本申請要求在韓國專利局于2015年7月1日提交的韓國專利中請No.10-2015-0094272和2015年1月25日提交的韓國專利申請No.10-2016-0008900的權(quán)益，其完整內(nèi)容通過提述并入本文。

發(fā)明背景

1.領(lǐng)域

本公開涉及用于降低細(xì)胞衰老水平的組合物，降低哺乳動物中細(xì)胞衰老水平的方法，和治療哺乳動物中與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀的方法。

2.相關(guān)領(lǐng)域的描述

衰老可以定義為細(xì)胞分裂的永久性停止。觀察復(fù)制性衰老或細(xì)胞衰老作為細(xì)胞水平上的老化模型。當(dāng)持續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞時，使細(xì)胞分裂多次，但一旦達(dá)到衰老時細(xì)胞不再分裂。衰老細(xì)胞經(jīng)常對程序性細(xì)胞死亡有抗性，且在一些情況中，衰老細(xì)胞保持不分裂狀態(tài)達(dá)幾年。

在與血清應(yīng)答元件(SRE)途徑活化有關(guān)的新的人基因的高通量篩選的過程期間發(fā)現(xiàn)DCUN1D3。DCUN1D3基因在脊椎動物中高度保守。人DCUN1D3互補(bǔ)DNA(cDNA)編碼304個氨基酸，具有34kDa的表觀分子量。DCUN1D3的氨基酸序列和編碼其的核苷酸序列可以分別是在Genbank登錄號NP_775746.1和NM_173475.2中描述的那些。DCUN1D3在幾種腫瘤組織和培養(yǎng)細(xì)胞系中廣泛表達(dá)。UV輻射顯著增加癌細(xì)胞系中的DCUN1D3表達(dá)水平。

在此背景下，仍然需要用于降低細(xì)胞衰老水平的組合物及其方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一個方面提供用于降低細(xì)胞衰老水平的組合物。

另一個方面提供降低哺乳動物中細(xì)胞衰老水平的方法。

再一個方面提供治療哺乳動物中與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀的方法。

附圖說明

這些和/或其他方面從連同附圖一起采用的例示性實(shí)施方案的以下描述將變得明顯和更容易領(lǐng)會的。

圖1是用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的衰老細(xì)胞的顯微鏡圖；

圖2A是用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒(小圖A)或含混雜shRNA的慢病毒(小圖B)轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的X-gal染色圖；

圖2B是在圖2A的X-gal染色圖中染成藍(lán)色的細(xì)胞的百分比；

圖3顯示根據(jù)用含DCUN1D3 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度的脂褐素量；

圖4顯示用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒或含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的相對細(xì)胞大小(對照的％)；

圖5顯示引入有DCUN1D3 siRNA或?qū)φ誷iRNA的衰老細(xì)胞在細(xì)胞周期的G0/G1、S或G2/M期的比例；

圖6顯示用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的衰老細(xì)胞的相對數(shù)目(A)和DNA含量(B)；

圖7顯示用含混雜shRNA(A)或SEAT1 shRNA(B)或DCUN1D3 shRNA(C)的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的X-gal染色圖，和染成藍(lán)色的細(xì)胞的百分比(％)；

圖8顯示測量用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞中的脂褐素的結(jié)果；

圖9顯示測量用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的細(xì)胞大小(A)和細(xì)胞粒度(B)的結(jié)果；

圖10顯示測量用SEAT1 siRNA或DCUN1D3 siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期的結(jié)果；

圖11顯示在引入有siSEAT1的人細(xì)胞(A)和小鼠細(xì)胞(B)中DCUN1D3基因和SEAT1基因的表達(dá)水平；

圖12顯示SEAT1 shRNA和/或DCUN1D3 shRNA對胞內(nèi)DNA損傷的影響；

圖13顯示SEAT1或DCUN1D3基因表達(dá)抑制對hIL-6表達(dá)的影響；和

圖14顯示miR-20b對DCUN1D3基因表達(dá)的影響。

具體實(shí)施方式

本文中提供了用于降低細(xì)胞衰老水平的組合物，該組合物包含作為活性成分的抑制以下一種或多種的活性的活性抑制劑：DCUN1D3蛋白(DCN1(cullin類泛素修飾(neddylation)缺陷1)含域3蛋白)和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸，或抑制以下一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑：編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因。

在與血清應(yīng)答元件(SRE)途徑活化有關(guān)的新的人基因的高通量篩選的過程期間發(fā)現(xiàn)了DCUN1D3。DCUN1D3基因在脊椎動物中高度保守。人DCUN1D3互補(bǔ)DNA(cDNA)編碼304個氨基酸，具有34kDa的表觀分子量。DCUN1D3的氨基酸序列和編碼其的核苷酸序列可以分別是在Genbank登錄號NP_775746.1(SEQ ID NO：3)和NM_173475.2(SEQ ID NO：4)中描述的那些。DCUN1D3在幾種腫瘤組織和培養(yǎng)細(xì)胞系中廣泛表達(dá)。UV輻射顯著增加癌細(xì)胞系中的DCUN1D3表達(dá)水平。

抑制DCUN1D3活性的活性抑制劑可以是抑制DCUN1D3的類泛素修飾活性的物質(zhì)。類泛素修飾可以是泛素樣蛋白NEDD8綴合到其靶蛋白的過程。

具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸(下文稱為“SEAT1(衰老有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本1)RNA”基因)可以是編碼長的非編碼核糖核酸(lncRNA)的基因。非編碼RNA是一種不翻譯成蛋白質(zhì)的功能性RNA分子。ncRNA可以是小核仁RNA(snoRNA)、microRNA、小干擾RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、胞外RNA(exRNA)、Piwi相互作用性RNA(piRNA)、或長ncRNA(IncRNA)。IncRNA是不翻譯成蛋白質(zhì)或具有低蛋白編碼潛力的轉(zhuǎn)錄本，且具有約50個核苷酸或更多、約100個核苷酸或更多、約200個核苷酸或更多、或約500個核苷酸或更多的長度。SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸可以是來自位于人16號染色體的p臂的核酸轉(zhuǎn)錄的核酸。SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸可以是來自位于人16號染色體的ERI1外切核糖核酸酶家族成員2(ERI2)基因和DCUN1D3基因(DCN1，cullin類泛素修飾缺陷1)含域3基因)之間的基因組區(qū)域的核酸。具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的核酸可以具有GenBank登錄號AK027199的序列。

