本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及一種無抗水產(chǎn)免疫增強劑的制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展、高密度集約化程度增大，養(yǎng)殖環(huán)境惡化、種質(zhì)資源退化及疾病感染等問題逐年增加，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物自身免疫能力是抗病的途徑之一。

目前的提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物免疫力的主要途徑是在水產(chǎn)飼料中添加抗生素類藥物。但是近年來抗生素等藥物濫用情況嚴重，不僅魚、蝦、蟹類曾經(jīng)都發(fā)生過大面積死亡，而且致使部分水產(chǎn)品中的藥物殘留量增加或嚴重超標，嚴重威脅食品安全。加之歐美日本等主要水產(chǎn)品進口國對水產(chǎn)品的檢驗日趨嚴格，也影響了水產(chǎn)品的出口，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。同時藥物在水中的積累會對養(yǎng)殖環(huán)境造成污染，進一步破壞養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，形成惡性循環(huán)。因此，從某種意義上講，增強水產(chǎn)養(yǎng)殖動物自身的免疫力，提高機體的生長性能，減少或停止使用抗生素類藥物，提高飼料效率，提高養(yǎng)殖對象品質(zhì)，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種無抗水產(chǎn)免疫增強劑的制備方法。本發(fā)明制得的無抗水產(chǎn)免疫增強劑選用純天然綠色原料，不含抗生素藥物，能夠有效提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫能力，且不會對養(yǎng)殖環(huán)境造成污染，綠色環(huán)保。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種無抗水產(chǎn)免疫增強劑的制備方法，包括以下步驟：

1）、將80-120份水產(chǎn)多肽、40-60份油茶籽粕改性提取物、10-30份蝦青素、10-30份巖藻黃質(zhì)、10-20份珍珠粉、40-80份海藻提取物、300-500份水混合均勻，制得組分A。

2）、將20-30份氯化鈣溶解于500-700份水中，制得組分B。

3）、將所述組分A裝入注射器中以0.5-1.5mL/s的速率滴加到組分B中，生產(chǎn)微溶于水的固體沉淀；過濾取固體沉淀，干燥后得到無抗水產(chǎn)免疫增強劑。

將組分A滴加到組分B中后，會交聯(lián)反應(yīng)生成球狀的固體沉淀，從而將水產(chǎn)多肽、油茶籽粕改性提取物、蝦青素、巖藻黃質(zhì)、珍珠粉等免疫活性成分進行包埋，防止這些免疫活性成分用于飼料添加到水中后溶解流失。

本發(fā)明選用水產(chǎn)魚類的多肽作為主要的免疫成分，再配以油茶籽粕改性提取物、蝦青素、巖藻黃質(zhì)、珍珠粉等物質(zhì)，復配成免疫增強劑，添加到水產(chǎn)飼料中被水產(chǎn)養(yǎng)殖動物食用后，能夠有效提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫能力。并且本發(fā)明的免疫增強劑純天然，不添加任何抗生素，不僅不會造成動物體內(nèi)藥物殘留，并且不會污染水體，綠色環(huán)保。

作為優(yōu)選，所述水產(chǎn)多肽選自分子量在1600-4000Da區(qū)間的安康魚多肽、分子量在200-800Da區(qū)間的鱈魚多肽、分子量在600-1000Da區(qū)間的金槍魚多肽。

不同魚類的不同分子量的多肽免疫活性不同，經(jīng)過本發(fā)明人的長期研究，發(fā)現(xiàn)上述分子量區(qū)間的多肽免疫活性較好。

作為優(yōu)選，所述水產(chǎn)多肽的制備方法如下：

a、原料解凍清洗：對魚皮進行流水解凍，解凍時間為2-5h；完全解凍后將魚皮洗凈。

b、原料預(yù)處理：將魚皮添加到5-10倍濃度為3-5wt%的氫氧化鈉溶液中，在20-30℃下脫脂4-6h，然后取魚皮用水洗凈。

c、蒸煮熬膠：將魚皮在90-100℃下進行蒸煮熬膠8-12h，取生成的魚皮膠，并對魚皮膠通過離心處理與油脂分離，離心速率為1000r/min。

d、酶解：將魚皮膠添加到含有中性蛋白酶的酶解液中進行酶解；其中中性蛋白酶的濃度為0.05-0.25wt%，酶解液質(zhì)量為魚皮膠質(zhì)量的2-4倍，酶解溫度為30-45℃，酶解液pH至控制在6-8，酶解時間為30-60min。

