本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，特別涉及胡椒堿作為免疫調(diào)節(jié)藥物，在制備調(diào)節(jié)免疫細胞AMPK免疫代謝通路藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

AMPK是調(diào)控能量代謝的樞紐分子，不僅調(diào)控免疫代謝(immunometabolism)，也調(diào)控細胞的生存，影響一系列細胞代謝活動。如AMPK通過磷酸化激活脂代謝關(guān)鍵激酶ACC，抑制脂類合成；AMPK還可通過對Raptor(mTORC1復(fù)合體的組成蛋白)或TSC2(mTORC1抑制因子)的磷酸化，抑制mTORC1的活性，從而限制蛋白質(zhì)的合成和細胞增殖。

微生物感染、高脂肪飲食等能改變固有免疫細胞的能量代謝，反過來又影響固有免疫細胞的功能。體外研究表明，細菌脂多糖(LPS)、游離脂肪酸、高脂誘導(dǎo)肥胖等炎癥刺激可激活炎癥小體通路，并抑制巨噬細胞內(nèi)AMPK的活性，細胞能量代謝從氧化磷酸化向糖酵解途徑轉(zhuǎn)變，上調(diào)胞內(nèi)HIF-1α的水平，產(chǎn)生類似腫瘤細胞的Warburg效應(yīng)，并持續(xù)釋放炎癥介質(zhì)；同時改變細胞脂代謝通路，導(dǎo)致巨噬細胞脂類沉積，轉(zhuǎn)化為泡沫細胞或脂肪巨噬細胞，增加動脈粥樣硬化和肥胖風(fēng)險。推而廣之，AMPK可能通過對免疫代謝的調(diào)控，在其他慢性炎癥性疾病中也起著重要的作用。

另一方面，盡管上述炎癥刺激可抑制細胞AMPK活性，上調(diào)胞內(nèi)HIF-1α的水平，從而有利于細胞生存。但與正常細胞相比，這些激活的巨噬細胞失去了免疫上的可塑性，在細菌和壞死細胞釋放的ATP等第二信號的刺激下，反而強烈上調(diào)AMPK信號，同時細胞發(fā)生焦亡。因此，免疫細胞能量代謝通路的改變，尤其是AMPK信號通路的改變，在敗血癥時發(fā)生的細胞焦亡和臟器損傷(因而產(chǎn)生免疫抑制)過程中，也起著關(guān)鍵作用。

由此可見，利用藥物調(diào)節(jié)AMPK能量代謝通路，從而修正細胞免疫代謝途徑，對于預(yù)防和治療慢性炎癥性疾病、防止患者產(chǎn)生免疫抑制，具有重要的醫(yī)學(xué)意義。

胡椒作為中藥，其歷史悠久，可追溯至漢唐時期。胡椒入胃大腸經(jīng)，溫中散寒，下氣消痰?？捎糜谥委熚改c不適和癲癇。胡椒堿在治療結(jié)腸炎方面的用途，可見公開專利文件(申請公布號CN103690537A)。胡椒堿(Piperine)是胡椒的主要活性成分，化學(xué)名為(E,E)-1-[5-(1,3-苯并二氧戊環(huán)-5-基)-1-氧代-2,4-戊二烯基]-哌啶(分子式為C₁₇H₁₉NO₃，分子量為285.34)，可溶于乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等有機溶劑中。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

胡椒堿作為AMPK信號通路調(diào)節(jié)藥物的應(yīng)用，目前尚未見諸報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種胡椒堿在制備調(diào)節(jié)免疫細胞AMPK免疫代謝通路藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：胡椒堿在制備調(diào)節(jié)免疫細胞AMPK免疫代謝通路藥物中的應(yīng)用。

所述的調(diào)節(jié)免疫細胞AMPK免疫代謝通路藥物以胡椒堿為活性成分。

所述的調(diào)節(jié)免疫細胞AMPK免疫代謝通路藥物包括可接受的輔料。

所述的輔料優(yōu)選為緩釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、吸附載體、表面活性劑或潤滑劑。