抑制SEAT1 RNA活性的活性抑制劑可以是針對SEAT1 RNA的小干擾RNA(siRNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)、反義寡核苷酸、miRNA、或其組合。siRNA可以是短的雙鏈RNA(dsRNA)，具有磷酸化的5′端和羥基化的3′端，有兩個突出的核苷酸。siRNA長度可具有20至24個核苷酸。siRNA可以具有與靶基因的mRNA互補(bǔ)的核苷酸序列。針對SEAT1 RNA的siRNA可以包含SEQ ID NO：6的多核苷酸和SEQ ID NO：7的多核苷酸(SEAT1 siRNA#1)；SEQ ID NO：8的多核苷酸和SEQ ID NO：9的多核苷酸(SEAT1 siRNA#2)；或SEQ ID NO：10的多核苷酸和SEQ ID NO：11的多核苷酸(SEAT1 siRNA#3)。抑制SEAT1RNA活性的活性抑制劑也可以是抑制DCUN1D3表達(dá)的表達(dá)抑制劑。

編碼SEAT1 RNA的基因可以位于人16號染色體的p臂。該基因可以是AK027199基因，即SEQ ID NO：5的多核苷酸。編碼SEAT1 RNA的基因可以位于人16號染色體的ERI2基因和DCUN1D3基因之間。

抑制編碼DCUN1D3和SEAT1 RNA的一種或多種的基因的表達(dá)的表達(dá)抑制劑可以是任何表達(dá)抑制劑，只要它降低細(xì)胞中編碼DCUN1D3和SEAT1RNA的一種或多種的基因的表達(dá)。表達(dá)抑制劑可以是siRNA、shRNA、miRNA、反義寡核苷酸、或其組合。針對DCUN1D3基因的siRNA可包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和SEQ ID NO：2的核苷酸序列(DCUN1D3 siRNA#1)。針對SEAT1 RNA的siRNA可以包含SEQ ID NO：6的核苷酸序列和SEQ ID NO：7的核苷酸序列(SEAT1 siRNA#1)；SEQ ID NO：8的核苷酸序列和SEQ ID NO：9的核苷酸序列(SEAT1 siRNA#2)；或SEQ ID NO：10的核苷酸序列和SEQ ID NO：11的核苷酸序列(SEAT1 siRNA#3)。抑制編碼SEAT1 RNA的基因表達(dá)的表達(dá)抑制劑也可以是抑制編碼DCUN1D3的基因表達(dá)的表達(dá)抑制劑。

抑制編碼DCUN1D3的基因表達(dá)的表達(dá)抑制劑可以是任何表達(dá)抑制劑，只要它降低細(xì)胞中編碼DCUN1D3基因的表達(dá)。表達(dá)抑制劑可以是小干擾RNA(siRNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)、反義寡核苷酸、或其組合。所述shRNA可包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列和SEQ ID NO：2的核苷酸序列。表達(dá)抑制劑可以是miR-20b。

在所述組合物中，細(xì)胞衰老水平的降低可以指細(xì)胞衰老的延遲或預(yù)防，或?qū)⑺ダ霞?xì)胞逆轉(zhuǎn)成更幼嫩的細(xì)胞狀態(tài)(例如非衰老細(xì)胞)。

在所述組合物中，細(xì)胞衰老水平的降低可包括以下一種或多種：細(xì)胞增殖的增加、增加自體吞噬活性、減少脂褐素的積累、降低β-半乳糖苷酶的活性、減少線粒體反應(yīng)性氧種類(reactive oxygen species)的數(shù)目、和增加線粒體膜電位。細(xì)胞可以是肌細(xì)胞，包括成肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、早老細(xì)胞(early senescent cell)、或神經(jīng)細(xì)胞。早老細(xì)胞可以是源自(獲自)患有早衰癥(progeria)的患者的細(xì)胞。早衰癥可以是Hutchinson-Gilford(哈-格二氏)早衰或Werner綜合征。

所述組合物可以用于治療與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀。與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀可包括皮膚皺紋、傷口愈合降低、肌肉衰減癥(sarcopenia)、肌營養(yǎng)不良、早衰癥狀(例如哈-格二氏早老綜合征)、或其組合。與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀可以包括與脂褐素積累相關(guān)的疾病或疾病癥狀。與脂褐素積累相關(guān)的疾病或疾病癥狀可以是神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(neuronal ceroid lipofuscinoses，NCL)、年齡相關(guān)的黃斑變性、神經(jīng)原纖維性纏結(jié)(neurofibrillary tangles)、心臟褐色萎縮(Brown atrophy of the heart)、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis(ALS))、肢端肥大癥(acromegaly)、去神經(jīng)萎縮(denervation atrophy)、脂質(zhì)肌病(lipid myopathy)或慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)。此外，與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀可以是由線粒體損傷所致的疾病，如線粒體ROS的增加、線粒體膜電位的降低、或其組合。另外，與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀可以是由細(xì)胞中增加的β-半乳糖苷酶活性導(dǎo)致的疾病。

抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑可以制備為藥學(xué)可接受的鹽。

細(xì)胞可以是哺乳動物(包括人)的細(xì)胞。哺乳動物可以患有與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病。細(xì)胞可以存在于體外(例如細(xì)胞系)或體內(nèi)。細(xì)胞可以是成纖維細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。

組合物還可以包含藥學(xué)可接受的載體。在組合物中，“藥學(xué)可接受的載體”一般指惰性材料，即與活性成分組合使用以協(xié)助該活性成分的應(yīng)用的材料。載體可以包括一般使用的藥學(xué)可接受的賦形劑、添加劑或稀釋劑。例如，載體可以包括選自以下的一種或多種：填充劑、粘合劑、崩解劑、緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑、滑潤劑、芳香劑(flavoring agent)、稠化劑、著色劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑和等張劑。

