本發(fā)明屬于藥物載體技術(shù)，具體涉及一種具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡及其制備方法與在核酸藥物輸送上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因療法是指把具有特異性功能的基因通過(guò)一定方法輸送到生物體特異性組織細(xì)胞來(lái)治療疾病的過(guò)程。利用已能精準(zhǔn)識(shí)別的多種致病基因來(lái)替代組織細(xì)胞內(nèi)的病變基因或抑制病變基因的表達(dá)，已可以治愈多種遺傳性疾?。灰部赏ㄟ^(guò)遞送功能性基因促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成、調(diào)控毒性蛋白或藥物前體活化酶的合成來(lái)治療非遺傳性疾病。但是基因藥物易被血清中的核酸酶降解，且進(jìn)入細(xì)胞能力差因此很難細(xì)胞核進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。因此設(shè)計(jì)能夠保護(hù)DNA不被降解且安全輸送進(jìn)入靶細(xì)胞核的載體十分重要。

近年來(lái)，小干擾RNAs(siRNA)作為一種新型核酸藥物用于治療包括癌癥在內(nèi)的多種不治之癥。值得注意的是，治療眼疾及呼吸道疾病的一系列siRNA正在臨床試驗(yàn)中。不同于DNA的是，siRNA的分子量小21-23個(gè)堿基對(duì)，只需要在細(xì)胞質(zhì)中，而不需要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用，具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，同樣由于非特異性脫靶、免疫源性高、siRNA易于降解和細(xì)胞攝取低等問(wèn)題，siRNAs進(jìn)一步發(fā)展成為抗腫瘤藥物仍然面臨巨大挑戰(zhàn)，探究載體如何高效復(fù)合遞送siRNA成為一個(gè)迫切需要科學(xué)家解決的難題。

以病毒為核酸藥物的載體是利用滅活后的病毒衣殼來(lái)攜帶核酸進(jìn)入細(xì)胞，雖然轉(zhuǎn)染效率很高，但安全性堪憂，存在高免疫原性和潛在的致癌性。因此非病毒基因載體尤其是陽(yáng)離子聚合物基因載體成為研究的熱點(diǎn)。聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）是繼聚賴氨酸之后研究最多的聚合物轉(zhuǎn)染試劑，具有較高的正電荷密度，每隔二個(gè)碳原子就是一個(gè)可質(zhì)子化的氨基氮原子，使聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的質(zhì)子海綿體(proton sponge)。支化結(jié)構(gòu)的PEI具有伯、仲、叔三種胺，具有比線性更好的基因復(fù)合效率和轉(zhuǎn)染效率。但是研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有PEI載體存在基因復(fù)合和轉(zhuǎn)染效率高但細(xì)胞毒性很大、細(xì)胞毒性雖小但其基因復(fù)合和轉(zhuǎn)染效率差的缺陷。用含陽(yáng)離子的脂質(zhì)體和聚離子復(fù)合物等納米載體來(lái)裝載核酸的研究結(jié)果也并不令人滿意，存在著體內(nèi)不穩(wěn)定、靶向性差、基因復(fù)合和轉(zhuǎn)染效率不高、仍有細(xì)胞毒性的問(wèn)題。目前尚無(wú)能同時(shí)解決這些問(wèn)題的方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)的生物可降解聚合物囊泡。

為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡，由聚合物自組裝后交聯(lián)得到；所述聚合物的分子鏈包括依次連接的親水鏈段、疏水鏈段以及PEI分子；所述疏水鏈段包括聚碳酸酯鏈段和/或聚酯鏈段；所述親水鏈段的分子量為3000-10000Da；疏水鏈段的分子量為親水鏈段分子量的2.3-8.4倍；PEI分子的分子量為親水鏈段分子量的20%-60%

優(yōu)選的，本發(fā)明的聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

其中，R₁選自以下基團(tuán)中的一種：

R₂選自以下基團(tuán)中的一種：

、；

PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

、

本發(fā)明的聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）為支化和線性兩種，得到聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為以下結(jié)構(gòu)式中的一種：

所述聚合物中，PEG的分子量為3000-10000Da；PTMC或PDLLA的總分子量為PEG分子量的2-6倍；PDTC的總分子量為PTMC或PDLLA總分子量的15%-40%；PEI分子的分子量為PEG分子量的20%-60%。

本發(fā)明的聚合物中，限定PEI的結(jié)構(gòu)與分子量，作為載體時(shí)毒性小，結(jié)合PEG鏈段與疏水鏈段，可以形成良好的藥物包載效果，即使當(dāng)siRNA含量高達(dá)80wt.%，該囊泡仍可以完全、緊實(shí)包裹siRNA；同時(shí)本發(fā)明的聚合物避免了現(xiàn)有PEI通過(guò)物理纏繞的方式結(jié)合核酸帶來(lái)的不穩(wěn)定、帶正電易與細(xì)胞結(jié)合而遷移力差、釋放效率差的缺陷；通過(guò)靜電作用力結(jié)合核酸，再被交聯(lián)的囊泡膜和外界分隔，避免在輸送過(guò)程被細(xì)胞黏附而造成損失和毒副作用，能夠高效遷移至病灶處，并在體內(nèi)高濃度鹽和還原劑GSH的作用下，快速釋放核酸藥物，解決疾病問(wèn)題。

本發(fā)明中，聚合物囊泡為具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的還原敏感可逆交聯(lián)、細(xì)胞內(nèi)可解交聯(lián)的生物可降解聚合物囊泡；所述聚合物為PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI，即聚合物由PEG親水鏈段、疏水鏈段以及PEI分子組成，其中疏水鏈段的結(jié)構(gòu)為：

；

當(dāng)R₂為時(shí)，為PTMC鏈段；當(dāng)R₂為時(shí)，為PDLLA鏈段，即疏水鏈段由PTMC-PDTC或者PDLLA-PDTC組成。

優(yōu)選方案為：PEG分子量為4000-8000Da；PTMC或PDLLA總分子量為PEG分子量的2.5-5倍；PDTC總分子量為PTMC或PDLLA總分子量的18%-38%；PEI的分子量為PEG單元分子量的25%-50%。

上述三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI，其中中間嵌段的TMC或者DLLA與DTC呈無(wú)規(guī)排列；PEI分子量小于PEG分子量，在自組裝、交聯(lián)后得到具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的交聯(lián)的聚合物囊泡，囊泡膜的內(nèi)殼為PEI用于復(fù)合核酸藥物如DNA和siRNA，并能通過(guò)質(zhì)子海綿效應(yīng)逃逸內(nèi)涵體；囊泡膜為可逆交聯(lián)的生物可降解且生物相容性好的PTMC或者PDLLA，側(cè)鏈的二硫戊環(huán)類似人體天然的抗氧化劑硫辛酸，可提供還原敏感的可逆交聯(lián)，不但支持生物藥物在血液中的長(zhǎng)循環(huán)，還可保證在細(xì)胞內(nèi)快速解交聯(lián)，釋放核酸藥物到靶細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡的制備方法，包括以下步驟：

（1）將PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(DLLA-DTC)的末端用羥基活化劑比如氯甲酸對(duì)硝基苯酯NPC活化，再與PEI反應(yīng)制得PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；

