對相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求在35u.s.c.§119(e)下的對2014年10月27日提交的美國臨時申請62/069,168的利益，所述申請通過引用完整地結(jié)合于此。

政府利益聲明

本發(fā)明的進(jìn)行得到了由國立健康研究院(nationalinstitutesofhealth)給予的資助號ca114536，ai053193和p51-od010425的政府支持。美國政府對此發(fā)明享有某些權(quán)力。

背景

本公開總體涉及用于增強(qiáng)或提高免疫療法效力的組合物和方法。更具體地，本公開涉及聯(lián)合使用表達(dá)抗原結(jié)合蛋白(例如，嵌合抗原受體)的t細(xì)胞和被修飾成表達(dá)與修飾的t細(xì)胞的抗原結(jié)合蛋白特異性結(jié)合的抗原的細(xì)胞(如造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合)以促進(jìn)用于治療與靶抗原的表達(dá)相關(guān)的疾病或病癥，如癌癥的過繼細(xì)胞免疫療法。

相關(guān)技術(shù)描述

通過基因轉(zhuǎn)移將腫瘤靶向受體引入t細(xì)胞中允許快速產(chǎn)生來自任何癌癥患者的腫瘤特異性t細(xì)胞以用于過繼t-細(xì)胞治療。一種有希望的策略包括用由對腫瘤細(xì)胞表面分子具有特異性并且與一種或多種t-細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相連的單鏈抗體或其他結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的合成嵌合抗原受體(car)改造t細(xì)胞(turtle等，curr.opin.immunol.24：633，2012；barrett等，annu.rev.med.65：10.1，2014；sadelain等，cancerdiscovery3：388，2013)。最近使用對b細(xì)胞惡性腫瘤上的cd19分子具有特異性的car-修飾的t細(xì)胞(car-t細(xì)胞)的試驗(yàn)顯示在患有晚期疾病的患者的亞組中的顯著的腫瘤消退(barrett等，2014；sadelain等，2013；kalos等，sci.transl.med.3：95ra73，2011；kochenderfer和rosenberg，nat.rev.clin.oncol.10：267，2013)。將該療法擴(kuò)展至常見的上皮癌癥提出若干挑戰(zhàn)，包括鑒定可以被t細(xì)胞安全地靶向的腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的分子。這被嚴(yán)重和甚至是致命的毒性所強(qiáng)調(diào)，據(jù)觀察所述毒性是由于car療法對表達(dá)靶分子的正常細(xì)胞的上靶/脫腫瘤作用所致(lamers等，mol.ther.21：904，2013；morgan等，mol.ther.18：843，2010)。此外，能夠鑒定指示其在體內(nèi)存活和發(fā)揮功能的能力的t細(xì)胞的性質(zhì)仍然是重要的研究領(lǐng)域。

顯然需要備選的組合物和方法用于增強(qiáng)或促進(jìn)針對各種癌癥(如白血病和腫瘤)的過繼細(xì)胞免疫療法。本文公開的實(shí)施方案解決了該需求并且提供了其他相關(guān)優(yōu)點(diǎn)。

附圖簡述

圖1a-1d顯示獼猴(rhesusmacaque)ror1的功能和表征。(a)被修飾成表達(dá)具有人或獼猴4-1bb和cd3ζ結(jié)構(gòu)域的r12-ror1car的獼猴t細(xì)胞的功能。(b)使用tcd19標(biāo)志物的ror1car-修飾的cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞的純度和表型的流式細(xì)胞分析。數(shù)據(jù)顯示對tcd19的選擇前后和對cd4(上圖)或cd8(下圖)的選擇后的未轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞(模擬)，轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞的表型。所有樣品對cd3⁺細(xì)胞門控(gated)。(c)4小時細(xì)胞毒性測定中cd4⁺和cd8⁺ror1car-t細(xì)胞針對⁵¹cr標(biāo)記的k562/ror1或k562細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。(d)如方法中所述一式三份地將5x10⁴ror1car-t細(xì)胞與k562/ror1細(xì)胞或pma/離子霉素或單獨(dú)的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24小時后獲得的上清的luminex細(xì)胞因子測定。培養(yǎng)基對照樣品中的細(xì)胞因子水平在檢測水平以下。b-d，顯示來自獼猴a13002的數(shù)據(jù)，其代表3只動物中的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

