本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的和厚樸酚納米顆粒在治療肝纖維化中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

和厚樸酚是一類木蘭科落葉喬木厚樸提取物。具有明顯的、持久的中樞性肌肉松弛，中樞神經(jīng)抑制作用，抗炎，抗菌，抗病原微生物，抗?jié)儯寡趸?，抗衰?抗腫瘤，降低膽固醇等藥理作用。它可抑制Akt磷酸化，并且亦可促進(jìn)ERK1/2磷酸化，在此前的研究報道中，和厚樸酚可以通過對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用抑制動脈血栓的形成，進(jìn)一步的研究表明和厚樸酚也可以通過促進(jìn)環(huán)前列腺素的生成抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，另外，和厚樸酚在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可調(diào)控iNOS/eNOS的表達(dá)，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)NO的合成維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。

在慢性肝損傷研究方面，和厚樸酚的研究不多，但其與慢性肝病的相關(guān)性亦有報道。在體外培養(yǎng)條件下和厚樸酚對活化肝星狀細(xì)胞HSC可產(chǎn)生影響，其通過線粒體細(xì)胞色素C的釋放以及Caspase 3的活化促進(jìn)活化的HSC凋亡，而對實質(zhì)細(xì)胞不造成重大的損傷。另外和厚樸酚還可調(diào)控肝損傷修復(fù)過程，其可以顯著地抑制慢性損傷所造成的組織破壞，顯示出對肝組織損傷較強的治療效應(yīng)。

RGD多肽標(biāo)記的PEG納米微粒是內(nèi)皮細(xì)胞特異的藥物傳遞系統(tǒng)，能牢固靶向結(jié)合于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的炎癥部位，被認(rèn)為是靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞治療理想的給藥系統(tǒng)。PEG包被和厚樸酚的研究亦早有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒的新用途。

本發(fā)明提供的靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在如下1)-10)中至少一種的應(yīng)用：

1)制備治療肝纖維化疾病產(chǎn)品；

2)制備抑制肝纖維化產(chǎn)品；

3)制備促進(jìn)或維持或恢復(fù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞處于分化狀態(tài)產(chǎn)品；

4)制備提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)肝臟修復(fù)作用產(chǎn)品；

5)制備提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中HGF蛋白表達(dá)和/或Wnt2蛋白表達(dá)產(chǎn)品；

6)制備抑制肝纖維化結(jié)節(jié)形成或促進(jìn)肝纖維化結(jié)節(jié)消除產(chǎn)品；

7)制備降低血清中ALT含量和/或AST含量產(chǎn)品；

8)制備抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Akt磷酸化水平產(chǎn)品；

9)制備促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Erk1/2磷酸化水平產(chǎn)品；

10)制備提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS表達(dá)量與Nox2表達(dá)量比值產(chǎn)品。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備治療肝纖維化疾病產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備抑制肝纖維化產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備促進(jìn)或維持或恢復(fù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞處于分化狀態(tài)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)肝臟修復(fù)作用產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中HGF蛋白表達(dá)和/或Wnt2蛋白表達(dá)產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備抑制肝纖維化結(jié)節(jié)形成或促進(jìn)肝纖維化結(jié)節(jié)消除產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備降低血清中ALT含量和/或AST含量產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Akt磷酸化水平產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Erk1/2磷酸化水平產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒在制備提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS表達(dá)量與Nox2表達(dá)量比值產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

促進(jìn)或維持或恢復(fù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞處于分化狀態(tài)的物質(zhì)在如下1)-10)中至少一種的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范：

1)制備治療肝纖維化疾病產(chǎn)品；

2)制備抑制肝纖維化產(chǎn)品；

4)制備提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)肝臟修復(fù)作用產(chǎn)品；

5)制備提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中HGF蛋白表達(dá)和/或Wnt2蛋白表達(dá)產(chǎn)品；