（2）在PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)–PEI的PEG端偶聯(lián)腫瘤特異性靶向分子，得到靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；

（3）以PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI為原料，通過(guò)溶劑置換法制備具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI為原料，通過(guò)溶劑置換法制備腫瘤靶向、具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI為原料，通過(guò)溶劑置換法制備腫瘤靶向、具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)為原料，通過(guò)溶劑置換法制備具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡；或者以PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)為原料，通過(guò)溶劑置換法制備具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡。

優(yōu)選以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)為原料，或者以PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和靶向PEG-P(DLLA-DTC)為原料，共混自組裝、裝載核酸、交聯(lián)得到腫瘤主動(dòng)靶向、具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的聚合物囊泡，外殼為以PEG為背景、靶向分子對(duì)癌細(xì)胞可高特異性結(jié)合，增加載體的靶向性。靶向分子可以為多肽cNGQ、cRGD及CC9或是葉酸、半乳糖。比如通過(guò)PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI和偶聯(lián)了腫瘤主動(dòng)靶向分子的二嵌段聚合物如cNGQ-PEG-P(TMC-DTC)混合，共自組裝、裝載核酸、交聯(lián)后得到腫瘤主動(dòng)靶向、具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的聚合物囊泡(cNGQ/RCCPs)；所述cNGQ-PEG-P(TMC-DTC)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

。

上述制備方法，具體包括以下步驟：

步驟（1）為將PEG-P(TMC-DTC)或者PEG-P(DLLA-DTC)、羥基活化劑氯甲酸對(duì)硝基苯酯NPC溶于干燥的溶劑中反應(yīng)，然后沉淀、過(guò)濾、真空干燥得到活化的PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(DLLA-DTC)-NPC；將PEG-P(TMC-DTC)-NPC或者PEG-P(DLLA-DTC)-NPC溶液滴加到PEI溶液中反應(yīng)后，透析、沉淀、抽濾、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI；步驟（2）為將得到聚合物溶于帶有靶向分子的有機(jī)溶劑如DSMO或DMF中；步驟（3）為將原料溶液中加入非離子緩沖溶液中如HEPES，室溫放置少許后在相同緩沖溶液中透析，室溫孵育交聯(lián)，得到具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡。本發(fā)明可以在加或不加還原劑如二硫代蘇糖醇（DTT）和谷胱甘肽（GSH）下室溫交聯(lián)得到具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡。

比如：

將PEG-P(TMC-DTC)的末端羥基用羥基活化劑氯甲酸對(duì)硝基苯酯NPC活化，再與PEI的端基伯胺反應(yīng)制得PEG-P(TMC-DTC)-PEI，具體為，PEG-P(TMC-DTC)和NPC溶于干燥的二氯甲烷(DCM)中冰水浴下反應(yīng)12-24小時(shí)，然后在冰乙醚中沉淀、過(guò)濾、真空干燥得到PEG-P(TMC-DTC)-NPC；然后將PEG-P(TMC-DTC)-NPC溶于干燥DCM，滴加到PEI的DCM中30-40℃下反應(yīng)12-24小時(shí)后，在DCM和甲醇(體積比為1:1)的介質(zhì)中透析24-48小時(shí)，接著沉淀、抽濾、真空干燥得到產(chǎn)物PEG-P(TMC-DTC)-PEI；

以PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)為原料，通過(guò)溶劑置換法制備具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的自交聯(lián)聚合物囊泡；具體為把PEG-P(TMC-DTC)-PEI和靶向PEG-P(TMC-DTC)的DMDO溶液混合后加入HEPES緩沖液中，室溫下放置過(guò)夜、透析、加或不加還原劑如二硫代蘇糖醇（DTT）和谷胱甘肽（GSH）孵育4 h，得到具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物囊泡。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種抗腫瘤藥物，由上述具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡裝載核酸藥物得到，如DNA或siRNA。本發(fā)明的藥物以主動(dòng)靶向、還原敏感可逆交聯(lián)的納米囊泡為載體、裝載核酸，在小鼠體內(nèi)治療腫瘤表現(xiàn)了卓越的療效和低毒性。

上述抗腫瘤藥物的制備方法，為以下制備方法中的一種：

（1）將PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液與核酸緩沖溶液、非離子緩沖溶液混合，室溫下放置，然后透析、交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；

（2）將PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液與核酸緩沖溶液、非離子緩沖溶液混合，室溫下放置，然后透析、交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；

（3）將PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液與核酸緩沖溶液、非離子緩沖溶液混合，室溫下放置，然后透析、交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；

（4）將PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液與核酸緩沖溶液、非離子緩沖溶液混合，室溫下放置，然后透析、交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；

（5）將PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)溶液與核酸緩沖溶液、非離子緩沖溶液混合，室溫下放置，然后透析、交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物。

本發(fā)明中，室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物。優(yōu)選的，將PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液與核酸siRNA溶液混合，再加入非離子緩沖溶液中如HEPES中，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；將PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液與核酸siRNA溶液混合，再加入非離子緩沖溶液中如HEPES中，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；將PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液與核酸siRNA溶液混合，再加入非離子緩沖溶液中如HEPES中，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；將PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液與核酸siRNA溶液混合，再加入非離子緩沖溶液中如HEPES中，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；將PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)溶液與核酸siRNA溶液混合，再加入非離子緩沖溶液中如HEPES中，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物。

優(yōu)選的，將核酸DNA溶液、非離子緩沖溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；將核酸DNA溶液、非離子緩沖溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)溶液，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；將核酸DNA溶液、非離子緩沖溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)溶液，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；將核酸DNA溶液、非離子緩沖溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(TMC-DTC)-PEI溶液，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物；將核酸DNA溶液、非離子緩沖溶液中如HEPES混合，再加入PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液和靶向PEG-P(DLLA-DTC)-PEI溶液，室溫下放置，然后透析、室溫孵育交聯(lián)，得到抗腫瘤藥物。

其中，聚合物溶液、核酸溶液和非離子緩沖溶液三者共同混合得到包載核酸藥物的具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡，優(yōu)選條件為聚合物溶液與siRNA溶液混合后再加入HEPES中，或聚合物溶液加入至含DNA的HEPES緩沖溶液中。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡作為核酸藥物載體的應(yīng)用，比如作為siRNA和DNA載體的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開(kāi)了上述具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的可逆交聯(lián)生物可降解聚合物囊泡在制備生物抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種聚合物，其特征在于，所述聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

