本發(fā)明涉及腦啡肽酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑與葉酸的藥物組合物及其用途，屬于藥學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
高血壓是最常見的慢性疾病之一，也是心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素，其腦卒中、心肌梗塞、心力衰竭及慢性腎臟病等主要并發(fā)癥的致殘、致死率高，嚴(yán)重消耗醫(yī)療資源，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。高血壓的主要治療目標(biāo)是最大限度地降低心血管并發(fā)癥的發(fā)生與死亡的總體危險(xiǎn)，需要治療所有可逆性心血管危險(xiǎn)因素、亞臨床靶器官損害以及各種并存的臨床疾病【中國(guó)高血壓防治指南修訂委員會(huì).中國(guó)高血壓防治指南2010.中華心血管病雜志，2011；39(7)：579】。
心力衰竭(簡(jiǎn)稱心衰)是高血壓后期的常見并發(fā)癥，其病理機(jī)制是心室泵血或充盈功能低下，心排血量不能滿足機(jī)體代謝的需要，組織、器官血液灌注不足，出現(xiàn)肺循環(huán)和/或體循環(huán)淤血，其實(shí)也是各種心臟病發(fā)展到嚴(yán)重階段的臨床綜合癥，也稱為充血性心力衰竭。心衰的特點(diǎn)是左室肥厚或擴(kuò)張，導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)分泌失常、循環(huán)功能異常，出現(xiàn)典型的臨床癥狀，如心悸氣促、呼吸困難、體液潴留(浮腫)、乏力(特別是運(yùn)動(dòng)時(shí))等。慢性心衰是指持續(xù)存在的心力衰竭狀態(tài)，可以穩(wěn)定、惡化或失代償。
心衰是心血管病患者喪失勞動(dòng)力及死亡的重要原因之一，全球估計(jì)有2600萬人患有心衰。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)資料，心衰的發(fā)生率已達(dá)1.9％，人類終生患病幾率達(dá)20％，心衰的兩年病死率為37％，6年死亡率高達(dá)82％。在美國(guó)，衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)顯示國(guó)家醫(yī)療費(fèi)用支出的1-2％用于心衰治療。我國(guó)心衰發(fā)病率亦比較高，心衰患病率預(yù)計(jì)在1.26％，估計(jì)約400萬人左右。
臨床上治療心衰的常用藥物包括利尿劑、強(qiáng)心苷類、非苷類正性肌力藥、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)抑制劑、β受體阻斷劑等。血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(AngiotensinⅡReceptor Blocker,ARB)本是治療高血壓的常用藥物，主要通過阻斷血 管緊張素Ⅱ(AngⅡ)與相應(yīng)受體AT1的結(jié)合而發(fā)揮藥理作用。AngⅡ是RAAS中最關(guān)鍵的一種生物學(xué)效應(yīng)物，它和特異性受體AT1的結(jié)合可介導(dǎo)血管平滑肌收縮、抗利尿激素及醛固酮分泌釋放(鈉水潴留)、交感神經(jīng)兒茶酚胺釋放增多等一系列生物學(xué)作用,導(dǎo)致血壓升高。因此，選擇性阻斷AT1受體是治療高血壓的有效途徑之一。目前臨床上ARB類藥物主要有：氯沙坦(Losartan)、纈沙坦(Valsartan)、厄貝沙坦(Irbesartan)、替米沙坦(Telmisartan)、坎地沙坦(Candesartan)、奧美沙坦(Olmesartan Medoxomil)、他索沙坦(Tasosartan)和依普沙坦(Eprosartan)等。