6)制備抑制肝纖維化結(jié)節(jié)形成或促進(jìn)肝纖維化結(jié)節(jié)消除產(chǎn)品；

7)制備降低血清中ALT含量和/或AST含量產(chǎn)品；

8)制備抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Akt磷酸化水平產(chǎn)品；

9)制備促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Erk1/2磷酸化水平產(chǎn)品；

10)制備提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS表達(dá)量與Nox2表達(dá)量比值產(chǎn)品。

上述促進(jìn)或維持或恢復(fù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞處于分化狀態(tài)的物質(zhì)為靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒。

上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥品。

本發(fā)明另一個目的是提供一種具有如下1)-10)中至少一種功能的產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品，包括靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒；

1)治療肝纖維化疾??；

2)抑制肝纖維化；

3)促進(jìn)或維持或恢復(fù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞處于分化狀態(tài)；

4)提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)肝臟修復(fù)作用；

5)提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中HGF蛋白表達(dá)和Wnt2蛋白表達(dá)；

6)抑制肝纖維化結(jié)節(jié)形成或促進(jìn)肝纖維化結(jié)節(jié)消除；

7)降低血清中ALT含量和/或AST含量；

8)抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Akt磷酸化水平；

9)促進(jìn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Erk1/2磷酸化水平；

10)提高肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS表達(dá)量與Nox2表達(dá)量比值。

上述產(chǎn)品中，所述靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒為用靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白或含有該蛋白的融合蛋白或含有該蛋白的復(fù)合物包被和厚樸酚得到的顆粒。

上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品為藥品。

上述中，所述靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒為用靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白或含有該蛋白的融合蛋白或含有該蛋白的復(fù)合物包被和厚樸酚得到的顆粒，在本發(fā)明的實施例中靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的多肽為cRGD，靶向肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的Honokiol納米顆粒為用cRGD-PEG-PLGA包被和厚樸酚(Honokiol)得到的和厚樸酚納米顆粒，具體按照如下方法制備：

1)將PEG-PLGA和cRGD在DMSO溶液中等摩爾比混合，得到PEG-cRGD；

2)將PEG-cRGD和PLGA按照摩爾比為10：1在DMSO溶液中混合，反應(yīng)，得到cRGD-PEG-PLGA；

3)將cRGD-PEG-PLGA溶液(50mg/ml)滴加于攪拌的Honokiol溶液(10mg/ml)按照體積比為3：4混合，反應(yīng)，得到cRGD-PEG-PLGA包被和厚樸酚的納米顆粒，即為Honokiol納米顆粒。

本發(fā)明第三個目的是提供一種抑制肝纖維化的方法。

本發(fā)明提供的方法，為以LSEC作為靶細(xì)胞，維持LSEC處于分化狀態(tài)，從而達(dá)到抑制肝纖維化的目的。

本發(fā)明的實驗證明，利用由cRGD標(biāo)記的PEG納米顆粒包裝Honokiol，制成內(nèi)皮細(xì)胞特異的藥物輸送體系，經(jīng)由腹腔注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，能有效地維持LSEC的分化表型以及促再生功能，從而在慢性肝損傷早期有效的抑制肝纖維化的進(jìn)程，同時誘導(dǎo)LSEC調(diào)控肝組織損傷修復(fù)。而在肝纖維化逆轉(zhuǎn)期，Honokiol能加快肝內(nèi)沉積纖維的清除效率，并迅速恢復(fù)LSEC的分化表型以及促再生功能，使其能迅速反應(yīng)以行使肝損傷修復(fù)的指導(dǎo)作用。因此，以LSEC作為靶細(xì)胞，通過調(diào)控其分化表型來抑制肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，對于抗纖維化治療的研究具有一定的指導(dǎo)意義。