其中， R₁選自以下基團(tuán)中的一種：

R₂選自以下基團(tuán)中的一種：

、；

PEI的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

、

所述聚合物中，PEG的分子量為3000-10000Da；PTMC或PDLLA的總分子量為PEG分子量的2-6倍；PDTC的總分子量為PTMC或PDLLA總分子量的15%-40%；PEI分子的分子量為PEG單元分子量的20%-60%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1. 本發(fā)明設(shè)計(jì)了具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物囊泡用于核酸的體內(nèi)傳遞；首先合成了三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI，PEI分子量為PEG分子量的20%-60%，在聚合物自組裝、交聯(lián)后得到具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的交聯(lián)的聚合物囊泡，囊泡膜的內(nèi)殼為PEI用于復(fù)合核酸如siRNA和DNA；囊泡膜為可逆交聯(lián)的生物可降解且生物相容性好的PTMC，側(cè)鏈的二硫戊環(huán)類似人體天然抗氧化劑硫辛酸，可提供還原敏感的可逆交聯(lián)，不但支持納米藥物在血液中長(zhǎng)循環(huán)，還可保證在細(xì)胞內(nèi)快速解交聯(lián)，釋放核酸到靶細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)；外殼以PEG為背景同時(shí)具有靶向分子，對(duì)癌細(xì)胞可高特異性結(jié)合。

2. 本發(fā)明通過(guò)對(duì)具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物囊泡來(lái)復(fù)合功能性siRNA和DNA藥物、其體內(nèi)外基因沉默效果、體內(nèi)血液循環(huán)及生物分布、治療荷原位肺癌小鼠的情況和毒副作用研究，表明該囊泡裝載核酸體系擁有多種獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，包括制備的簡(jiǎn)易操控性、杰出的生物相容性、對(duì)核酸極好的控制釋放性(生理?xiàng)l件泄漏量低/腫瘤細(xì)胞內(nèi)快速釋放)、超強(qiáng)的體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性、對(duì)癌細(xì)胞的優(yōu)越靶向性、顯著的特異性基因沉默能、卓越的抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的能力；因此，本發(fā)明的囊泡體系有望成為集便捷、穩(wěn)定、多功能等優(yōu)點(diǎn)于一身的納米系統(tǒng)平臺(tái)，用于高效、主動(dòng)靶向輸送核酸藥物至腫瘤包括原位腫瘤。

3. 本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的、還原敏感可逆交聯(lián)、細(xì)胞內(nèi)可解交聯(lián)的生物可降解聚合物囊泡，其囊泡膜的內(nèi)表面由低分子量的PEI（600-6000Da）組成，用于高效裝載核酸，交聯(lián)的囊泡膜可保護(hù)核酸不被降解，并可在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)，囊泡的納米尺寸以及腫瘤特異性靶向使得囊泡可輸送核酸高效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境下，囊泡解交聯(lián)，核酸解離釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；這里限定的低分子量PEI作為載體時(shí)毒性小，在結(jié)合PEG鏈段與疏水鏈段后卻可以形成良好的藥物包載效果；同時(shí)本發(fā)明的聚合物避免了現(xiàn)有PEI通過(guò)靜電相互作用結(jié)合核酸形成的復(fù)合物帶來(lái)的不穩(wěn)定、帶正電易與細(xì)胞結(jié)合而遷移力差、釋放效率差的缺陷。

4.本發(fā)明的具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的聚合物囊泡為交聯(lián)囊泡，PEI配合親水鏈段以及疏水鏈段，從而具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)循環(huán)良好，能夠即使當(dāng)siRNA含量高達(dá)80 wt.%，該囊泡仍可以完全、緊實(shí)包裹siRNA，證明siRNA-cNGQ/RCCPs穩(wěn)定性優(yōu)異，當(dāng)它在10 mM GSH存在下孵育20 h后發(fā)現(xiàn)，由于交聯(lián)囊泡的解交聯(lián)及溶脹大部分siRNA釋放出來(lái)；是一種良好的siRNA控釋載體，用于腫瘤治療。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例一中PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k核磁譜圖；

圖2為實(shí)施例七中載siScramble交聯(lián)囊泡siScramble-cNGQ/RCCPs的粒徑分布及TEM圖；

圖3為實(shí)施例九中載DNA交聯(lián)囊泡DNA-RCCPs的凝膠電泳圖

圖4 是實(shí)施例十二中載siScramble交聯(lián)囊泡siScramble-cNGQ/RCCPs的凝膠電泳圖；

圖5 是實(shí)施例十三中載siRNA交聯(lián)囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs對(duì)A549肺癌細(xì)胞的流式結(jié)果圖；

圖6是實(shí)施例十三中載siRNA交聯(lián)囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs對(duì)A549肺癌細(xì)胞的共聚焦顯微鏡（CLSM）結(jié)果圖；

圖7是實(shí)施例十四中載siGL3交聯(lián)囊泡siGL3-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc肺癌細(xì)胞的熒光素基因沉默結(jié)果圖；

圖8為實(shí)施例十五中載siPLK1交聯(lián)囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc肺癌細(xì)胞的PLK1基因沉默結(jié)果圖；

圖9為實(shí)施例十六中載siGL3交聯(lián)囊泡siGL3-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果圖；

圖10為實(shí)施例十六中載siGL3交聯(lián)囊泡siGL3-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型的基因沉默圖；

圖11為實(shí)施例十六中載siGL3交聯(lián)囊泡siGL3-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型的基因沉默定量圖；

圖12為是實(shí)施例十八中載siRNA交聯(lián)囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型的藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果圖；

圖13為是實(shí)施例十八中載siRNA交聯(lián)囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型的成像結(jié)果圖；

圖14為是實(shí)施例十九中載siRNA交聯(lián)囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型的體外熒光成像圖；

圖15為是實(shí)施例十九中載siRNA交聯(lián)囊泡siCy5-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型的生物分布圖；

圖16為實(shí)施例二十中載siPLK1交聯(lián)囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型的治療成像圖；

圖17為實(shí)施例二十中載siPLK1交聯(lián)囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型治療后的器官成像圖；

圖18為實(shí)施例二十中載載siPLK1交聯(lián)囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型的治療實(shí)驗(yàn)，其中A為熒光定量曲線，B為小鼠治療后肺部圖片，C為體重變化曲線，D為生存曲線；

圖19為實(shí)施例二十中載siPLK1交聯(lián)囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs對(duì)A549-Luc原位肺癌模型治療后各器官組織學(xué)分析。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例一 PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k嵌段共聚物的合成

PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI的合成分為兩步，首先是開(kāi)環(huán)聚合制備PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)二嵌段共聚物，具體操作如下，在氮?dú)馐痔紫鋬?nèi)，依次稱取MeO-PEG-OH (M_n=5.0 kg/mol, 0.50 g, 100 μmol), TMC (2.0 g, 19.2 mmol) 和DTC (0.50 g, 2.60 mmol) 并溶解在二氯甲烷(DCM，7.0 mL)中，快速加入開(kāi)環(huán)聚合催化劑雙（雙三甲基硅基）胺鋅(29 mg, 75 μmol)。密閉反應(yīng)器密封好放置40 °C油浴中磁力攪拌下反應(yīng)2天。冰醋酸終止反應(yīng)后在冰乙醚中沉淀兩次、抽濾、常溫真空干燥后得到PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)。