e、炭脫、板框過濾：向酶解液中添加質(zhì)量為酶解液1-2wt%的活性炭，并將酶解液加熱到70-80℃，脫色30-50min；將脫色后的酶解液轉(zhuǎn)移至板框過濾池內(nèi)進行過濾，取澄清液。

f、分離純化：將澄清液轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱中進行鼓氣起泡，并收集泡沫液，，在鼓氣的同時向泡沫分離柱中注水；鼓氣速率為3-5L/min，注水速率為0.1-0.3L/min，泡沫分離柱中液體的裝載高度與泡沫分離柱內(nèi)徑比為8-10:1，澄清液溫度保持在25-35℃；待收集的泡沫液滅泡后，用離子交換器對泡沫液進行重金屬分離；向重金屬分離后的泡沫液中添加質(zhì)量為泡沫液1-2%的磁性親和微球并分散均勻，靜置親和吸附50-70min后利用磁場使磁性親和微球聚集；分離出磁性親和微球后，用pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液對磁性親和微球進行洗脫，再次利用磁場分離出磁性親和微球后，得到洗脫液，將洗脫液在75-85℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

板框過濾后澄清液中的不溶性雜質(zhì)基本分離完畢，基本只存在溶解性雜質(zhì)以及重金屬離子等。對澄清液進行泡沫分離純化，由于蛋白物質(zhì)具有一定的表面活性，能夠在液體氣泡后聚集在泡沫表面，收集泡沫液，能夠?qū)⒌鞍孜镔|(zhì)與其他物質(zhì)進行分離。在泡沫分離過程中，由于泡沫分離柱中水分的不斷變少，使得液體中蛋白物質(zhì)的濃度升高，導致濃度超過臨界膠束濃度， 從而容易將其他可溶性雜質(zhì)附帶在泡沫表面，影響分離效果，進行注水能夠有效維持液體中蛋白濃度。用離子交換器能夠?qū)ε菽褐械囊煌街闹亟饘龠M行分離，再用磁性親和微球?qū)ε菽褐械哪繕说鞍孜镔|(zhì)進行親和吸附，使得膠原蛋白肽的純度更高。

g、濃縮：將洗脫液先后輸入雙效濃縮鍋和四效濃縮鍋中進行濃縮，制得濃縮液，所述濃縮液的折光度控制在5-6，濃縮后濃縮液在50-60℃下儲存。

h、膜過濾：將濃縮液通過二級0.22微米膜過濾器進行除雜除菌；其中膜過濾溫度小于45℃，一級過濾壓力小于0.25MPa，二級過濾壓力小于0.4MPa。

i、多肽分級：采用超濾膜或納濾膜對膜過濾后的濃縮液按分子量進行分離，得到目標分子量的水產(chǎn)多肽；

j、噴霧干燥：對水產(chǎn)多肽進行噴霧干燥；噴霧溫度為80-90℃，噴霧干燥后水產(chǎn)多肽的含水率小于等于5wt%。

本發(fā)明制備的水產(chǎn)多肽，純度高，得率高，分子量分布區(qū)間小，在目標分子量區(qū)間內(nèi)的多肽含量高。

作為優(yōu)選，所述磁性親和微球由以下方法制得：將海藻酸鈉、聚乙二醇、殼聚糖、正庚烷、乙酸、水按質(zhì)量比2-3:1:2:0.5:3-5:100混合溶解，攪拌均勻后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A質(zhì)量4-6%的四氧化三鐵磁粉并分散均勻，得到混合液B；對混合液B進行超聲波分散，同時向混合液B中勻速滴加混合液B質(zhì)量40-60%的乳化液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C質(zhì)量0.1-0.2%的98wt%的戊二醛和混合液C質(zhì)量0.5-1倍的2.5-3.5wt%的氯化鈣溶液，充分攪拌，靜置1-2h，生成磁性微球；利用磁場對液體中磁性微球進行聚集，取出磁性微球后進行清洗、干燥；將磁性微球浸泡在水中溶脹15-25min，然后取出磁性微球并添加到活化液中在35-45℃下活化40-80min，磁性微球與活化液的固液比為0.5-1.0g/mL；活化后取出磁性微球并洗凈，將磁性微球與肝素按質(zhì)量比1.5-2.5:1進行混合，得到懸浮液，將懸浮液pH值調(diào)節(jié)至4-5，然后向懸浮液中添加懸浮液體積1.5-2.5倍的3wt%的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺，在4℃下靜置12-18h;生成磁性親和微球，最后從懸浮液中取出磁性親和微球，洗凈、干燥，備用。

