huán)糊精、微晶纖維素。將上述組分混合均勻，80目篩制顆粒，60目篩整粒，填充膠囊，制成膠囊劑。
二、藥效研究實施例
1.復(fù)方葛花組合物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的影響
樣品：空白對照組，模型對照組，陽性藥對照組(聯(lián)苯雙酯)，葛花有效成分提取物與密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比組合的復(fù)方葛花組合物(FFGH)高、中、低劑量組，葛花(GH)有效成分高、中、低劑量組，密蒙花菊花有效成分混合物(MMHJH)高、中、低劑量組。
實驗動物：昆明種小鼠
實驗方法：每組小鼠雌雄各半，共取144只，分12組，每組12只，各受試藥物組每日灌胃給藥一次，陽性藥對照組給藥劑量為10mg/kg，F(xiàn)FGH高、中、低組給藥劑量為48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，GH高、中、低組給藥劑量為48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，MMHJH高、中、低組給藥劑量為48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，空白對照組、模型對照組給予同體積蒸餾水，上述給藥劑量參考2015版《中國藥典》和相關(guān)用藥指導(dǎo)后按人鼠給藥比例折算后確定，連續(xù)給藥7天，于第6天晚9點禁食，于第7天早9點灌胃給藥，2小時后進行造模。造模方法：除空白對照組外，其余各組腹腔注射0.15％四氯化碳豆油溶液0.2mL/10g體重，禁食10小時后摘眼球取血，取離心血清測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，結(jié)果見表1，統(tǒng)計方法采用t檢驗。
表1：受試藥物對CCL4致急性肝損傷血清ALT和AST的影響(n＝12)
注：與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
上述結(jié)果表明：對血清ALT，模型組與空白組比較具有顯著性差異P＜0.01，指標(biāo)顯著升高；FFGH組與模型組比較，高、中劑量具有顯著性差異P＜0.01，低劑量具有差異P＜0.05，可回調(diào)升高指標(biāo)；GH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異；MMHJH組與模型組比較，高、中、低劑量組未見差異。對血清AST，模型組與空白組比較具有顯著性差異P＜0.01，指標(biāo)顯著升高；FFGH組與模型組比較，高劑量具有顯著性差異P＜0.01，中、低劑量具有差異P＜0.05，可回調(diào)升高指標(biāo)；GH組與模型組比較，高、中劑量組具有差異P＜0.05，低劑量組未見差異；MMHJH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異。可見復(fù)方葛花組合物能回調(diào)肝損傷時血清ALT和AST指標(biāo)，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物能部分回調(diào)指標(biāo)。但其降酶作用復(fù)方葛花組合物明顯優(yōu)于其余受試藥物，協(xié)同配伍組成復(fù)方降酶藥效優(yōu)勢明顯。
2.復(fù)方葛花組合物對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的影響
樣品：空白對照組，模型對照組，陽性藥對照組(硫普羅寧)，葛花有效成分提取物與密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比組合的復(fù)方葛花組合物(FFGH)高、中、低劑量組，葛花(GH)有效成分高、中、低劑量組，密蒙花菊花有效成分混合物(MMHJH)高、中、低劑量組。
實驗動物：Wistar種大鼠
實驗方法：實驗各組除空白對照組外用30％CCL4豆油溶液灌胃，每間隔5天灌胃一次，連續(xù)三個月。陽性藥對照組給藥劑量為120mg/kg，F(xiàn)FGH高、中、低組給藥劑量為48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，GH高、中、低組給藥劑量為48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，MMHJH高、中、低組給藥劑量為48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，空白對照組、模型對照組給予同體積蒸餾水，上述給藥劑量參考2015版《中國藥典》和相關(guān)用藥指導(dǎo)后按人鼠給藥比例折算后確定，實驗于末次給藥2小時將動物摘眼球取血，檢測血中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的濃度。結(jié)果見表2、表3，統(tǒng)計方法采用t檢驗。
