本發(fā)明涉及一種蕎麥總黃酮的提取方法，屬于醫(yī)藥領域。

背景技術：

蕎麥(Fagopyrum esculentum Moench)屬于蓼科蕎麥屬雙子葉一年生作物。生產(chǎn)上栽培的主要有兩種,即甜蕎麥(F.esculentumMoench)和苦蕎麥(F.esculentum(L.)Gaerth)?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，蕎麥具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多方面的藥理作用，營養(yǎng)、保健及藥用價值較高。隨著人們生活水平的提高，蕎麥食品、藥品等制品正日益受到人們的青睞。

蕎麥不僅含有豐富的蛋白質、碳水化合物、不飽和脂肪酸及維生素，還含有豐富的生物活性成分—蘆丁、山奈酚和槲皮素等黃酮類化合物。許多研究已表明黃酮類化合物具有多種生物活性，除有抗菌、消炎、降壓等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有顯著效果。由于黃酮類化合物具有如此廣泛的生物活性，使得對它的研究、開發(fā)及利用引起了越來越多的關注。為更好地利用蕎麥資源，亟需提供一種能夠有效提取其中黃酮類物質的方法。

傳統(tǒng)的蕎麥黃酮的提取方法主要為乙醇浸提法、超聲波法、纖維素酶法等。這些方法雖然都可以將黃酮類成分從蕎麥中提出，但存在各種缺陷，比如，有機溶劑的大量使用使得溶劑殘留難以避免，操作復雜、對設備要求較高，導致生產(chǎn)成本增加等等，極大限制了這類提取技術在工業(yè)上的應用。

10、雙水相體系一般由兩種聚合物、聚合物和鹽、離子液體和鹽、小分子親水有機溶劑和鹽組成。當兩種成相物質在水中充分溶解后，在分子間相互排斥力和空間阻礙作用的影響下，經(jīng)過一段時間平衡，形成互不滲透的兩相體系。雙水相提取的原理與常規(guī)的液/液溶劑萃取原理相似，都是依據(jù)物質在兩相間的選擇性分配，但其較常規(guī)的液/液溶劑萃取方式有明顯優(yōu)勢：1、操作條件溫和，體系含水量高(一般為75％～90％)，在接近生理環(huán)境的體系中進行萃取，不會引起生物活性物質失活或變性；2、一般不存在有機溶劑的殘留問題；3、易于連續(xù)化操作，設備簡單，無需進行特殊處理，適于工業(yè)化生產(chǎn)。然而，采用雙水相技術提取植物中的有效成分并非易事，往往需要根據(jù)待提取物質的理化性質進行大量實驗研究才能確定較為適宜的提取條件，從而得到較高的提取率；尤其是成相物質的選擇尤為重要，通常對目標物質在雙水相系統(tǒng)的分配行為具有顯著影響。

因此，提供一種能夠從蕎麥中有效提取總黃酮的雙水相提取工藝，成為了一個亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種蕎麥總黃酮的提取方法。

本發(fā)明提供了一種蕎麥總黃酮的提取方法，包括如下步驟：取蕎麥籽粒，粉碎，脫脂，采用丙醇-硫酸銨雙水相體系進行提取，靜置分層，取上清液，即得。

進一步的，所述提取條件為：丙醇與水的體積比為3:10～9:10，硫酸銨濃度為0.27～0.45g/ml，料液比為1:10～1:40，提取時間為15～45min，提取溫度為30～60℃。

優(yōu)選的，所述提取條件為：丙醇與水的體積比為8:10，硫酸銨濃度為0.39～0.42g/ml，料液比為1:20～1:25，提取時間為25～30min，提取溫度為50～55℃。