載體可以包含用于將核苷酸投遞給受試者(例如哺乳動物)的媒介物。所述媒介物可包括納米顆粒、編碼siRNA序列的DNA模板、陽離子脂質(zhì)體、膽固醇綴合物、抗體綴合物陽離子脂質(zhì)(如Lipofectamine)、帶正電荷的肽或蛋白質(zhì)、和/或肽介導(dǎo)的投遞系統(tǒng)?？梢允褂脤iRNA投遞到特定靶細(xì)胞的胞質(zhì)的許多辦法，復(fù)雜性范圍從簡單的裸siRNA到復(fù)雜的基于納米顆粒的投遞媒介物。例子包括但不限于，可以將編碼siRNA序列的DNA模板投遞至可轉(zhuǎn)錄以表達(dá)siRNA的細(xì)胞；使用陽離子脂質(zhì)體、膽固醇綴合物、抗體綴合物、電穿孔、直接注射、水動力轉(zhuǎn)染(hydrodynamic transfection)、電脈沖或任何其他適用于直接投遞的方法；陽離子脂質(zhì)，如Lipofectamine，作為轉(zhuǎn)染試劑可用于體外投遞siRNA；siRNA可以使用膽固醇綴合物、脂質(zhì)體和基于聚合物的納米顆粒大小的投遞媒介物系統(tǒng)性投遞；且siRNA可以經(jīng)由肽介導(dǎo)的投遞系統(tǒng)投遞?？梢允褂糜糜谕哆f的質(zhì)粒或病毒載體。

根據(jù)一些實(shí)施方案，帶正電荷的肽或蛋白質(zhì)可以用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)-siRNA復(fù)合物，其可用于投遞siRNA。siRNA的磷酸酯骨架帶負(fù)電荷，且允許與陽離子肽和蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，不管其序列如何。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)-siRNA復(fù)合物可包含非特異性細(xì)胞穿透肽(例如Tat)來將siRNA投遞至細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)-siRNA復(fù)合物可包含靶向性模塊，如受體結(jié)合肽或抗體用于特異性投遞。所述組合物可以以“治療有效量”包含抑制以下一種或多種的活性的活性抑制劑：DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸，或抑制以下一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑：編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因，其藥學(xué)可接受的鹽，或溶劑合物。在組合物中，“治療有效量”指在施用給需要治療的受試者時足以指示治療效果的量。術(shù)語“治療”指在受試者(例如哺乳動物，包括人)中治療疾病或醫(yī)學(xué)癥狀如與細(xì)胞衰老相關(guān)的疾病的實(shí)踐，且治療的例子如下：(a)預(yù)防疾病或醫(yī)學(xué)癥狀的發(fā)生，即對患者的預(yù)防性治療；(b)緩解疾病或醫(yī)學(xué)癥狀，即涉及患者中的疾病或醫(yī)學(xué)癥狀的除去或恢復(fù)；(c)抑制疾病或醫(yī)學(xué)癥狀，即涉及延遲或停止受試者中疾病或醫(yī)學(xué)癥狀；或(d)減輕受試者中的疾病或醫(yī)學(xué)癥狀?！坝行Я俊笨梢杂杀绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員適當(dāng)?shù)剡x擇。例如，“有效量”可以在約0.01mg至約10,000mg、約0.1mg至約1,000mg、約1mg至約100mg、約0.01mg至約1,000mg、約0.01mg至約100mg、約0.01mg至約10mg、或約0.01mg至約1mg每日的范圍內(nèi)。

組合物可以口服施用給受試者，或胃腸外經(jīng)由靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、直腸和局部施用給受試者。因此，組合物可以配制為多種形式，包括片劑、膠囊劑、水性溶液、或懸浮劑。在用于口服使用的片劑配制劑的情況中，一般可以將賦形劑如乳糖或玉米淀粉和滑潤劑如硬脂酸鎂添加至組合物。在用于口服使用的膠囊劑配制劑的情況中，乳糖和/或干玉米淀粉可以用作稀釋劑。當(dāng)需要用于口服使用的水性懸浮劑時，活性成分可以與乳化劑和/或懸浮劑聯(lián)合使用。若必要的話，可添加特定的甜味劑和/或芳香劑。在神經(jīng)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)施用的情況中，一般制備活性成分的無菌溶液，由此適當(dāng)?shù)卣{(diào)整和緩沖溶液的pH。在靜脈內(nèi)施用的情況中，調(diào)整溶質(zhì)的總濃度以賦予配制劑以等張性。組合物可以制備成含有藥學(xué)可接受的載體的水性溶液，具有pH 7.4，如同鹽水。水性溶液可以經(jīng)由局部推注注射引入患者的肌肉或神經(jīng)血液流中。

如本文中使用的，術(shù)語“細(xì)胞衰老(或細(xì)胞的衰老)”指相比于參照細(xì)胞，下列一種或多種：細(xì)胞增殖的降低、自體吞噬活性的降低、脂褐素的累積、β-半乳糖苷酶活性的增加、線粒體ROS數(shù)目的增加、和線粒體膜電位的降低、或指導(dǎo)致上述現(xiàn)象的過程。在本文中，所述參照細(xì)胞可以是同一類型的已知的非衰老細(xì)胞。術(shù)語“幼嫩細(xì)胞”指與參照細(xì)胞相比時，具有以下一種或多種的細(xì)胞：細(xì)胞增殖的增加、自體吞噬活性的增加、脂褐素累積的降低、β-半乳糖苷酶活性的降低、線粒體ROS數(shù)目的降低、和線粒體膜電位的增加。在本文中，所述參照細(xì)胞可以是同一類型的已知的衰老細(xì)胞。作為參考細(xì)胞的非衰老細(xì)胞可以是源自年齡為約18至約25、約18至約23或約18至約20歲的正常且健康的人的細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞。

所述組合物可以與一種或多種另外的治療劑組合使用來治療與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病?；蛘?，除了以下之外，組合物可以沒有其他活性成分來治療與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾?。阂种艱CUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑，其藥學(xué)可接受的鹽，或其溶劑合物。

另一個方面提供用于降低細(xì)胞中脂褐素累積的組合物，該組合物包含抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑作為活性成分。該組合物可以用于治療與細(xì)胞中脂褐素的累積有關(guān)的疾病或疾病癥狀。與脂褐素的累積有關(guān)的疾病或疾病癥狀可以是NCL、年齡相關(guān)的黃斑變性、神經(jīng)原纖維性纏結(jié)、心臟褐色萎縮、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、ALS、肢端肥大癥、去神經(jīng)萎縮、脂質(zhì)肌病、或COPD。除非本文中另外提到，在“用于降低細(xì)胞中的脂褐素累積的組合物”中使用的術(shù)語與“用于降低細(xì)胞衰老水平的組合物’中的那些相同。