上述方法制得的磁性微球，以四氧化三鐵磁粉為磁核，以海藻酸鈉、聚乙二醇、殼聚糖為磁核的主要包衣材料，以正庚烷為致孔劑，添加戊二醛和氯化鈣溶液后，交聯(lián)成型，具有多孔性，比表面積大，吸附容量大，分散性佳，粒徑均一性好。

作為優(yōu)選，所述乳化液為體積占比為30-40%的司盤-80無水乙醇混合液，乳化液在10-20min內(nèi)滴加完畢。

作為優(yōu)選，所述活化液由1mol/L的氫氧化鈉溶液、二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷按體積比4-6:1:0.5-0.7組成。

作為優(yōu)選，所述油茶籽粕改性提取物的制備方法如下：取榨油后的油茶籽粕，研磨成粉，按液固比16-20mL/g將油茶籽粕添加到濃度為70-80wt%的乙醇溶液中并攪拌均勻，將乙醇溶液轉(zhuǎn)移至微波提取器中進行加熱提取，提取溫度為60-70℃，提取時間為2-4min，微波功率為800-1000W；提取后得到粗提液，將粗提液過濾，取過濾液，向過濾液中添加過濾液體積0.02-0.04倍的30wt%雙氧水溶液，在50-60℃下加熱10-20min，然后向溶液中添加溶液質(zhì)量0.4-0.6%殼聚糖，在室溫下靜置10-20h，離心、過濾得到精提液，將精提液真空干燥后制得油茶籽粕提取物；將油茶籽粕提取物溶于酸性溶液中配得濃度為4-6wt%、pH為3-4的油茶籽粕提取物酸性溶液，在2-4h內(nèi)向油茶籽粕提取物酸性溶液中勻速滴加質(zhì)量為油茶籽粕提取物0.4-0.6倍的亞硒酸鈉進行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為60-80℃；反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)過濃縮、真空干燥制得油茶籽粕改性提取物。

對油茶籽粕進行提取，能夠得到天然的糖苷類化合物，基本結(jié)構(gòu)主要由皂苷元、糖體、有機酸三部分組成，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，這類物質(zhì)具有較強的抗氧化能力，能夠提高生物體的免疫力。該物質(zhì)的糖體結(jié)構(gòu)上含有部分的羥基和羧基等基團，本發(fā)明利用這些基團對其進行硒化改性，進一步增強油茶籽粕提取物的免疫活性。

作為優(yōu)選，所述海藻提取物的制備方法如下：將切碎的海藻碎末與水混合，打漿后制得濃度為10-30wt%的海藻漿料；向海藻漿料中添加等體積的檸檬酸鈉溶液，制得pH值為4-6的混合漿料，將混合漿料在60-80℃下提取2-4h，提取后過濾得到海藻粗提液，將海藻粗提液轉(zhuǎn)移至高壓滅菌鍋內(nèi)進行熟化滅菌；然后繼續(xù)對海藻粗提液通過微濾膜去除大分子雜蛋白，最后冷凍干燥后制得海藻提取物。

上述方法制得的海藻提取物，含有大量的海藻多糖類物質(zhì)，溶于水后能夠與氯化鈣反應(yīng)生成微溶于水的固體物質(zhì)。在本發(fā)明的免疫增強劑的制備過程中，將水產(chǎn)多肽、油茶籽粕改性提取物、蝦青素、巖藻黃質(zhì)、珍珠粉、海藻提取物混合，將混合物滴加到氯化鈣水溶液中，能夠交聯(lián)生成微溶于水的固體物質(zhì)，從而將水產(chǎn)多肽、油茶籽粕改性提取物、蝦青素、巖藻黃質(zhì)、珍珠粉等免疫活性成分進行包埋，防止這些免疫活性成分用于飼料添加到水中后溶解流失。此外，海藻多糖自身也具有出色的抗氧化性，具有免疫活性。