進一步優(yōu)選的，所述提取條件為：丙醇與水的體積比為8:10，硫酸氨濃度為0.39g/ml，料液比為1:20，提取時間為30min，提取溫度為55℃。

進一步的，采用超聲波輔助丙醇-硫酸銨雙水相體系進行提取，超聲功率為250W。

進一步的，所述的蕎麥為甜蕎。

進一步的，所述的脫脂方法為：取蕎麥粉，加入石油醚，超聲波提取，過濾，收集濾渣，即得。

進一步的，加入料液比為1：10的石油醚，于30℃～60℃超聲波提取30min，超聲功率為250W。

本發(fā)明提供了一種根據(jù)所述提取方法制備得到的蕎麥總黃酮。

本發(fā)明提供了一種蕎麥總黃酮的提取方法，具有以下有益效果：

1、本發(fā)明采用雙水相提取技術提取蕎麥中的黃酮類物質，并確定雙水相系統(tǒng)的成相物質為丙醇-硫酸銨，相較于傳統(tǒng)的雙水相體系中使用聚合物作為成相物質，本發(fā)明具有成本低、操作簡便、易于后續(xù)處理等優(yōu)點。

2、本發(fā)明提供了雙水相提取蕎麥黃酮的具體條件參數(shù)，可得到高于0.3％的提取率，最高提取率可達到0.57％。

3、本發(fā)明進一步采用超聲波輔助雙水相進行提取，利用超聲波的空化作用、機械效應和熱效應等加速植物細胞內黃酮類物質的釋放、擴散和溶解，從而提高提取效率，縮短提取時間，節(jié)約溶劑，并且避免了高溫對黃酮類化合物的破壞。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為蘆丁標準曲線圖；

圖2為醇水比對提取得率的影響圖；

圖3為硫酸銨濃度對提取得率的影響圖；

圖4為料液比對提取得率的影響圖；

圖5為提取時間對提取得率的影響圖；

圖6為提取溫度對提取得率的影響圖。

具體實施方式

本發(fā)明具體實施方式中使用的原料、設備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品獲得。

1、實驗原料

甜蕎麥籽粒(原糧產(chǎn)地：遼寧朝陽；中糧米業(yè)(磐石)有限公司生產(chǎn)，金盈牌)

預處理：將甜蕎麥粉碎后，過100目篩制成蕎麥粉備用。

2、主要藥品試劑

蘆丁標準品(天津西瑪科技)；石油醚(沸程：60-90℃)；丙醇、三氯化鋁、乙酸鉀、甲醇、無水乙醇、硫酸銨等。

3、主要儀器設備

UV-1200型紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；粉碎機；SB-5200DTDN超聲清洗器(超聲功率250W)；JA1203電子分析天平：上海越平科技儀器有限公司；SZ-93型自動雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠等。

實施例1本發(fā)明蕎麥總黃酮的提取方法

稱取2.00g蕎麥粉于100ml具塞錐形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超聲波提取30min，超聲功率250W，除去脂溶性成分，過濾，濾渣于室溫揮發(fā)干燥除去其中殘余的石油醚。按照1:20料液比(m/v)，加入醇水比(v/v)為8:10，硫酸銨濃度為0.39g/ml配制的雙水相溶液，設置超聲提取溫度55℃，超聲提取30min，超聲功率250W。于分液漏斗中靜置分層后，取上清液，即得。總黃酮得率為0.57％。

以下通過實驗例證明本發(fā)明的有益效果。

總黃酮的含量測定方法

根據(jù)NY/T1295-2007《蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定》的方法測定總黃酮的含量。

首先，配制0.1mol/L三氯化鋁、0.1mol/L乙酸鉀溶液、甲醇水溶液(7+3)，然后，稱取蘆丁標準品0.0573g于燒杯中，用甲醇溶解，移至1000mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得0.0500mg/mL的蘆丁標準溶液。蘆丁標準曲線繪制：用移液管分別準確吸取0.25、0.50、1.0、2.0、3.0、4.0mL蘆丁標準溶液置于10mL容量瓶中，分別加入0.1mol/L三氯化鋁2mL、0.1mol/L乙酸鉀溶液3mL，加入甲醇溶液定容至刻度，搖晃均勻，室溫下放置30min。同時作空白。標準曲線中蘆丁含量分別為0.00125mg/mL、0.00250mg/mL、0.00500mg/mL、0.0100mg/mL、0.0150mg/mL、0.0200mg/mL。在420nm波長處測定吸光度。以為蘆丁標準溶液濃度橫坐標、吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖1。

