專利名稱：與免疫增強劑相連的寡聚流感免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
本公開文本涉及用于預防流感感染的免疫原性組合物。
背景技術：
屬于Orthomyxoviridae科的甲型流感病毒能在人、鳥類或馴養(yǎng)的食用動物中導致流感?？苫谄浔砻嫣堑鞍祝毎?HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，將所述病毒分為不 同亞型。在16種已知的HA和九種NA中，有三種HA亞型(H1、H2和H3)和兩種NA亞型(NI和N2)最常在人中被發(fā)現(xiàn)。HlNl和H3N2是導致人季節(jié)性流行性感冒(flu)和流感全球流行的主要亞型。2009年的流感流行是豬源的甲型流感病毒HlNl導致的。其引起了對高度致病性的禽流感(HPAI)H5N1病毒流行潛勢的日益増加的關注。因此，為預防流感的未來爆發(fā)，迫切需要開發(fā)針對不同的甲型流感病毒毒株的有效且安全的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本文公開了用于預防流感病毒感染的免疫原性組合物。公開的免疫原性組合物是三聚體蛋白，其包含1)免疫原，例如流感血細胞凝集素序列；2)三聚化或穩(wěn)定化序列；和3)免疫增強劑序列。這三種序列是連續(xù)的，并且作為單個蛋白在哺乳動物表達系統(tǒng)中表達，或者，免疫原和免疫原和免疫增強劑以化學方式相連并被穩(wěn)定。在一種實施方式中，本文公開了用于誘導針對流感病毒的免疫應答的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含下述多肽，所述多肽包含免疫原和免疫增強劑。在另ー實施方式中，所述多肽還包含穩(wěn)定化序列。在其它ー些實施方式中，免疫原是流感病毒的血細胞凝集素序列、流感病毒的神經(jīng)氨酸酶序列或流感病毒的膜蛋白序列。在另ー實施方式中，免疫原是所述血細胞凝集素序列的片段，其選自HA1、HA2和RBD構成的組。在另ー實施方式中，免疫增強劑選自人IgG、C3d、Onchocerca volvulus ASP-1、clera 韋素和胞壁酸妝構成的組。在另ー實施方式中，穩(wěn)定化序列是折疊子(foldon)或GCN4。在還ー實施方式中，多肽是融合蛋白。在另ー實施方式中，多肽是在哺乳動物表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的。在另ー實施方式中，多肽選自HAl-hFc、HA-hFc、HAl+3-259-hFc、HAl-Fd-hFc、HA-Fd-hFc、HA2-Fd_hFc、HA-RBD-Fd-hFc 和 HAl+3-259-Fd_hFc 構成的組。在另ー實施方式中，免疫原與所述穩(wěn)定化序列相連，并且其中，所述穩(wěn)定化序列與免疫增強劑相連于單條多肽中。在還ー實施方式中，免疫原和免疫增強劑通過2，2_聯(lián)吡啶-5-羧酸(BPY)被化學穩(wěn)定。在又ー實施方式中，免疫原性組合物還包含佐劑。
本文還公開了誘導針對流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包括將權利要求I的免疫原性組合物施用給需要其的宿主，并且其中，所述免疫原性組合物在宿主中誘導針對感染性試劑攻擊的保護性免疫應答。在另ー實施方式中，免疫原性組合物還包含佐劑。