心衰的病理生理機(jī)制涉及RAAS激活、醛固酮增加等，故ARB不僅用于治療高血壓，同時(shí)也是治療心衰(尤其是伴有低射血分?jǐn)?shù)時(shí))的基礎(chǔ)藥物。左心室肥厚是心衰的重要病理基礎(chǔ)，ARB亦能逆轉(zhuǎn)高血壓患者的心臟肥厚，其逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)作用主要通過降低心室前后負(fù)荷、抑制AngⅡ的增生作用和交感神經(jīng)活性、抑制醛固酮誘導(dǎo)的心臟肥厚等【中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì).中國(guó)慢性心力衰竭診斷治療指南2007.中華心血管病雜志，2007,35(12)：1～29】。
2015年7月上旬美國(guó)FDA批準(zhǔn)諾華公司的LCZ696上市，該藥由纈沙坦(valsartan)和沙庫比曲(sacubitril，又稱AHU377)以1：1摩爾比組成固定劑量組合，是一個(gè)口服有效、雙重作用的血管緊張素受體-腦啡肽酶抑制劑(angiotensin receptor-neprilysin inhibitor,ARNi)，用于治療高血壓和心衰。LCZ696有血流動(dòng)力學(xué)和神經(jīng)激素效應(yīng)，其中纈沙坦則通過阻斷特異受體AT1而抑制AngⅡ的作用，而沙庫比曲(又稱AHU377)是一種腦啡肽酶抑制劑的前藥，可增強(qiáng)利鈉肽(又稱心鈉素，簡(jiǎn)稱ANP)、緩激肽的作用。腦啡肽酶是一種中性內(nèi)肽酶，降解幾種內(nèi)源性血管活性肽，包括ANP、緩激肽和腎上腺髓質(zhì)素。抑制腦啡肽酶即可以增加這些物質(zhì)的水平，對(duì)抗血管收縮、鈉潴留、心肌重構(gòu)和神經(jīng)內(nèi)分泌的過度激活。目前市場(chǎng)上的腦啡肽酶抑制劑口服制劑有消旋卡多曲，主要用于治療兒童腹瀉，也有企業(yè)在開發(fā)用于鎮(zhèn)痛的腦啡肽酶抑制劑。腦啡肽酶抑制的重要效應(yīng)是ANP的濃度增加，ANP具有強(qiáng)大的擴(kuò)血管、排鈉、利尿、抑制RAAS和抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮進(jìn)而降低循環(huán)血量、減輕心臟負(fù)荷以及調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡的作用，是體內(nèi)最重要的RAAS拮抗激素。
LCZ696的Ⅲ期臨床試驗(yàn)是有史以來在心衰患者中開展的最大規(guī)模臨床研究，其數(shù)據(jù)顯示，LCZ696可顯著降低心血管死亡或心衰住院風(fēng)險(xiǎn)。但是，該臨床試驗(yàn)受試人群中NYHA分級(jí)為4級(jí)的患者只有不到1％，這可能會(huì)限制其在晚期心衰患者中的使用； 其次，受試者中只有約7％的患者進(jìn)行心臟再同步化治療(CRT)，這使人們不得不質(zhì)疑受試者是否在隨機(jī)化分配時(shí)已接受了最佳的心衰治療。因此，LCZ696雖然為心衰的治療帶來新的希望，但尚存在一些不足。
由于導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)的淤血或血流緩慢，持續(xù)存在的慢性心力衰竭可能產(chǎn)生一些并發(fā)癥，如血栓形成，這可進(jìn)一步演變成血栓脫落和栓塞，如發(fā)生部位在腦部，則易導(dǎo)致腦卒中。而高血壓本身即是腦卒中的重要危險(xiǎn)因素。無論是慢性心衰還是高血壓，其治療目的主要是降低心血管并發(fā)癥的危險(xiǎn)，也即是說靶器官保護(hù)是最終目標(biāo)，需要治療各種可逆的心血管危險(xiǎn)因素、靶器官損害或并存的疾病。因此，如何進(jìn)一步提高LCZ696及同類藥物對(duì)慢性心衰的療效或獲益/風(fēng)險(xiǎn)比，以及如何提高對(duì)高血壓伴心衰患者的靶器官保護(hù)、從而降低腦卒中事件風(fēng)險(xiǎn)，無論從臨床意義抑或社會(huì)意義來說，都是值得研究和需要解決的問題。