總黃酮含量測定：精確量取蕎麥總黃酮待測液1.0mL于10mL容量瓶，加入0.1mol/L三氯化鋁2mL、0.1mol/L乙酸鉀溶液3mL，加入甲醇溶液定容至刻度，搖勻，室溫下放置30min。然后于420nm波長處測定吸光度，將得到的吸光度，代入蘆丁標準曲線的回歸方程，計算總黃酮的濃度和總黃酮質量?？傸S酮得率＝蕎麥中總黃酮質量/蕎麥的質量×100％。

實驗例1醇水比對提取得率的影響

稱取2.00g蕎麥粉于100ml具塞錐形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超聲波提取30min，超聲功率為250W，除去脂溶性成分，過濾，濾渣于室溫揮發(fā)干燥除去其中殘余的石油醚。按照1：25料液比(m/v)，分別加入醇水比(v/v)為3:10、4:10、5:10、6:10、7:10、8:10、9:10，濃度為0.35g/ml的硫酸銨配制的雙水相溶液(丙醇-硫酸銨雙水相體系根據(jù)參考文獻制備：1、馬宏飛,韓秋菊,李薇.丙醇-硫酸銨雙水相體系及應用探討[J].氨基酸和生物資源.2011,33(4):67-69；2、高云濤,吳立生,王偉.丙醇-硫酸銨-水液-液體系萃取分離鉑、鈀、銠和金[J].分析化學.2001,29(8):901-903)，設置超聲提取溫度60℃，超聲提取25min，超聲功率250W。于分液漏斗中靜置分層后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，該溶液為總黃酮待測液，測定總黃酮含量，結果見圖2。

實驗結果：隨著醇水比增加總黃酮的提取得率先增加后減小。隨著醇水比增加，丙醇濃度增大，使提取劑對物料的滲透能力增強，提高了總黃酮的溶解度，到醇水比(v/v)為7:10時所得提取率最高；但是醇水比繼續(xù)增大，會影響雙水相的兩相分配，總黃酮溶解度降低，提取得率下降。

實驗例2硫酸銨濃度對提取得率的影響

稱取2.00g蕎麥粉于100ml具塞錐形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超聲波提取30min，超聲功率為250W，除去脂溶性成分，過濾，濾渣于室溫揮發(fā)干燥除去其中殘余的石油醚。按照1:25料液比(m/v)，分別加入醇水比(v/v)為6:10，硫酸銨濃度為0.27、0.30、0.33、0.36、0.39、0.42、0.45g/ml配制的雙水相溶液，設置超聲提取溫度60℃，超聲提取25min，超聲功率250W。于分液漏斗中靜置分層后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，該溶液為總黃酮待測液，測定總黃酮含量，結果見圖3。

實驗結果：隨著硫酸銨濃度的增加，總黃酮的提取得率先增加后減小。由于硫酸銨濃度增加，雙水相越趨于穩(wěn)定，到硫酸銨濃度為0.4g/ml時雙水相最穩(wěn)定，提取得率最高；但是隨著硫酸銨濃度繼續(xù)增加吸走大量水分，使得上相即有機相的水分減少，一些水溶性的黃酮類化合物溶解度減小，提取得率隨之降低。

實驗例3料液比對提取得率的影響

稱取2.00g蕎麥粉于100ml具塞錐形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超聲波提取30min，超聲功率為250W，除去脂溶性成分，過濾，濾渣于室溫揮發(fā)干燥除去其中殘余的石油醚。分別按照1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40料液比(m/v)，加入醇水比(v/v)為6:10，濃度為0.35g/ml的硫酸銨配制的雙水相溶液，在超聲提取溫度60℃，超聲提取25min，超聲功率250W。于分液漏斗中靜置分層后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，該溶液為總黃酮待測液，測定總黃酮含量，結果見圖4。