接著，PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)的末端羥基氯甲酸對(duì)硝基苯酯NPC活化，再與支化PEI（bPEI）的伯胺反應(yīng)制得。具體的，PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k) (0.4 g, 羥基0.013 mmol)和NPC(40 mg, 0.07 mmol)溶于干燥的DCM中在0℃下反應(yīng)24小時(shí)，然后在冰乙醚中沉淀、過(guò)濾、真空干燥得到PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-NPC。然后將產(chǎn)物溶于3 mL DCM后滴加到3 mL溶有bPEI (M_n=1.8 kg/mol) (180 mg, 0.10 mmol)的DCM中，30℃下反應(yīng)24小時(shí)后，在DCM和甲醇(體積比為1:1)中透析(MWCO 7000) 48小時(shí)，接著在冰乙醚中沉淀兩次、抽濾并室溫真空干燥得到產(chǎn)物PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k。產(chǎn)率：91.6%。¹H NMR (400 MHz, DTCl₃)：PEG: δ 3.38, 3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02, PEI: δ 2.56-2.98。附圖1為PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k的核磁圖譜，其¹H NMR表征顯示除了PEG及P(DTC-TMC)峰外，還有PEI的特征峰在2.59-2.79，通過(guò)積分可知，聚合物的分子量為5.0-(4.4-19.8)-1.8 kg/mol。

實(shí)施例二 Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-lPEI1.2k嵌段共聚物的合成

Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-lPEI1.2k的合成與實(shí)施例一類似，也是分為兩步，只是將其中的第一步中的引發(fā)劑MeO-PEG-OH換為馬來(lái)酰亞胺官能化的Mal-PEG6k-OH，開(kāi)環(huán)聚合TMC和DTC得到Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)，其末端羥基用NPC活化，再與線性PEI (lPEI)的伯胺(M_n=1.2 kg/mol)反應(yīng)制得。具體操作與實(shí)施例一類似，產(chǎn)物在冰乙醚中沉淀兩次、抽濾并室溫真空干燥得到產(chǎn)物。產(chǎn)率：93.2%。¹H NMR (400 MHz, DTCl₃)：PEG: δ 3.38, 3.65; TMC: δ 4.24, 2.05; DTC: δ 4.32, 3.02, PEI: δ 2.56-2.98。聚合物的數(shù)均分子量通過(guò)特征峰面積的積分比值，計(jì)算為6.0-(4.8-19.2)-1.2 kg/mol，為Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-lPEI1.2k。

實(shí)施例三 cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)二嵌段共聚物的合成

cNGQ-PEG7k-P(DTC2.8k-TMC14.2k)的合成與實(shí)施例一類似，也是分為兩步，將第一步中的引發(fā)劑MeO-PEG-OH換為N-羥基琥珀酰亞胺官能化的NHS-PEG-OH，開(kāi)環(huán)聚合TMC和DTC得到NHS-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)；其次，具有自由伯胺的多肽C(NGQGEQ) (cNGQ)與NHS-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)通過(guò)酰胺化反應(yīng)而鍵合。簡(jiǎn)要的說(shuō)，NHS-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k) (0.5 g, 0.017 mmol) 與cNGQ (20 mg, 0.033 mmol) 相繼溶解在5 mL DMF中, 常溫反應(yīng)2天后，在蒸餾水中透析兩天(MWCO 3500)，冷凍干燥得產(chǎn)物cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)。產(chǎn)率：81.2%。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): PEG: δ 3.51; TMC: δ 4.23, 1.94; DTC: δ 4.13, 2.99; cNGQ: δ 6.84–7.61。BCA蛋白試劑盒(Thermo scientific)測(cè)得cNGQ的接枝率為89.7%。通過(guò)調(diào)整原料比例可以得到不同分子量的聚合物，見(jiàn)表1。

表1 各個(gè)聚合物制備條件和產(chǎn)物的核磁表征結(jié)果

實(shí)施例四 靶向聚合物的合成

靶向聚合物的合成有多種方式，取決于PEG的另一端功能化基團(tuán)，我們將分幾種情況描述。第一，例如當(dāng)馬來(lái)酰亞胺Mal功能化的Mal-PEG6k-OH或者丙烯酸酯功能化的AA-PEG6.5k-OH引發(fā)DTC與TMC開(kāi)環(huán)聚合、端羥基活化、與支化b1.8k PEI反應(yīng)得到末端為活性Mal的聚合物Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-bPEI1.8k或者末端為活性AA的AA-PEG6.5k-P(DTC4.6k-TMC18.6k)-bPEI1.8k，最后通過(guò)邁克爾加成與含有自由巰基的靶向分子如多肽cNGQ-SH或葉酸FA-SH，室溫下反應(yīng)后得到靶向聚合物，cNGQ-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-bPEI1.8k。

第二，當(dāng)炔功能化的Alkynyl-PEG5k-OH引發(fā)DTC與DLLA開(kāi)環(huán)聚合、端羥基活化、與線性lPEI1.2k反應(yīng)得到末端為活性炔基的聚合物Alkynyl-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-lPEI1.2k；最后，與疊氮功能化的靶向分子，如多肽cNGQ-N3或半乳糖Gal-N3，通過(guò)疊氮-炔基的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)得到靶向聚合物Gal-PEG5k-P(DTC5.8k-LA23k)-lPEI1.2k。

第三，當(dāng)疊氮功能化的Azide-PEG3k-OH引發(fā)DTC與TMC開(kāi)環(huán)聚合、端羥基活化、與支化bPEI0.6k反應(yīng)得到末端為活性疊氮基的聚合物Azide-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0.6k，最后，與炔基功能化的靶向分子，如alk-CC9或是cRGD-alk，通過(guò)疊氮-炔基的點(diǎn)擊化學(xué)得到靶向聚合物CC9-PEG3k-P(DTC4k-TMC12k)-bPEI0.6k。

當(dāng)功能化聚合物為二嵌段聚合物、沒(méi)有PEI的情況，其鍵合cNGQ等多肽的方式與上述類似。

實(shí)施例五 PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k制備siRNA-RCCPs

siRNA-RCCPs通過(guò)溶劑交換法制備并復(fù)合包裹無(wú)特異性的、對(duì)照siRNA(siScramble)。100 μL PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k的DMSO溶液(5.0 mg/mL)與預(yù)定數(shù)量的siRNA緩沖溶液(1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH 7.4)混合，再緩慢打入900 μL的HEPES (10 mM, pH 6.8)，室溫下放置過(guò)夜、在HEPES中透析、25℃孵育4 h，自交聯(lián)得到siRNA-RCCPs。DLS結(jié)果顯示包裹10 w t % siRNA時(shí)，粒徑為100 納米左右，且TEM證實(shí)了其中空結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例六 腫瘤靶向、裝siRNA的交聯(lián)囊泡siRNA-cNGQ/RCCPs的制備

siRNA-cNGQ/RCCPs通過(guò)溶劑交換法制備并復(fù)合包裹siScramble。重量含量為80%的PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k及20%的 cNGQ-PEG6.5k-P(DTC4.6k-TMC18.6k)-bPEI1.8溶解于DMSO (5.0 mg/mL)中，先與預(yù)定數(shù)量的siRNA緩沖溶液(1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH 7.4)混合，再緩慢加入到900 μL的HEPES (10 mM, pH 6.8)，室溫放置過(guò)夜，在HEPES中透析、孵育4 h，得到交聯(lián)siRNA-cNGQ/RCCPs。