葉酸類化合物包括葉酸、5-甲基四氫葉酸、甲酰四氫葉酸、亞葉酸、左亞葉酸鈣等，它們均屬于水溶性維生素，經(jīng)由腸道吸收，由尿排出體外，在人體內(nèi)存留時(shí)間短暫，很少蓄積，所以必須經(jīng)常從體外攝取以滿足營(yíng)養(yǎng)和代謝需要。人體內(nèi)葉酸缺乏時(shí)影響同型半胱氨酸的代謝，目前認(rèn)為高同型半胱氨酸血癥是一種心血管危險(xiǎn)因素，與血管內(nèi)皮損傷、誘導(dǎo)血栓形成等有關(guān)，也是腦卒中的危險(xiǎn)因素之一。因此，在“腦啡肽酶抑制劑+ARB”基礎(chǔ)上增加葉酸類化合物將可能改進(jìn)前者組合的功效，提高其作為治療心衰(尤其基礎(chǔ)疾病為高血壓時(shí))藥物的臨床價(jià)值。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服LCZ696類藥物存在的不足，提供一種在靶器官保護(hù)及降低腦卒中事件危險(xiǎn)性方面表現(xiàn)更優(yōu)的復(fù)方藥物組合物。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種藥物組合物，包括：
(1)藥用劑量的腦啡肽酶抑制劑；
(2)藥用劑量的血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARB)；
(3)藥用劑量的葉酸類化合物；
(4)藥劑學(xué)上可接受的載體。
上述的“藥用劑量”是指《中國(guó)慢性心力衰竭診斷治療指南2007》中相對(duì)應(yīng)的各種具體藥物的推薦劑量，或各藥品說明書規(guī)定的劑量范圍。
所述腦啡肽酶抑制劑選自沙庫比曲(AHU377)，含量為10～100mg。
所述ARB選自纈沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、厄貝沙坦、奧美沙坦、他索沙坦、依普沙坦、氯沙坦及其活性代謝產(chǎn)物、酯類或鹽類的一種，含量為4～600mg。
通過進(jìn)一步研究，ARB的含量分別為纈沙坦(80～320mg)、坎地沙坦(4～32mg)、替米沙坦(20～120mg)、厄貝沙坦(75～300mg)、奧美沙坦(20～80mg)、他索沙坦(25～300mg)、依普沙坦(200～600mg)、氯沙坦(25～100mg)，上述物質(zhì)活性代謝產(chǎn)物、酯類或鹽類含量與相應(yīng)的上述物質(zhì)含量等同。
所述葉酸的含量為0.1～5.0mg，更加優(yōu)選0.2～2.0mg。
在本發(fā)明中，引起心衰的基礎(chǔ)疾病以原發(fā)性高血壓為主，由它引起的靶器官損害包括左心室肥厚、腎功能不全、動(dòng)脈痙攣和硬化等。當(dāng)靶器官損害仍不能給予有效控制，則發(fā)展成為更嚴(yán)重的后果，尤其動(dòng)脈硬化，在高血壓基礎(chǔ)上可進(jìn)一步導(dǎo)致腦血管事件，包括腦出血或腦梗塞，兩者通常合稱為腦卒中。
本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，由腦啡肽酶抑制劑AHU377、ARB與葉酸組成的復(fù)方藥物除對(duì)心衰模型動(dòng)物有極佳的治療作用外，還具有顯著改善血管內(nèi)皮功能、動(dòng)脈彈性及減少尿蛋白等功效，提示對(duì)靶器官的顯著保護(hù)作用。即當(dāng)AHU377、ARB與葉酸合用時(shí)能協(xié)同增強(qiáng)對(duì)患者的靶器官保護(hù)作用，且這一協(xié)同作用明顯強(qiáng)于LCZ696。
本發(fā)明還提供該藥物組合物在用于制備降低高血壓引起的腦血管事件危險(xiǎn)性的藥物中的用途,主要指降低腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