附圖說明

圖1為各組LSEC中p-Erk1/2，p-Akt，Erk1/2，Akt，eNOS，Nox2的表達(dá)情況。

圖2為(A)掃描電鏡圖像顯示纖維化4周與6周慢性肝損傷組與Honokiol抑制組中LSEC表面窗孔結(jié)構(gòu)的變化；(B)掃描電鏡圖像顯示纖維化逆轉(zhuǎn)期2周與4周慢性肝損傷組與Honokiol促逆轉(zhuǎn)組中LSEC表面窗孔結(jié)構(gòu)的變化。

圖3為(A)Western blot結(jié)果顯示纖維化4周與6周慢性肝損傷組與Honokiol抑制組LSEC中HGF以及Wnt2表達(dá)的變化；(B)Western blot結(jié)果顯示慢性肝損傷組與Honokiol治療組LSEC中HGF以及Wnt2表達(dá)的變化。

圖4為(A)Masson三色染色圖像顯示纖維化4周與6周慢性肝損傷組與Honokiol抑制組中組織纖維沉積的變化；(B)Masson三色染色圖像顯示纖維化逆轉(zhuǎn)2周與4周慢性肝損傷逆轉(zhuǎn)組與Honokiol促逆轉(zhuǎn)組中組織纖維沉積的變化。

圖5為ALT及AST血清濃度監(jiān)測結(jié)果顯示Honokiol可顯著降低這兩類轉(zhuǎn)氨酶在肝纖維化進(jìn)程(A)和逆轉(zhuǎn)過程中(B)的含量。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中采用的小鼠為C57BL/6J小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；

下述實施例中靶向LSEC的和厚樸酚納米顆粒(以下稱為Honokiol納米顆粒)：為用cRGD-PEG-PLGA包被和厚樸酚(Honokiol)得到的和厚樸酚納米顆粒；

和厚樸酚納米顆粒制備方法參考如下文獻(xiàn)：Qing Xu,Yuexian Liu,Shishuai Su,Wei Li,Chunying Chen*,Yan Wu*.Anti-tumor activity of paclitaxel through dual-targeting carrier of cyclic RGD and transferrin conjugated hyperbranched copolymer nanoparticles,Biomaterials,2012,33,1627-1639，具體步驟如下：

精密稱取PEG-PLGA(14.7μmol,岸谷納米)50mg至含有500μL DMSO溶液的圓底燒瓶中,室溫下攪拌溶解后,加入等摩爾的多肽cRGD(蘇州強耀生物)攪拌2h,用薄層色譜法(TLC)分析跟蹤反應(yīng)，直到cRGD完全消失。真空條件下蒸去溶劑，然后用蒸餾水重新溶解,再用去離子水透析除去小分子物質(zhì),透析袋(截留相對分子量3500),濃縮待用，得到濃縮后的PEG-cRGD，其中，PEG-PLGA和cRGD的加入摩爾比為1:1。

取濃縮后的PEG-cRGD(14.7μmol)完全溶解在DMSO溶液500μL中,然后加入1.47μmol的PLGA溶液(溶劑為DMSO 500μL),室溫下攪拌18h,TLC跟蹤反應(yīng)到結(jié)束。真空條件下蒸去溶劑,然后用蒸餾水重新溶解,再用去離子水透析,透析袋(截留相對分子量為14000),經(jīng)冷凍干燥,得到cRGD-PEG-PLGA固體產(chǎn)物，其中，PEG-cRGD和PLGA的加入摩爾比為10：1。

cRGD-PEG-PLGA和Honokiol根據(jù)需要分別配成相應(yīng)濃度(溶劑為DMSO),將cRGD-PEG-PLGA溶液(50mg/ml)滴加于攪拌的Honokiol溶液(10mg/ml)中,室溫孵育30min,制成體積比3:4比例的復(fù)合物,復(fù)合物溶液無菌過濾后4℃?zhèn)溆?顆粒大小～200nm，得到Honokiol納米顆粒。