表2：受試藥物對CCL4致慢性肝損傷血清ALT和AST的影響(n＝12)
注：與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
上述結(jié)果表明：對血清ALT，模型組與空白組比較具有顯著性差異P＜0.01，指標(biāo)顯著升高；FFGH組與模型組比較，高劑量具有顯著性差異P＜0.01，中、低劑量具有差異P＜0.05，可回調(diào)升高指標(biāo)；GH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異；MMHJH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異。對血清AST，模型組與空白組比較具有顯著性差異P＜0.01，指標(biāo)顯著升高；FFGH組與模型組比較，高劑量具有顯著性差異P＜0.01，中劑量具有差異P＜0.05，可回調(diào)升高指標(biāo)，低劑量組未見差異；GH組與模型組比較，高、中劑量組具有差異P＜0.05，低劑量組未見差異；MMHJH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異?？梢姀?fù)方葛花組合物能回調(diào)肝損傷時血清ALT和AST指標(biāo)，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物能部分回調(diào)指標(biāo)。但其降酶作用復(fù)方葛花組合物明顯優(yōu)于其余受試藥物，協(xié)同配伍組成復(fù)方藥效優(yōu)勢明顯。
表3：受試藥物對CCL4致慢性肝損傷血清TP和ALB的影響(n＝12)
注：與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，Δp＜0.05，ΔΔP＜0.01
上述結(jié)果表明：對血清TP，模型組與空白組比較具有顯著性差異P＜0.01，指標(biāo)顯著降低；FFGH組與模型組比較，高劑量具有顯著性差異P＜0.01，中劑量具有差異P＜0.05，可回調(diào)降低指標(biāo)，低劑量組無影響；GH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異；MMHJH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異。對血清ALB，模型組與空白組比較具有顯著性差異P＜0.01，指標(biāo)顯著降低；FFGH組與模型組比較，高劑量具有顯著性差異P＜0.01，中、低劑量具有差異P＜0.05，可回調(diào)降低指標(biāo)；GH組與模型組比較，高、中劑量組具有差異P＜0.05，低劑量組未見差異；MMHJH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異?？梢姀?fù)方葛花組合物能回調(diào)肝損傷時血清TP和ALB指標(biāo)，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物能部分回調(diào)指標(biāo)。復(fù)方葛花組合物明顯優(yōu)于其余受試藥物，協(xié)同配伍組成復(fù)方降酶藥效優(yōu)勢明顯。
3.復(fù)方葛花組合物對大鼠肝組織膠原蛋白含量的影響
樣品：空白對照組，模型對照組，陽性藥對照組(硫普羅寧)，葛花有效成分提取物與密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比組合的復(fù)方葛花組合物(FFGH)高、中、低劑量組，葛花(GH)有效成分高、中、低劑量組，密蒙花菊花有效成分混合物(MMHJH)高、中、低劑量組。
實驗動物：Wistar種大鼠
實驗方法：實驗各組除空白對照組外用30％CCL4豆油溶液灌胃，每間隔5天灌胃一次，連續(xù)三個月。陽性藥對照組給藥劑量為120mg/kg，F(xiàn)FGH高、中、低組給藥劑量為48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，GH高、中、低組給藥劑量為48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，MMHJH高、中、低組給藥劑量為48.0mg/kg、24.0mg/kg、12.0mg/kg，空白對照組、模型對照組給予同體積蒸餾水，上述給藥劑量參考2015版《中國藥典》和相關(guān)用藥指導(dǎo)后按人鼠給藥比例折算后確定，實驗于末次給藥2小時取肝臟組織勻漿，用無水乙醇、丙酮脫水、脫脂制成肝粉。取10mg肝粉加入6mol/L HCL1.5ml，沸水水浴5小時，待冷卻后取上清液在550nm波長比色。按公式求得羥脯氨酸含量，再折算成膠原蛋白的含量。結(jié)果見表4，統(tǒng)計方法采用t檢驗。