圖2a-2e顯示ror1car-t細(xì)胞的毒性和體內(nèi)持久性的監(jiān)測。(a)在t-細(xì)胞灌輸前以及在t-細(xì)胞灌輸后指定的日子的體重和血清化學(xué)?；疑幱皡^(qū)表示獼猴特有的各參數(shù)的正常范圍。(b)使用獼猴特異性多路細(xì)胞因子測定在灌輸前后測量血漿細(xì)胞因子水平。(c)在ror1car-和對照egfrt⁺t細(xì)胞的灌輸之前及之后指定的日子獲得pbmc。在用對cd3，cd4，cd8，和cd19或?qū)gfrt具有特異性的mab染色后通過流式細(xì)胞術(shù)確定cd3⁺cd4⁺亞組和cd3⁺cd8⁺亞組內(nèi)轉(zhuǎn)移的t細(xì)胞的頻率(％)。(d)在可信任的臨床實(shí)驗(yàn)室中，在指定的日子，通過流式細(xì)胞術(shù)測量并且基于cbc的結(jié)果計(jì)算的外周血中r12-ror1car⁺和egfrt⁺t細(xì)胞的絕對數(shù)目。(e)自在指定的日子獲得的pbmc樣品分離dna并且通過實(shí)時qpcr(taqman)檢測轉(zhuǎn)基因載體特異性序列的存在。

圖3a-3d顯示r12-ror1car-t細(xì)胞的體內(nèi)遷移和功能。(a)將在t-細(xì)胞灌輸前和在t-細(xì)胞灌輸后的第5天獲得的bm和ln樣品用對cd3，cd4，cd8，和cd19或?qū)gfrt特異的mab染色，并且在對cd3⁺cd4⁺或cd3⁺cd8⁺t細(xì)胞門控后通過流式細(xì)胞術(shù)檢查。(b)檢測bm中的ror1⁺b-細(xì)胞前體。在灌輸前以及在灌輸后第5天獲得bm樣品并且通過流式細(xì)胞術(shù)檢測表達(dá)ror1的cd19⁺cd45^intermediateb細(xì)胞亞組的存在。(c)通過用對cd19，cd3，cd4，和cd8特異的mab染色以及用以檢測cd19⁺cd3^-b細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)確定的t-細(xì)胞灌輸前后獲得的外周血樣品中的cd19⁺b細(xì)胞的絕對數(shù)目?；谕瑫r獲得的并且在可信任的臨床實(shí)驗(yàn)室中測定的cbc上的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)確定絕對數(shù)目。(d)cd107a脫粒測定。在灌輸前以及在灌輸后的第7天獲得pbmc，用k562/rori細(xì)胞，培養(yǎng)基，或pma和離子霉素體外刺激，并且通過流式細(xì)胞術(shù)檢測cd107a的表達(dá)，如方法中所述。培養(yǎng)的ror1car-t細(xì)胞充當(dāng)陽性對照。

