本發(fā)明涉及一種乳鐵蛋白殼聚糖微粒的制備方法。

背景技術(shù)：

乳鐵蛋白是具有廣泛生物學(xué)功能的蛋白類治療藥物，直接通過(guò)口服乳鐵蛋白給藥雖然便捷，但蛋白類藥物從消化系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)需要克服大量障礙，而殼聚糖作為負(fù)載蛋白類藥物載體在保持自身緩釋特性的同時(shí)，還可以保護(hù)對(duì)環(huán)境敏感的蛋白類藥物免受降解，因而是載藥微粒的理想組合。

目前制備乳鐵蛋白殼聚糖的微粒，其粒徑大小為微米數(shù)量級(jí)，同時(shí)制備方法如乳化交聯(lián)法，所需交聯(lián)劑如戊二醛等存在一定毒性，不適合直接作用于人體；此外，制備得到的載藥顆粒性狀會(huì)受到殼聚糖原料相關(guān)參數(shù)以及反應(yīng)條件等因素影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有乳鐵蛋白殼聚糖微粒的粒徑較大，為微米級(jí)，包封率和載藥率低的問(wèn)題，提供納米級(jí)乳鐵蛋白殼聚糖微粒的制備方法。

本發(fā)明通過(guò)離子交聯(lián)法制備得到乳鐵蛋白殼聚糖納米微粒，該方法采用三聚磷酸鈉作為交聯(lián)劑，對(duì)殼聚糖進(jìn)行離子凝膠誘導(dǎo)化，在特定pH范圍內(nèi)，殼聚糖的質(zhì)子化氨基與三聚磷酸鈉的磷酸根相互作用，形成藥物載體包裹乳鐵蛋白。

本發(fā)明納米級(jí)乳鐵蛋白殼聚糖微粒的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、試劑處理：

將殼聚糖溶解于冰醋酸中，調(diào)整pH為4-5，制得濃度為0.6-0.8mg/mL的殼聚糖溶液；

將9-11mg溶菌酶加入1ml無(wú)菌水或10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液，得到溶菌酶混合液；

將乳鐵蛋白溶于0.1mol/L氯化鈉溶液，震蕩混勻，制得濃度為9-11mg/mL的乳鐵蛋白溶液；

二、殼聚糖改性：

向殼聚糖溶液中加入適量溶菌酶混合液，于38-42℃75-85轉(zhuǎn)/分鐘震蕩3-4小時(shí)，將長(zhǎng)鏈殼聚糖降解為殼寡糖，然后加熱煮沸3-5分鐘使溶菌酶失活，得到改性后的殼聚糖溶液；

三、交聯(lián)：

將適量乳鐵蛋白溶液與改性后的殼聚糖溶液進(jìn)行混合，使每50ml殼聚糖溶液含有乳鐵蛋白5mg-10mg，持續(xù)磁力攪拌，同時(shí)逐滴加入0.5-0.6mg/mL三聚磷酸鈉溶液進(jìn)行離子交聯(lián)，持續(xù)磁力攪拌30-40分鐘，溶液整體呈現(xiàn)藍(lán)色乳光；

四、分離：

將步驟三交聯(lián)后的溶液中在5-15℃條件下15000-25000轉(zhuǎn)/分鐘離心0.5-1小時(shí)，取沉淀，即為乳鐵蛋白殼聚糖納米微粒。

進(jìn)一步的，步驟二中殼聚糖溶液與溶菌酶混合液的體積比為1000:1。

進(jìn)一步的，步驟三中三聚磷酸鈉溶液的滴加速度為1滴/秒。

進(jìn)一步的，步驟三中改性后的殼聚糖溶液與三聚磷酸鈉溶液的體積比為(4-5):1。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明利用溶菌酶可以水解β-1,4糖苷鍵這一特點(diǎn)，對(duì)殼聚糖進(jìn)行水解改性，改性后殼寡糖主要為2-7聚，分子量大致為3000-10000D，低聚殼聚糖有利于機(jī)體吸收，有更強(qiáng)的生物活性，同時(shí)相較于長(zhǎng)鏈殼聚糖分子質(zhì)子化氨基更容易暴露并與磷酸根交聯(lián)，從而增強(qiáng)載藥體系的結(jié)合程度，為離子交聯(lián)法制備殼聚糖乳鐵蛋白納米載藥體系提供參考。