術(shù)語“藥用劑量”是指為達(dá)到有效控制或治療疾病的目的，臨床醫(yī)生根據(jù)患病個(gè)體病情嚴(yán)重程度對(duì)患病個(gè)體施與藥物的劑量。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明提供的藥物藥用劑量不是對(duì)本發(fā)明的限制，而是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選，通常情況下，在該劑量?jī)?yōu)選范圍內(nèi)，該藥物能夠?qū)疾€(gè)體產(chǎn)生有效的治療效果?；疾€(gè)體是指患有疾病的獨(dú)立存在的生命體，在本發(fā)明中，生命體尤指人類。應(yīng)當(dāng)理解，現(xiàn)有技術(shù)中，人類藥用劑量或藥用劑量范圍可與哺乳動(dòng)物，如大鼠、小鼠等進(jìn)行換算以得出適合相應(yīng)動(dòng)物適用的藥用劑量或劑量范圍。
本發(fā)明提供的藥物組合物中的化合物在相同的制劑中可以同時(shí)施與患病個(gè)體，也可分別地相繼施與患病個(gè)體。若是相繼施與患病個(gè)體，則第二個(gè)(或附加的)活性成分施與的延遲不應(yīng)當(dāng)導(dǎo)致活性成分聯(lián)合帶來的有益效果的損失。若是同時(shí)施與患病個(gè)體，組合物中的化合物可以混合存在于同一個(gè)藥物制劑形式中，也可以以同樣的制劑 形式分別獨(dú)立存在。若是以同樣的制劑形式分別獨(dú)立存在，則藥物組合物可以變通的以“組合藥盒”形式存在。“組合藥盒”是一種盒狀容器，內(nèi)置一種或多種劑量形式的藥物組合及其使用說明書，在本發(fā)明中優(yōu)選所述的腦啡肽酶抑制劑AHU377、ARB類藥物的一種與葉酸類化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有藥用劑量的AHU377或其它腦啡肽酶抑制劑的一種、藥用劑量的ARB及其活性代謝產(chǎn)物或其鹽類中的一種、葉酸類化合物和可藥用載體的藥物組合物在用于制備治療心衰的藥物中的用途，更具體地說，是提供在用于制備治療心衰(尤其由高血壓引起的心衰)、預(yù)防腦卒中的藥物中的用途。
本發(fā)明提供的藥物組合物的劑型包括但不限于普通片劑、雙層片劑、多層片劑、緩釋片劑、單室控釋片劑、雙室控釋片劑、微孔型控釋片劑、舌下含片、口腔速崩片、分散片、腸溶片、顆粒劑、丸劑、腸溶膠囊、延遲釋放片、定時(shí)/位釋放片、普通膠囊、緩釋膠囊、控釋膠囊、含有微丸或小片的膠囊、含有微丸或小片的pH依賴型膠囊、顆粒劑、口服液、膜劑或貼劑等劑型，其中優(yōu)選片劑、膠囊或顆粒劑。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的藥物組合物具有明顯協(xié)同作用，即協(xié)同治療慢性心力衰竭、預(yù)防腦卒中的作用。本發(fā)明還提供了上述藥用劑量的AHU377或其它腦啡肽酶抑制劑、ARB和葉酸類化合物組成的藥物組合物在用于制備治療心力衰竭的藥物中的用途；進(jìn)一步，本發(fā)明提供了上述藥物組合物在用于制備預(yù)防基礎(chǔ)疾病—高血壓引起的腦卒中的藥物中的用途。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，并非對(duì)本發(fā)明的限定，凡依照本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1.制備AHU377 20mg/纈沙坦80mg/葉酸0.4mg片(1000片量)
制備方法：將輔料粉碎過80目篩，干燥備用。取20g AHU377、80g纈沙坦、0.4g葉酸按照等量遞增法混合均勻，按照處方量分別加入微晶纖維素、膠態(tài)二氧化硅和交聯(lián)聚維酮，用2％羥丙基甲基纖維素溶液制成軟材，20目篩制粒，40℃干燥約2h，20目篩整粒，控制顆粒的含水量為2-3％，將干燥后的顆粒與硬脂酸鎂、滑石粉混合均勻，半成品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定含量，用壓片機(jī)壓制成1000片。制備過程中注意避光，制成的片劑需鋁塑泡罩包裝，避光保存。
