本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物，特別涉及一種具有靶向和示蹤功能的抗腫瘤高分子鍵合藥及其制備方法，屬生物醫(yī)用高分子領域。

背景技術：

脂肪族聚酯因其具有良好的生物相容性及可降解性而被廣泛地應用在生物醫(yī)用高分子領域，而高分子載體納米藥物因其尺寸小，同樣的具有生物相容性和可降解性、在血液循環(huán)系統(tǒng)中能夠保留較長的時間、載藥量可控同時能夠保護未達到作用部位而被提前降解以及容易進行表面修飾和化學改性等特點，被認為是最常用和最簡單的納米藥物傳輸載體，特別是后兩者已經(jīng)達到了臨床應用的標準。一般來說，根據(jù)藥物搭載機制可將其分為三類：通過共價鍵合的高分子鍵合藥、通過物理包裹的集合物囊泡和通過疏水作用制備的聚合物膠束，大部分的經(jīng)開發(fā)的高分子載體已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準作為靶向藥物的載體。

靶向治療是將靶分子與納米藥物通過共價鍵的接合使之能夠特異性定向蓄積于腫瘤組織，細胞甚至是細胞結合器，能大大的提高納米藥物的特異性，減少對正常組織的副作用，常用的靶分子有葉酸、半乳糖、抗體、生物素、核酸適配體，或者可以識別腫瘤組織表達受體的蛋白質等。

為了弄清生物體內的各種反應機理，人們必須對生物體內的各種細胞的相互作用進行監(jiān)控，過去常常以同位素和有機熒光染色體標記生物大分子和細胞來達到這一目的，但是眾所周知，同位素標記和有機熒光染色體標記在應用方面存在一系列的缺陷從而限制了其在生物活體內的應用，而量子點的出現(xiàn)解決了這一問題，其熒光壽命長、光穩(wěn)定性好和尺寸可控及穩(wěn)定而被看好成為下一代生物熒光標記物。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中的抗腫瘤聚合物前藥存在的降解性差，生物利用度低以及無法監(jiān)控等問題，本發(fā)明的第一個目的是在于提供一種可完全降解、載藥量可控，且具有腫瘤組織靶向和可監(jiān)控治療的抗腫瘤高分子鍵合藥。

本發(fā)明的另一個目的是提供了一種經(jīng)濟、高效和無毒的制備高純度抗腫瘤高分子鍵合藥的方法。

為了實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明提供了一種具有靶向和示蹤功能的抗腫瘤高分子鍵合藥，該抗腫瘤高分子鍵合藥具有式1結構：

其中，

A為羥基官能化的具有靶向作用的基團；

B為含羥基或/和氨基的抗腫瘤藥物基團；

D為配體基團；

Q為量子點；

x為20～100，y為1～100，z為1～100，n為8～17；

R₁、R₂、R₃為各自獨立地選自C₁～C₄的亞烷基；

優(yōu)選的方案，A為羥基官能化的生物素基團和/或羥基官能化的葉酸基團。

優(yōu)選的方案，B為紫杉醇基團、多西紫杉醇基團、喜樹堿基團、絲裂霉素C基團、阿霉素基團、表阿霉素基團中的至少一種。

優(yōu)選的方案，D為咪唑基團、吡啶基團、巰基基團中的至少一種。

優(yōu)選的方案，Q為CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdTe/SeCd、CdTe/CdSe、CdZnSe/ZnS、CdSe/CdS/ZnS中的至少一種。

本發(fā)明還提供了一種制備所述的具有靶向和示蹤功能的抗腫瘤高分子鍵合藥的方法，包括以下步驟：

1)將靶分子與二醇化合物進行酯化反應，得到羥基官能化靶分子；

2)采用所述羥基官能化靶分子引發(fā)含降冰片烯基團的丙交酯單體進行聚合反應，得到含靶分子和降冰片烯側基的聚丙交酯；所述含靶分子和降冰片烯側基的聚丙交酯與含疊氮取代基的聚乙二醇單甲醚進行疊氮-烯點擊反應，得到含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯；采用所述含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯引發(fā)含降冰片烯基團的丙交酯單體進行聚合反應，聚合反應產(chǎn)物進一步引發(fā)α位溴代己內酯進行聚合產(chǎn)物，得到式2載體聚合物；