圖I示出了甲型流感H5N1病毒的血細胞凝集素(HA)蛋白[A/Anhui/1/2005 (H5N1)]的結構，還示出了含有HAl片段(氨基酸[aa]+3-322)的重組HAl-hFc和HAl-Fd-hFc蛋白、以及與人IgG Fe (hFc)融合的、包括H5N1病毒HA的aa+3-259的HAl片段的重組HA-3-259-Fd-hFc蛋白(有或沒有Fd序列)的構建。圖2示出了對表達的HAl-hFc和HAl-FchhFc蛋白的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(圖2a)和Western雜交印跡(圖2b)分析。圖3示出了對表達的HAl-hFc和HAl-Fd-hFc蛋白的快速蛋白液相色譜(FPLC)分祈。蛋白的分子量示于每個峰上，還示出了對應于經(jīng)計算的標準蛋白的結構。圖4 示出了 用重組 HAI-hFc、HA-Fd-hFc 和 HA-3-259-Fd_hFc 蛋白對 BALB/c 小鼠免疫的示意圖，對誘導的抗體和中和活性的檢測，用活H5N1病毒對經(jīng)疫苗接種小鼠的攻擊，用于交叉保護評估。圖5示出了在第O天(免疫前)和用重組HAl-hFc和HAl-Fd-hFc蛋白的第一次、第二次和第三次強化之后10天收集的小鼠血清(I 3000稀釋)的結合反應活性。圖 6 示出了 IgG 抗體(Ab)與 HAl-hFc、HAl-Fd-hFc 和 HA-3-259-Fd_hFc 融合蛋白結合的能力，這是在用HAI-hFc、HAl-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白進行最后一次免疫接種后10天收集的小鼠血清中檢測的。圖7示出了最后一次免疫接種后10天收集的小鼠血清的平均抗HAl-hFc、抗HA-Fd-hFc 和抗 HA-3-259-Fd_hFc IgG Ab 效價。圖8示出了 IgG Ab與沒有Fd和Fe的HAl蛋白結合的能力，這是在用HAl-hFc、HAl-Fd-hFc和HA-3-259-Fd-hFc蛋白進行最后一次免疫接種后10天收集的經(jīng)系列稀釋的小鼠血清中檢測的。圖9 示出了 IgG Ab 與 A/VietNam/1194/2004(VN/1194)_ 失活 H5N1 病毒結合的能力，這是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc進行最后一次免疫接種后10天收集的經(jīng)系列稀釋的小鼠血清中檢測的。圖10示出了 IgGl亞型Ab與HAl蛋白結合的能力，這是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc進行最后一次免疫接種后10天收集的經(jīng)系列稀釋的小鼠血清中檢測的。圖11示出了 IgG2a亞型Ab與HAl蛋白結合的能力，這是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc進行最后一次免疫接種后10天收集的經(jīng)系列稀釋的小鼠血清中檢測的。圖12示出了對經(jīng)HAl-hFc和經(jīng)HAl-FchhFc免疫接種的小鼠中IgGl和IgG2a Ab應答的比較。圖13示出了經(jīng)HAl-hFc每次強化免疫接種后的小鼠血清針對表達XJ-HA、QH_HA、 AH-HA和HK-HA的H5N1假病毒的中和Ab效價(NT5tl)，這是通過假病毒中和檢驗測量的。圖14示出了經(jīng)HAl-Fd-hFc每次強化免疫接種后的小鼠血清針對表達XJ-HA、QH-HA,AH-HA和HK-HA的H5N1假病毒的中和Ab效價(NT5tl)，這是通過假病毒中和檢驗測量的。
圖15示出了經(jīng)HAl-hFc和HAl-Fd-hFc每次強化免疫接種后的小鼠血清針對表達同源AH-HA的H5N1假病毒的中和Ab效價(NT5tl)，這是通過假病毒中和檢驗測量的。圖16示出了針對H5N1假病毒的異源(HK-HA、1194-HA、QH-HA和XJ-HA)和同源(AH-HA)毒株的HA的中和Ab效價(NT5tl)，這是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc進行最后一次免疫接種之后10天在小鼠血清中檢測的。圖17示出了針對H5N1假病毒的異源(HK-HA、1194-HA)和同源(AH-HA)毒株的HA的中和Ab效價(NT5tl)，這是在用HA-3-259-Fd-hFc蛋白進行最后一次免疫接種之后10天在小鼠血清中檢測的。