實施例1、Honokiol納米顆粒在治療肝纖維化中的應(yīng)用

一、Honokiol納米顆粒在慢性肝損傷階段對鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

慢性肝損傷可引起肝纖維化，該部分實驗是為了證明Honokiol通過升高p-Erk1/2/p-Akt的比例調(diào)控肝竇內(nèi)皮細(xì)胞正常的生理功能。

1、Honokiol納米顆粒作用于慢性肝損傷引起的肝纖維化小鼠方法

實驗分組：

1)陰性對照組：正常飲用水、標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)，自由采食，每周更換3次飲用水以及飼料，僅注射無菌橄欖油和生理鹽水，注射次數(shù)與劑量對應(yīng)相應(yīng)的實驗組；

2)慢性肝損傷病理組(CCl₄造成慢性肝損傷模型)：正常飲用水、標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)，自由采食，每周更換3次飲用水以及飼料，每周腹腔注射2次CCl₄與橄欖油混合物(體積比1:7，劑量1mg/kg)和生理鹽水，連續(xù)注射6周。分別在2周、4周和6周處死小鼠進(jìn)行檢測。

3)逆轉(zhuǎn)組：正常飲用水、標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)，自由采食，每周更換3次飲用水及飼料，連續(xù)腹腔注射6周CCl₄與橄欖油混合物(體積比1:7)和生理鹽水，停止注射CCl₄，正常飲食，讓其自行恢復(fù)，同時腹腔注射生理鹽水逆轉(zhuǎn)，分別在逆轉(zhuǎn)2周和4周處死小鼠進(jìn)行檢測。

4)Honokiol納米顆粒抑制組：正常飲用水、標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)，自由采食，每周更換3次飲用水及飼料，連續(xù)腹腔注射6周CCl₄與橄欖油混合物(體積比1:7，劑量1mg/kg，需要生理鹽水)和生理鹽水，將Honokiol納米顆粒按照0.2mg/kg比例一同腹腔注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，連續(xù)注射6周。分別在2周、4周和6周處死小鼠進(jìn)行檢測。

5)Honokiol納米顆粒促逆轉(zhuǎn)組：正常飲用水、標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)，自由采食，每周更換3次飲用水及飼料，連續(xù)腹腔注射6周CCl₄與橄欖油混合物(體積比1:7，劑量1mg/kg)和生理鹽水，停止注射CCl₄，正常飲食，讓其自行恢復(fù)，同時將Honokiol納米顆粒按照0.2mg/kg比例一同腹腔注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)，連續(xù)注射4周。分別在逆轉(zhuǎn)2周和逆轉(zhuǎn)4周處死小鼠進(jìn)行檢測。

上述飼養(yǎng)環(huán)境條件：溫度范圍20-22℃，濕度范圍50-55％，明暗各12小時。實驗動物自由進(jìn)食和飲水，4只一籠飼養(yǎng)。

2、檢測

1)Western blotting檢測

提取上述1中各組中不同時間點處死的小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞全蛋白，通過Western blotting檢測各組中不同時間點的小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中Erk1/2、Akt、p-Erk1/2、p-Akt、eNOS和Nox2蛋白表達(dá)水平，具體檢測方法如下：

首先對蛋白進(jìn)行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上后放入封閉液(TBST中5％脫脂奶粉)中封閉1h，在1:200稀釋的Erk1/2抗體，Akt抗體，p-Erk1/2抗體，p-Akt抗體以及eNOS抗體(均來自CST)，Nox2抗體(Proteintech公司)，一抗中4℃孵育過夜，TBST洗膜5次，加入1：5000稀釋鼠二抗(康為公司)室溫下孵育1h，TBST緩沖液洗膜5次，化學(xué)發(fā)光底物ECL試劑盒(Thermo,32106)顯色。