所述的調(diào)節(jié)免疫細胞AMPK免疫代謝通路藥物還包括其他起配伍協(xié)同作用的有效成分。

所述的調(diào)節(jié)免疫細胞AMPK免疫代謝通路藥物可以為各種劑型，如片劑、顆粒劑、膠囊、滴丸、緩釋劑、口服液、注射劑等。

本發(fā)明的機理為：

本發(fā)明公開了胡椒堿在制備調(diào)節(jié)免疫細胞AMPK免疫代謝通路藥物中的應(yīng)用，即免疫細胞在細菌脂多糖(革蘭氏陰性細菌的病原相關(guān)分子模式)等炎癥刺激下，細胞AMPK代謝信號通路發(fā)生改變，在ATP等第二信號刺激下，AMPK代謝信號平衡被打破，其活性(磷酸化AMPK的水平)急劇上調(diào)，而經(jīng)胡椒堿預(yù)處理的細胞，上述AMPK活性受到抑制，細胞因而免于焦亡性死亡。因此，胡椒堿具有調(diào)節(jié)免疫代謝和免疫細胞功能的活性。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果：

胡椒堿具有明確的AMPK免疫代謝通路調(diào)節(jié)活性，對于修復(fù)細胞免疫代謝，防止其功能耗竭具有重要意義；胡椒堿顯著抑制細菌感染(LPS+ATP)上調(diào)的AMPK活性，可用于調(diào)節(jié)因細菌感染等受到抑制的免疫細胞的功能。胡椒堿的上述新的活性與用途，尚未見公開文獻報道。

附圖說明

圖1為實施例1小鼠單核巨噬細胞J774A.1細胞分別經(jīng)胡椒堿預(yù)處理、LPS激活和ATP處理后細胞蛋白的免疫印跡圖；PIP表示胡椒堿(piperine)。

圖2為對實施例1小鼠單核巨噬細胞J774A.1細胞分別經(jīng)胡椒堿預(yù)處理、LPS激活和ATP處理后細胞蛋白的免疫印跡圖中p-AMPK免疫印跡條帶的灰度分析直方圖；PIP表示胡椒堿(piperine)；***,P<0.001。

圖3為實施例2二甲雙胍(metformin)拮抗胡椒堿對小鼠單核巨噬細胞J774A.1中“LPS+ATP”激活A(yù)MPK的抑制作用的免疫印跡圖；PIP表示胡椒堿(piperine)。

圖4為對實施例2二甲雙胍(metformin)拮抗胡椒堿對小鼠單核巨噬細胞J774A.1中“LPS+ATP”激活A(yù)MPK的抑制作用的免疫印跡圖中p-AMPK免疫印跡條帶的灰度分析直方圖；PIP表示胡椒堿(piperine)；*,P<0.05。

圖5為實施例3小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDM)分別經(jīng)胡椒堿預(yù)處理、LPS激活和ATP處理后提取其蛋白的免疫印跡圖；PIP表示胡椒堿(piperine)。

圖6為對實施例3小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMDM)分別經(jīng)胡椒堿預(yù)處 理、LPS激活和ATP處理后提取其蛋白的免疫印跡圖中p-AMPK免疫印跡條帶的灰度分析直方圖。示意胡椒堿可抑制LPS+ATP激活的AMPK活性；PIP表示胡椒堿(piperine)；***,P<0.001。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例中所用到的材料：

胡椒堿(純度>98％)購自廣東省藥品檢驗所；脂多糖(LPS)(產(chǎn)品名稱Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4，目錄號：L4391)、ATP(目錄號：A6419)、二甲基亞砜(DMSO)(目錄號：D8418)、Tween-80(目錄號：P8074)均購自Sigma-Aldrich公司；二甲雙胍(Metformin，LKB1-AMPK激活劑)購自碧云天(Beyotime)公司(目錄號：S1741)?？筽-AMPK(目錄號：#2535)、抗AMPK(目錄號：#5831)、抗β-tubulin(目錄號：#2118)等抗體以及2×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液(2×SDS-loading buffer)購自Cell Signaling Technologies(CST)公司；小鼠巨噬細胞J774A.1購自中國科學(xué)院上海細胞庫；L929細胞系購自中國科學(xué)院昆明動物所細胞庫。細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清(FBS)等細胞培養(yǎng)用物質(zhì)均為Thermo/Gibco公司產(chǎn)品。