圖18 示出了針對H5N1 活病毒的異源毒株A/Hong Kong/156/97 (HK/156)、VN/1194和 A/Shenzhen/406H/06 (SZ/406H)的中和 Ab 效價(NT5tl)，這是在用 HAI-hFc 和 HAl-FchhFc進行最后一次免疫接種之后10天在小鼠血清中檢測的。圖19示出了針對H5N1活病毒的異源毒株(HK/156，VN/1194和SZ/406H)的血細胞凝集素抑制(HI)抗體效價，這是在用HAl-hFc和HAl-Fd-hFc進行最后一次免疫接種之后10天在小鼠血清中檢測的。圖20示出了經(jīng)HAl-hFc和經(jīng)HAl-FchhFc免疫接種的小鼠針對致死性H5N1病毒攻擊的交叉保護，這是通過被H5N1活病毒的HK/156毒株(分支0(clade O))攻擊的小鼠的存活率(％)指示的。圖21示出了經(jīng)HAl-hFc和經(jīng)HAl-FchhFc免疫接種的小鼠針對致死性H5N1病毒攻擊的交叉保護，這是通過被H5N1活病毒的VN/1194毒株(分支I)攻擊的小鼠的存活率(% )指示的。圖22示出了經(jīng)HAl-hFc和經(jīng)HAl-FchhFc免疫接種的小鼠針對致死性H5N1病毒攻擊的交叉保護，這是通過被H5N1活病毒的SZ/406H毒株(分支2. 3. 4)攻擊的小鼠的存活率(％ )指示的。圖23示出了對經(jīng)H5N1病毒攻擊的小鼠肺組織中病毒RNA的定量,這是通過定量逆轉錄PCR(QRT-PCR)來進行的。在經(jīng)HAl-hFc和HAl-Fd-hFc蛋白免疫接種的小鼠的肺組織中，測定了 H5N1病毒的HK/156、VN/1194和SZ/406H毒株的病毒效價。圖24示出了用H5N1病毒的異源毒株進行致死性攻擊后、對經(jīng)HAl-hFc和經(jīng)HAl-Fd-hFc免疫接種的小鼠肺組織中的組織病理性改變的評估。來自注射了 PBS的小鼠的肺組織和未受感染的小鼠的肺組織分別被用作為陰性和正常對照。肺組織的所有切片用蘇木精和曙紅(H&E)染色，并在光學顯微鏡(放大倍率IOOx)下觀察。示出了經(jīng)H5N1毒株HK/156 (a), VN/1194(b)和SZ/406H(c)攻擊的、經(jīng)免疫接種的小鼠的組織病理學損傷的各幅圖像。術語定義為幫助對下文的詳述、實施例和所附權利要求的理解，參照下述定義可能是有用的。這些定義本身并非限制性的，其僅為讀者便利而提供?；颉盎颉痹诒疚闹惺褂脮r表示遺傳構建體的下述至少一部分，其具有該遺傳構建體所需的、或可修飾該遺傳構建體的表達的啟動子和/或其它調(diào)控序列。
宿主在本文中使用時“宿主”表示本發(fā)明的免疫原性組合物的接受體。示例性的宿主是哺乳動物，其包括但不限于靈長類、嚙齒類、母牛、馬、狗、貓、綿羊、山羊、豬和大象。在本發(fā)明的一種實施方式中，宿主是人。就本公開文本的目的而言，宿主與“被免疫接種者”同義。
免疫原在本文中使用吋，術語“免疫原”表示在宿主中引發(fā)免疫應答的任何底物。本公開文本的免疫原包括但不限于流感病毒的血細胞凝集素。免疫原性組合物在本文中使用吋,“免疫原性組合物”表示表達的蛋白或重組載體，其有或沒有佐劑，其體內(nèi)表達和/或分泌免疫原，并且其中，所述免疫原在宿主中引發(fā)免疫應答。本文公開的免疫原性組合物可以是或者可以不是免疫保護性的或治療性的。當免疫原性組合可預防、減輕、緩和或消除患者的疾病時，那么免疫原性組合物可任選地被稱為疫苗。但是，術語免疫原性組合物并非意欲被限制為疫苗。發(fā)明詳述為預防流感未來的爆發(fā)(尤其是高度致病性禽流感(HPAI)H5N1病毒的不同毒株的流行潛勢)，迫切需要開發(fā)針對不同的甲型流感病毒的有效且安全的疫苗。本公開文本描述了基于甲型流感病毒的表面血細胞凝集素(HA)蛋白來開發(fā)亞単元流感疫苗。該候選疫苗使用了哺乳動物細胞表達的、編碼HA的HAl片段的重組蛋白。其在經(jīng)免疫接種的動物中誘導強烈的免疫應答、有效的中和抗體和廣泛的交叉保護免疫力。引發(fā)的中和抗體被證實對假型的(pseudotyped)甲型流感病毒分離株的至少五種毒株(代表分支O、1、2. 