本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿的制備方法。

背景技術(shù)：

i型膠原是哺乳動物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，在肌腱和韌帶、皮膚、血管、角膜、骨等組織中都有分布。膠原通過其獨特的結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)不同組織中對力學(xué)特性的不同要求，起著穩(wěn)定、支撐，提供強度的作用。i型膠原纖維可溶于酸溶液中，當(dāng)ph和溫度升髙至一定程度時，會在體外重組形成纖維。膠原是一種特殊可生物降解的材料，人體內(nèi)的膠原酶能使膠原降解為各種片段，在體溫下這些大片段很快自發(fā)變性，被其他酶進一步降解成寡肽或氨基酸。或者被結(jié)締組織細胞核炎癥細胞吞噬，并由溶酶體將其進一步降解。膠原蛋白海綿與血液接觸，利用其海綿結(jié)構(gòu)的毛細作用，迅速吸附血液，引起血小板聚集，破壞血小板，激活內(nèi)源性凝血因子，產(chǎn)生凝血酶，凝血酶再催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，使血液凝固?，F(xiàn)有純膠原蛋白海綿在應(yīng)用過程中往往降解快、力學(xué)性能差，機械強度低，并且海綿在濕潤環(huán)境下很難維持自身固有形態(tài)，容易坍塌。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于：提供一種膠原蛋白海綿，克服了傳統(tǒng)膠原蛋白海綿只能利用海綿結(jié)構(gòu)吸收血液中的水分進行物理止血，止血效果欠佳的問題，以實現(xiàn)微纖維顯微結(jié)構(gòu)進行生物止血的功能。

本發(fā)明解決的又一技術(shù)問題在于：提供膠原蛋白海綿的制備方法，克服了現(xiàn)有制備方法透析技術(shù)耗時長、效率低以及制備的膠原蛋白海綿上血效果差等缺點，以高效地制備表面具有微纖維結(jié)構(gòu)的膠原蛋白海綿，能夠快速止血。

本發(fā)明的技術(shù)方案之一：提供一種重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿，具有海綿狀，膠原蛋白海綿表面具有膠原的微纖維結(jié)構(gòu)，其膠原分子以纖維形式存在，且具有三維螺旋結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的技術(shù)方案之二：提供制備膠原蛋白海綿的方法，包括以下步驟：

步驟1，利用切向流過濾技工藝對膠原蛋白的純化及濃縮；

步驟2，純化濃縮的膠原溶液與一定體積的生物緩沖液進行混合，緩沖液中含有5~20ppm交聯(lián)劑，且混合時緩沖液的溫度為30±0.5℃，調(diào)節(jié)ph為6.5~8.5，進行分子自組裝；

步驟3，離心，棄上清液，獲得渾濁液；

步驟4，凝膠化且進行交聯(lián)；

步驟5，在不同溫度下進行反復(fù)預(yù)凍、解凍及水洗；

步驟6，冷凍干燥。

優(yōu)選地，所述膠原分子具體有三螺旋結(jié)構(gòu)，能保留其原有的生物學(xué)性能，能夠吸引原纖維和粘附血小板，隨后發(fā)生釋放反應(yīng)，觸發(fā)血小板凝集，并在其纖維間隙內(nèi)形成血栓。所述膠原蛋白海綿是利用切向流過濾技工藝進行膠原蛋白的純化及濃縮；在體外進行分子自組裝；離心分離；凝膠化；反復(fù)預(yù)凍、解凍及水洗；冷凍干燥等工藝方法而制得。

本發(fā)明的膠原蛋白海綿在動物體內(nèi)2周已逐步降解，4-8周能完全降解，吸水率為自重的60倍以上。

優(yōu)選地，所述步驟1是將鹽析后膠原纖維用純化液進行重溶，使用切向流過濾技術(shù)對膠原進行純化、濃縮，此過程在4~13℃溫度下進行。

優(yōu)選地，所述步驟1純化過程中結(jié)合攪拌及純化液的補給，使得膠原能夠順利的進行純化。

優(yōu)選地，所述步驟1中，所述鹽析后膠原纖維重溶后的濃度為0.5~8mg/ml。

優(yōu)選地，所述步驟1中，純化時選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的截留分子量為50~100kd，最終進行膠原濃縮時選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的孔徑為0.1~1μm；在2~4h內(nèi)實現(xiàn)膠原溶液的純化。