實(shí)施例七 腫瘤靶向、裝siRNA的交聯(lián)囊泡PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k和cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)制備siRNA-cNGQ/RCCPs

siRNA-cNGQ/RCCPs通過(guò)溶劑交換法制備并復(fù)合包裹siScramble，加入重量比為80%的PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k及20% cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)由溶劑交換法包載siRNA制備得到siRNA-cNGQ/RCCPs。100 μL PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k和cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)的DMSO溶液(5.0 mg/mL)與預(yù)定數(shù)量的siRNA緩沖溶液(1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH 7.4)混合，再緩慢打入900 μL的HEPES (10 mM, pH 6.8)，室溫下放置過(guò)夜，在HEPES中透析(MWCO 14000) 12小時(shí)（換液五次），接著在25℃搖床中孵育4 h囊泡自交聯(lián)，得到siRNA-cNGQ/RCCPs。后續(xù)實(shí)驗(yàn)若無(wú)特殊說(shuō)明，均使用的是這兩種聚合物制備的包載siRNA交聯(lián)靶向囊泡。

附圖2為siRNA-cNGQ/RCCPs的DLS結(jié)果圖以及TEM圖，DLS結(jié)果顯示包載10 w t .% siRNA的cNGQ/RCCPs平均粒徑為109 nm，粒徑分布為0.13；TEM圖片顯示它為清晰的球狀中空結(jié)構(gòu)。表2為siRNA-cNGQ/RCCPs的粒徑與siRNA含量的關(guān)系；隨著siRNA含量從0wt.%增加到50 wt.%，siRNA-cNGQ/RCCPs的粒徑也由109增長(zhǎng)到175 nm。

表2 siRNA-cNGQ/RCCPs的粒徑與siScramble含量的關(guān)系

實(shí)施例八 包載siRNA靶向交聯(lián)囊泡siRNA-cNGQ/RCCPs的制備

實(shí)施例四介紹了多種功能性聚合物鍵合多肽的方式，除此以外，還可以通過(guò)溶劑交換法制備納米粒之后，再后修飾靶向多肽，具體舉例如下，通過(guò)開(kāi)環(huán)聚合并與支化PEI反應(yīng)得到功能化聚合物Mal-PEG6k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)-bPEI1.8k，與上述溶劑交換法復(fù)合siRNA類似得到Mal-siRNA-RCCPs，接著在室溫下與cNGQ-SH邁克爾加成得到靶向交聯(lián)囊泡siScramble-cNGQ/RCCPs,。

實(shí)施例九 PEG5k-P(DTC3.0k-TMC15k)-bPEI1.8k制備DNA-RCCPs

通過(guò)溶劑交換法可制備并復(fù)合包裹核酸DNA得到DNA-RCCPs。DNA為pcDEF3-CD8IL-36γ（pIL-36γ），pcDEF3-CD8IL-12（pIL-12）、小牛胸腺DNA等。具體操作為下，100 μL PEG5k-P(DTC3.0k-TMC15k)-bPEI1.8k的DMSO溶液(5.0 mg/mL) 緩慢打入預(yù)定數(shù)量的DNA緩沖溶液(1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH 7.4)與900 μL的HEPES (10 mM, pH 6.8)的混合溶液，室溫下放置過(guò)夜，在HEPES中透析(MWCO 14000) 12小時(shí)（換液五次），接著加入催化量還原劑二硫蘇糖醇（DTT）交聯(lián)得到DNA-RCCPs。DLS結(jié)果顯示，DNA-RCCPs粒徑隨著DNA百分比的增加而增大，見(jiàn)表3，且TEM證實(shí)了其中空結(jié)構(gòu)，凝膠電泳顯示交聯(lián)囊泡可有效復(fù)合DNA（pIL-12），見(jiàn)附圖3。

表3 DNA-cNGQ/RCCPs的粒徑與DNA含量的關(guān)系

實(shí)施例十 腫瘤靶向、裝DNA的交聯(lián)囊泡PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k和cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)制備DNA-cNGQ/RCCPs制備DNA-cNGQ-RCCPs

通過(guò)溶劑交換法可制備并復(fù)合包裹核酸DNA得到DNA-RCCPs。DNA為pcDEF3-CD8IL-36γ（pIL-36γ），pcDEF3-CD8IL-12（pIL-12）、小牛胸腺DNA等。具體操作為下，80 μL PEG5k-P(DTC4.4k-TMC19.8k)-bPEI1.8k與20 μL cNGQ-PEG7k-P(DTC4.8k-TMC19.2k)的DMSO溶液(5.0 mg/mL) 緩慢打入預(yù)定數(shù)量的DNA緩沖溶液(1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH 7.4)與900 μL的HEPES (10 mM, pH 6.8)的混合溶液，室溫下放置過(guò)夜，在HEPES中透析(MWCO 14000) 12小時(shí)（換液五次），接著加入催化量還原劑二硫蘇糖醇（DTT）交聯(lián)得到DNA-cNGQ-RCCPs

實(shí)施例十一 裝載DNA的交聯(lián)靶向囊泡DNA-cNGQ-RCCPs凝膠電泳分析

在70 mL四溴乙烷(TBE)緩沖溶液中加入0.7 g瓊脂糖，加熱溶解瓊脂糖粉末，在冷卻后加入1 μL溴化乙錠，得到瓊脂糖膠待用。DNA-cNGQ-RCCPs或DNA-RCCPs 在DNA和聚合物的重量百分比(wt. %)分別設(shè)定為10%、20%、30%、40%、50%。在膠中分別加入20 μL的DNA-cNGQ-RCCPs、DNA-RCCPs、自由DNA，以及用10 mM DTT處理20 h后的DNA-cNGQ-RCCPs，在TBE電泳緩沖液中跑膠(100 V, 30 min)。之后，由Molecular Imager FX(Bio-Rad, Hercules，Ex/Em: 532/605 nm)拍照凝膠圖片，通過(guò)Quantity One 軟件(Bio-Rad)分析，瓊脂糖凝膠阻留法表明，即使當(dāng)DNA含量高達(dá)50 wt.%，DNA-cNGQ-RCCPs仍可以完全、緊實(shí)包裹DNA，證明DNA-cNGQ-RCCPs穩(wěn)定性優(yōu)異。然而，當(dāng)它在10 mM GSH存在下孵育20 h后發(fā)現(xiàn)，由于交聯(lián)囊泡的解交聯(lián)及溶脹大部分DNA釋放出來(lái)。

實(shí)施例十二 siScramble-cNGQ/RCCPs的凝膠電泳分析

在70 mL四溴乙烷(TBE)緩沖溶液中加入0.7 g瓊脂糖，加熱溶解瓊脂糖粉末，在冷卻后加入1 μL溴化乙錠，得到瓊脂糖膠待用。siRNA-cNGQ/RCCPs或siRNA-RCCPs在siRNA和聚合物的重量百分比(wt. %)分別設(shè)定為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%。在膠中分別加入20 μL的siRNA-cNGQ/RCCPs、siRNA-RCCPs、自由siRNA，以及用10 mM GSH處理20 h后的siRNA-cNGQ/RCCPs，在TBE電泳緩沖液中跑膠(100 V, 30 min)。之后，由Molecular Imager FX(Bio-Rad, Hercules，Ex/Em: 532/605 nm)拍照凝膠圖片，通過(guò)Quantity One 軟件(Bio-Rad)分析，見(jiàn)附圖4，瓊脂糖凝膠阻留法表明，即使當(dāng)siRNA含量高達(dá)80 wt.%，cNGQ/RCCPs仍可以完全、緊實(shí)包裹siRNA，證明siRNA-cNGQ/RCCPs穩(wěn)定性優(yōu)異。然而，當(dāng)它在10 mM GSH存在下孵育20 h后發(fā)現(xiàn)，由于交聯(lián)囊泡的解交聯(lián)及溶脹大部分siRNA釋放出來(lái)。