結(jié)果如圖1所示，2w、4w、6w為慢性肝損傷病理組2周、4周和6周處死小鼠；2w+H、4w+H、6w+H為Honokiol納米顆粒抑制組2周、4周和6周處死小鼠；R2w、R4w為逆轉(zhuǎn)組2周、4周處死小鼠；R2w+H、R4w+H為Honokiol納米顆粒促逆轉(zhuǎn)組2周、4周處死小鼠；可以看出，Honokiol納米顆粒對慢性肝損傷4-6周以及逆轉(zhuǎn)期4周LSEC中Akt的磷酸化具有較為顯著的抑制作用，與此同時可促進(jìn)Erk1/2的磷酸化，并顯著提升下游eNOS/Nox2的比例。Honokiol在纖維化發(fā)生之時能夠維持LSEC中p-Erk1/2/p-Akt的高比值，并顯著提升下游eNOS/Nox2的比例進(jìn)而保持了LSEC的分化表型以及正常的生理功能。

二、Honokiol納米顆粒在慢性肝損傷階段調(diào)控LSEC的分化表型

Honokiol在纖維化發(fā)生之時能夠維持LSEC中p-Erk1/2/p-Akt的高比值，進(jìn)而保持了LSEC的分化表型以及正常的生理功能。

已知Honokiol能夠抑制Akt蛋白的磷酸化，并促進(jìn)Erk1/2的磷酸化，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Honokiol在臨床上被用作血管保護(hù)劑，治療心肌肥大等心血管疾病。圖1所示Honokiol納米顆粒對慢性肝損傷4-6周以及逆轉(zhuǎn)期4周LSEC中Akt的磷酸化具有較為顯著的抑制作用，與此同時可促進(jìn)Erk1/2的磷酸化，并顯著提升下游eNOS/Nox2的比例。因此進(jìn)一步采用掃描電鏡的方法，確認(rèn)Honokiol納米顆粒在慢性肝損傷階段對LSEC的分化表型是否具有調(diào)控作用。

1、Honokiol納米顆粒在慢性肝損傷階段對LSEC的分化表型是否具有調(diào)控作用

具體方法如下：

1)取材：將組織塊固定在濾紙或卡片紙上，以充分暴露待觀察的組織表面，用手術(shù)刀切成面積達(dá)8mm×8mm，厚度達(dá)5mm的小塊；

2)樣品的清洗：用等滲的PBS緩沖液清洗；

3)固定：3％戊二醛固定。4℃過夜；

4)次日用PBS清洗細(xì)胞，依次用50％，70％，80％，90％和100％乙醇脫水，其中100％乙醇脫水3次，每次10min；

5)使用乙醇：叔丁醇＝1:1的混合溶液脫水；

6)使用純叔丁醇脫水2次，每次10min；

7)加入新鮮的叔丁醇以沒過組織樣品為宜；

8)冷凍干燥；

9)樣品噴金；

10)掃描電鏡觀測。

Honokiol納米顆粒對各組不同時間點組織肝竇表面內(nèi)皮細(xì)胞分化標(biāo)志物-窗孔結(jié)構(gòu)的維持情況如圖2所示，2w、4w、6w為慢性肝損傷病理組2周、4周和6周處死小鼠；2w+H、4w+H、6w+H為Honokiol納米顆粒抑制組2周、4周和6周處死小鼠；R2w、R4w為逆轉(zhuǎn)組2周、4周處死小鼠；R2w+H、R4w+H為Honokiol納米顆粒促逆轉(zhuǎn)組2周、4周處死小鼠；可以看出，Honokiol納米顆粒對慢性肝損傷4周和6周能很好的維持LSEC的分化表型(表面窗孔結(jié)構(gòu))，而在逆轉(zhuǎn)期2周和4周中，Honokiol納米顆粒可顯著加速LSEC分化表型的恢復(fù)。

2、Honokiol納米顆粒在慢性肝損傷階段提高LSEC促進(jìn)肝臟修復(fù)能力

另外，LSEC對肝損傷具有較好的修復(fù)作用，其分泌的HGF和Wnt2促進(jìn)了損傷部位肝實質(zhì)細(xì)胞的增殖。因此采用WB檢測的方法，確認(rèn)Honokiol納米顆粒在慢性肝損傷階段對LSEC的促修復(fù)能力是否具有調(diào)控作用。具體方法如下：