膠原蛋白ug/mg肝粉＝羥脯氨酸含量÷13.4％
表4：受試藥物對CCL4致大鼠肝組織膠原蛋白的影響(n＝12)
注：與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01
上述結(jié)果表明：對于肝組織膠原蛋白含量，模型組與空白組比較具有顯著性差異P＜0.01，指標(biāo)顯著升高；FFGH組與模型組比較，高劑量具有顯著性差異P＜0.01，中劑量具有差異P＜0.05，可回調(diào)降低指標(biāo)，低劑量組無影響；GH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異；MMHJH組與模型組比較，高劑量組具有差異P＜0.05，中、低劑量組未見差異?？梢姀?fù)方葛花組合物能回調(diào)肝損傷時肝臟組織膠原蛋白含量，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物能部分回調(diào)指標(biāo)。復(fù)方葛花組合物明顯優(yōu)于其余受試藥物，協(xié)同配伍組成復(fù)方抗肝纖維化藥效優(yōu)勢明顯。
4.復(fù)方葛花組合物對大鼠膽汁排出量的影響
樣品：空白對照組，陽性藥對照組(去氧膽酸)，葛花有效成分提取物與密蒙花、菊花有效成分混合提取物以2∶1重量比組合的復(fù)方葛花組合物(FFGH)高、中、低劑量組，葛花(GH)有效成分高、中、低劑量組，密蒙花菊花有效成分混合物(MMHJH)高、中、低劑量組。
實驗動物：Wistar種大鼠
實驗方法：實驗前禁食12～16小時，用20％烏拉坦(0.89ml/kg)麻醉，背位固定，開腹后找到胃幽門部，以幽門部為準(zhǔn)翻轉(zhuǎn)十二指腸，即可見到白色的十二指腸乳頭部，從乳頭部追蹤到膽總管，暴露膽總管，結(jié)扎下端，向膽總管近端插入外徑1mm左右的塑料管，形成漏管引流膽汁。待膽汁流量穩(wěn)定20分鐘后，各給藥組于十二指腸注射藥物，正常對照組給予同體積蒸餾水，測定給藥后30，60，90，120，180分鐘膽汁流量。結(jié)果見表5，統(tǒng)計采用t檢驗。
表5：復(fù)方葛花組合物對大鼠膽汁排出量的影響(n＝12)
注：與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.01
上述結(jié)果表明：各受試藥物組與空白組比較，30min和60min時均未出現(xiàn)膽汁量排除增加；90min時與空白組比較FFGH組高劑量組具有顯著差異P＜0.01，中、低劑量具有差異P＜0.05，增加膽汁排出量；120min時與空白組比較FFGH組高、中劑量組具有顯著差異P＜0.01，膽汁分泌量增加。180min時與空白組比較FFGH組高劑量組具有顯著差異P＜0.01，中劑量組具有差異P＜0.01，膽汁分泌量增加。可見復(fù)方葛花組合物具有利膽作用，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物不及配伍后應(yīng)用。復(fù)方葛花組合物明顯優(yōu)于其余受試藥物，協(xié)同配伍組成復(fù)方利膽藥效優(yōu)勢明顯。
綜上所述，葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物按比例組合后所得復(fù)方葛花組合物經(jīng)實驗證明，對急性肝損傷模型具有顯著治療作用，可通過降低ALT和AST發(fā)揮降酶保肝的抗肝損傷作用。對慢性肝損傷模型也表現(xiàn)出顯著治療作用，可通過降低ALT、AST、TP和ALB發(fā)揮降酶保肝的抗肝損傷作用。復(fù)方葛花組合物其可降低慢性肝損傷中肝臟組織膠原蛋白含量，可通過減輕肝纖維化發(fā)揮抗肝損傷作用。同時，通過對膽汁排出量實驗，發(fā)現(xiàn)復(fù)方葛花組合物具有顯著的利膽保肝抗肝損傷作用。通過以上研究可以發(fā)現(xiàn)，復(fù)方葛花組合物的抗肝損傷作用強于葛花有效成分提取物和密蒙花、菊花有效成分混合提取物，說明聯(lián)合應(yīng)用不是簡單的治療相加作用而是協(xié)同配伍增強療效。因此，復(fù)方葛花組合物具有保肝、降酶、利膽、降低肝纖維化程度等抗肝損傷的綜合作用，可達到治療肝損傷的藥效。