再一個方面提供用于增加細(xì)胞增殖的組合物，該組合物包含抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑作為活性成分。該組合物可以用于治療與降低的細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病或疾病癥狀。與降低的細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病或疾病癥狀可以是皮膚皺紋、傷口愈合降低、肌肉衰減癥、肌營養(yǎng)不良、早衰癥狀(例如哈-格二氏早老綜合征)、或其組合。除非本文中另外提到，在“用于增加細(xì)胞增殖的組合物“中使用的術(shù)語與”用于降低細(xì)胞衰老水平的組合物“中的那些相同。

又一個方面提供了降低哺乳動物中細(xì)胞衰老水平的方法，該方法包括對哺乳動物施用有效量的抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑來降低細(xì)胞衰老水平。

關(guān)于所述方法使用的“抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑”，“降低細(xì)胞衰老水平”和“哺乳動物”與上文的描述相同。有效量指在施用給受試者時“足以降低細(xì)胞衰老水平的量”。施用指施用上文描述的組合物，包含“抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑，其藥學(xué)可接受的鹽或其溶劑合物”。

再一個方面提供了治療哺乳動物中與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀的方法，該方法包括對哺乳動物施用治療有效量的抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑以治療與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀。

關(guān)于所述方法使用的“抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種表達(dá)的表達(dá)抑制劑”，“與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀”和“哺乳動物”與上文的描述相同。有效量指在施用給具有與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀的受試者時“足以治療與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀的量”。施用指施用上文描述的組合物，包含“抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑，其藥學(xué)可接受的鹽或其溶劑合物”。

關(guān)于所述方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)患者的狀況適宜地選擇施用路徑。施用可以是口服、胃腸外或局部施用。施用可以是局部應(yīng)用至組成為(consist of)或包含衰老細(xì)胞的組織。施用可以局部施用至皮膚組織、肌肉組織或神經(jīng)組織。

關(guān)于所述方法，“治療有效量”是在哺乳動物中有效得足以治療與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀的量。如上文描述的，施用量可根據(jù)多種因素而變化，諸如患者的狀況、施用路徑或內(nèi)科醫(yī)師的決定。可以通過體外或從動物模型測試獲得的劑量-反應(yīng)曲線來估測有效施用量。本發(fā)明的組合物中組分的比率或濃度可以根據(jù)化學(xué)特性、施用路徑或治療量來確定。當(dāng)以約約1μg/kg至約1g/kg每天或約0.1mg/kg至約500mg/kg重量每天的范圍施用時，施用量在受試者中可以是有效的。施用量可以隨受試者的年齡、重量、易感性或癥狀而變化。

再一個方面提供了降低哺乳動物細(xì)胞中脂褐素水平的方法，該方法包括對哺乳動物施用治療有效量的抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑以降低細(xì)胞中的脂褐素水平。該方法可以用于治療與哺乳動物細(xì)胞中增加的脂褐素水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀。與增加的脂褐素水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀可以是NCL、年齡相關(guān)的黃斑變性、神經(jīng)原纖維性纏結(jié)、心臟褐色萎縮、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、ALS、肢端肥大癥、去神經(jīng)萎縮、脂質(zhì)肌病、或COPD。除非本文中另外提到，在“降低哺乳動物細(xì)胞中脂褐素水平的方法”中使用的術(shù)語與“治療哺乳動物中與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀的方法”中的那些相同。

仍一個方面提供了增加哺乳動物細(xì)胞增殖的方法，該方法包括對哺乳動物施用有效量的抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑以增加細(xì)胞的增殖。該方法可以用于治療與哺乳動物細(xì)胞的降低的增殖有關(guān)的疾病或疾病癥狀。與細(xì)胞的降低增殖有關(guān)的疾病或疾病癥狀可以是皮膚皺紋、傷口愈合降低、肌肉衰減癥、肌營養(yǎng)不良、早衰癥狀(例如哈-格二氏早老綜合征)、或其組合。除非本文中另外提到，在“增加哺乳動物細(xì)胞增殖的方法”中使用的術(shù)語與“治療哺乳動物中與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀的方法”中的那些相同。

根據(jù)一個方面的組合物可以用于降低細(xì)胞衰老水平，該組合物包含抑制DCUN1D3蛋白和具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的一種或多種的活性的活性抑制劑，或抑制編碼DCUN1D3的基因和編碼SEQ ID NO：5的核苷酸序列的基因的一種或多種的表達(dá)的表達(dá)抑制劑，其藥學(xué)可接受的鹽，或其溶劑合物。

根據(jù)另一個方面的降低哺乳動物中細(xì)胞衰老水平的方法可以用于有效降低哺乳動物中的細(xì)胞衰老。

根據(jù)又一個方面的治療哺乳動物中與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀的方法可以用于有效治療哺乳動物中與增加的細(xì)胞衰老水平有關(guān)的疾病或疾病癥狀。

再一個方面提供降低細(xì)胞中細(xì)胞衰老水平的方法，該方法包括抑制細(xì)胞中DCUN1D3和/或具有核苷酸序列SEQ ID NO：5的多核苷酸的活性或表達(dá)。

用于所述方法的細(xì)胞可以源自哺乳動物。哺乳動物可以患有與增加的細(xì)胞衰老或脂褐素的累積有關(guān)的疾病或疾病癥狀。所述疾病或癥狀可以是皮膚皺紋、傷口愈合降低、肌肉衰減癥、肌營養(yǎng)不良、早衰癥狀(例如哈-格二氏早老綜合征)、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(NCL)、年齡相關(guān)的黃斑變性、神經(jīng)原纖維性纏結(jié)、心臟褐色萎縮、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、肢端肥大癥、去神經(jīng)萎縮、脂質(zhì)肌病或慢性阻塞性肺病(COPD)、或其組合?？梢酝ㄟ^對細(xì)胞施用小干擾RNA(siRNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)、microRNA(miRNA)、反義寡核苷酸、或其組合(其與編碼DCUN1D3的核苷酸序列或SEQ ID NO：5雜交)在細(xì)胞中抑制DCUN1D3和/或具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的多核苷酸的活性或表達(dá)。