3)將含巰基的羧酸化合物(巰基乙酸、巰基丙酸)與式2載體聚合物進行巰基-溴點擊反應，得到含羧側基的載體聚合物；所述含羧側基的載體聚合物通過N-羥基琥珀酰亞胺活化羧基后，與含氨基的量子點配體化合物進行酰胺化反應，得到式3含量子點配體側基的載體聚合物；

4)將含巰基的羧酸化合物(巰基乙酸、巰基丙酸)與式3含量子點配體側基的載體聚合物進行巰基-烯光點擊反應，得到含羧基和量子點配體側基的載體聚合物；所述含羧基和量子點配體側基的載體聚合物與含羥基或/和氨基的抗腫瘤藥物進行酯化或/和酰胺化反應，即得式4抗腫瘤高分子鍵合藥；

5)將所述抗腫瘤高分子鍵合藥與表面帶配體的量子點進行配體交換，即得具有靶向和示蹤功能的抗腫瘤高分子鍵合藥；

其中，

A為羥基官能化的具有靶向作用的基團；

B為含羥基或/和氨基的抗腫瘤藥物基團；

D為配體基團；

20≤x≤100，1≤y≤100、1≤z≤100，8≤n≤17；

R₁、R₂、R₃為各自獨立地選自C₁～C₄的亞烷基。

優(yōu)選的方案，靶分子為生物素和/或葉酸。

優(yōu)選的方案，抗腫瘤藥物為紫杉醇、多西紫杉醇、喜樹堿、絲裂霉素C、阿霉素、表阿霉素中的至少一種。

優(yōu)選的方案，含氨基的量子點配體化合物中配體為咪唑基團、吡啶基團或巰基基團。

優(yōu)選的方案，量子點為CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdTe/SeCd、CdTe/CdSe、CdZnSe/ZnS、CdSe/CdS/ZnS中的至少一種。較優(yōu)選的量子點CdSe/ZnS(表面配體為三辛基磷和三辛基磷)具有很好的生物相容性和熒光穩(wěn)定性；

本發(fā)明的方案中，配體交換產(chǎn)物分散在水相中，通過透析除去有機相，即得具有靶向和示蹤功能的抗腫瘤高分子鍵合藥納米粒子。

優(yōu)選的方案，酯化反應過程中均以N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)為縮合劑，其副產(chǎn)物易除去，避免了傳統(tǒng)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)縮合后劇毒物質二環(huán)己基脲(DCU)的產(chǎn)生。

本發(fā)明的羥基官能化靶分子是以含羧基靶分子中的羧基與二醇化合物中的一個羥基進行縮合反應得到的，經(jīng)分離、過柱和純化得到的羥基官能化靶分子。

本發(fā)明的含靶分子和降冰片烯側基聚丙交酯的制備方法：將L-丙交酯和N-溴代丁二酰亞胺(NBS)，以四氯化碳或苯為溶液，以過氧化二苯甲酰(BPO)做催化劑，在60～90℃下發(fā)生取代反應，得到溴代丙交酯；得到的溴代丙交酯以二氯甲烷溶劑中，在三乙胺的作用下，0～5℃下發(fā)生消去反應得到雙鍵丙交酯；得到的雙鍵丙交酯和新蒸環(huán)戊二烯在四氯化碳或苯溶液中，氬氣保護，60～90℃下，通過Diels-Alder反應后，得到含降冰片烯基團的丙交酯單體；以TBD或DBU為催化劑，羥基官能化靶分子為引發(fā)劑，二氯甲烷為溶劑-20～40℃下，引發(fā)含降冰片烯基團的丙交酯單體開環(huán)聚合后得到含靶分子和降冰片烯側基的聚丙交酯。

本發(fā)明的含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯通過含靶分子和降冰片烯側基的聚丙交酯與含疊氮取代基的聚乙二醇單甲醚(mOEG-azide)發(fā)生疊氮-烯環(huán)加成化學反應，得到含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯。