與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的無抗水產(chǎn)免疫增強劑選用純天然綠色原料，不含抗生素藥物，能夠有效提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的免疫能力，且不會對養(yǎng)殖環(huán)境造成污染，綠色環(huán)保。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。

實施例1

一種無抗水產(chǎn)免疫增強劑的制備方法，包括以下步驟：

1）、將100份水產(chǎn)多肽、50份油茶籽粕改性提取物、20份蝦青素、20份巖藻黃質(zhì)、15份珍珠粉、60份海藻提取物、400份水混合均勻，制得組分A。所述水產(chǎn)多肽為分子量在1600-4000Da區(qū)間的安康魚多肽。

2）、將25份氯化鈣溶解于600份水中，制得組分B。

3）、將所述組分A裝入注射器中以1mL/s的速率滴加到組分B中，生產(chǎn)微溶于水的固體沉淀；過濾取固體沉淀，干燥后得到無抗水產(chǎn)免疫增強劑。

其中，所述水產(chǎn)多肽的制備方法如下：

a、原料解凍清洗：對魚皮進行流水解凍，解凍時間為3.5h；完全解凍后將魚皮洗凈。

b、原料預(yù)處理：將魚皮添加到7.5倍濃度為4wt%的氫氧化鈉溶液中，在25℃下脫脂5h，然后取魚皮用水洗凈。

c、蒸煮熬膠：將魚皮在95℃下進行蒸煮熬膠10h，取生成的魚皮膠，并對魚皮膠通過離心處理與油脂分離，離心速率為1000r/min。

d、酶解：將魚皮膠添加到含有中性蛋白酶的酶解液中進行酶解；其中中性蛋白酶的濃度為0.15wt%，酶解液質(zhì)量為魚皮膠質(zhì)量的3倍，酶解溫度為38℃，酶解液pH至控制在6-8，酶解時間為45min。

e、炭脫、板框過濾：向酶解液中添加質(zhì)量為酶解液1.5wt%的活性炭，并將酶解液加熱到75℃，脫色40min；將脫色后的酶解液轉(zhuǎn)移至板框過濾池內(nèi)進行過濾，取澄清液。

f、分離純化：將澄清液轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱中進行鼓氣起泡，并收集泡沫液，，在鼓氣的同時向泡沫分離柱中注水；鼓氣速率為4L/min，注水速率為0.2L/min，泡沫分離柱中液體的裝載高度與泡沫分離柱內(nèi)徑比為9:1，澄清液溫度保持在30℃；待收集的泡沫液滅泡后，用離子交換器對泡沫液進行重金屬分離；向重金屬分離后的泡沫液中添加質(zhì)量為泡沫液1.5%的磁性親和微球并分散均勻，靜置親和吸附60min后利用磁場使磁性親和微球聚集；分離出磁性親和微球后，用pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液對磁性親和微球進行洗脫，再次利用磁場分離出磁性親和微球后，得到洗脫液，將洗脫液在80℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

所述磁性親和微球由以下方法制得：將海藻酸鈉、聚乙二醇、殼聚糖、正庚烷、乙酸、水按質(zhì)量比2.5:1:2:0.5:4:100混合溶解，攪拌均勻后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A質(zhì)量5%的四氧化三鐵磁粉并分散均勻，得到混合液B；對混合液B進行超聲波分散，同時在15min內(nèi)向混合液B中勻速滴加混合液B質(zhì)量50%的乳化液，所述乳化液為體積占比為35%的司盤-80無水乙醇混合液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C質(zhì)量0.15%的98wt%的戊二醛和混合液C質(zhì)量0.75倍的3wt%的氯化鈣溶液，充分攪拌，靜置1.5h，生成磁性微球；利用磁場對液體中磁性微球進行聚集，取出磁性微球后進行清洗、干燥；將磁性微球浸泡在水中溶脹20min，然后取出磁性微球并添加到活化液中在40℃下活化60min，所述活化液由1mol/L的氫氧化鈉溶液、二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷按體積比5:1:0.6組成。磁性微球與活化液的固液比為0.75g/mL；活化后取出磁性微球并洗凈，將磁性微球與肝素按質(zhì)量比2:1進行混合，得到懸浮液，將懸浮液pH值調(diào)節(jié)至4-5，然后向懸浮液中添加懸浮液體積2倍的3wt%的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺，在4℃下靜置15h;生成磁性親和微球，最后從懸浮液中取出磁性親和微球，洗凈、干燥，備用。