圖4a-4e顯示以高細(xì)胞劑量提供的ror1car-t細(xì)胞的持久性，遷移，和安全性。(a)t細(xì)胞灌輸?shù)氖疽鈭D。以5x10⁸/kg的總劑量過繼轉(zhuǎn)移自體ror1car-t細(xì)胞。以相等的劑量施用對照tcd34⁺基因標(biāo)記的t細(xì)胞。在t-細(xì)胞灌輸前和t-細(xì)胞灌輸后第3天獲得bm和ln樣品。(b)在t-細(xì)胞灌輸前和t-細(xì)胞灌輸后第1天自獼猴a13011和a13002獲得的pbmc的流式細(xì)胞分析。(c)在用對cd3，cd4，cd8，和cd19或tcd34特異的mab染色后確定cd3⁺cd4⁺亞組和cd3⁺cd8⁺亞組內(nèi)的轉(zhuǎn)移的t細(xì)胞的頻率(％)。c，pbmc，bm，和ln樣品在t-細(xì)胞灌輸后第3天自兩種獼猴獲得，用對cd3，cd4，cd8，和cd19或tcd34特異的mab染色，并且在對cd3⁺cd4⁺或cd3⁺cd8⁺細(xì)胞門控后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。各動物的各亞組中的ror1car和對照tcd34標(biāo)記的t細(xì)胞的頻率顯示在柱狀圖中。(d)在ror1car-t細(xì)胞前后的bm中的ror1⁺b-細(xì)胞前體的頻率。在ror1car-t細(xì)胞轉(zhuǎn)移前以及在ror1car-t細(xì)胞轉(zhuǎn)移后3天獲得的bm樣品通過流式細(xì)胞術(shù)檢測表達(dá)ror1的cd19⁺cd45^intermediateb-細(xì)胞的存在。顯示的是對cd19⁺細(xì)胞門控的獼猴a13011的代表性染色。(e)ln中ror1⁺b細(xì)胞的頻率。在t-細(xì)胞灌輸前以及在t-細(xì)胞灌輸后3天獲得ln樣品，用對cd19，cd45，和ror1或同種型特異的mab染色，并且通過流式細(xì)胞術(shù)檢測ror1⁺cd45⁺細(xì)胞在cd19⁺亞組內(nèi)的存在。顯示的是來自獼猴a13011的數(shù)據(jù)。

圖5a-5d顯示體內(nèi)ror1+t細(xì)胞(t-apc)激發(fā)對轉(zhuǎn)移的ror1car-t細(xì)胞的作用。(a)pbmc樣品在指定的日子獲得自a13011和a13002并且在用對cd3，cd4，cd8，和cd19或cd34特異的mab染色后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測。在可信任的臨床實(shí)驗(yàn)室中確定cbc。顯示的是cd3⁺cd4⁺和cd3⁺cd8⁺亞組中的外周血中的ror1car⁺和tcd34⁺t細(xì)胞的絕對數(shù)目。(b)t-apc激發(fā)后血液中ror1car-t細(xì)胞絕對數(shù)目的倍數(shù)變化。血液的cd3⁺cd8⁺t細(xì)胞和cd19⁺cd8⁺t細(xì)胞數(shù)目/μl通過流式細(xì)胞術(shù)在t-apc施用之前并且在t-apc施用之后指定的日子測量。數(shù)據(jù)顯示在t-apc施用后內(nèi)源未標(biāo)記的cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞，r12ror1carcd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞，和tcd34標(biāo)記的cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞的絕對數(shù)目相對基線的倍數(shù)增加。(c)自具有持續(xù)性ror1car-t細(xì)胞的動物(a13011)在第1，5和7天獲得的pbmc樣品中t-apc灌輸前后tror1⁺t細(xì)胞的存在。將pbmc用抗-cd3和抗-ror1mab染色。(d)自沒有ror1car-t細(xì)胞的動物(a12022)在第1，5和7天獲得的pbmc樣品中t-apc灌輸前后tror1⁺t細(xì)胞的存在。

發(fā)明詳述

在一方面，本公開提供用于提高，增大或增強(qiáng)過繼細(xì)胞免疫療法效力或治療過增生疾病的組合物和方法，其是通過向人受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含修飾的人t細(xì)胞的群體，所述修飾的人t細(xì)胞包含編碼抗原結(jié)合蛋白(例如，嵌合抗原受體，car)的核酸分子，其中所述抗原結(jié)合蛋白包含被布置在胞外結(jié)合組分和胞內(nèi)效應(yīng)器組分之間的疏水部分；和修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合的群體，所述修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合包含編碼被抗原結(jié)合蛋白的胞外結(jié)合組分特異性識別的抗原的核酸分子。