本發(fā)明的α位溴代己內酯是利用溴代劑與環(huán)己酮反應，生成α位溴代的環(huán)己酮，產(chǎn)物經(jīng)過柱分離得到。所得溴代環(huán)己酮與間氯過氧苯甲酸(m-CPBA)通過Baeyer-Villiger反應，生成α位溴代己內酯，產(chǎn)物同樣經(jīng)過硅膠柱分離，得到淺黃色油狀液體，經(jīng)過低溫重結晶得到白色固體。

本發(fā)明的載體聚合物(含靶分子、降冰片烯側基和溴取代基的兩親性三嵌段聚合物)以含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯為引發(fā)劑，依次開環(huán)含降冰片烯側基的丙交酯和α位溴代己內酯進行聚合得到，其中，開環(huán)聚合過程中以TBD或DBU為催化劑，二氯甲烷為溶劑，反應溫度為-20～40℃。

本發(fā)明的高分子鍵合藥載體聚合物與表面帶配體的量子點進行配體交換反應優(yōu)選的溶劑為四氫呋喃，反應條件為40℃，反應時間為2小時。

本發(fā)明的具有靶向和示蹤功能的抗腫瘤高分子鍵合藥的具體合成路線如下：以靶分子D-生物素(biotin)和抗腫瘤前藥紫杉醇(paclitaxel)為例，二醇化合物采用己二醇，含巰基的酸類化合物為3-巰基丙酸：

相對現(xiàn)有技術，本發(fā)明的技術方案帶來的有益效果：

1)本發(fā)明的技術方案以可降解的聚合物(聚丙交酯和聚己內酯嵌段共聚物)作為納米藥物載體，包裹量子點和抗腫瘤藥物構成納米粒子，既可以延長藥物在體內釋放的時間，提高藥效，又能對被標記的抗腫瘤藥物進行實時動態(tài)示蹤。而將納米載體的粒徑控制在適當?shù)牧椒秶鷥?如10～200nm)時，可實現(xiàn)腫瘤被動靶向作用，將納米載體外層修飾含有主動腫瘤靶向的小分子時，納米藥物載體就同時具有主動靶向和被動靶向，從而提高了抗腫瘤藥物的生物利用率；

2)本發(fā)明的高分子鍵合藥將具有靶向作用的生物素引入到可降解的兩親性載體聚合物的親水端從而使得到的納米膠束具有靶向性；

3)本發(fā)明的高分子鍵合藥的載體聚合物在丙交酯主鏈上引入低聚聚乙二醇，使其具有親水性且低聚聚乙二醇易于從人體排出；

4)本發(fā)明的高分子鍵合藥的載體聚合物采用的聚丙交酯和聚己內酯具有良好的生物可降解性和生物相容性；

5)本發(fā)明的高分子鍵合藥的載體聚合物采用的含咪唑基團的組胺等與量子點作用后的穩(wěn)定性好，且耐酸堿性高；

6)本發(fā)明技術方案通過點擊反應與低聚聚乙二醇單甲醚(mOEG)反應，無副反應、產(chǎn)率高，后處理簡單；

7)本發(fā)明的抗腫瘤前藥的制備方法成本低，產(chǎn)率高，安全無毒，可以廣泛應用。

附圖說明

【圖1】為羥基官能化的生物素的核磁氫譜圖；

【圖2】為含靶分子和降冰片烯側基的聚丙交酯的核磁氫譜圖；

【圖3】為含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯的核磁氫譜圖；

【圖4】A為含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯核磁氫譜圖，B為含靶分子、聚乙二醇單甲醚支鏈和降冰片烯側基的聚丙交酯核磁氫譜圖，C為載體聚合物(含靶分子、聚乙二醇單甲醚支鏈、降冰片烯側基及溴取代基的兩親性聚丙交酯-聚己內酯共聚物)核磁氫譜圖；

【圖5】A為含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯凝膠色譜圖，B為含靶分子、聚乙二醇單甲醚支鏈和降冰片烯側基的聚丙交酯凝膠色譜圖，C為載體聚合物(含靶分子、聚乙二醇單甲醚支鏈、降冰片烯側基及溴取代基的兩親性聚丙交酯-聚己內酯共聚物)凝膠色譜圖；