作為優(yōu)選，所述步驟1中，純化液選用0.01m~0.5m醋酸溶液。

所述步驟2中，所述膠原溶液的濃度為1~5mg/ml，ph為2.0~3.5；所述生物緩沖液ph為7.2~7.5；分子自組裝于30±0.5℃孵育30~90min。

優(yōu)選地，所述步驟2中，所述膠原溶液的濃度為1~5mg/ml，ph為2.0~3.5。

優(yōu)選地，所述步驟2中，所述生物緩沖液包括如hepes、pbs、tes等中的至少一種，ph為7.2~7.4。

優(yōu)選地，所述步驟2中，所述交聯(lián)劑包括甲醛、戊二醛、改性戊二醛、碳化二亞胺中的至少一種。

優(yōu)選地，所述步驟3中，離心速度為6000~12000rpm，20~30℃下離心3~30min。

優(yōu)選地，所述步驟4具體為：將步驟3獲得的渾濁液混合均勻后，裝入模具中，繼續(xù)升溫至35~37℃，凝膠化30min~90min。

優(yōu)選地，所述步驟5中，具體包括以下工藝：

1）-80℃快速冷凍，解凍，水洗；其中解凍是在室溫下進行緩慢解凍；

2）在不同溫度下反復(fù)冷凍，解凍，水洗：將水凝膠在-40℃和-20℃再進行冷凍；解凍是在室溫下進行緩慢解凍。

優(yōu)選地，所述步驟5中，所述水洗是將水凝膠浸泡在自重2~5倍的4~10℃去離子水中1~3次，清除凝膠內(nèi)的鹽分和對于交聯(lián)劑。

優(yōu)選地，所述步驟6中，冷凍干燥時間為24h-48h。

所述的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿，是由上述的制備方法制成的。

本發(fā)明的技術(shù)效果：本發(fā)明的膠原蛋白海綿表面具有膠原的微纖維結(jié)構(gòu)，能夠快速激發(fā)血小板，促進血凝速度，從而安全高效止血，此技術(shù)克服了傳統(tǒng)膠原蛋白海綿只是利用海綿結(jié)構(gòu)吸收血液中的水分，進行物理止血，而不能利用膠原纖維本身的顯微結(jié)構(gòu)進行生物止血和缺陷；本發(fā)明的膠原蛋白海綿具有更佳的機械強度、熱穩(wěn)定性及降解性能，具有更合適的體內(nèi)降解時間，安全有效。

進一步地，本發(fā)明的制備方法中，（1）本發(fā)明使用切向流技術(shù)替代傳統(tǒng)透析工藝對膠原蛋白進行純化，能在2~4h內(nèi)實現(xiàn)膠原溶液的純化，原始透析工藝至少需要3~6d，極大的提高了膠原純化的速率，此技術(shù)克服了膠原純化時采用傳統(tǒng)的透析技術(shù)耗時長、效率低等缺點。（2）在體外，通過調(diào)節(jié)膠原溶液的濃度、ph、離子環(huán)境、溫度等條件，實現(xiàn)膠原分子重組、凝膠化，并對凝膠進行交聯(lián)改性，并且通過水洗清除凝膠內(nèi)的鹽分和對于交聯(lián)劑，最終使用冷凍干燥技術(shù)，改善了膠原材料的機械強度、熱穩(wěn)定性及降解性能，獲得外觀形貌良好，且有較合適的體內(nèi)降解時間，安全有效的膠原蛋白海綿。本發(fā)明的制備方法產(chǎn)能高、工藝穩(wěn)定，制得的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿可廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、外科手術(shù)創(chuàng)口的止血和修復(fù)，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例所制備的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿放大200倍的掃描電鏡圖。

圖2是本發(fā)明實施例所制備的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿放大1000倍的掃描電鏡圖。

圖3是本發(fā)明實施例所制備的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿的膠原分子重組后的纖維結(jié)構(gòu)的透射電鏡圖。

具體實施例

本發(fā)明提供一種重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿，具有海綿狀，其膠原分子以纖維形式存在，且具有三維螺旋結(jié)構(gòu)。其中，膠原分子具體有三螺旋結(jié)構(gòu)；能保留其原有的生物學(xué)性能，能夠吸引原纖維和粘附血小板，隨后發(fā)生釋放反應(yīng)，觸發(fā)血小板凝集，并在其纖維間隙內(nèi)形成血栓；所述膠原蛋白海綿是利用切向流過濾技工藝進行膠原蛋白的純化及濃縮后進行分子自組裝、凝膠化、冷凍干燥而制備而成；所述膠原蛋白海綿在動物體內(nèi)2周已逐步降解，4-8周能完全降解，吸水率為自重的60倍以上。