在詳述本公開之前，有助于對其理解的是提供本文中所用的某些術(shù)語的定義。另外的定義被陳述于本公開的全文中。

除非另外說明，在本說明書中，任何濃度范圍，百分比范圍，比率范圍，或整數(shù)范圍被理解為包括所述范圍內(nèi)的任意整數(shù)值，并且合適時，包括其分?jǐn)?shù)(如整數(shù)的十分之一和百分之一)。此外，除非另外說明，本文中述及的涉及任何物理特征，如聚合物亞基，大小或厚度的任何數(shù)目范圍被理解為包括所述范圍內(nèi)的任意整數(shù)。除非另外說明，當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語″約″表示指定范圍，值或結(jié)構(gòu)的±20％。應(yīng)當(dāng)理解本文中使用的術(shù)語″一個″和″一種″是指″一個或多個″所列舉的組分。備選方案的使用(例如，″或″)應(yīng)當(dāng)被理解為是指備選項(xiàng)中的一個，兩個或其任意組合。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語″包括″，″具有″和″包含″被同義使用，所述術(shù)語及其變體意在被視為是非限制性的。

此外，應(yīng)當(dāng)理解衍生自本文中所述的結(jié)構(gòu)和取代基的個體化合物，或多種組合的化合物的組，被本申請公開至與單獨(dú)陳述各化合物或化合物的組相同的程度。因此，選擇特定的結(jié)構(gòu)或特定的取代基在本公開的范圍內(nèi)。

術(shù)語″基本上由……組成″將權(quán)利要求的范圍限制到特定的材料或步驟，或限制到不實(shí)質(zhì)影響本發(fā)明的基本特征的那些。例如，當(dāng)結(jié)構(gòu)域，區(qū)域，組件，或蛋白的氨基酸序列所包括的延長，缺失，突變，或其組合(例如，氨基端或羧基端或結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸)合并起來占所述結(jié)構(gòu)域，區(qū)域，組件，或蛋白的長度的最多20％(例如，最多15％，10％，8％，6％，5％，4％，3％，2％或1％)并且基本上不影響(即，減小的活性不超過50％，如不超過40％，30％，25％，20％，15％，10％，5％，或1％)所述結(jié)構(gòu)域，區(qū)域，組件，或蛋白的活性(例如，結(jié)合蛋白的靶結(jié)合親和性)時，蛋白結(jié)構(gòu)域，區(qū)域或組件(例如，結(jié)合結(jié)構(gòu)域，鉸鏈區(qū)，接頭組件)或蛋白(其可以具有一個或多個結(jié)構(gòu)域，區(qū)域，或組件)″基本上由″特定的氨基酸序列″組成″。

當(dāng)在本文中使用時，″造血祖先細(xì)胞″是這樣的細(xì)胞，其來源于造血干細(xì)胞或胎兒組織并且能夠進(jìn)一步分化成成熟的細(xì)胞類型(例如，免疫系統(tǒng)細(xì)胞)。示例性的造血祖先細(xì)胞包括具有cd24^lolin^-cd117⁺表型的那些或在胸腺中發(fā)現(xiàn)的那些(被稱為祖先胸腺細(xì)胞)。

″造血干細(xì)胞″是指未分化的造血細(xì)胞，其能夠在體內(nèi)自我更新，在體外基本上無限地增殖，并且能夠分化成其他細(xì)胞類型，包括t細(xì)胞系的細(xì)胞。造血干細(xì)胞可以例如分離自胎兒肝，骨髓，臍帶血。

″胚胎干細(xì)胞″或″es細(xì)胞″或″esc″是指未分化的胚胎干細(xì)胞，其能夠整合到發(fā)育的胚胎的生殖系中并且成為其部分。胚胎干細(xì)胞能夠分化成造血祖先細(xì)胞，和任何組織或器官。適用于本文中的用途的胚胎干細(xì)胞包括來自以下的細(xì)胞：j1es細(xì)胞系，129jes細(xì)胞系，鼠干細(xì)胞系d3(美國模式生物保藏中心)，來源于129/sv小鼠的r1或e14k細(xì)胞系，來源于balb/c和c57b1/6小鼠的細(xì)胞系，和人胚胎干細(xì)胞(例如，來自wicellresearchinstitute，wi；或escellinternational，melbourne，australia)。