【圖6】D為含羧基側基的載體聚合物核磁氫譜圖，E為N-羥基琥珀酰亞胺活化的含羧基側基的載體聚合物的核磁氫譜圖，F(xiàn)為含咪唑基團的載體聚合物的核磁氫譜圖；

【圖7】為抗腫瘤高分子鍵合藥核磁氫譜圖；

【圖8】F為含咪唑基團的載體聚合物凝膠色譜圖，G為含羧基側基和咪唑側基的載體聚合物的凝膠色譜圖，H為抗腫瘤高分子鍵合藥的凝膠色譜圖；

【圖9】QDs為純的量子點，histamine-QDs為具有靶向和示蹤功能抗腫瘤高分子鍵合藥納米粒子的紫外吸收圖譜；

【圖10】QDs為純的量子點，histamine-QDs為具有靶向和示蹤功能抗腫瘤高分子鍵合藥納米粒子的熒光發(fā)光圖譜。

具體實施方式

以下實施例旨在對本發(fā)明內容進一步說明，而不是限制本發(fā)明權利要求的保護范圍。

實施例1

1、羥基官能化的D-生物素的制備：

稱取1.0g(1eq)的D-生物素和0.906g(1.1eq)的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)溶于5mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和2ml的二甲基亞砜(DMSO)的混合溶劑，冰浴下滴加到0.944g(2eq)的1，6-己二醇和催化量4-二甲氨基吡啶(DMAP)(0.1eq)的乙酸乙酯溶劑中，在氮氣保護下45℃反應36小時。反應結束后，旋掉乙酸乙酯，抽濾除去大部分的二環(huán)己基脲(DCU)，二氯甲烷稀釋濾液飽和的氯化鈉洗滌2遍，無水硫酸鎂干燥有機相，濃縮，過柱分離，乙酸乙酯∶石油醚＝1∶3除去DCU，乙酸乙酯淋洗得到產(chǎn)物。其結構見核磁圖譜圖1。說明該物質已成功合成。

2、含靶分子和降冰片烯側基的聚丙交酯的制備：

稱取1.0g(30eq)的降冰片烯丙交酯和0.057g(1eq)的羥基D-生物素于烘烤三次的干燥無氧的聚合管中，在氮氣的保護下加入催化量的1，5，7-三氮雜二環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(TBD)和2.5mL精制的二氯甲烷，室溫下反應24小時，反應結束后無水甲醇反復沉降三次，抽濾，干燥即得含靶分子和降冰片烯側基的聚丙交酯。其結構表征見核磁圖譜圖2。說明該聚合物己成功合成。通過調節(jié)降冰片烯丙交酯和羥基D-生物素的比例可以得到不同聚合度的含靶分子和降冰片烯側基的聚丙交酯。

3、含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯的制備：

稱取0.70g(1eq)的含靶分子和降冰片烯側基的聚丙交酯和4.0g(1.5eq)的含疊氮取代基的聚乙二醇單甲醚(Mn＝775)加入到干燥無氧的聚合管中，氮氣保護下加入5mL精制的乙酸乙酯，80℃反應72h。反應完成后，旋掉乙酸乙酯，二氯甲烷溶解，用無水乙醚反復沉降三次，真空干燥。即得含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯。其結構表征見核磁圖譜圖3和圖4(A)，分子量分布見圖5(A)。說明該聚合物已成功合成。