實(shí)施例2.制備AHU377 40mg/坎地沙坦16mg/葉酸0.8mg片(1000片)
制備方法：輔料為直壓輔料，干燥備用。取處方量的葉酸、坎地沙坦及微晶纖維素30g按照等量遞增法混合均勻，得到混粉1；稱取剩余處方量的微晶纖維素、乳糖、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、二氧化硅，與AHU377按等量遞增法充分混勻，得到混粉2；將混粉1和混粉2與處方量的山愈酸甘油酯混合均勻，得最終混粉中間體，檢測(cè)混粉中間體，壓制成1000片。制備過程中注意避光，制成的片劑需鋁塑泡罩包裝，避光保存。
實(shí)施例3.制備AHU377 50mg/替米沙坦60mg/葉酸0.8mg膠囊(1000粒量)
制備方法：將原輔料粉碎80目篩，干燥備用。取50g AHU377、60g替米沙坦、0.8g葉酸按照等量遞增法混合均勻，分別加入乳糖、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉和低取代羥丙基纖維素，混合均勻，用2％羥丙甲纖維素溶液制成軟材，20目篩制粒，40℃干燥約2h，18目篩整粒，控制顆粒的含水量為2-3％，將干燥后的顆粒與硬脂酸鎂混合均勻，半成品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定含量，裝入空心膠囊即得。
實(shí)施例4.AHU377/纈沙坦/葉酸組方對(duì)心衰大鼠的治療作用
一、方法：
1.動(dòng)物：Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重200--240g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
2.造模方法：采用腹主動(dòng)脈縮窄法(心臟后負(fù)荷增加)制作慢性心衰大鼠模型。大鼠行4％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，每公斤體重注射40mg，劍突下腹正中切口，分層打開腹腔，在腎動(dòng)脈分支以上鈍性游離腹主動(dòng)脈，將7#注射器針頭平行置于腹主動(dòng)脈上，用4#手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和注射器一同結(jié)扎，然后緩慢將注射器撤出，關(guān)腹，分層縫合。使大鼠腹主動(dòng)脈直徑縮窄為0.7mm。正常對(duì)照組開腹后將手術(shù)絲線穿過腹主動(dòng)脈，除不縮窄腹主動(dòng)脈以外，其他操作與手術(shù)組完全相同。正常喂養(yǎng)3周，測(cè)定血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，以確定慢性心衰模型是否成功。
3.分組給藥及指標(biāo)檢測(cè)：將上述造模成功后的心衰大鼠隨機(jī)分組，另設(shè)正常對(duì)照組大鼠10只，各組給藥劑量情況見表2。采用灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3周。分別測(cè)定給藥前、給藥后不同時(shí)間大鼠心率(HR)、射血前期(PEP)、左室舒張時(shí)間(LVET)、每搏心輸出量(SV)、每分心輸出量(CO)。采用無創(chuàng)性心功能血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。接好心電圖的肢體導(dǎo)聯(lián)，同步記錄心電圖和心阻抗—階微分圖。記錄8-10個(gè)心動(dòng)周期，求其平均值。系統(tǒng)自動(dòng)采用Kubicek公式計(jì)算相關(guān)指標(biāo)。另取大鼠靜脈血1ml，用來檢測(cè)血漿ANP濃度(ELISA法)。
4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)。全部數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行分析。