當(dāng)在本文中使用時，″免疫系統(tǒng)細(xì)胞″表示源自骨髓中的造血干細(xì)胞的任何免疫系統(tǒng)細(xì)胞，其產(chǎn)生兩種主要種系，骨髓祖先細(xì)胞(其產(chǎn)生骨髓細(xì)胞如單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹突細(xì)胞，巨核細(xì)胞和粒細(xì)胞)和淋巴祖先細(xì)胞(其產(chǎn)生淋巴細(xì)胞如t細(xì)胞，b細(xì)胞和自然殺傷(nk)細(xì)胞)。示例性的免疫系統(tǒng)細(xì)胞包括cd4+t細(xì)胞，cd8+t細(xì)胞，cd4-cd8-雙陰性t細(xì)胞，γδt細(xì)胞，調(diào)節(jié)性t細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞，和樹突細(xì)胞。巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞可被稱為″抗原遞呈細(xì)胞″或″apc″，其是在apc表面上的主要組織相容性復(fù)合體(mhc)受體與t細(xì)胞表面上的tcr相互作用時，可以激活t細(xì)胞的專門細(xì)胞。備選地，任何造血干細(xì)胞或免疫系統(tǒng)細(xì)胞都可以通過引入表達(dá)被tcr或另一種抗原結(jié)合蛋白(例如，car)識別的抗原的核酸分子而被轉(zhuǎn)化為apc。

當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語″宿主″是指為了利用異源或外源核酸分子進(jìn)行遺傳修飾以制備目的多肽(例如，癌癥抗原特異性car)而被靶向的細(xì)胞(例如，t細(xì)胞，造血祖先細(xì)胞)或微生物。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞可以任選地已經(jīng)具有或被修飾成包括給予與異源或外源蛋白的生物合成相關(guān)或不相關(guān)的所需性質(zhì)的其他遺傳修飾(例如，包括可檢測的標(biāo)志物；缺失的，改變的或截短的cd34；增加的共刺激因子表達(dá))。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是轉(zhuǎn)導(dǎo)有異源或外源核酸分子的人造血祖先細(xì)胞，所述異源或外源核酸分子編碼與疾病相關(guān)并且被抗原結(jié)合蛋白(例如，car)特異性結(jié)合的抗原。

″t細(xì)胞″是在胸腺中成熟并且產(chǎn)生t細(xì)胞受體(tcr)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。t細(xì)胞可以是幼稚(不暴露于抗原；與tcm相比，cd62l，ccr7，cd28，cd3，cd127和cd45ra表達(dá)增加，并且cd45ro表達(dá)減少)，記憶型t細(xì)胞(tm)(經(jīng)歷并且長時間存在的抗原)，和效應(yīng)器細(xì)胞(經(jīng)歷的抗原，細(xì)胞毒性的)。tm可被進(jìn)一步分成亞組：中央記憶型t細(xì)胞(tcm，與幼稚t細(xì)胞相比，cd62l，ccr7，cd28，cd127，cd45ro和cd95表達(dá)增加，并且cd54ra表達(dá)減少)和效應(yīng)器記憶型t細(xì)胞(tem，與幼稚t細(xì)胞或tcm相比，cd62l，ccr7，cd28，cd45ra表達(dá)減少，并且cd127表達(dá)增加)。效應(yīng)器t細(xì)胞(te)是指經(jīng)歷抗原的cd8+細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞，其與tcm相比，cd62l，ccr7，cd28的表達(dá)減少，并且對粒酶和穿孔素是陽性的。