g、濃縮：將洗脫液先后輸入雙效濃縮鍋和四效濃縮鍋中進行濃縮，制得濃縮液，所述濃縮液的折光度控制在5-6，濃縮后濃縮液在55℃下儲存。

h、膜過濾：將濃縮液通過二級0.22微米膜過濾器進行除雜除菌；其中膜過濾溫度小于45℃，一級過濾壓力小于0.25MPa，二級過濾壓力小于0.4MPa。

i、多肽分級：采用超濾膜或納濾膜對膜過濾后的濃縮液按分子量進行分離，得到目標分子量的水產(chǎn)多肽。

j、噴霧干燥：對水產(chǎn)多肽進行噴霧干燥；噴霧溫度為85℃，噴霧干燥后水產(chǎn)多肽的含水率小于等于5wt%。

所述油茶籽粕改性提取物的制備方法如下：取榨油后的油茶籽粕，研磨成粉，按液固比18mL/g將油茶籽粕添加到濃度為75wt%的乙醇溶液中并攪拌均勻，將乙醇溶液轉(zhuǎn)移至微波提取器中進行加熱提取，提取溫度為65℃，提取時間為3min，微波功率為900W；提取后得到粗提液，將粗提液過濾，取過濾液，向過濾液中添加過濾液體積0.03倍的30wt%雙氧水溶液，在55℃下加熱15min，然后向溶液中添加溶液質(zhì)量0.5%殼聚糖，在室溫下靜置15h，離心、過濾得到精提液，將精提液真空干燥后制得油茶籽粕提取物；將油茶籽粕提取物溶于酸性溶液中配得濃度為5wt%、pH為3-4的油茶籽粕提取物酸性溶液，在3h內(nèi)向油茶籽粕提取物酸性溶液中勻速滴加質(zhì)量為油茶籽粕提取物0.5倍的亞硒酸鈉進行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為65℃；反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)過濃縮、真空干燥制得油茶籽粕改性提取物。

所述海藻提取物的制備方法如下：將切碎的海藻碎末與水混合，打漿后制得濃度為20wt%的海藻漿料；向海藻漿料中添加等體積的檸檬酸鈉溶液，制得pH值為4-6的混合漿料，將混合漿料在65℃下提取3h，提取后過濾得到海藻粗提液，將海藻粗提液轉(zhuǎn)移至高壓滅菌鍋內(nèi)進行熟化滅菌；然后繼續(xù)對海藻粗提液通過微濾膜去除大分子雜蛋白，最后冷凍干燥后制得海藻提取物。

實施例2

一種無抗水產(chǎn)免疫增強劑的制備方法，包括以下步驟：

1）、將80份水產(chǎn)多肽、40份油茶籽粕改性提取物、10份蝦青素、10份巖藻黃質(zhì)、10份珍珠粉、40份海藻提取物、300份水混合均勻，制得組分A。所述水產(chǎn)多肽為分子量在200-800Da區(qū)間的鱈魚多肽。

2）、將20份氯化鈣溶解于500份水中，制得組分B。

3）、將所述組分A裝入注射器中以0.5mL/s的速率滴加到組分B中，生產(chǎn)微溶于水的固體沉淀；過濾取固體沉淀，干燥后得到無抗水產(chǎn)免疫增強劑。