實(shí)施例十三 Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡(CLSM)實(shí)驗(yàn)

基因使用Cy5-siRNA（Cy5在5′反轉(zhuǎn)鏈末端引入）。按實(shí)施例五制備裝載熒光標(biāo)記的基因Cy5-siRNA的囊泡Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs。流式細(xì)胞儀測(cè)試具體操作如下：A549-Luc細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)(1 × 10⁶細(xì)胞/孔)孵育24小時(shí)，加入50 μL HEPES的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs、Cy5-siRNA-RCCPs或自由Cy5-siRNA(Cy5-siRNA 濃度為200 nmol）37℃孵育4 h。然后，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并離心(1000 × g)2次，由PBS清洗兩次并再次分散在500 μL PBS中待測(cè)。Cy5熒光強(qiáng)度由BD FACS Calibur流式儀(Becton Dickinson, USA)檢測(cè)并分析。CLSM實(shí)驗(yàn)具體操作如下：A549-Luc細(xì)胞鋪于6孔板內(nèi)(1 × 10⁶細(xì)胞/孔)孵育24小時(shí)，加入50 μL HEPES的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs、Cy5-siRNA-RCCPs或自由Cy5-siRNA(Cy5-siRNA 濃度為200 nmol）37℃孵育4 h。之后，移走培養(yǎng)基并繼續(xù)孵育4 h后，移走培養(yǎng)基用PBS清洗兩遍。接著染溶酶體1 h、4%多聚甲醛固定15 min、DAPI染色10 min，每個(gè)過(guò)程均用PBS清洗兩遍，最后用甘油固定封片。熒光圖片由共聚焦儀器(TCS SP5)拍攝獲得。

細(xì)胞內(nèi)吞及釋放行為通過(guò)流式及CLSM檢測(cè)cNGQ/RCCPs 包載Cy5-siRNA作用于A549肺癌細(xì)胞。附圖5為流式分析結(jié)果圖，流式分析顯露cNGQ功能化顯著提高RCCPs被A549細(xì)胞內(nèi)吞；附圖6為CLSM圖，顯示Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs能有效逃離內(nèi)涵/溶酶體。此外，Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs孵育的細(xì)胞Cy5熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于無(wú)靶向組Cy5-siRNA-RCCPs及游離siRNA組。

實(shí)施例十四 siGL3-cNGQ/RCCPs體外熒光素及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

siRNA使用螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因siRNA(siGL3)。熒光素酶基因穩(wěn)定表達(dá)的肺癌細(xì)胞(A549-Luc)懸浮在含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中植于96孔板(8 × 10³細(xì)胞/孔)培養(yǎng)24 h。接著，換上90 μL新鮮培養(yǎng)基并加入10 μL siRNA-cNGQ/RCCPs或siRNA-RCCPs (200 nM和400 nM 的siRNA)，pH為7.4的HEPES緩沖液作為對(duì)照組。孵育48 h后，細(xì)胞由細(xì)胞裂解液(Promega, Fitchburg, WI, USA)裂解。細(xì)胞裂解液的熒光素強(qiáng)度由基于熒光酶標(biāo)儀(Mithras LB 940, Berthold technologies, Bad Wildbad, Germany)的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(Promega)測(cè)定。以HEPES組別為標(biāo)準(zhǔn)(100%)得到相對(duì)熒光素酶活性（n = 4）。

細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)要概述：A549-Luc懸浮在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中植于96孔板(8 × 10³細(xì)胞/孔)培養(yǎng)24 h。然后換上新鮮培養(yǎng)基并加上預(yù)定濃度的siRNA-cNGQ/RCCPs或siRNA-RCCPs，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。接著，加入CCK-8溶液(1 μL/10 μL培養(yǎng)基)37℃孵育 1 h。細(xì)胞存活率由酶標(biāo)儀(Tecan Ltd., Morrisville, NC, USA)在450 nm檢測(cè)計(jì)算得到（n = 4）。

為了研究siRNA-cNGQ/RCCPs體外基因沉默效率，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)選用siGL3并在A549-Luc細(xì)胞進(jìn)行。附圖7為熒光素酶基因表達(dá)結(jié)果圖，結(jié)果顯示熒光素酶表達(dá)被siGL3-cNGQ/RCCPs顯著下調(diào)。siGL3-cNGQ/RCCPs在siRNA濃度為200 nM和400 nM時(shí)，分別抑制約48%及62%熒光素酶表達(dá)，對(duì)照組siScramble-cNGQ/RCCPs并沒(méi)有導(dǎo)致熒光素酶表達(dá)量降低，siGL3-RCCPs(無(wú)靶向?qū)φ战M)呈現(xiàn)出較低的基因沉默效率。

實(shí)施例十五 siPLK1-cNGQ/RCCPs中siPLK1基因沉默能力，

按實(shí)施例五制備裝載治療性基因siRNA(siPLK1，siE6，北海道系統(tǒng)科學(xué)提供Hokkaido, Japan)的囊泡siPLK1-cNGQ/RCCPs。用qRT-PCR來(lái)評(píng)估siPLK1基因沉默能力，附圖8為靶向性及序列特異性基因沉默能力結(jié)果圖，siPLK1-cNGQ/RCCPs在A549細(xì)胞中孵育48 h，發(fā)現(xiàn)siPLK1-cNGQ/RCCPs 組PLK1 mRNA量與siPLK1-cNGQ/RCCPs和siScramble-cNGQ/RCCPs相比顯著降低，證明其靶向性及序列特異性基因沉默能力。本發(fā)明的cNGQ/RCCPs 包載siGL3或siPLK1，囊泡在細(xì)胞培養(yǎng)基環(huán)境下能有效包裹siRNA，通過(guò)受體介導(dǎo)內(nèi)吞方式有效細(xì)胞內(nèi)在化，由于PEI質(zhì)子海綿效應(yīng)逃離內(nèi)涵體，細(xì)胞質(zhì)還原環(huán)境下快速釋放siRNA，從而有如此高的基因沉默能力。另外，附圖9為水溶性四唑鹽(CCK-8)試劑盒檢測(cè)的細(xì)胞毒性結(jié)果圖，表明siGL3-cNGQ/RCCPs和siGL3-RCCPs均無(wú)毒性，佐證了本發(fā)明的囊泡優(yōu)異的生物相容性。