如圖1-3所示本發(fā)明實施例的膠原蛋白海綿的微觀結(jié)構(gòu)。圖1表明形成的膠原凍干品具有海綿狀，有空隙。圖2說明形成的膠原蛋白海綿其顯微結(jié)構(gòu)是可以看到膠原分子是以纖維的形式存在。圖3則是膠原分子自組裝后的透射電鏡圖片，表明此膠原分子還具有三維螺旋結(jié)構(gòu)，則其具有生物活性。本發(fā)明重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿不僅能夠利用海綿結(jié)構(gòu)，而且其纖維結(jié)構(gòu)能夠吸引原纖維和粘附血小板，隨后發(fā)生釋放反應(yīng)，觸發(fā)血小板凝集，并在其纖維間隙內(nèi)形成血栓，從而利用膠原纖維本身的顯微結(jié)構(gòu)進行生物止血。

本發(fā)明具有重組纖維結(jié)構(gòu)的膠原蛋白海綿的制備方法包括下述步驟1-6所述的具體步驟而進行。本發(fā)明的制備方法（1）提供了一種高效的進行膠原純化、濃縮的新方法，使用切向流過濾技術(shù)，能夠快速高效進行膠原純化，并且可以達到濃縮的效果；（2）提供了一種膠原分子體外自組裝、凝膠化后，并將此水凝膠改性后冷凍干燥制備膠原蛋白海綿的方法，此膠原蛋白海綿表面具有膠原的微纖維結(jié)構(gòu)，能夠快速激發(fā)血小板，促進血凝速度。此技術(shù)克服了傳統(tǒng)膠原蛋白海綿只是利用海綿結(jié)構(gòu)吸收血液中的水分，進行物理止血，而不能利用膠原纖維本身的顯微結(jié)構(gòu)進行生物止血。

步驟1，膠原蛋白的純化及濃縮：利用切向流過濾技工藝對膠原蛋白進行純化，在2~4h內(nèi)實現(xiàn)膠原溶液的純化；再進行濃縮，從而獲得純化濃縮的膠原溶液，膠原溶液的濃度為1~5mg/ml，ph為2.0~3.5，具體工藝如下：

（1）提供膠原溶液，經(jīng)過鹽析后形成絮狀白色的膠原纖維，將鹽析后膠原纖維用純化液優(yōu)選醋酸溶液重溶，所述鹽析后膠原纖維重溶后的濃度為0.5~8mg/ml；

（2）使用切向流過濾技術(shù)對膠原進行純化，純化液選用0.01m~0.5m醋酸溶液，選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的截留分子量為50~100kd，由于膠原分子的分子量達到300kd，純化過程中結(jié)合攪拌及溶解液（純化液）的補給，使得膠原能夠順利的進行純化；

其中，攪拌條件可選擇為：磁力攪拌器，轉(zhuǎn)速為800~1200rpm；

純化液的補給滿足：純化液的體積始終保持初始狀態(tài)，也就是透析出多少液體就加進多少液體，從而使系統(tǒng)內(nèi)純化液體積不變；

（3）最終進行膠原濃縮，選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的孔徑為0.1~1μm；

濃縮過程中中斷對透析系統(tǒng)的純化液補給，最終膠原溶液的濃度自然會上升達到濃縮的目的。

其中，對膠原進行純化、濃縮的過程在4~13℃溫度下進行，膠原蛋白對溫度比較敏感，否則會發(fā)生變性。上述純化液可用檸檬酸、鹽酸，但優(yōu)選使用醋酸溶液。

步驟2分子自組裝，在體外，通過調(diào)節(jié)膠原溶液的濃度、ph、離子環(huán)境、溫度等條件，實現(xiàn)膠原分子重組，具體包括以下工藝：

（1）將純化濃縮的膠原溶液與一定體積的生物緩沖液進行混合：

膠原溶液的濃度為1~5mg/ml，ph為2.0~3.5；

所述生物緩沖液包括如hepes、pbs、tes中的一種或多種，ph為7.2~7.5，混合時緩沖液的溫度為30±0.5℃，例如tes緩沖液(1×,ph7.5)由10mmtris-hcl緩沖液(ph7.5)；