現(xiàn)將詳細(xì)參考例示性實(shí)施方案，其例子在所附附圖中例示，其中類似的參考編號通篇指類似的要素。在此方面，本發(fā)明的例示性實(shí)施方案可具有不同的形式且不應(yīng)理解為受到本文中列出的描述的限制。因此，例示性實(shí)施方案僅在以下通過參照附圖描述來解釋各方面。如本文中使用的，術(shù)語“和/或”包括一種或多種所列關(guān)聯(lián)項(xiàng)的任意和所有組合。

下文中，將參照以下實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例僅用于例示性目的且不意圖限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1：DCUN1D3 shRNA或siRNA對衰老細(xì)胞的影響

(1)誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的增殖

將DCUN1D3 shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到衰老細(xì)胞中來檢查其對衰老細(xì)胞增殖的影響。要使用的衰老細(xì)胞通過將獲自4步齡男孩的人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)M4細(xì)胞(源自該4步齡供體的包皮，Seoul National University)在DMEM(下文稱為‘DMEM”)(HyClone，Logan，UT，USA：貨號SH30243)中在37℃和5％CO₂的條件下傳代培養(yǎng)來制備，所述DMEM含有高濃度的葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸鹽，并補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1x青霉素/鏈霉素(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)。使用的衰老細(xì)胞在第33代且細(xì)胞倍增時間為約14天或更長。

將DCUN1D3 shRNA引入慢病毒中來制備含DCUN1D3 shRNA的慢病毒，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到所述衰老細(xì)胞中。通過以下來制備含DCUN1D3 shRNA的慢病毒pLKO.1puro載體(OriGene，USA)：分別合成SEQ ID NOS：1和2的核苷酸序列來制備雙鏈shRNA構(gòu)建體(IDT，Korea)，并將該shRNA構(gòu)建體連接到用限制酶AgeI和EcoRI消化的pLKO.1puro載體中。使用Lipofectamine 2000連同包裝載體VSV-G和PAX2(OriGene，USA)將制備好的含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到293FT人胚胎腎細(xì)胞(#R700-07：Invitrogen)。本文中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)期間，向腎細(xì)胞的生長培養(yǎng)基添加6ug/ml聚凝胺(polybrene)以增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的第2天，收集慢病毒上清并使用Lenti-X(Clontech，貨號631231)濃縮。

將如此制備的含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染到衰老細(xì)胞中并在DMEM(下文稱為“DMEM”)(HyClone，貨號SH30243，USA)中在37℃和5％CO₂的條件下傳代培養(yǎng)4周，所述DMEM含有高濃度的葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸鹽，并補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1x青霉素/鏈霉素(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)。DCUN1D3 shRNA的核苷酸序列是SEQ ID NO：1(有義)和SEQ ID NO：2(反義)的核苷酸序列。制造商提供的混雜RNA(Bioneer，Korea)被用作對照組。

SEQ ID NO：1(有義)：GUCACUGCAUCGGGAAAUA(dTdT)

SEQ ID NO：2(反義)：UAUUUCCCGAUGCAGUGAC(dTdT)

圖1是用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)衰老細(xì)胞的顯微鏡圖。在圖1中，“對照shRNA”指用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞，而“DCUN1D3 shRNA”指用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞。如圖1中顯示的，用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞顯示與用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞(即陰性對照組)相比，細(xì)胞數(shù)目的增加和與幼嫩細(xì)胞類似的形態(tài)學(xué)，從而指示DCUN1D3 shRNA在引入衰老細(xì)胞后誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的增殖。

(2)衰老有關(guān)的beta-半乳糖苷酶(SAβ-gal)活性的降低

衰老細(xì)胞由于增加的SAβ-gal活性而被X-gal染成藍(lán)色。如(1)中解釋的，將衰老細(xì)胞用含DCUN1D3 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染，并測量培養(yǎng)的衰老細(xì)胞中的SAβ-gal活性。沒有用含DCUN1D3 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞被用作陰性對照組。

詳細(xì)地，使用細(xì)胞衰老測定試劑盒(CeU BIOLABS，INC.)依照制造商說明來染色培養(yǎng)的衰老細(xì)胞，并在顯微鏡下對染成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。圖2A是用含DCUN1D3 shRNA(右)或混雜shRNA(左)的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的X-gal染色圖(A)，且圖2B是在圖2A的X-gal染色圖中染成藍(lán)色的細(xì)胞的百分比(B)。

如圖2B中顯示的，約84％的用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞被染色，而約52％的用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞被染色。因此，確認(rèn)了SAβ-gal活性通過用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染衰老細(xì)胞而降低，表明細(xì)胞衰老水平通過用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染衰老細(xì)胞而降低。

(3)自體吞噬活性的降低和脂褐素累積的降低

已知衰老細(xì)胞顯示自體吞噬活性的降低、脂褐素的累積和線粒體損傷。為了檢查這點(diǎn)，如(1)描述的，將衰老細(xì)胞用含DCUN1D3 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染，并測量培養(yǎng)的衰老細(xì)胞中脂褐素的量。沒有用含DCUN1D3 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞被用作陰性對照組。此外，測量了細(xì)胞的大小。

通過自身熒光測量培養(yǎng)的衰老細(xì)胞中脂褐素的量。圖3顯示用含DCUN1D3 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞中脂褐素的量。

如圖3中顯示的，與用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的自身熒光水平(作為100％)相比，用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的自身熒光水平為約66％。因此，確認(rèn)了脂褐素累積通過用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞而在衰老細(xì)胞中降低，表明細(xì)胞衰老水平通過用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染衰老細(xì)胞而降低。

圖4顯示測量用含DCUN1D3 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的大小的結(jié)果。如圖4顯示的，用含DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的大小比用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞小。

在圖3-4中，通過流式細(xì)胞術(shù)估測細(xì)胞的大小、粒度和自身熒光。詳細(xì)地，將用胰蛋白酶處理的細(xì)胞收集到PBS中，并通過FACS Caliber儀(Becton Dickson，USA)分析。通過之前的前向和側(cè)向散射來評估100,000個細(xì)胞的大小和粒度。使用用于激發(fā)的488-nm激光和用于檢測的530/30帶通濾波器來測量自身熒光。在圖4的A和B的縱軸中的FSC和SSC分別代表前向散射(細(xì)胞大小)和側(cè)向散射(細(xì)胞粒度)。