實(shí)施例十六 siPLK1-cNGQ/RCCPs通過(guò)qRT-PCR定量體外基因沉默實(shí)驗(yàn)和siGL3-cNGQ/RCCPs體內(nèi)基因沉默實(shí)驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)(qPCR)用于研究siPLK1-cNGQ/RCCPs內(nèi)源性基因沉默活性實(shí)驗(yàn)，類似球激酶(PLK1)作為靶向基因。A549細(xì)胞懸浮于含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中鋪于6孔板((1×10⁶ 個(gè)細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)24 h后，分別加入10 μL siPLK1-cNGQ/RCCPs、siScramble-cNGQ/RCCPs和siPLK1-RCCPs (最終siRNA濃度為200 nM)。孵育48 h后，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗并收集RNA，反轉(zhuǎn)并由qPCR測(cè)試得到。人β-機(jī)動(dòng)蛋白作為內(nèi)援參照基因確定PLK1 mRNA量。mRNA表達(dá)水平由相對(duì)Ct方法(2^?ΔΔCt)計(jì)算得到。每個(gè)樣品平行四組，取平均值最終結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)偏差。附圖10為荷A549-Luc原位肺癌異種移植裸鼠肺部熒光在siGL3-cNGQ/RCCPs給藥前后的變化圖片；附圖11為肺部生物熒光圖，注射siGL3-cNGQ/RCCPs 24及48 h后，肺部生物熒光強(qiáng)度分別降低76%及53%，證明siGL3-cNGQ/RCCPs引誘肺組織熒光素酶基因有效表達(dá)。相反，沒(méi)有觀察到siScramble-cNGQ/RCCPs對(duì)照組小鼠肺部熒光強(qiáng)度的變化，證實(shí)了只有特異序列才能致使生物熒光基因沉默。

實(shí)施例十七 siE6-RCCPs通過(guò)qRT-PCR定量體外基因沉默實(shí)驗(yàn)

PEG5k-P(DTC3k-TMC15k)-bPEI1.8k和cNGQ-PEG7k-P(DTC3k-TMC15k)聚合物按4:1復(fù)合siE6基因得到siE6-cNGQ/RCCPs實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)(qPCR)用于研究siE6- cNGQ/RCCPs內(nèi)源性基因沉默活性實(shí)驗(yàn)，E6作為靶向基因，我們選用人宮頸癌細(xì)胞（Hela）。我們選用Hela細(xì)胞懸浮于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中鋪于6孔板((1×10⁶ 個(gè)細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)24 h后，分別加入10 μL siE6-cNGQ/RCCPs和siScramble-cNGQ/RCCPs (最終siRNA濃度為200 nM)。孵育48 h后，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗并收集RNA，反轉(zhuǎn)并由qPCR測(cè)試得到。人β-機(jī)動(dòng)蛋白作為內(nèi)援參照基因確定E6 mRNA量。mRNA表達(dá)水平由相對(duì)Ct方法(2^?ΔΔCt)計(jì)算得到。每個(gè)樣品平行四組，取平均值最終結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果證明siE6-cNGQ/RCCPs誘導(dǎo)Hela細(xì)胞的E6基因有效下調(diào)，而作為對(duì)照組的siScramble-cNGQ/RCCPs則無(wú)明顯變化，證實(shí)了只有特異序列才能致使生物熒光基因沉默。

實(shí)施例十八 Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs藥代動(dòng)力學(xué)及體內(nèi)活體成像

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在蘇州大學(xué)動(dòng)物中心及動(dòng)物保護(hù)及使用委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。Balb/C小白鼠經(jīng)尾靜脈注射200 μL HEPES的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs，Cy5-siRNA-RCCPs和游離Cy5-siRNA (20 μg Cy5-siRNA 每只小鼠)。在預(yù)訂時(shí)間里，從眼眶取血(約50 μL血液)，并立即溶解在100 μL1%曲拉通裂解液中，其中Cy5由500 μL萃取液(含20 mM DTT的DMSO溶液)在37℃萃取過(guò)夜。離心(14.8 krpm, 30 min)后，上清液中Cy5的含量由熒光測(cè)得。血液循環(huán)有兩種典型模式：快速降低的分散相(t_1/2, α)及長(zhǎng)時(shí)間的消除相(t_1/2, β)。由以下公式及Origin 8軟件擬合這兩種半衰期: y = A₁ × exp(-x/t₁) + A₂ × exp(-x/t₂) + y₀, 接著由t_1/2, α= 0.693×t₁ and t_1/2, β= 0.693× t₂獲得。

在6周齡Balb/C裸鼠肺癌注射100 μL懸浮于PBS(含1/4組織膠)的A549-Luc細(xì)胞來(lái)建立原位肺癌模型。由IVIS Lumina系統(tǒng)觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。約兩周后，將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為兩組，分別尾靜脈注射200 μL HEPES的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs 和Cy5-siRNA-RCCPs(20 μg Cy5-siRNA 每只小鼠)。在不同時(shí)間點(diǎn)(0, 2, 4, 8, 12和24 h)注射后，小鼠通過(guò)異氟烷麻醉并由近紅外熒光成像系統(tǒng)(Lumina, IVIS II)獲取熒光圖片，發(fā)射波長(zhǎng)為643 nm，吸收波長(zhǎng)為668 nm。在圖片獲取過(guò)程中，由小動(dòng)物麻醉機(jī)麻醉小鼠。通過(guò)Lumina II軟件拍攝并分析圖片。

Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)于小鼠體內(nèi)研究。單劑量尾靜脈注射各種Cy5-siRNA制劑(20 μg Cy5-siRNA每只小鼠)，通過(guò)熒光檢測(cè)血漿中不同時(shí)間點(diǎn)的Cy5-siRNA。附圖12為血漿中不同時(shí)間點(diǎn)的Cy5-siRNA圖，結(jié)果表明，Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs和Cy5-siRNA-RCCPs證明相對(duì)于游離Cy5-siRNA，它們有相當(dāng)長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，并且長(zhǎng)于文獻(xiàn)中報(bào)道的其他陽(yáng)離子復(fù)合物siRNA載體。(Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs和Cy5-siRNA-RCCPs的消除半衰期分別為1.35和1.21 h，而自由Cy5-siRNA則為0.17 h)。

Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs及Cy5-siRNA-RCCPs尾靜脈進(jìn)入荷瘤裸鼠體內(nèi)，通過(guò)近紅外熒光實(shí)時(shí)跟蹤其在在原位A549-Luc肺癌的積累。附圖13為腫瘤部位Cy5-siRNA熒光圖，圖片顯示Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs組小鼠在注射2 h后，觀察到腫瘤部位Cy5-siRNA熒光很強(qiáng)。相比之下，無(wú)靶向組Cy5-siRNA-RCCPs在腫瘤部位積累量顯著減少，盡管它們含有相近的循環(huán)時(shí)間。這些結(jié)果表明主動(dòng)靶向在腫瘤高富集及久持續(xù)上發(fā)揮著重要作用。