2和2. 3)有效，井能針對活H5N1流感病毒的至少三種毒株(覆蓋分支O、I和2. 3. 4)進行中和和交叉保護。在本文公開的ー種實施方式中，提供了亞單元流感疫苗(免疫原性組合物)，其包含流感病毒的血細胞凝集素(HA)、穩(wěn)定化序列和免疫增強劑。在另ー實施方式中，免疫原性組合物被表達于哺乳動物表達系統(tǒng)中。能提供異亞型(heterosubtypic)免疫力的通用流感疫苗對公共健康來說將是極大的進歩。本文公開了候選流感疫苗，其中使用哺乳動物293T細胞表達的融合蛋白，該蛋白編碼甲型流感H5N1病毒[A/Anhui/1/2005 (H5N1)]的HAl片段(分別為殘基+3-322，SEQ ID NO. 2和殘基+3-259，SEQ ID NO. 30)。表達的重組蛋白與折疊子(Fd)序列(SEQ IDNo. 6)和人IgGl的Fe片段(SEQ ID NO. 7) (hFc)融合，其意圖于維持天然HA蛋白的三聚體結構以及增加穩(wěn)定性和免疫原性。折疊子是來自T4噬菌體纖維蛋白(fibritin)的三聚化或寡聚化模體(motif)。HA是同源三聚體嵌膜糖蛋白。其形狀像圓柱體，長大約13. 5納米。構成HA的三個相同單體被構建為中央α螺旋；三個球形頭含有唾液酸結合位點。HA單體作為前體被合成，前體再被糖基化，并被切割成兩個較小的多肽ΗΑ1和ΗΑ2亞單元。每個HA単體由通過ΗΑ2錨定在膜中的長螺旋鏈構成，并且頂部有大的HAl球體。在一種實施方式中，免疫增強劑是免疫球蛋白Fe片段。免疫球蛋白分子由通過ニ硫鍵保持在一起的兩條輕(L)鏈和兩條重(H)鏈構成，使得這些鏈形成Y型。Y的底部(重鏈的羧基端)在對免疫細胞活性的調(diào)節(jié)中具有作用。該區(qū)域被稱為Fe (片段，可結晶)區(qū)域，由兩條重鏈組成，取決于抗體的類型，該兩條重鏈貢獻兩個或三個恒定結構域。通過與特定的蛋白結合，F(xiàn)e區(qū)域確保每個抗體都產(chǎn)生針對給定抗原的合適免疫應答。Fe區(qū)域還與多種細胞受體(例如Fe受體)和其它免疫分子(例如補體蛋白)結合。由此其介導不同的生理效果，包括調(diào)理化(opsonization)，細胞裂解和肥大細胞、嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞的脫粒。本文公開的免疫原性組合物在測試動物中對有效免疫應答的誘導中具有高效力。它們能引發(fā)高度有效的中和抗體，所述抗體在基于細胞培養(yǎng)物的假病毒中和檢驗中，不僅能中和表達HA蛋白的H5N1病毒的同源A/Anhui/1/2005 (AH,分支2. 3)毒株，還能中和異源 A/Hong Kong/156/97 (HK,分支 O)、A/VietNam/1194/2004 (1194,分支 I)、A/Xinjiang/1/2006 (XJ，分支 2. 2)和 A/Qinghai/59/05 (QH,分支 2. 2)毒株。此夕卜，本文公開的免疫原性組合物能針對H5N1活病毒的至少三種不同毒株進行高度中和和完全交叉保護，所述毒株包括分支O :A/Hong Kong/156/97 (HK/156)，分支I AlVietNam/1194/2004 (VN/1194)和分支 2. 3. 4 A/Shenzhen/406H/06 (SZ/406H)。上述特征顯示，表達的融合蛋白具有被開發(fā)為用于預防未來的流感暴發(fā)的通用流感疫苗的高度潛力。此前設計的基于流感HA的疫苗不能在宿主中誘導高度有效和廣泛的中和應答，這最可能是因為這些疫苗不能正確維持穩(wěn)定和可溶的三聚體構象，或者它們?nèi)狈Ω咝У拿庖咴詠碚T導高水平的中和抗體。而本發(fā)明描述的免疫原性組合物解決了這些問題，這是 通過下述方式解決的1)向HAl添加Fd，三聚化模體，令HAl正確維持穩(wěn)定和可溶的三聚體構象；以及2) IgG的Fe片段與HAl-Fd的融合，其導致HAl-三聚體的免疫原性增強以誘導高水平的中和抗體，以及產(chǎn)生針對廣譜流感病毒的交叉保護。此外，F(xiàn)e片段具有通過其ニ硫鍵形成非共價ニ聚體的趨勢，這可令融合蛋白形成ニ聚體、六聚體或其它寡聚體形式，產(chǎn)生更具免疫原性的分子。誘導針對特定病毒的不同毒株的抗體的能力將能解決對所有流行性感冒疫苗生產(chǎn)商來說是顯著阻礙的ー種毒株-一種疫苗的問題。此外，描述的配方不利用雞蛋來培育病毒——這是重大優(yōu)點，不僅顯著降低生產(chǎn)時間和成本，還令孕婦和對雞蛋的蛋白過敏的人也能接受疫苗。表I可用于設計與免疫增強劑相連的寡聚流感疫苗的組分