(4)對細(xì)胞周期調(diào)控的影響

當(dāng)衰老時，在G0/G1期的細(xì)胞的比例增加，而在S期和G2/M期的細(xì)胞的比率降低。

為了確認(rèn)這一點(diǎn)，對衰老細(xì)胞引入siRNA和對照siRNA，并檢查細(xì)胞周期。詳細(xì)地，如(1)解釋的，將siRNA和對照siRNA引入衰老細(xì)胞中，通過使用lipofectamine而不是將shRNA或混雜RNA包裝在慢病毒中將其導(dǎo)入，培養(yǎng)衰老細(xì)胞，然后檢查細(xì)胞周期。引入DCUN1D3 shRNA，因此允許DCUN1D3 siRNA在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。

圖5顯示測量引入有DCUN1D3 siRNA或?qū)φ誷iRNA的衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期的結(jié)果。在圖5中，一式三份地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并實(shí)施培養(yǎng)3天。如圖5顯示的，與引入對照siRNA的衰老細(xì)胞相比，引入DCUN1D3 siRNA的衰老細(xì)胞顯示在G0/G1期的降低的細(xì)胞百分比和在S期和G2/M期的增加的細(xì)胞百分比。圖5縱軸的單位是％，其為當(dāng)將對照siRNA的結(jié)果取作100時的百分比。

[表1]

n＝3，3天培養(yǎng)，HDF(M4，倍增時間＝14天)。

實(shí)施例2：DCUN1D3 shRNA或siRNA和/或shSEAT1或siSEAT1對衰老細(xì)胞的影響

在本實(shí)施例中，檢查了DCUN1D3和SEAT1的胞內(nèi)水平的相關(guān)性，并檢查了其對衰老細(xì)胞的影響。

(1)誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的增殖

將DCUN1D3 shRNA或SEAT1(衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本1)shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)到衰老細(xì)胞中來檢查其對衰老細(xì)胞增殖的影響。要使用的衰老細(xì)胞通過將獲自4歲齡男孩的人皮膚成纖維細(xì)胞(HDF)M4細(xì)胞(源自該4歲齡供體的包皮，Seoul National University)在DMEM(下文稱為“DMEM”)(HyClone，Logan，UT，USA：貨號SH30243)中在37℃和5％CO₂的條件下傳代培養(yǎng)來制備，所述DMEM含有高濃度的葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸鹽，并補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1x青霉素/鏈霉素(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)。使用的衰老細(xì)胞在傳代第33代且細(xì)胞倍增時間為約14天或更長。

將DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA引入慢病毒中來制備含DCUN1D3shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒，將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到所述衰老細(xì)胞中。通過以下來制備含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒pLKO.1puro載體(OriGene，USA)：分別合成SEQ ID NOS：1和2，和SEQ ID NOS：6-11的核苷酸序列來制備雙鏈shRNA構(gòu)建體(IDT，Korea)，并將該shRNA構(gòu)建體連接到用限制酶AgeI和EcoRI消化的pLKO.1puro載體中。使用Lipofectamine 2000連同包裝載體VSV-G和PAX2(OriGene，USA)將制備好的含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到293FTA胚胎腎細(xì)胞(#R700-07：Invitrogen)。本文中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)期間，向腎細(xì)胞的生長培養(yǎng)基添加6ug/ml聚凝胺以增加轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后的第2天，收集慢病毒上清并使用Lenti-X(Clontech，貨號631231)濃縮。

將如此制備的含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染到衰老細(xì)胞中并在DMEM(下文稱為“DMEM”)(HyClone，貨號SH30243，USA)中在37℃和5％CO₂的條件下傳代培養(yǎng)4周，所述DMEM含有高濃度的葡萄糖、谷氨酰胺和丙酮酸鹽，并補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1x青霉素/鏈霉素(100U/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素)。使用的DCUN1D3 shRNA的核苷酸序列是SEQ ID NO：1(有義)和SEQ ID NO：2(反義)的核苷酸序列。使用的SEAT1 shRNA的核苷酸序列是SEQ ID NO：6的核苷酸序列和SEQ ID NO：7的多核苷酸(SEAT1 siRNA#1)；SEQ ID NO：8的核苷酸序列和SEQ ID NO：9的多核苷酸(SEAT1 siRNA#2)；或SEQ ID NO：10的核苷酸序列和SEQ ID NO：11的多核苷酸(SEAT1 siRNA#3)。制造商提供了用作對照組的混雜RNA(Bioneer，Korea)。

DCUN1D3 shRNA：

SEQ ID NO：1(有義)：GUCACUGCAUCGGGAAAUA(dTdT)

SEQ ID NO：2(反義)：UAUUUCCCGAUGCAGUGAC(dTdT)

SEAT1 shRNA：

SEAT1 siRNA#1；SEQ ID NO：6(有義)和SEQ ID NO：7(反義)的多核苷酸

SEAT1 siRNA#2；SEQ ID NO：8(有義)和SEQ ID NO：9(反義)的多核苷酸

SEAT1 siRNA#3；SEQ ID NO：10(有義)和SEQ ID NO：11(反義)的多核苷酸

圖6顯示用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)的衰老細(xì)胞的相對數(shù)目(A)和DNA含量(B)。在圖6中，“對照shRNA”表示用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞，而“DCUN1D3shRNA”和“SEAT1shRNA”分別表示用含DCUN1D3 shRNA(SEQ ID NOs：1和2)或SEAT1shRNA(SEQ ID NOs：6和7)的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞。如圖6中顯示的，用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞顯示與用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞(即陰性對照組)相比，細(xì)胞數(shù)目和DNA含量的增加。此外，其細(xì)胞形態(tài)與幼嫩細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)相同。因此，可以看出將DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA引入衰老細(xì)胞中誘導(dǎo)衰老細(xì)胞的增殖。在圖6中，如下測量DNA含量。將細(xì)胞以20,000個細(xì)胞/孔的密度接種到平底6孔微板中。通過測量在預(yù)定的時間在fluorstar微板讀數(shù)器(BMG Labtec，Cary，NC，USA)中的SYBR Gold(Invitrogen)熒光強(qiáng)度來測定細(xì)胞數(shù)。

(2)衰老有關(guān)的beta-半乳糖苷酶(SAβ-gal)活性的降低

衰老細(xì)胞由于增加的SAβ-gal活性被X-gal染成藍(lán)色。如(1)中解釋的，將衰老細(xì)胞用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染，并測量培養(yǎng)的衰老細(xì)胞中的SAβ-gal活性。沒有用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞被用作陰性對照組。