其中，所述水產(chǎn)多肽的制備方法如下：

a、原料解凍清洗：對魚皮進行流水解凍，解凍時間為2h；完全解凍后將魚皮洗凈。

b、原料預(yù)處理：將魚皮添加到5倍濃度為5wt%的氫氧化鈉溶液中，在20℃下脫脂6h，然后取魚皮用水洗凈。

c、蒸煮熬膠：將魚皮在90℃下進行蒸煮熬膠12h，取生成的魚皮膠，并對魚皮膠通過離心處理與油脂分離，離心速率為1000r/min。

d、酶解：將魚皮膠添加到含有中性蛋白酶的酶解液中進行酶解；其中中性蛋白酶的濃度為0.05wt%，酶解液質(zhì)量為魚皮膠質(zhì)量的4倍，酶解溫度為30℃，酶解液pH至控制在6-8，酶解時間為60min。

e、炭脫、板框過濾：向酶解液中添加質(zhì)量為酶解液1wt%的活性炭，并將酶解液加熱到70℃，脫色50min；將脫色后的酶解液轉(zhuǎn)移至板框過濾池內(nèi)進行過濾，取澄清液。

f、分離純化：將澄清液轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱中進行鼓氣起泡，并收集泡沫液，，在鼓氣的同時向泡沫分離柱中注水；鼓氣速率為3L/min，注水速率為0.1L/min，泡沫分離柱中液體的裝載高度與泡沫分離柱內(nèi)徑比為8:1，澄清液溫度保持在25℃；待收集的泡沫液滅泡后，用離子交換器對泡沫液進行重金屬分離；向重金屬分離后的泡沫液中添加質(zhì)量為泡沫液1%的磁性親和微球并分散均勻，靜置親和吸附50min后利用磁場使磁性親和微球聚集；分離出磁性親和微球后，用pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液對磁性親和微球進行洗脫，再次利用磁場分離出磁性親和微球后，得到洗脫液，將洗脫液在75℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

所述磁性親和微球由以下方法制得：將海藻酸鈉、聚乙二醇、殼聚糖、正庚烷、乙酸、水按質(zhì)量比2:1:2:0.5:3:100混合溶解，攪拌均勻后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A質(zhì)量4%的四氧化三鐵磁粉并分散均勻，得到混合液B；對混合液B進行超聲波分散，同時在10min內(nèi)向混合液B中勻速滴加混合液B質(zhì)量40%的乳化液，所述乳化液為體積占比為30%的司盤-80無水乙醇混合液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C質(zhì)量0.1%的98wt%的戊二醛和混合液C質(zhì)量0.5倍的3.5wt%的氯化鈣溶液，充分攪拌，靜置1h，生成磁性微球；利用磁場對液體中磁性微球進行聚集，取出磁性微球后進行清洗、干燥；將磁性微球浸泡在水中溶脹15min，然后取出磁性微球并添加到活化液中在35℃下活化80min，所述活化液由1mol/L的氫氧化鈉溶液、二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷按體積比4:1:0.5組成。磁性微球與活化液的固液比為0.5g/mL；活化后取出磁性微球并洗凈，將磁性微球與肝素按質(zhì)量比1.5:1進行混合，得到懸浮液，將懸浮液pH值調(diào)節(jié)至4-5，然后向懸浮液中添加懸浮液體積1.5倍的3wt%的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺，在4℃下靜置12h;生成磁性親和微球，最后從懸浮液中取出磁性親和微球，洗凈、干燥，備用。