本發(fā)明制備并分離得到納米級(jí)的乳鐵蛋白殼聚糖微粒，該方法利用無(wú)毒副作用的三聚磷酸鈉對(duì)殼聚糖進(jìn)行離子誘導(dǎo)凝膠化，利用帶正電的質(zhì)子化氨基與帶負(fù)電的磷酸根相互吸引，交聯(lián)過(guò)程中將藥物包裹形成載藥納米粒。本方法制備的納米級(jí)乳鐵蛋白殼聚糖微粒具有較高的包封率和載藥率。將離心后得到的微粒自然風(fēng)干，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中的蛋白濃度，結(jié)合投入蛋白藥物的量，估測(cè)蛋白藥物的包封率及載藥率，測(cè)定結(jié)果為：包封率為20％-30％，載藥率為9％-26％。

本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，適用于口服乳鐵蛋白藥物的制備。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1制備的乳鐵蛋白殼聚糖納米微粒的SEM圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式納米級(jí)乳鐵蛋白殼聚糖微粒的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、試劑處理：

將殼聚糖溶解于冰醋酸中，調(diào)整pH為4-5，制得濃度為0.6-0.8mg/mL的殼聚糖溶液；

將9-11mg溶菌酶加入1ml無(wú)菌水或1ml 10mmol/L的Tris·Cl(pH8.0)溶液，得到溶菌酶混合液；

將乳鐵蛋白溶于0.1mol/L氯化鈉溶液，震蕩混勻，制得濃度為9-11mg/mL的乳鐵蛋白溶液；

二、殼聚糖改性：

向殼聚糖溶液中加入適量溶菌酶混合液，于38-42℃75-85轉(zhuǎn)/分鐘震蕩3-4小時(shí)，將長(zhǎng)鏈殼聚糖降解為殼寡糖，然后加熱煮沸3-5分鐘使溶菌酶失活，得到改性后的殼聚糖溶液；

三、交聯(lián)：

將適量乳鐵蛋白溶液與改性后的殼聚糖溶液進(jìn)行混合，使每50ml殼聚糖溶液含有乳鐵蛋白5mg-10mg，持續(xù)磁力攪拌，同時(shí)逐滴加入0.5-0.6mg/mL三聚磷酸鈉溶液進(jìn)行離子交聯(lián)，持續(xù)磁力攪拌30-40分鐘，溶液整體呈現(xiàn)藍(lán)色乳光；

四、分離：

將步驟三交聯(lián)后的溶液中在5-15℃條件下15000-25000轉(zhuǎn)/分鐘離心0.5-1小時(shí)，取沉淀，即為乳鐵蛋白殼聚糖納米微粒。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟一中制得濃度為0.7mg/mL的殼聚糖溶液。其它與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是：步驟一中制得濃度為10mg/mL的乳鐵蛋白溶液。其它與具體實(shí)施方式一或二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：步驟二中殼聚糖溶液與溶菌酶混合液的體積比為1000:1。其它與具體實(shí)施方式一至三之一相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：步驟二中于40℃80轉(zhuǎn)/分鐘震蕩3小時(shí)。其它與具體實(shí)施方式一至四之一相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟三中使每50ml殼聚糖溶液含有乳鐵蛋白6mg-9mg。其它與具體實(shí)施方式一至五之一相同。

具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟三中使每50ml殼聚糖溶液含有乳鐵蛋白7mg-8mg。其它與具體實(shí)施方式一至五之一相同。