4、載體聚合物(含靶分子、聚乙二醇單甲醚支鏈、降冰片烯側基及溴取代基的兩親性聚丙交酯-聚己內酯共聚物)的制備：

稱取1.0g的含靶分子和聚乙二醇單甲醚支鏈的聚丙交酯于干燥無氧的聚合管中，氮氣保護下加入0.24g的含降冰片烯基團的丙交酯和催化量的1，5，7-三氮雜二環(huán)[4.4.0]癸-5-烯(TBD)以及2.5mL精制二氯甲烷，室溫下反應24小時，無水乙醚反復沉降三次，真空干燥，得到含靶分子、聚乙二醇單甲醚支鏈和降冰片烯側基的聚丙交酯，產(chǎn)物表征見圖4(B)及圖5(B)；將得到的含靶分子、聚乙二醇單甲醚支鏈和降冰片烯側基的聚丙交酯產(chǎn)物在加入到干燥無氧的聚合管中，氮氣保護下加入0.18g的α位溴代己內酯和催化量的催化劑TBD，注射器滴加3mL精制的二氯甲烷，室溫反應24小時，反應結束后，無水乙醚反復沉降三次，真空干燥即得載體聚合物。其結構表征見核磁圖譜圖4(C)，分子量分布見圖5(C)。說明該聚合物已成功合成。

5、含咪唑基團的載體聚合物的制備：

稱取0.8g載體聚合物于裝有磁石的50mL單口圓底燒瓶內，加入0.07g的巰基丙酸和10mL精制的乙腈溶液氬氣保護下滴加0.16g的三乙胺，滴加完成后，25℃下反應2小時，停止反應，過濾以除去大部分的季銨鹽，濾液濃縮，無水乙醚沉降2次，產(chǎn)物再經(jīng)水透析24小時，冷凍干燥，得到含羧基側基的載體聚合物，產(chǎn)物表征見圖6(D)，將產(chǎn)物轉移至裝有磁石的50mL圓底燒瓶中，加入0.083g N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)和催化量的DMAP以及10mL精制乙酸乙酯，在氮氣保護和不斷攪拌下加入0.075g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，將反應轉移至40℃下反應16小時，反應結束后，過濾，濾液濃縮，無水乙醚沉降三次，產(chǎn)物經(jīng)丙酮透析24小時，得到N-羥基琥珀酰亞胺活化的含羧基側基的載體聚合物，產(chǎn)物表征見圖6(E)，轉移至25mL圓底燒瓶，加入0.073g的組胺和8ml的無水甲醇，室溫下攪拌8小時，反應結束后，經(jīng)無水甲醇透析24小時干燥得純凈含咪唑基團的載體聚合物產(chǎn)物。其結構表征見核磁圖譜圖6(F)，分子量分布見圖8(F)。說明該聚合物已成功合成。

6、抗腫瘤高分子鍵合藥的制備

稱取0.3g含咪唑基團的載體聚合物和0.07g 3-巰基丙酸于50mL圓底燒瓶，并加入催化量的安息香二甲醚(DMPA)和15mL四氫呋喃，在紫外照射下反應30min，反應結束后，無水乙醚反復沉降三次，得到的產(chǎn)物分子量分布見圖8(G)，將得到的產(chǎn)物轉移至50mL圓底燒瓶，加入催化量的DMAP，在氮氣保護下逐滴滴加0.03g的紫杉醇和0.004g N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)的乙酸乙酯混合溶液，45℃下攪拌24小時，停止反應，旋蒸濃縮，異丙醇反復沉降三次，即得抗腫瘤高分子鍵合藥，其核磁圖譜見圖7，分子量分布見圖8(H)。說明該聚合物已成功合成。

7、具有靶向和示蹤功能的抗腫瘤高分子鍵合藥納米粒子的制備

量取10μL CdSe/ZnS量子點(表面配體為三辛基膦和三辛基氧化膦)的環(huán)己烷溶液于10mL圓底燒瓶中，旋干溶劑，加入1mL四氫呋喃將其溶解，另外稱取50mg抗腫瘤高分子鍵合藥溶于2mL四氫呋喃，在氣體保護的條件下將兩者混合，40℃下反應2小時，停止反應，旋蒸濃縮，環(huán)己烷反復沉降三次，產(chǎn)物干燥，用3mL丙酮溶解，逐滴加入高速攪拌下的20mL中，滴加完畢，將溶液至于透析袋中(Cut off Mn＝3500)，用二次水透析24小時以除去丙酮。即得具有靶向和示蹤功能的抗腫瘤高分子鍵合藥納米粒子。其紫外吸收圖譜見圖9，熒光圖譜見圖10。