二、結(jié)果：
1、造模情況：(1)一般情況：于手術(shù)后第3周觀察大鼠一般情況，以評(píng)價(jià)心衰程度，結(jié)果顯示：腹主動(dòng)脈縮窄法造成大鼠3周后出現(xiàn)明顯心衰癥狀，模型組大鼠活動(dòng)明顯減少，爪背紫紺，水腫，尿量減少，與正常對(duì)照組有顯著差異。(2)流動(dòng)力學(xué)變化：第3周手術(shù)組和對(duì)照組大鼠心功能變化情況見表2。模型組HR由381±52.4次/分上升到471±57.8次/分，LVET由80.3±24.0ms縮短至52.5±22.3ms，SV和CO均顯著下降，提示模型組大鼠手術(shù)后3周心臟功能明顯下降，而對(duì)照組心功能各項(xiàng)指標(biāo)均無變化。組間比較HR、LVET、CO、SV均有顯著性差異，說明模型組造模成功。(3)病理觀察：模型組電鏡所見：心肌T—管及肌漿網(wǎng)池均呈高度至極度擴(kuò)張成大串，有處大串連接成蔟。心肌線粒體于肌膜下增生成蔟、有的線粒體灶性溶解。心肌肌膜局部溶解、水腫，局部肌纖維溶解。散在的肌纖維有小灶性溶解。心肌束間微血管擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞胞飲泡增多。正常對(duì)照組電鏡所見：為正常心肌組織，均符合下列條件：核常染色質(zhì)和異染色質(zhì)分明，有大圓核仁。有豐富核仁協(xié)同染色質(zhì)，有染色質(zhì)周圍及間顆粒。核周間隙狹窄而一致。線粒體完整，大而嵴清晰。心肌T—管及肌漿網(wǎng)少而不擴(kuò)張。肌膜下無水腫。
表1 第3周手術(shù)組和對(duì)照組大鼠心功能變化情況
每組第3周測(cè)量值分別與本組第1周比較：*P＜0.05，**P＜0.01；
模型組與對(duì)照組的比較：△P＜0.05,△△P＜0.01。
2、AHU377/纈沙坦/葉酸與LCZ696的比較：經(jīng)3周治療后，與模型組比較，LCZ696組、AHU377/纈/葉組心衰大鼠第6周的血流動(dòng)力學(xué)均得到顯著改善，表現(xiàn)為心率及PEP下降、LVET及CO上升，LCZ696組、AHU377/纈/葉組大鼠的血漿ANP濃度亦明顯增高，均提示對(duì)心衰的顯著治療作用。此外，與LCZ696組比較，AHU377/纈/葉組PEP下降、CO上升更為顯著，提示對(duì)心衰的治療作用有一定優(yōu)勢(shì)。
表2 第6周各組大鼠心功能及血漿ANP情況比較(n＝10)
【注】AHU377/纈/葉組表示AHU377+纈沙坦+葉酸組。
與對(duì)照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；
與LCZ696組比較：#P＜0.05。
三、討論：
本研究采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作慢性心衰大鼠模型。心衰時(shí)血液動(dòng)力學(xué)異常是產(chǎn)生臨床充血癥狀的病理生理基礎(chǔ)。左室功能障礙引起CO降低和左室舒張時(shí)間延長(zhǎng)，前者導(dǎo)致組織器官血液灌注不足，后者引起肺血管嵌壓升高。采用縮窄大鼠腹主動(dòng)脈，造成壓力負(fù)荷病理性增高，心臟作功增加，引起左心衰，最終導(dǎo)致全心衰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：腹主動(dòng)脈縮窄3周后出現(xiàn)明顯心衰癥狀，與正常對(duì)照組有顯著性差異。模型組大鼠活動(dòng)明顯減少，爪背紫紺、水腫，與對(duì)照組比較有顯著性差異。提示造模組大鼠心功能下降，全身血液灌注減少。心臟功收縮和舒張功能障礙分別引起CO降低和左室舒張末壓力(LVEDP)增高。隨著心輸出量的減少，激活了各種神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)機(jī)制，使外周循環(huán)阻力增加，外周血液重新分配。