權利要求
1.用于誘導針對流感病毒的免疫應答的免疫原性組合物，所述組合物包含下述多肽，所述多肽包含 免疫原；和 免疫增強劑。
2.權利要求I的免疫原性組合物,其中所述多肽還包含穩(wěn)定化序列。
3.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述免疫原是所述流感病毒的血細胞凝集素序列。
4.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述免疫原是所述流感病毒的神經(jīng)氨酸酶序列。
5.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述免疫原是所述流感病毒的膜蛋白序列。
6.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述免疫增強劑選自人IgG的Fe片段、C3d、Onchocerca volvulus ASP-1、clera毒素和胞壁酸妝構成的組。
7.權利要求2的免疫原性組合物，其中所述穩(wěn)定化序列是折疊子或GCN4。
8.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述多肽是融合蛋白。
9.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述多肽在哺乳動物表達系統(tǒng)中產(chǎn)生。
10.權利要求3的免疫原性組合物，其中所述免疫原是選自HA1、HA2和RBD構成的組的所述血細胞凝集素序列的片段。
11.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述多肽選自HAl-Fc、HA-hFc和HAl+3-259-hFc 構成的組。
12.權利要求2的免疫原性組合物，其中所述多肽選自HAl-Fd-hFc、HA-Fd-hFc、HA2-Fd-hFc、HA-RBD-Fd-hFc 和 HAl+3-259-Fd_hFc 構成的組。
13.權利要求2的免疫原性組合物，其中所述免疫原與所述穩(wěn)定化序列相連，并且其中所述穩(wěn)定化序列與所述免疫增強劑在單個多肽中相連。
14.權利要求I的免疫原性組合物，其中所述免疫原和所述免疫增強劑通過2，2-聯(lián)吡啶-5-羧酸(BPY)以化學方式被穩(wěn)定。
15.權利要求I的免疫原性組合物,其中所述免疫原性組合物還包含佐劑。
16.誘導針對流感病毒的保護性免疫應答的方法，所述方法包括 將權利要求I的免疫原性組合物施用給需要其的宿主； 以及，其中，所述免疫原性組合物在所述宿主中誘導針對感染性試劑攻擊的保護性免疫應答。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中所述免疫原性組合物還包含佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于預防流感病毒感染的免疫原性組合物，其中，所述免疫原性組合物包含流感病毒的免疫原例如血細胞凝集素，以及免疫增強劑例如人IgG的Fc片段，和任選地穩(wěn)定化序列。所述免疫原與穩(wěn)定化序列相連，所述穩(wěn)定化序列進而與免疫增強劑相連。
文檔編號A61K39/385GK102665755SQ201080045622
公開日2012年9月12日 申請日期2010年10月5日 優(yōu)先權日2009年10月9日
發(fā)明者姜世勃, 杜蘭英 申請人:紐約血庫公司