實驗結果：隨著料液比的增加，總黃酮提取率先增加，到達1:30左右時達到最大，然后開始下降。料液比小，黃酮類化合物溶解于溶劑的速度慢；料液比太大，溶劑用量增多，相對地硫酸銨鹽的用量增多，影響雙水相的穩(wěn)定，使得黃酮提取得率減少。

實驗例4提取時間對提取得率的影響

稱取2.00g蕎麥粉于100ml具塞錐形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超聲波提取30min，超聲功率為250W，除去脂溶性成分，過濾，濾渣于室溫揮發(fā)干燥除去其中殘余的石油醚。按照1：25料液比(m/v)，加入醇水比(v/v)為6：10，濃度為0.35g/ml的硫酸銨配制的雙水相溶液，在超聲提取溫度60℃，超聲功率250W的條件下，分別超聲提取15、20、25、30、35、40、45min。于分液漏斗中靜置分層后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，該溶液為總黃酮待測液，測定總黃酮含量，結果見圖5。

實驗結果：提取時間增加提取得率增大，提取時間為30min時，提取得率達到最大，之后隨著提取的時間增加，會使得黃酮類化合物被氧化分解，所以提取得率開始下降。

實驗例5提取溫度對提取得率的影響

稱取2.00g蕎麥粉于100ml具塞錐形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超聲波提取30min，超聲功率為250W，除去脂溶性成分，過濾，濾渣于室溫揮發(fā)干燥除去其中殘余的石油醚。按照1:25料液比(m/v)，加入醇水比(v/v)為6:10，濃度為0.35g/ml的硫酸銨配制的雙水相溶液，在超聲提取溫度分別為30、35、40、45、50、55、60℃的條件下，超聲提取25min，超聲功率250W。于分液漏斗中靜置分層后，取上清液置于100mL容量瓶中，用30％v/v乙醇水溶液定容，該溶液為總黃酮待測液，得到總黃酮待測液，測定總黃酮含量，結果見圖6。

實驗結果：總黃酮提取得率隨溫度升高而增大，因為黃酮類化合物在丙醇中溶解度隨溫度增加而增加，溫度增加，黃酮類化合物擴散系數(shù)增加，使得提取得率也隨之增大；但是當溫度增加到50℃以后，提取得率便開始下降，主要是因為在較高溫度下黃酮類化合物會發(fā)生氧化分解等反應而被破壞。

實驗例6采用不同提取條件總黃酮提取率的比較

共分為16個試驗組，每組稱取2.00g蕎麥粉于100ml具塞錐形瓶中，加入20ml石油醚，于60℃超聲波提取30min，超聲功率為250W，除去脂溶性成分，過濾，濾渣于室溫揮發(fā)干燥除去其中殘余的石油醚。其余各步驟條件參數(shù)分別如表1所示。

表1采用不同提取條件總黃酮提取率的比較

實驗結果：采用本發(fā)明提取條件可使蕎麥總黃酮的提取得率達到0.3％以上；其中，試驗組11及12蕎麥總黃酮的提取得率在0.5％以上，較其它試驗組得率顯著提高，表明在丙醇與水的體積比為8:10，硫酸銨濃度為0.39～0.42g/ml，料液比為1:20～1:25，提取時間為25～30min，提取溫度為50～55℃的提取條件下，即可達到較高的提取率；在上述所有試驗組中，試驗組11蕎麥總黃酮的提取得率最高，可達到0.57％，表明本發(fā)明最佳提取條件為：醇水比為8:10、硫酸銨濃度為0.39g/ml、料液比為1:20、提取時間為30min、提取溫度為55℃。

實驗例7本發(fā)明提取工藝的驗證試驗

取同一批蕎麥，采用根據(jù)實驗例6所述最佳提取條件(即試驗組11的提取條件)進行總黃酮的提取，重復3次，總黃酮提取得率分別為0.53％、0.57％、0.59％，平均為0.56％，RSD0.03％。

上述結果表明本發(fā)明提取工藝重復性、穩(wěn)定性高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。