具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至七之一不同的是：步驟三中三聚磷酸鈉溶液的滴加速度為1滴/秒。其它與具體實(shí)施方式一至七之一相同。

具體實(shí)施方式九：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至八之一不同的是：步驟三中改性后的殼聚糖溶液與三聚磷酸鈉溶液的體積比為(4-5):1。其它與具體實(shí)施方式一至八之一相同。

具體實(shí)施方式十：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至九之一不同的是：步驟三中在10℃條件下離心。其它與具體實(shí)施方式一至九之一相同。

具體實(shí)施方式十一：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至十之一不同的是：步驟三中離心轉(zhuǎn)速為20000轉(zhuǎn)/分鐘。其它與具體實(shí)施方式一相至十之一同。

具體實(shí)施方式十二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至十一之一不同的是：步驟三中離心時(shí)間為0.7-0.8小時(shí)。其它與具體實(shí)施方式一至十一之一相同。

為驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：

實(shí)施例1

本實(shí)施例納米級(jí)乳鐵蛋白殼聚糖微粒的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、試劑處理：

將殼聚糖溶解于冰醋酸中，調(diào)整pH為4.5，制得濃度為0.7mg/mL的殼聚糖溶液；

10mg溶菌酶加入1ml無(wú)菌水，得到溶菌酶混合液；

乳鐵蛋白溶于0.1mol/L氯化鈉溶液，震蕩混勻，制得濃度為10mg/mL的乳鐵蛋白溶液；

二、殼聚糖改性：

向殼聚糖溶液加入適量溶菌酶混合液，殼聚糖溶液與溶菌酶混合液的體積比為1000:1，40℃80轉(zhuǎn)/分鐘震蕩3小時(shí)，將長(zhǎng)鏈殼聚糖降解為殼寡糖，然后加熱煮沸5分鐘使溶菌酶失活，得到改性后的殼聚糖溶液；

三、交聯(lián)：

將適量乳鐵蛋白溶液與改性后的殼聚糖溶液進(jìn)行混合，使每50ml殼聚糖溶液含有乳鐵蛋白5mg，持續(xù)磁力攪拌，同時(shí)逐滴加入0.5mg/mL三聚磷酸鈉溶液進(jìn)行離子交聯(lián)，改性后的殼聚糖溶液與三聚磷酸鈉溶液的體積比為4.5:1，持續(xù)磁力攪拌30分鐘，溶液整體呈現(xiàn)藍(lán)色乳光；其中三聚磷酸鈉溶液的滴加速度為1滴/秒。

四、分離：

將步驟三交聯(lián)后的溶液中在10℃條件下20000轉(zhuǎn)/分鐘離心1小時(shí)，取沉淀，即為乳鐵蛋白殼聚糖納米微粒。

本實(shí)施例制備的微粒的SEM掃描結(jié)果如圖1所示，可以看出本方法得到了納米級(jí)的乳鐵蛋白殼聚糖微粒。

將離心后得到的微粒自然風(fēng)干，通過(guò)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中的蛋白濃度，結(jié)合投入蛋白藥物的量，估測(cè)蛋白藥物的包封率及載藥率，測(cè)定結(jié)果為：包封率為30％，載藥率為26％。

本方法利用溶菌酶可以水解β-1,4糖苷鍵這一特點(diǎn)，對(duì)殼聚糖進(jìn)行水解改性，改性后殼寡糖主要為2-7聚，分子量為3000-10000D，平均分子量為5000-5500D，低聚殼聚糖有利于機(jī)體吸收，有更強(qiáng)的生物活性，同時(shí)相較于長(zhǎng)鏈殼聚糖分子質(zhì)子化氨基更容易暴露并與磷酸根交聯(lián)，從而增強(qiáng)載藥體系的結(jié)合程度，為離子交聯(lián)法制備殼聚糖乳鐵蛋白納米載藥體系提供參考。