詳細(xì)地，使用細(xì)胞衰老測定試劑盒(Cell BIOLABS，INC.)依照制造商說明來染色培養(yǎng)的衰老細(xì)胞，并在顯微鏡下對染成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。圖7顯示用含混雜shRNA(A)或SEAT1 shRNA(B)或DCUN1D3 shRNA(C)的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的X-gal染色圖，和染成藍(lán)色的細(xì)胞的百分比(％)。

如圖7中顯示的，約85.5％的用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞被染色，而分別為約52％和約12.6％的用含DCUN1D3 shRNA和SEAT1 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞被染色。因此，確認(rèn)了SAβ-gal活性通過用含DCUN1D3 shRNA和/或SEAT1 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染衰老細(xì)胞而降低，表明細(xì)胞衰老水平通過用含DCUN1D3 shRNA和/或SEAT1 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染衰老細(xì)胞而降低。

(3)自體吞噬活性的降低和脂褐素累積的降低

已知衰老細(xì)胞顯示自體吞噬活性的降低、脂褐素的累積和線粒體損傷。為了檢查這點(diǎn)，如(1)描述的，將衰老細(xì)胞用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染，并測量培養(yǎng)的衰老細(xì)胞中脂褐素的量。沒有用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞被用作陰性對照組。此外，測量了細(xì)胞的大小。

通過自身熒光測量培養(yǎng)的衰老細(xì)胞中脂褐素的量。圖8顯示測量用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞中脂褐素的量的結(jié)果。

如圖8中顯示的，與用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的自身熒光水平(作為100％)相比，用含SEAT1 shRNA或DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的自身熒光水平分別為約10％和約66％。因此，確認(rèn)了脂褐素累積通過用含SEAT1 shRNA或DCUN1D3 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞而在衰老細(xì)胞中降低，表明細(xì)胞衰老水平通過用含SEAT1 shRNA或DCUN1D3shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染而降低。

圖9顯示測量用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA或混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的細(xì)胞大小(A)和細(xì)胞粒度(B)的結(jié)果。如圖9顯示的，用含DCUN1D3 shRNA或SEAT1 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的尺寸比用含混雜shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染的衰老細(xì)胞的尺寸小。

在圖8和9中，通過流式細(xì)胞術(shù)估測細(xì)胞的大小、粒度和自身熒光。詳細(xì)地，將用胰蛋白酶處理的細(xì)胞收集到PBS中，并通過FACS Caliber儀(Becton Dickson，USA)分析。通過之前的前向和側(cè)向散射來評估100,000個細(xì)胞的大小和粒度。使用用于激發(fā)的488-nm激光和用于檢測的530/30帶通濾波器來測量自身熒光。在圖9的A和B的縱軸中的FSC和SSC分別代表前向散射(細(xì)胞大小)和側(cè)向散射(細(xì)胞粒度)。

(4)對細(xì)胞周期調(diào)控的影響

當(dāng)衰老時，在G0/G1期的細(xì)胞增加，而在S期和G2/M期的細(xì)胞減少。

為了確認(rèn)這一點(diǎn)，對衰老細(xì)胞引入siRNA和對照siRNA，并檢查細(xì)胞周期。詳細(xì)地，如(1)解釋的，將siRNA和對照siRNA引入衰老細(xì)胞中，通過使用lipofectamine而不是將shRNA或混雜RNA包裝在慢病毒中將其導(dǎo)入衰老細(xì)胞中進(jìn)行，培養(yǎng)衰老細(xì)胞，然后檢查細(xì)胞周期。分別引入SEAT1 siRNA和DCUN1D3 shRNA，因此允許SEAT1 siRNA和DCUN1D3 siRNA在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。

圖10顯示測量引入有SEAT1 siRNA或DCUN1D3 siRNA或?qū)φ誷iRNA的衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期的結(jié)果。在圖10中，一式三份地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并實(shí)施培養(yǎng)3天。如圖10顯示的，與引入對照siRNA的衰老細(xì)胞相比，引入SEAT1 siRNA或DCUN1D3 siRNA的衰老細(xì)胞顯示在G0/G1期的降低的細(xì)胞百分比和在S期和G2/M期的增加的細(xì)胞百分比。圖10縱軸的單位是％，其為當(dāng)將對照siRNA的結(jié)果取作100時的百分比。

[表2]

n＝3，3天培養(yǎng)，HDF(M4，倍增時間＝14天)。

SEAT1shRNA#2的序列如下。

SEAT1#2shRNA：

SEAT1siRNA#2；SEQ ID NO：8(有義)和SEQ ID NO：9(反義)的多核苷酸

(5)DCUN1D3作為SEAT1的靶蛋白

檢查了DCUN1D3基因是否是Lnc RNA，SEAT1的靶物。

首先，檢查了DCUN1D3基因的表達(dá)是否通過用siSEAT1引入人細(xì)胞和小鼠細(xì)胞而降低。使用的人細(xì)胞是(1)中使用的衰老的HDF M4細(xì)胞，且小鼠細(xì)胞是MEF(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)細(xì)胞。將siRNA引入細(xì)胞以與(4)中相同的方式實(shí)施。

圖11顯示在引入siSEAT1的人細(xì)胞(A)和小鼠細(xì)胞(B)中DCUN1D3基因和SEAT1基因的表達(dá)水平。如圖11顯示的，當(dāng)引入SEAT1 siRNA時，DCUN1D3基因的表達(dá)以及SEAT1基因的表達(dá)降低，表明DCUN1D3基因的表達(dá)與SEAT1基因的表達(dá)強(qiáng)烈相關(guān)。亦即，DCUN1D3基因是SEAT1的靶物。