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組HR顯著加快；LVET縮短，SV和CO均顯著下降，提示模型組大鼠手術(shù)后3周心臟功能明顯下降，而對(duì)照組心功能各項(xiàng)指標(biāo)均無變化，說明造模成功。本實(shí)驗(yàn)采用無創(chuàng)性心功能血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，在大鼠清醒狀態(tài)下測(cè)量心功能血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，克服了在麻醉狀態(tài)下使用創(chuàng)傷性測(cè)量方法，從而避免了動(dòng)物所處狀態(tài)(清醒或麻醉)以及操作方法(有創(chuàng)或無創(chuàng))不同而造成的對(duì)大鼠心功能的干 擾。模型組大鼠手術(shù)3周后心臟收縮和舒張功能均明顯降低，說明模型組大鼠心臟收縮和舒張功能明顯下降。
本研究初步證實(shí)AHU377+纈沙坦+葉酸三聯(lián)組方組在對(duì)心衰的顯著療效：經(jīng)3周治療后，與模型組比較，AHU377/纈/葉組心衰大鼠第6周的血流動(dòng)力學(xué)均得到顯著改善，表現(xiàn)為心率及PEP下降、LVET及CO上升，大鼠血漿ANP濃度亦明顯增高，這些結(jié)果的綜合提示對(duì)心衰的顯著治療作用。此外，與LCZ696組比較，AHU377/纈/葉組PEP下降、CO上升更為顯著，提示本組方對(duì)心衰的治療作用還有一定優(yōu)勢(shì)。
實(shí)施例5.AHU377/坎地沙坦/葉酸對(duì)卒中易感型高血壓大鼠靶器官的保護(hù)作用
一、方法：
8周齡左右雄性卒中易感型自發(fā)性高血壓(SHR-SP)大鼠共60只，根據(jù)是否給予治療干預(yù)，分為模型組、坎地沙坦+AHU377+葉酸組(相應(yīng)劑量：2.4+5+0.08mg/kg)、坎地沙坦+AHU377組(相應(yīng)劑量：2.4+5mg/kg)。飼養(yǎng)條件：室溫22±2℃；相對(duì)濕度50％；飲用水為純凈水。另設(shè)WKY對(duì)照組，20只。灌胃給藥，每天1次，每周稱重一次，根據(jù)體重調(diào)整藥量，連續(xù)8周。觀察指標(biāo)：(1)每日觀察動(dòng)物飲食、存活情況及行為活動(dòng)，于8周記錄各組動(dòng)物腦卒中發(fā)生情況。(2)神經(jīng)功能分級(jí)參照Bederson的神經(jīng)功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，分為如下5級(jí)，每周觀察一次：0級(jí)(正常)：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1級(jí)(輕微)：前肢蜷縮或屈曲,主要是持續(xù)性腕屈曲或肩內(nèi)收伴肘部伸展；2級(jí)(中度)：前肢持續(xù)性蜷縮或屈曲,可見腕、肘全部屈曲、肩部?jī)?nèi)收或內(nèi)旋；3級(jí)(嚴(yán)重)：持續(xù)性肢體蜷縮或屈曲,一側(cè)肢體推力體抗持續(xù)性減弱,自主活動(dòng)時(shí)不伴肢體劃圈行為；4級(jí)(甚重)：雙側(cè)肢體持續(xù)性蜷縮或屈曲,一側(cè)肢體推力體抗持續(xù)性減弱,自主活動(dòng)時(shí)出現(xiàn)肢體劃圈行為。(3)病理學(xué)觀察：所有存活動(dòng)物及死亡后可取得病理組織的大鼠均取腦組織，切片、HE染色，觀察腦出血或腦梗塞情況，計(jì)算各組大鼠腦卒中發(fā)生率。
二、結(jié)果：