溶液配制方法：

DMEM完全培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基中添加下列成分：10％(v/v)胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素(終濃度)、100μg/mL鏈霉素(終濃度)。

LPS溶于PBS。

胡椒堿溶于DMSO中，儲存于-20℃保存，細胞培養(yǎng)實驗時，胡椒堿進一步用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

實施例1

(1)細胞培養(yǎng)和處理

小鼠巨噬細胞J774A.1培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基中。待細胞長至對數(shù)生 長期，種于6孔板中，細胞密度為2.5×10⁵/孔(2mL培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時。先經(jīng)不同濃度的胡椒堿(20,40,80μmol/L)預(yù)處理4小時，再加入50μg/ml LPS20μl，使其終濃度為500ng/ml，處理4小時激活細胞。用含0.1％FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌后，細胞培養(yǎng)液換成含0.1％FBS和4mmol/L ATP的DMEM培養(yǎng)基(1.2mL)處理1小時。

(2)AMPK活性的檢測方法：

細胞經(jīng)上述處理后，用2×十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液(2×SDS-loading buffer)裂解細胞，利用免疫印跡(Western blotting)方法檢測細胞中AMPK總蛋白水平(用AMPK抗體檢測)和磷酸化的AMPK蛋白水平(用p-AMPK抗體檢測)。用免疫印跡法檢測上述蛋白水平時，各樣品之間上樣量一致，由于β-tubulin為看家基因，在細胞內(nèi)表達恒定，因此以β-tubulin作為內(nèi)參，其表達水平用β-tubulin抗體檢測。

(3)實驗結(jié)果

由于AMPK被磷酸化后，具有相應(yīng)的蛋白激酶活性，因此磷酸化AMPK(p-AMPK)的水平，代表著AMPK的蛋白激酶活性。圖1為小鼠單核巨噬細胞J774A.1細胞經(jīng)上述處理后得到的免疫印跡圖；從圖1中可以看出，細胞經(jīng)LPS+ATP處理，磷酸化AMPK，即p-AMPK免疫印跡條帶顯著上調(diào)，說明細胞經(jīng)LPS+ATP處理顯著上調(diào)AMPK的活性，而“胡椒堿+LPS+ATP”組的p-AMPK免疫印跡條帶與“LPS+ATP”組相比顯著減弱，說明當(dāng)細胞經(jīng)加入不同濃度(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)的胡椒堿溶液預(yù)處理后，可顯著抑制上述由“LPS+ATP”激活的AMPK活性。

圖2為對圖1中p-AMPK免疫印跡條帶的灰度分析直方圖。表明胡椒堿可抑制LPS+ATP激活的AMPK活性；***表示P<0.001。

實施例2

(1)細胞培養(yǎng)和藥物處理：

小鼠單核巨噬細胞J774A.1細胞培養(yǎng)方法同“實施例1”。待細胞長至對數(shù)生長期，用DMEM完全培養(yǎng)基種于6孔板中，密度細胞密度為2.5×10⁵/孔 (2mL培養(yǎng)基)，先經(jīng)含80μmol/L胡椒堿的DMEM完全培養(yǎng)基預(yù)處理4小時，補加50μg/ml LPS 20μl，使其終濃度為500ng/ml，處理4小時激活細胞。然后，用含0.1％FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌后，細胞培養(yǎng)液換成含0.1％FBS和1mmol/L二甲雙胍(Metformin，AMPK激活劑)的DMEM培養(yǎng)基(1.2ml)，處理1小時。然后補加48μl濃度為100mmol/L的ATP溶液，使其終濃度4mmol/L，ATP處理1小時。