g、濃縮：將洗脫液先后輸入雙效濃縮鍋和四效濃縮鍋中進行濃縮，制得濃縮液，所述濃縮液的折光度控制在5-6，濃縮后濃縮液在50℃下儲存。

h、膜過濾：將濃縮液通過二級0.22微米膜過濾器進行除雜除菌；其中膜過濾溫度小于45℃，一級過濾壓力小于0.25MPa，二級過濾壓力小于0.4MPa。

i、多肽分級：采用超濾膜或納濾膜對膜過濾后的濃縮液按分子量進行分離，得到目標分子量的水產(chǎn)多肽。

j、噴霧干燥：對水產(chǎn)多肽進行噴霧干燥；噴霧溫度為80℃，噴霧干燥后水產(chǎn)多肽的含水率小于等于5wt%。

所述油茶籽粕改性提取物的制備方法如下：取榨油后的油茶籽粕，研磨成粉，按液固比16mL/g將油茶籽粕添加到濃度為70wt%的乙醇溶液中并攪拌均勻，將乙醇溶液轉(zhuǎn)移至微波提取器中進行加熱提取，提取溫度為60℃，提取時間為4min，微波功率為800W；提取后得到粗提液，將粗提液過濾，取過濾液，向過濾液中添加過濾液體積0.02倍的30wt%雙氧水溶液，在50℃下加熱20min，然后向溶液中添加溶液質(zhì)量0.4%殼聚糖，在室溫下靜置20h，離心、過濾得到精提液，將精提液真空干燥后制得油茶籽粕提取物；將油茶籽粕提取物溶于酸性溶液中配得濃度為4wt%、pH為3-4的油茶籽粕提取物酸性溶液，在2h內(nèi)向油茶籽粕提取物酸性溶液中勻速滴加質(zhì)量為油茶籽粕提取物0.4倍的亞硒酸鈉進行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為80℃；反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)過濃縮、真空干燥制得油茶籽粕改性提取物。

所述海藻提取物的制備方法如下：將切碎的海藻碎末與水混合，打漿后制得濃度為10wt%的海藻漿料；向海藻漿料中添加等體積的檸檬酸鈉溶液，制得pH值為4-6的混合漿料，將混合漿料在60℃下提取4h，提取后過濾得到海藻粗提液，將海藻粗提液轉(zhuǎn)移至高壓滅菌鍋內(nèi)進行熟化滅菌；然后繼續(xù)對海藻粗提液通過微濾膜去除大分子雜蛋白，最后冷凍干燥后制得海藻提取物。

實施例3

一種無抗水產(chǎn)免疫增強劑的制備方法，包括以下步驟：

1）、將120份水產(chǎn)多肽、60份油茶籽粕改性提取物、30份蝦青素、30份巖藻黃質(zhì)、20份珍珠粉、80份海藻提取物、500份水混合均勻，制得組分A。所述水產(chǎn)多肽為分子量在600-1000Da區(qū)間的金槍魚多肽。

2）、將30份氯化鈣溶解于700份水中，制得組分B。

3）、將所述組分A裝入注射器中以1.5mL/s的速率滴加到組分B中，生產(chǎn)微溶于水的固體沉淀；過濾取固體沉淀，干燥后得到無抗水產(chǎn)免疫增強劑。

其中，所述水產(chǎn)多肽的制備方法如下：

a、原料解凍清洗：對魚皮進行流水解凍，解凍時間為5h；完全解凍后將魚皮洗凈。

b、原料預(yù)處理：將魚皮添加到10倍濃度為3wt%的氫氧化鈉溶液中，在30℃下脫脂4h，然后取魚皮用水洗凈。

c、蒸煮熬膠：將魚皮在100℃下進行蒸煮熬膠8h，取生成的魚皮膠，并對魚皮膠通過離心處理與油脂分離，離心速率為1000r/min。

d、酶解：將魚皮膠添加到含有中性蛋白酶的酶解液中進行酶解；其中中性蛋白酶的濃度為0.25wt%，酶解液質(zhì)量為魚皮膠質(zhì)量的2倍，酶解溫度為45℃，酶解液pH至控制在6-8，酶解時間為30min。

e、炭脫、板框過濾：向酶解液中添加質(zhì)量為酶解液1-2wt%的活性炭，并將酶解液加熱到80℃，脫色30min；將脫色后的酶解液轉(zhuǎn)移至板框過濾池內(nèi)進行過濾，取澄清液。

f、分離純化：將澄清液轉(zhuǎn)移至泡沫分離柱中進行鼓氣起泡，并收集泡沫液，，在鼓氣的同時向泡沫分離柱中注水；鼓氣速率為5L/min，注水速率為0.3L/min，泡沫分離柱中液體的裝載高度與泡沫分離柱內(nèi)徑比為10:1，澄清液溫度保持在35℃；待收集的泡沫液滅泡后，用離子交換器對泡沫液進行重金屬分離；向重金屬分離后的泡沫液中添加質(zhì)量為泡沫液2%的磁性親和微球并分散均勻，靜置親和吸附70min后利用磁場使磁性親和微球聚集；分離出磁性親和微球后，用pH值為7.2的Tris-HCl緩沖液對磁性親和微球進行洗脫，再次利用磁場分離出磁性親和微球后，得到洗脫液，將洗脫液在85℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