實(shí)施例十九 siPLK1-cNGQ/RCCPs離體成像及生物分布

尾靜脈單次注射200 μL的Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs和Cy5-siRNA-RCCPs的HEPES溶液(20 μg Cy5-siRNA 每只小鼠)至荷A549-Luc肺癌原位裸鼠體內(nèi)。注射后4 h，荷瘤裸鼠被處死。收集包括心、肝、脾、腎及含腫瘤肺等主要器官、清洗、干燥并稱重。熒光圖片由Lumina IVIS II近紅外熒光成像系統(tǒng)拍攝獲取。為了定量Cy5-siRNA在肺及其他器官的分布，肺及其他組織中加入600 μL 1%曲拉通勻漿機(jī)(IKA T25)勻漿10 min，之后加入900 μL上述萃取劑在37℃萃取過(guò)夜。離心30 min后，懸浮液中Cy5由熒光檢測(cè)，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，最終表達(dá)為每克組織注射百分比(%ID/g)。

注射Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs 4 h后，通過(guò)離體成像及熒光定量進(jìn)一步分析Cy5-siRNA在心、肝、脾、腎及含有腫瘤的肺等主要器官的生物分布。附圖14為不同部位Cy5-siRNA熒光強(qiáng)度圖，結(jié)果表明Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs組小鼠肺部Cy5-siRNA熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他主要器官，相比之下，無(wú)靶向?qū)φ战MCy5-siRNA-RCCPs肺部呈現(xiàn)出較弱的Cy5-siRNA熒光，而在肝及腎熒光很強(qiáng)。附圖15為不同部位Cy5-siRNA富集率圖，熒光定量表明Cy5-siRNA-cNGQ/RCCPs在肺部富集量為4.02%，為Cy5-siRNA-RCCPs(1.13 %ID/g)組3.5倍。

實(shí)施例二十 荷A549-Luc原位肺癌裸鼠的治療實(shí)驗(yàn)

荷A549-Luc原位肺癌異種移植裸鼠模型的建立方法見(jiàn)實(shí)施例七具體操作。所有圖片在3%的異氟烷麻醉、仰臥姿勢(shì)、體內(nèi)生物發(fā)光模式下通過(guò)Lumina IVIS II系統(tǒng)采集。為了觀察A549-Luc細(xì)胞，在成像前10-15分鐘，腹腔注射100 μL熒光素酶(150 mg/kg)。在約10 d后，腫瘤熒光強(qiáng)度達(dá)到7 × 10⁴時(shí)開(kāi)始治療，并將這天定義為0 d。小鼠稱重并隨機(jī)分為4組(每組6只)：siPLK1-cNGQ/RCCPs (I), siPLK1-RCCPs (II), siScramble-cNGQ/RCCPs (III), and PBS (IV)。小鼠經(jīng)尾靜脈每?jī)商熳⑸湟淮?，劑量?0 μg siRNA每只小鼠。小鼠的相對(duì)體重以它們初始體重為標(biāo)準(zhǔn)。此外，在第10天治療終止，每組任意取一只小鼠處死，取出主要器官清洗、干燥后由Lumina IVIS II系統(tǒng)成像。之后，浸泡在4%的福爾馬林并包埋于石蠟中，由H&E染色并由正置顯微鏡拍照(Olympus BX41)。除此以外，在57天內(nèi)觀察各組的生存曲線(每組5只)。

為了評(píng)估siRNA-cNGQ/RCCPs在體內(nèi)的治療效率，我們以siPLK作為治療siRNA，以荷A549-Luc原位肺癌為腫瘤模型。siPLK1-cNGQ/RCCPs在第0, 2, 4, 6和8天給藥，siPLK1的給藥量為40 μg每只小鼠。附圖16為通過(guò)熒光成像跟蹤腫瘤生長(zhǎng)情況圖，結(jié)果表明siPLK1-cNGQ/RCCPs顯著抑制腫瘤增長(zhǎng)。siPLK1-RCCPs造成部分腫瘤增長(zhǎng)被抑制。對(duì)比之下，我們觀察到siScramble-cNGQ/RCCPs及PBS組小鼠腫瘤快速增長(zhǎng)。附圖17為小鼠器官離體成像圖，經(jīng)siPLK1-cNGQ/RCCPs治療10天后，此組別顯示其肺組織生物熒光顯著低于其他對(duì)照組。此外，siScramble-cNGQ/RCCPs和PBS組小鼠圖像顯示肝腫瘤大面積轉(zhuǎn)移至心臟及肝臟，而siPLK1-cNGQ/RCCPs.組小鼠其他器官幾乎沒(méi)有熒光，證明肺癌沒(méi)有轉(zhuǎn)移。

附圖18從左至右分別為肺部A549-Luc含量圖、小鼠體重以及生存率圖，顯示各治療組肺部A549-Luc含量。siPLK1-cNGQ/RCCPs展示出高效的腫瘤抑制能力，顯著強(qiáng)于無(wú)靶向?qū)φ战MsiPLK1-RCCPs；表明各組在10天后肺部圖片再次說(shuō)明siPLK1-cNGQ/RCCPs高效的治療效率，siPLK1-cNGQ/RCCPs或siPLK1-RCCPs組小鼠體重幾乎無(wú)變化，而siScramble-cNGQ/RCCPs及PBS組小鼠體重有所降低這可能是由于肺部、以及腫瘤轉(zhuǎn)移的心臟和肝臟衰竭。生存曲線顯示siPLK1-cNGQ/RCCPs診斷組小鼠生存期明顯延長(zhǎng)。siPLK1-cNGQ/RCCPs、siPLK1-RCCPs和siScramble-cNGQ/RCCPs組小鼠生存中值分別為54.0、30.1及21.9天。

附圖19為H&E染色的組織學(xué)分析圖，表明，siPLK1-cNGQ/RCCPs治療的小鼠的肺組織和外觀和正常小鼠的肺部類似，其他組老鼠肺部仍有大量腫瘤細(xì)胞存在。siPLK1-cNGQ/RCCPs比其他組引發(fā)了大量及大面積肺腫瘤細(xì)胞的凋亡，但對(duì)心、肝及腎傷害較?。欢鴖iScramble-cNGQ/RCCPs及PBS組小鼠的肝臟及心臟均存在肺癌轉(zhuǎn)移，并造成傷害。這些結(jié)果指明siPLK1-cNGQ/RCCPs介導(dǎo)安全、高效、靶向傳遞siRNA至荷原位肺癌小鼠。

本發(fā)明設(shè)計(jì)了基于三嵌段聚合物PEG-P(TMC-DTC)-PEI或者PEG-P(DLLA-DTC)-PEI的腫瘤靶向、具有不對(duì)稱膜結(jié)構(gòu)的、還原敏感可逆交聯(lián)、細(xì)胞內(nèi)可解交聯(lián)的生物可降解聚合物囊泡。該囊泡能高效裝載保護(hù)核酸藥物siRNA或DNA，并能輸送其到活體的腫瘤細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)其凋亡。該體系擁有多種獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，包括制備的簡(jiǎn)易操控性、杰出的生物相容性、對(duì)siRNA極好的控制釋放性、超強(qiáng)的體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性、優(yōu)越的癌細(xì)胞靶向性、顯著的特異性基因沉默能力等。因此，其有望成為集簡(jiǎn)易、穩(wěn)定、多功能等優(yōu)點(diǎn)于一身的納米系統(tǒng)平臺(tái)，用于高效、主動(dòng)靶向輸送核酸至原位腫瘤。