緩沖液中還含有5~20ppm交聯(lián)劑，所述交聯(lián)劑包括甲醛、戊二醛、改性戊二醛、碳化二亞胺等中的一種或幾種，交聯(lián)劑加入之后膠原就開始發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)；

（2）混合后調(diào)節(jié)其ph為6.5~8.5，進行分子自組裝：

溶解于稀酸中的膠原，在ph調(diào)節(jié)至中性，溫度達到生理溫度時，膠原就會在體外重組形成纖維結(jié)構(gòu)，不同的離子環(huán)境會影響膠原纖維的具體形態(tài)；

（3）于30±0.5℃孵育30~90min：溫度太低時形成的膠原纖維過大，而高于此溫度后形成的膠原纖維其螺紋性周期結(jié)構(gòu)會有殘缺，不完整。

步驟3，離心，棄上清液：離心速度為6000~12000rpm，室溫下離心3~30min。

步驟4，凝膠化：將步驟3獲得的渾濁液混合均勻后，裝入合適的模具中，繼續(xù)升溫至35~37℃，凝膠化30min~90min。此步驟中進行部分化學(xué)交聯(lián)，凝膠化過程也通過分子間通過氫鍵進行一些物理交聯(lián)。

步驟5，反復(fù)預(yù)凍、解凍及水洗：

（1）-80℃快速冷凍，解凍，水洗；解凍是在室溫下進行緩慢解凍，

（2）在不同溫度下反復(fù)冷凍，解凍，水洗：

將水凝膠在-40℃和-20℃再進行冷凍；

解凍是在室溫下進行緩慢解凍；

所述水洗是將水凝膠浸泡在自重2~5倍的4~10℃去離子水中1~3次，清除凝膠內(nèi)的鹽分和多余交聯(lián)劑；

反復(fù)預(yù)凍可以是將溫度升到接近共晶點，從而將物料內(nèi)部水分全部結(jié)晶成冰晶；本發(fā)明的預(yù)凍主要是為達到：（1）提高凝膠的強度；（2）凝膠中的水分能形成一定的冰晶，可以在凝膠內(nèi)形成較大的連通孔，方便清洗干凈徹底。

步驟6：冷凍干燥，冷凍干燥時間可以為24h-48h。具體是在-40℃預(yù)凍，-20℃進行一次升華凍干，25℃進行解析干燥。冷凍干燥技術(shù)能使膠原材料在不影響其生物學(xué)性能的同時去除水分，獲得外觀形貌良好，且有較合適的體內(nèi)降解時間，安全有效的膠原蛋白海綿。

通過上述步驟1-6從而獲得所述的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿。重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿不僅能夠利用海綿結(jié)構(gòu)，而且其纖維結(jié)構(gòu)能夠吸引原纖維和粘附血小板，隨后發(fā)生釋放反應(yīng)，觸發(fā)血小板凝集，并在其纖維間隙內(nèi)形成血栓。制備方法的主要特點在于：（1）本發(fā)明使用切向流技術(shù)替代傳統(tǒng)透析工藝對膠原蛋白進行純化，能在2~4h內(nèi)實現(xiàn)膠原溶液的純化，原始透析工藝至少需要3~6d，極大的提高了膠原純化的速率；（2）在體外，通過調(diào)節(jié)膠原溶液的濃度、ph、離子環(huán)境、溫度等條件，實現(xiàn)膠原分子重組、凝膠化，并對凝膠進行交聯(lián)改性，并且通過水洗清除凝膠內(nèi)的鹽分和對于交聯(lián)劑，最終使用冷凍干燥技術(shù)，冷凍干燥技術(shù)能使膠原材料在不影響其生物學(xué)性能的同時去除水分，獲得外觀形貌良好，且有較合適的體內(nèi)降解時間，安全有效的膠原蛋白海綿。本發(fā)明的制備方法產(chǎn)能高、工藝穩(wěn)定，制得的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿可廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、外科手術(shù)創(chuàng)口的止血和修復(fù)，具有良好的應(yīng)用前景。

具體實施例1：

本實例中，通過下述步驟1-6從而獲得所述的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿：

步驟1：

（1）將鹽析后膠原纖維用醋酸重溶，重溶后的濃度為0.5mg/ml；

（2）使用切向流過濾技術(shù)對膠原進行：

a)純化，純化液選用0.01m醋酸溶液，選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的截留分子量為50kd；

b)濃縮，此過程在4~13℃溫度下進行，最終進行膠原濃縮時選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的孔徑為0.1μm；

