本發(fā)明屬于禽類疫苗制備技術領域，具體涉及一種番鴨細小病毒亞單位滅活疫苗。
背景技術：
細小病毒病是鵝和番鴨(又稱瘤頭鴨)的高度傳染性疾病,它又稱為德茲西氏病、鵝流感、鵝瘟或小鵝瘟、鵝肝炎、鵝腸炎、鵝傳染l生心肌炎或鵝腹水性肝腎炎。根據(jù)受感染小鵝的齡期不同,這病可分為急性、亞急性或慢性三個型。急性型可引起10日齡以內(nèi)的雛鵝100％死亡。小鵝瘟病毒主要通過病鵝的分泌物、排泄物、種蛋及病鵝飲過的水、飼料、用具、場地等傳播。臨床以精神委頓，離群獨偶，鼻孔流出漿液性鼻液，患鵝頻頻搖頭，拉灰黃色或黃綠色稀糞，神經(jīng)紊亂，小腸中后段黏膜壞死脫落與纖維素性滲出物凝固形成栓子，形如臘腸狀為特征。常呈敗血經(jīng)過，發(fā)病率和死亡率很高，對養(yǎng)鵝業(yè)生產(chǎn)危害極大。該病主要發(fā)生于1～3周齡的雛鵝和雛番鴨，尤其是1周齡左右的更易感，4周齡以上的鵝或番鴨感染后，很少表現(xiàn)臨床癥狀。本病最早于20世紀60年代中后期出現(xiàn)于中國和許多歐洲國家，直到1978年才將該病稱為鵝細小病毒感染，但是通過病毒中和試驗、分子生物學研究證明，從鵝和番鴨分離到的細小病毒有明顯的差異。如果對死亡的番鴨處理不當，往往造成病毒的蔓延，產(chǎn)生更大的危害。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種番鴨細小病毒亞單位疫苗，所提供的疫苗具有高效、安全性好、保護率高的優(yōu)點，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
本發(fā)明的一種番鴨細小病毒亞單位疫苗，包括有抗原和疫苗佐劑，其所用的抗原為番鴨細小病毒VP蛋白，其中VP蛋白包含有：
1)氨基酸序列為SEQ ID NO:1的蛋白，
2)在1)中限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有1)中蛋白活性，由1)衍生的蛋白。
編碼上述VP蛋白的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2；
其中的VP蛋白經(jīng)過甲醛溶液滅活；
上述的疫苗中VP蛋白的含量不低于150μg/ml。
上述滅活疫苗所使用的佐劑為氫氧化鋁膠佐劑。
本發(fā)明制備的疫苗免疫番鴨后能提高番鴨的抗體水平，保證其子代母源抗體水平，預防番鴨源小鵝瘟病毒引起的雛番鴨小鵝瘟病毒感染；免疫1日齡雛番鴨能有效預防番鴨源小鵝瘟病毒引起的雛番鴨小鵝瘟病毒感染。
附圖說明
圖1：本發(fā)明篩選的VP蛋白的BlastP的結果圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。本發(fā)明所應用的方法可以采用疫苗制備領域中常用的方法，而不僅限于本發(fā)明實施例的具體記載，本領域的普通技術人員可以其它常規(guī)方法來實現(xiàn)本發(fā)明。
實施例1、番鴨細小病毒VP蛋白的篩選
2014年某鴨場的雛番鴨群中出現(xiàn)了典型的番鴨細小病毒病癥狀，但發(fā)病的鴨群之前已經(jīng)注射過番鴨細小病毒病疫苗，因此，懷疑是致病菌發(fā)生了基因突變，導致疫苗的免疫效果不佳。為了分離病源，無菌采集瀕死鴨的肝臟、脾臟及胰腺，用無菌生理鹽水勻漿制成懸液，離心取上清除菌后經(jīng)尿囊腔分別接種11日齡番鴨胚，孵化168小時，收集24小時后死亡胚的尿囊液及胚體組織，經(jīng)勻漿后，反復凍融后，取上清液凍存。收獲的病毒液經(jīng)純化后進行了病毒含量、免疫原性、特異性及純凈性等方面的病毒特性的分析檢測，結果表明分離的毒株與番鴨細小病毒發(fā)生特異性反應，無細菌、支原體及外源病毒污染。純化后的病毒株命名為GPV201401。
對于本發(fā)明篩選的毒株的性狀進行檢測，結果表明，該株病毒屬細小病毒，攻毒實驗結果表明篩選的該病毒可引起雛番鴨發(fā)生以腹瀉、部分鴨腸粘膜脫落形成栓塞為特征的番鴨細小病毒病。該毒株制備的疫苗免疫1日齡雛番鴨，10天就可產(chǎn)生抗體，免疫期可達6個月以上；免疫成年番鴨后，能保護免疫6個月內(nèi)種番鴨所產(chǎn)子代免受流行毒株的攻擊。
對篩選鑒定的GPV201401株的結構蛋白基因VP進行了測序,VP基因全長2199bp，編碼732個氨基酸；將其與GenBank中收錄的VP基因序列進行遺傳進化樹(圖1)及核苷酸序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明獲得GPV201401株VP基因與另外30個GPV毒株的VP基因同源性介于85.9％～90.3％之間；結果表明篩選病毒的VP蛋白與已報道的小鵝瘟病毒VP基因存在著氨基酸差異。
實施例2表達VP基因的重組質(zhì)粒的構建