(2)AMPK活性的檢測方法：

同“實施例1”。

(3)實驗結(jié)果

圖3為二甲雙胍拮抗胡椒堿對小鼠單核巨噬細胞J774A.1細胞中“LPS+ATP”激活A(yù)MPK的抑制作用的免疫印跡圖；圖4是對圖3中p-AMPK免疫印跡條帶的灰度分析圖。從圖3中可以看出：細胞經(jīng)“LPS+ATP”處理可激活A(yù)MPK(圖中第二泳道p-AMPK水平急劇上調(diào))，但先經(jīng)胡椒堿預(yù)處理再經(jīng)“LPS+ATP”處理的細胞中，其胞內(nèi)p-AMPK水平(圖中第三泳道)被顯著抑制(與單獨“LPS+ATP”處理組的p-AMPK免疫印跡條帶相比)；然而，在加入ATP之前經(jīng)二甲雙胍處理的細胞中，其p-AMPK的水平(圖中第四泳道)再次上調(diào)(與“胡椒堿預(yù)處理+LPS+ATP”組相比)。該結(jié)果顯示AMPK激活劑二甲雙胍可拮抗胡椒堿對“LPS+ATP”誘導(dǎo)的p-AMPK的下調(diào)作用。

實施例3

(1)細胞培養(yǎng)及處理

小鼠成纖維細胞L929細胞購自中國科學(xué)院昆明動物研究所細胞庫。細胞培養(yǎng)方法參照Monack實驗室的操作程序(Stanford)，將1×10⁸個細胞培養(yǎng)于底面積為500cm²的三層培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為DMEM完全培養(yǎng)基，200mL，培養(yǎng)一周。

小鼠骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)的培養(yǎng)方法：C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。經(jīng)頸椎脫臼處死后，取其大腿骨，用注射器將骨髓細胞用DMEM培養(yǎng)基沖出，300×g離心。得到的細胞用BM-Mac 培養(yǎng)基(80％DMEM完全培養(yǎng)基+20％L929細胞培養(yǎng)上清)，培養(yǎng)于細菌培養(yǎng)皿(密度為5×10⁶/皿，培養(yǎng)基體積為8-10mL)。培養(yǎng)3天，添加10mL新的BM-Mac培養(yǎng)基；培養(yǎng)第5天，替換為上述新鮮BM-Mac培養(yǎng)基。培養(yǎng)第7天，收集細胞，培養(yǎng)于含10％FBS和含100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM(完全培養(yǎng)基)的6孔板中，細胞密度為2.3×10⁶/孔(2mL培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24小時。然后換成含不同濃度胡椒堿(40、80、160μmol/L)的DMEM完全培養(yǎng)基預(yù)處理4小時，再補加50μg/ml LPS 20μl，使其終濃度為500ng/ml，處理4小時激活細胞。最后，用含0.1％FBS的DMEM培養(yǎng)基洗滌后，細胞培養(yǎng)液換成含0.1％FBS和4mmol/L ATP的DMEM培養(yǎng)基(1.2mL)處理1小時。

(2)AMPK活性的檢測方法：

同“實施例1”。

(3)實驗結(jié)果

圖5為本實施例BMDM細胞分別經(jīng)胡椒堿預(yù)處理、LPS激活和ATP處理后細胞蛋白的免疫印跡圖；從圖5可以看出，BMDM細胞經(jīng)“LPS+ATP”處理，顯著上調(diào)AMPK的活性(圖中p-AMPK免疫印跡條帶水平顯著上調(diào))，當(dāng)細胞經(jīng)不同濃度(40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L)的胡椒堿溶液預(yù)處理后，上述由“LPS+ATP”激活的AMPK活性被顯著抑制，表現(xiàn)為“胡椒堿+LPS+ATP”組的p-AMPK免疫印跡條帶顯著弱于“LPS+ATP”組。

圖6為對附圖5中p-AMPK免疫印跡條帶的灰度分析直方圖。圖6表明胡椒堿可抑制LPS+ATP激活的AMPK活性；***表示P<0.001。

從上述實施例中可以看出，胡椒堿可調(diào)節(jié)因細菌感染、炎癥小體激活引起的免疫代謝信號通路，顯著下調(diào)LPS+ATP處理而急劇上調(diào)的AMPK活性(后者導(dǎo)致細胞焦亡性死亡)。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。