提取上述1中各組中不同時間點處死的小鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞全蛋白，通過Western blotting檢測各組中不同時間點的HGF和Wnt2(促進(jìn)肝實質(zhì)細(xì)胞修復(fù)，為LSEC促修復(fù)表型標(biāo)志物)的表達(dá)：

首先對樣本進(jìn)行常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上后放入封閉液(TBST中5％脫脂奶粉)中封閉1h，在1:200稀釋的HGF抗體和Wnt2抗體(Proteintech公司)一抗中4℃孵育過夜，TBST洗膜5次，加入1：5000稀釋鼠二抗(康為公司)室溫下孵育1h，TBST緩沖液洗膜5次，化學(xué)發(fā)光底物ECL試劑盒(Thermo,32106)顯色。

Honokiol納米顆粒對各組不同時間點LSEC促修復(fù)能力的維持情況如圖3所示，2w、4w、6w為慢性肝損傷病理組2周、4周和6周處死小鼠；2w+H、4w+H、6w+H為Honokiol納米顆粒抑制組2周、4周和6周處死小鼠；R2w、R4w為逆轉(zhuǎn)組2周、4周處死小鼠；R2w+H、R4w+H為Honokiol納米顆粒促逆轉(zhuǎn)組2周、4周處死小鼠；可以看出，Honokiol促進(jìn)HGF和Wnt2表達(dá)，表明，Honokiol對慢性肝損傷4周和6周能很好的維持LSEC的促修復(fù)作用，而在逆轉(zhuǎn)期2周和4周中，Honokiol納米顆?？娠@著加速LSEC分化表型的恢復(fù)。

三、Honokiol納米顆粒在治療慢性肝損傷階段肝纖維化病中的應(yīng)用

已知圖1所示Honokiol納米顆粒對慢性肝損傷4-6周以及逆轉(zhuǎn)期4周LSEC中Akt的磷酸化具有較為顯著的抑制作用，與此同時可促進(jìn)Erk1/2的磷酸化，并顯著提升下游eNOS/Nox2的比例。圖2所示Honokiol納米顆粒對慢性肝損傷4周和6周能很好的維持LSEC的分化表型，而在逆轉(zhuǎn)期2周和4周中，Honokiol納米顆?？娠@著加速LSEC分化表型的恢復(fù)。圖3所示Honokiol納米顆粒對慢性肝損傷4周和6周能很好的維持LSEC的促修復(fù)作用，而在逆轉(zhuǎn)期2周和4周中，Honokiol納米顆?？娠@著加速LSEC分化表型的恢復(fù)。因此進(jìn)一步肝組織切片Masson三色染色和血清ALT，AST含量(肝損傷檢測指標(biāo)，輔助Masson染色評價肝纖維化病癥的嚴(yán)重性)檢測的方法，確認(rèn)Honokiol納米顆粒靶向干預(yù)LSEC在慢性肝損傷階段肝纖維化病癥是否具有治療作用，具體方法如下

1、組織切片Masson三色染色

A、試劑的配置

1)蘇木素染液

2)Masson復(fù)合染色液：麗春紅(ponceau 2R)0.7g，酸性品紅(acid fuchsin)0.3g，蒸餾水99ml，冰醋酸(glacial acetic acid)1ml。

3)亮綠染色液：亮綠(light green)1g，冰醋酸(glacial acetic acid)1ml，蒸餾水99ml。

4)1％磷鉬酸水溶液：磷鉬酸(phosphomolybdic acid)1g，蒸餾水加至100ml。

5)2％苯胺藍(lán)液：苯胺藍(lán)(aniline blue)2g，冰醋酸(glacial acetic acid)2ml，蒸餾水加至100ml。

B、染色步驟：

將上述1中各組中不同時間點處死的小鼠肝組織進(jìn)行10％甲醛液固定，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。