步驟2：

（1）將純化濃縮的膠原溶液與一定體積的生物緩沖液進行混合：

膠原溶液的濃度為1mg/ml，ph為2.0；緩沖液為10×pbs，其中含有5ppm戊二醛交聯(lián)劑，ph為7.4，且混合時緩沖液的溫度為30±0.5℃；混合后調(diào)節(jié)其ph為8.5；

（2）進行分子自組裝，30±0.5℃孵育30min；

步驟3：離心，棄上清液；離心速度為6000rpm，室溫下離心30min；

步驟4：將步驟3獲得的渾濁液混合均勻后，裝入合適的模具中，繼續(xù)升溫至37℃，凝膠化90min；

步驟5：-80℃快速冷凍后，在室溫下進行緩慢解凍，后將水凝膠浸泡在自重2倍的10℃去離子水中3次；之后將水凝膠在-40℃和-20℃再進行冷凍，再進行緩慢解凍，后將水凝膠浸泡在自重2倍的10℃去離子水中3次；

步驟6：預(yù)先冷凍后進行冷凍干燥，時間為24h。

具體實施例2：

本實例中，通過下述步驟1-6從而獲得所述的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿：

步驟1：

（1）將鹽析后膠原纖維用醋酸重溶，重溶后的濃度為3.5mg/ml；

（2）使用切向流過濾技術(shù)對膠原進行：

a)純化，純化液選用0.2m醋酸溶液，選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的截留分子量為70kd；

b)濃縮，此過程在4~13℃溫度下進行，最終進行膠原濃縮時選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的孔徑為0.65μm；

步驟2：

（1）將純化濃縮的膠原溶液與一定體積的生物緩沖液進行混合：

膠原溶液的濃度為3mg/ml，ph為3.0；緩沖液為2×tes，其中含有10ppm碳化二亞胺交聯(lián)劑，ph為7.2，且混合時緩沖液的溫度為30±0.5℃；混合后調(diào)節(jié)其ph為7.5；

（2）進行分子自組裝，30±0.5℃孵育90min；

步驟3：離心，棄上清液；離心速度為9000rpm，室溫下離心10min；

步驟4：將步驟3獲得的渾濁液混合均勻后，裝入合適的模具中，繼續(xù)升溫至35℃，凝膠化90min；

步驟5：-80℃快速冷凍后，在室溫下進行緩慢解凍，后將水凝膠浸泡在自重5倍的4℃去離子水中次；之后將水凝膠在-40℃和-20℃再進行冷凍，再進行緩慢解凍，后將水凝膠浸泡在自重3倍的4℃去離子水中3次；

步驟6：預(yù)先冷凍后進行冷凍干燥，時間為48h。

具體實施例3

本實例中，通過下述步驟1-6從而獲得所述的重組纖維結(jié)構(gòu)膠原蛋白海綿：

步驟1：

（1）將鹽析后膠原纖維用醋酸重溶，重溶后的濃度為8mg/ml；

（2）使用切向流過濾技術(shù)對膠原進行：

a)純化，純化液選用0.5m醋酸溶液，選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的截留分子量為100kd；

b)濃縮，此過程在4~13℃溫度下進行，最終進行膠原濃縮時選用改性聚醚砜中空纖維過濾管的孔徑為1μm；

步驟2：

（1）將純化濃縮的膠原溶液與一定體積的生物緩沖液進行混合：

膠原溶液的濃度為5mg/ml，ph為3.5；緩沖液為5×hepes緩沖鹽溶液，其中含有20ppm甲醛交聯(lián)劑，ph為7.3，且混合時緩沖液的溫度為30±0.5℃；混合后調(diào)節(jié)其ph為6.5；

（2）進行分子自組裝，30±0.5℃孵育60min；

步驟3：離心，棄上清液；離心速度為12000rpm，室溫下離心3min；

步驟4：將步驟3獲得的渾濁液混合均勻后，裝入合適的模具中，繼續(xù)升溫至36℃，凝膠化60min；

步驟5：-80℃快速冷凍后，在室溫下進行緩慢解凍，后將水凝膠浸泡在自重4倍的7℃去離子水中次；之后將水凝膠在-40℃和-20℃再進行冷凍，再進行緩慢解凍，后將水凝膠浸泡在自重2倍的4℃去離子水中2次；

步驟6：預(yù)先冷凍后進行冷凍干燥，時間為36h。