所述磁性親和微球由以下方法制得：將海藻酸鈉、聚乙二醇、殼聚糖、正庚烷、乙酸、水按質(zhì)量比3:1:2:0.5:5:100混合溶解，攪拌均勻后制得混合液A；向混合液A中添加混合液A質(zhì)量6%的四氧化三鐵磁粉并分散均勻，得到混合液B；對混合液B進行超聲波分散，同時在20min內(nèi)向混合液B中勻速滴加混合液B質(zhì)量60%的乳化液，所述乳化液為體積占比為40%的司盤-80無水乙醇混合液，得到混合液C；先后向混合液C中添加混合液C質(zhì)量0.2%的98wt%的戊二醛和混合液C質(zhì)量1倍的2.5wt%的氯化鈣溶液，充分攪拌，靜置2h，生成磁性微球；利用磁場對液體中磁性微球進行聚集，取出磁性微球后進行清洗、干燥；將磁性微球浸泡在水中溶脹25min，然后取出磁性微球并添加到活化液中在45℃下活化40min，所述活化液由1mol/L的氫氧化鈉溶液、二甲基亞砜和環(huán)氧氯丙烷按體積比4:1:0.5組成。磁性微球與活化液的固液比為0.5g/mL；活化后取出磁性微球并洗凈，將磁性微球與肝素按質(zhì)量比1.5:1進行混合，得到懸浮液，將懸浮液pH值調(diào)節(jié)至4-5，然后向懸浮液中添加懸浮液體積1.5倍的3wt%的1-乙基-3-二甲氨丙基-碳二亞胺，在4℃下靜置18h;生成磁性親和微球，最后從懸浮液中取出磁性親和微球，洗凈、干燥，備用。

g、濃縮：將洗脫液先后輸入雙效濃縮鍋和四效濃縮鍋中進行濃縮，制得濃縮液，所述濃縮液的折光度控制在5-6，濃縮后濃縮液在60℃下儲存。

h、膜過濾：將濃縮液通過二級0.22微米膜過濾器進行除雜除菌；其中膜過濾溫度小于45℃，一級過濾壓力小于0.25MPa，二級過濾壓力小于0.4MPa。

i、多肽分級：采用超濾膜或納濾膜對膜過濾后的濃縮液按分子量進行分離，得到目標分子量的水產(chǎn)多肽。

j、噴霧干燥：對水產(chǎn)多肽進行噴霧干燥；噴霧溫度為80℃，噴霧干燥后水產(chǎn)多肽的含水率小于等于5wt%。

所述油茶籽粕改性提取物的制備方法如下：取榨油后的油茶籽粕，研磨成粉，按液固比20mL/g將油茶籽粕添加到濃度為70wt%的乙醇溶液中并攪拌均勻，將乙醇溶液轉(zhuǎn)移至微波提取器中進行加熱提取，提取溫度為70℃，提取時間為2min，微波功率為1000W；提取后得到粗提液，將粗提液過濾，取過濾液，向過濾液中添加過濾液體積0.04倍的30wt%雙氧水溶液，在60℃下加熱10min，然后向溶液中添加溶液質(zhì)量0.6%殼聚糖，在室溫下靜置20h，離心、過濾得到精提液，將精提液真空干燥后制得油茶籽粕提取物；將油茶籽粕提取物溶于酸性溶液中配得濃度為6wt%、pH為3-4的油茶籽粕提取物酸性溶液，在4h內(nèi)向油茶籽粕提取物酸性溶液中勻速滴加質(zhì)量為油茶籽粕提取物0.6倍的亞硒酸鈉進行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為60℃；反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)過濃縮、真空干燥制得油茶籽粕改性提取物。

所述海藻提取物的制備方法如下：將切碎的海藻碎末與水混合，打漿后制得濃度為30wt%的海藻漿料；向海藻漿料中添加等體積的檸檬酸鈉溶液，制得pH值為4-6的混合漿料，將混合漿料在80℃下提取2h，提取后過濾得到海藻粗提液，將海藻粗提液轉(zhuǎn)移至高壓滅菌鍋內(nèi)進行熟化滅菌；然后繼續(xù)對海藻粗提液通過微濾膜去除大分子雜蛋白，最后冷凍干燥后制得海藻提取物。

本發(fā)明中所用原料、設(shè)備，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常用原料、設(shè)備；本發(fā)明中所用方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。