(6)SEAT1和DCUN1D3對DNA損傷的影響

檢查了SEAT1和/或DCUN1D3是否降低或增加DNA損傷。

詳細(xì)地，將SEAT1 shRNA和DCUN1D3 shRNA的每種根據(jù)(1)中描述的方法引入(1)中描述的衰老的HDF M4細(xì)胞中并培養(yǎng)。然后，使用特異于DNA損傷標(biāo)志物vH2AX和53BP1的單克隆抗體來檢查vH2AX和/或53BP1陽性細(xì)胞。詳細(xì)地，細(xì)胞在聚L-賴氨酸包被的蓋玻片(#08-774-383；Corning Inc.，Corning NY，USA)上或在35-mm皿(#81156：Corning Inc.)中培養(yǎng)。將細(xì)胞在室溫用新鮮PBS中2％低聚甲醛固定10至20分鐘，然后用PBS中0.5％Triton X-100和2ug/ml Hoechst 33342(Sigma-Aldrich)透化5分鐘。在室溫使用PBS中2％BSA實(shí)施封閉30分鐘。在室溫將樣品與用2％BSA/PBS-d稀釋的一抗溫育1至2hr或過夜，并用PBS洗滌。然后，將樣品與二抗(Jackson ImmunoResearch)溫育30分鐘。接著，使用ProLong Gold Antifade試劑(Invitrogen)封固樣品，接著保藏在-30℃或立即成像。使用Zeiss AxioObserver D1或Zeiss 710共聚焦顯微鏡(Wetzlar，Germany)可視化熒光信號。結(jié)果在圖12給出。

圖12顯示SEAT1 shRNA和/或DCUN1D3 shRNA對胞內(nèi)DNA損傷的影響。如圖12顯示的，當(dāng)將SEAT1 shRNA或DCUN1D3 shRNA引入衰老細(xì)胞時，DNA損傷顯著降低，表明SEAT1 shRNA或DCUN1D3 shRNA將衰老細(xì)胞轉(zhuǎn)化成幼嫩細(xì)胞，或保護(hù)衰老細(xì)胞，且還指示SEAT1 shRNA或DCUN1D3 shRNA可以阻止或治療衰老有關(guān)的疾病或病癥。在圖12中，“增殖”代表HDF M4細(xì)胞。圖12的縱軸代表vH2AX和53BP1雙陽性細(xì)胞的百分比。該值越高則DNA損傷越高。

(7)抑制SEAT1或DCUN1D3基因表達(dá)對hIL-6表達(dá)的影響

檢查了抑制SEAT1或DCUN1D3基因表達(dá)對hIL-6表達(dá)的影響。IL-6(白介素-6)是促炎性細(xì)胞因子，且在人中由IL6基因表達(dá)。已知衰老細(xì)胞比幼嫩細(xì)胞顯示更高的IL-6水平。胞內(nèi)IL-6水平的降低可以是保護(hù)衰老細(xì)胞或?qū)⑺ダ霞?xì)胞轉(zhuǎn)化成幼嫩細(xì)胞的能力的指數(shù)。

詳細(xì)地，將SEAT1 shRNA和DCUN1D3 shRNA的每種根據(jù)(1)中描述的方法引入(1)中描述的衰老的HDF M4細(xì)胞中并培養(yǎng)。然后，使用特異于hIL-6的單克隆抗體來實(shí)施ELISA，并通過Luminex測量培養(yǎng)上清中的hIL-6水平。結(jié)果在圖13中給出。

圖13顯示SEAT1或DCUN1D3基因表達(dá)抑制對hIL-6表達(dá)的影響。在圖13中，siSEAT1#3，DCUN1D3#2和#3代表從具有以下序列的shRNA形成的siRNA。此外，siSEAT1#1，2，3和siDCUN1D3#1，2，3分別表示三種siRNA的共引入。

SEAT1#3shRNA：

SEQ ID NO：10(有義)的多核苷酸

SEQ ID NO：11(反義)的多核苷酸

DCUN1D3#2shRNA：

SEQ ID NO：12(有義)的多核苷酸

SEQ ID NO：13(反義)的多核苷酸

DCUN1D3#3shRNA：

SEQ ID NO：14(有義)的多核苷酸

SEQ ID NO：15(反義)的多核苷酸

如圖13中顯示的，當(dāng)將SEAT1和/或DCUN1D3的siRNA引入衰老細(xì)胞中時，hIL-6水平顯著降低，表明SEAT1和/或DCUN1D3的shRNA可以將衰老細(xì)胞轉(zhuǎn)化成幼嫩細(xì)胞，保護(hù)衰老細(xì)胞，或預(yù)防或治療受試者的衰老有關(guān)的疾病或癥狀。

(8)通過miR-20b調(diào)控DCUN1D3基因表達(dá)

涉及DCUN1D3基因表達(dá)調(diào)控的miR-20b(SEQ ID NO：16)通過將SEAT1和DCUN1D3基因的序列與已知miRNA序列比較而鑒定。

詳細(xì)地，將miR-20b根據(jù)(1)中描述的方法引入(1)中描述的衰老的HDFM4細(xì)胞中并培養(yǎng)。然后，使用特異于DCUN1D3的單克隆抗體來實(shí)施ELISA，并測量細(xì)胞中的DCUN1D3水平。具體地，根據(jù)以下方法將miR-20b轉(zhuǎn)染到衰老的HDF M4細(xì)胞中，并培養(yǎng)3天。收獲細(xì)胞并從其提取RNA。將提取的RNA用作模板來實(shí)施RT-PCR，并測量DCUN1D3mRNA水平。使用與Lipfectamine RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)混合的50nM siRNA依照制造商說明來實(shí)施HDF M4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后3天時，收獲細(xì)胞并從其提取RNA。使用miR-20b模擬物(50nM)及其陰性對照(50nM)在HDF M4細(xì)胞上實(shí)施miR-20b功能獲得(gain-of-function)研究。使用miR-20b抑制劑(75nM)及其陰性對照(75nM)在HDF M4細(xì)胞上實(shí)施功能喪失(loss-of-function)研究。結(jié)果在圖14給出。

圖14顯示miR-20b對DCUN1D3基因表達(dá)的影響。在圖14中，縱軸代表相對DCUN1D3水平。如圖14中顯示的，當(dāng)將miR-20b引入衰老細(xì)胞時，DCUN1D3表達(dá)顯著降低。

應(yīng)理解本文中描述的例示性實(shí)施方案應(yīng)僅視為描述性意義而不是用于限制目的。對每個例示性實(shí)施方案內(nèi)的特征或方面的描述應(yīng)通常視為可用于其他例示性實(shí)施方案中的其他類似的特征或方面。

盡管已參照附圖描述了一個或多個例示性實(shí)施方案，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解可在其中進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)的多種變化而不背離本發(fā)明的精神和范圍，如由所附權(quán)利要求限定的。