根據(jù)VP基因序列與表達性載體PET32a(+)的多克隆酶切位點，利用DNAStar軟件設計引物來擴增VP基因的全序列，其中正向引物的5′端加入了BamHⅠ酶切位點；反向引物的3′端加入了NotⅠ酶切位點。以GPV201401病毒為模板進行PCR擴增，并用DNA純化回收試劑盒回收目的基因。利用pET32a(+)質(zhì)粒獲得pET32a-VP重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達性大腸桿菌宿主菌,挑取單個克隆，酶切法鑒定陽性克隆，搖菌，測序。
實施例3.重組融合蛋白的表達、純化、復性及SDS-PAGE鑒定
將測序結果正確的單個克隆重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達性Rosetta宿主菌構建出重組基因工程菌。將該重組基因工程菌接種于含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB細菌培養(yǎng)基,37℃振搖(200r/min)培養(yǎng)過夜，次日取出1ml培養(yǎng)物接種于120ml的LB培養(yǎng)基中，37℃振搖(200r/min)培養(yǎng)2.5h后，菌液搖至半透明半渾濁狀態(tài)，吸光光度法測得OD600＝0.6～0.8,在誘導前先取10ml作為誘導前對照，并將振搖溫度變?yōu)?0℃加α-乳糖(終濃度為1.0mmol/L)誘導，分別誘導1h、2h、3h、4h、5h、6h收集10ml菌液，以誘導未轉(zhuǎn)化pET32a(+)載體的菌液作為空白對照，以誘導轉(zhuǎn)化pET32a(+)載體的菌液作為空載體對照。按照以下步驟進行純化、復性：(1)將誘導表達的菌液取出分裝至50ml離心管中，4000r/min離心10min，棄上清；(2)用1ml TE1(Tris-cl 10mM/L,EDTA二鈉1mM/L,PH＝8.0)重懸沉淀并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，按照以下條件：超聲30s、間隔30s、工作20次、480V電壓下超聲波裂解破碎工程菌，7000r/min 4℃離心20min，棄上清；(3)將沉淀中加入1ml TE2(Triton X-100/TE1＝1/100配置)震蕩混勻，7000r/min 4℃離心20min，棄上清；(4)在沉淀中加入1ml TE3(用TE1配置2M/L尿素)，7000r/min 4℃離心20min，棄上清；(5)將沉淀收集加入150ml變性液(8M/L尿素、10mM/L Tris-cl、10mM/L DTT)攪拌溶解，8000r/min 4℃離心30min，取上清；(6)將上清液加入半透膜袋中，4℃透析復性48h。取半透膜袋中的蛋白液按1:1加2×上樣Buffer煮沸10min，離心取上清，上清用12％SDS-PAGE電泳鑒定分析獲得目的蛋白。
將純化好的VP蛋白溶液用甲醛滅活后，與氫氧化鋁膠佐劑按體積比＝1：3進行配苗，制備成基因工程亞單位疫苗，相當于每毫升氫氧化鋁膠苗中含有融合蛋白200μg/ml。
實施例4、疫苗效力檢驗
1)取1日齡雛番鴨20只，隨機分成兩組，每組10只，其中一組每只頸部皮下注射疫苗，0.2ml/只，另一組10只同日齡雛番鴨不免疫作對照，隔離飼養(yǎng)。于免疫后15日免疫組和對照組同時攻擊雛鴨源小鵝瘟病毒GPV201401株，每只頸部皮下注射疫苗，0.2ml/只(106.50ELD50/0.2ml)，連續(xù)觀察15日，結果免疫組鴨9只保護，對照組鴨10只全部發(fā)病。(見表1)。
表1：疫苗效力檢驗結果
2)子代母源抗體與攻毒保護的關系90日齡種番鴨20只，每只頸部皮下注射疫苗，2.0ml/只，另取10只同日齡種番鴨不免疫作對照。于免疫后15日相同途徑相同劑量再免疫一次，收集開產(chǎn)后4月時所產(chǎn)種蛋孵化出雛，于雛番鴨7日齡時，免疫組子代取10只，對照組子代取10只，攻毒GPV201401株，每只肌肉注射0.2ml。免疫組子代保護9只，對照組全部發(fā)病。
申請人將番鴨的數(shù)目擴大，再次進行免疫；結果表明本發(fā)明制備的疫苗對番鴨細小病毒具有很好的免疫效果，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學的意義。
3)對地方流行毒株的攻毒保護(毒株的選育)90日齡種番鴨20只，每只頸部皮下注射疫苗，2.0ml/只，另取10只同日齡種番鴨不免疫作對照。于免疫后15日相同途徑相同劑量再免疫一次，收集開產(chǎn)1個月內(nèi)所產(chǎn)種蛋孵化出雛，于雛番鴨7日齡時，免疫組子代取10只，對照組子代取10只，攻毒6株各地方分離株，每只肌肉注射0.2ml。結果表明，用GPV201401株制備的番鴨小鵝瘟滅活疫苗相比較其它毒株制備的滅活疫苗，能抵御各地方分離毒的攻擊。
此外，本發(fā)明的疫苗對于GPV201401株的攻毒實驗表明，GPV201401株制備的疫苗的免疫效果最好，推測是由于GPV201401株基因發(fā)生變異導致的。
上述結果表明，本發(fā)明制備的疫苗能有效的預防目前各地流行的番鴨小鵝瘟的感染，具有很好的應用前景。