1)蘇木素染液5～10min。

2)流水稍洗，1％鹽酸分化。

3)流水沖洗數(shù)分鐘。

4)Masson復(fù)合染色液5～10min。

5)蒸餾水稍沖洗。

6)1％磷鎢酸液處理約5min。

7)不用水洗，直接用亮綠染色液(或苯胺藍(lán)液)復(fù)染5min。

8)1％冰醋酸水處理1min。

9)95％酒精脫水多次。

10)無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

Honokiol納米顆粒對肝纖維化進(jìn)程的抑制(A)以及對肝纖維化逆轉(zhuǎn)(B)的加速作用的Masson染色驗證如圖4所示，2w、4w、6w為慢性肝損傷病理組2周、4周和6周處死小鼠；2w+H、4w+H、6w+H為Honokiol納米顆粒抑制組2周、4周和6周處死小鼠；R2w、R4w為逆轉(zhuǎn)組2周、4周處死小鼠；R2w+H、R4w+H為Honokiol納米顆粒促逆轉(zhuǎn)組2周、4周處死小鼠；可以看出，Honokiol納米顆粒靶向LSEC抑制慢性肝損傷4周和6周肝纖維化結(jié)節(jié)的形成，而在逆轉(zhuǎn)期2周和4周中，Honokiol納米顆?？娠@著加速肝纖維化結(jié)節(jié)的消除。

2、血清ALT、AST含量檢測

上述1中各組中不同時間點處死的小鼠摘眼球采血，血液常溫靜置1-2小時，3000r/min離心，收取上層液體，交由中國人民解放軍307醫(yī)院檢驗科進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶以及谷草轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)水平檢測，具體方法如下：

1)試劑配制

(1)0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)

稱取NaH₂PO₄.2H₂O 2.96495g，Na₂HPO₄.12H₂O 29.0142g，溶解于蒸餾水中，定容到1000mL。

(2)20μmol/L丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液

稱取22mg丙酮酸鈉，溶解于0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)100mL中?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

(3)ALT基質(zhì)液

稱取α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78mg(L-丙氨酸0.85mg)溶解于30mL0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)中，溶解后校正pH至7.4，再用pH7.4的磷酸緩沖液定容至100mL，置冰箱中保存?zhèn)溆?可保存一周)。可加入氯仿數(shù)滴防腐。

(4)0.02％2，4—二硝基苯肼溶液

稱取20mg2，4—二硝基苯肼先溶解于10mL純鹽酸中，電爐加熱助溶，待2，4—二硝基苯肼全部溶解后，用蒸餾水稀釋至100mL，過濾后盛于棕色中，置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(5)1mol/L NaOH溶液：

稱取4g NaOH溶解于蒸餾水后，定容到100mL。

(6)0.4mol/L NaOH溶液

稱取16g NaOH溶解于蒸餾水后，定容到1000mL。

2)實驗方法

(1)樣品的處理按3.5方法進(jìn)行。

(2)ALT標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.將測定所用試劑除氫氧化鈉溶液外全部置于水浴箱內(nèi)，預(yù)溫37℃至然后使用.取6支試管，按表1進(jìn)行配制

表1 ALT標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

2.冷卻后以0為對照用分光光度計比色測定吸光值OD_520nm。

3.以丙酮酸含量為縱坐標(biāo)，吸光值OD_520nm為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

Honokiol納米顆粒對肝纖維化進(jìn)程的抑制(A)以及對肝纖維化逆轉(zhuǎn)(B)的加速作用的血清ALT，AST含量檢測的驗證如圖5所示，可以看出，Honokiol納米顆粒靶向LSEC降低慢性肝損傷4周和6周血清中ALT和AST的含量，而在逆轉(zhuǎn)期2周和4周中，Honokiol納米顆?？娠@著加速血清中ALT和AST的含量的降低。