本實(shí)驗(yàn)過程中，模型組大鼠卒中后出現(xiàn)明顯精神萎靡，嗜睡，毛發(fā)蓬松、干枯或脫落、無光澤，體重下降，主動(dòng)活動(dòng)明顯減少，行動(dòng)遲緩，肢體呈不同程度癱瘓，部分大鼠發(fā)病同時(shí)伴有抽搐、腹瀉、小便失禁、眼球出血等癥狀，病情嚴(yán)重者數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。治療組的大部分動(dòng)物神經(jīng)功能缺損較模型組輕微，精神狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組， 自主活動(dòng)增加，主動(dòng)覓食、飲水，體重下降不明顯，毛發(fā)也較模型組順滑有光澤。
模型組有2只、坎地沙坦+AHU377+葉酸組有1只、坎地沙坦+AHU377組有1只動(dòng)物死亡后被其他動(dòng)物食掉，未能取腦組織進(jìn)行病理檢查。
模型組20只大鼠中有16只發(fā)生腦卒中，其中死亡5只，除2只動(dòng)物于夜間死亡后未能及時(shí)取得組織外，其他18只動(dòng)物均進(jìn)行了病理組織學(xué)觀察，共16只有腦卒中病理表現(xiàn)發(fā)生，其中腦出血5只，腦梗死6只，混合性中風(fēng)5只。腦卒中灶及周圍均可見小動(dòng)脈透明變性或纖維素樣壞死，管壁增厚，管腔狹窄，有的管腔內(nèi)可見微血栓形成，管周滲血?？驳厣程?AHU377組20只大鼠有12只發(fā)生腦卒中，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)死亡2只，其中1只動(dòng)物未能取得病理組織，其他19只動(dòng)物均進(jìn)行了病理組織學(xué)觀察，9只有腦卒中病理表現(xiàn)，與模型組比較腦卒中發(fā)生率明顯降低(P<0.05)?？驳厣程?AHU377+葉酸20只大鼠中有8只發(fā)生腦卒中，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)死亡2只，其中1只動(dòng)物未能取得病理組織，其他19只動(dòng)物均進(jìn)行了病理組織學(xué)觀察，8只有腦卒中病理表現(xiàn)，其腦卒中發(fā)生率明顯降低，與模型組比較均具有極顯著差異(P<0.01)，見表3。
表3 坎地沙坦+AHU377+葉酸給藥8周對(duì)SHR-SP大鼠腦卒中的影響
注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與坎地沙坦+AHU377組比較，#P<0.05。
經(jīng)4周、8周的給藥干預(yù)后，與模型組比較，坎地沙坦+AHU377+葉酸組及坎地沙坦+AHU377組大鼠的神經(jīng)功能分級(jí)均有明顯改善(P<0.05或0.01)。鑒于表3已非常明確顯示模型組與對(duì)照組之間腦卒中發(fā)生率的巨大差異(說明造模成功)，故在下表4、表5分析中模型組與對(duì)照組將不需比較，而重點(diǎn)是比較后三組間神經(jīng)功能分級(jí)3-4級(jí)的差異。結(jié)果表明，兩個(gè)治療組在4周時(shí)的神經(jīng)功能改善作用基本相當(dāng)，而8周時(shí)坎地沙坦+AHU377+葉酸組的改善作用更為顯著(表5)。
表4 坎地沙坦+AHU377+葉酸給藥4周對(duì)SHR-SP大鼠腦卒中神經(jīng)功能分級(jí)比較(只)
注：與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。
表5 坎地沙坦+AHU377+葉酸給藥8周對(duì)SHR-SP大鼠腦卒中神經(jīng)功能分級(jí)比較(只)
注：與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與坎地沙坦+AHU377組比較，#P<0.05。
通過本實(shí)驗(yàn)研究可得出初步結(jié)論：坎地沙坦+AHU377+葉酸的三聯(lián)組方能夠明顯降低卒中易感型自發(fā)性高血壓(SHR-SP)大鼠腦卒中的發(fā)生率及促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)，其效果優(yōu)于坎地沙坦+AHU377的二聯(lián)組方，提示葉酸發(fā)揮一定藥理作用。