″結(jié)合組分″(也被稱為″結(jié)合區(qū)″或″結(jié)合部分″)，當(dāng)在本文中使用時，是指能夠特異性且非共價地關(guān)聯(lián)，聯(lián)合或結(jié)合靶分子(例如，cd19，cd20，egfrviii，gd2，muc16，ror1，間皮素，pd-l1，pd-l2，psma，癌癥相關(guān)新抗原)的肽，寡肽，多肽或蛋白。結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括對于生物分子，分子復(fù)合體(即，包含兩種以上生物分子的復(fù)合體)或其他目的靶標(biāo)的任何天然存在的，合成的，半合成的或重組制備的結(jié)合配偶體。示例性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括單鏈免疫球蛋白可變區(qū)(例如，sctcr，scfv)，受體胞外結(jié)構(gòu)域，配體(例如，細(xì)胞因子，趨化因子)或針對結(jié)合生物分子，分子復(fù)合體或其他目的靶標(biāo)的具體能力選擇的合成的多肽。

當(dāng)在本文中使用時，″特異性結(jié)合″或″具有特異性″是指結(jié)合蛋白(例如，car或tcr)或結(jié)合組分(或其融合蛋白)與靶分子結(jié)合或聯(lián)合，親和力或ka(即，特定結(jié)合相互作用的平衡結(jié)合常數(shù)，單位為1/m)等于或大于10⁵m^-1(對于該結(jié)合反應(yīng)，等于結(jié)合速率(on-rate)[kon]與解離速率(off-rate)[koff]之比)，同時不顯著地與樣品中的任何其他分子或組分相結(jié)合或聯(lián)合。結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其融合蛋白)可以被分類為″高親和性″結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其融合蛋白)或″低親和性″結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其融合蛋白)?！甯哂H和性″結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域是指ka為至少10⁷m^-1，至少10⁸m^-1，至少10⁹m^-1，至少10¹⁰m^-1，至少10¹¹m^-1，至少10¹²m^-1或至少10¹³m^-1的那些結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域?！宓陀H和性″結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域是指ka高達(dá)10⁷m^-1，高達(dá)10⁶m^-1，高達(dá)10⁵m^-1的那些結(jié)合蛋白或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。備選地，親和性可以被定義為特定結(jié)合相互作用的平衡解離常數(shù)(kd)，其單位為m(例如，10^-5m至10^-13m)。

已知多種測定用于鑒定特異性結(jié)合特定靶標(biāo)的本公開的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及確定結(jié)合結(jié)構(gòu)域或融合蛋白親和力，如蛋白質(zhì)印跡法，elisa，分析超速離心，光譜法和表面等離子共振分析(參見，例如，scatchard等，ann.n.y.acad.sci.51：660，1949；wilson，science295：2103，2002；wolff等，cancerres.53：2560，1993；和美國專利號5,283,173，5,468,614，或?qū)?yīng)申請)。

當(dāng)在本文中使用時，″鉸鏈區(qū)″或″鉸鏈″是指(a)免疫球蛋白鉸鏈序列(其由例如上部或核心區(qū)組成)或其功能變體，(b)ii型c-凝集素結(jié)構(gòu)域間(莖)區(qū)或其功能變體，或(c)分化簇(cd)分子莖區(qū)或其功能變體。當(dāng)在本文中使用時，″野生型免疫球蛋白鉸鏈區(qū)″是指在抗體重鏈中發(fā)現(xiàn)的天然存在的被插入ch1和ch2結(jié)構(gòu)域(對應(yīng)igg，iga和igd)之間并將兩者連接或被插入ch1和ch3結(jié)構(gòu)域(對于ige和igm)之間并將兩者連接的上部和中間鉸鏈氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)是人鉸鏈區(qū)，并且在特別的實(shí)施方案中，包含人igg鉸鏈區(qū)。

當(dāng)在本文中使用時，″疏水部分″表示在細(xì)胞膜中熱穩(wěn)定并且長度通常為約15個氨基酸至約30個氨基酸的具有三維結(jié)構(gòu)的任何氨基酸序列。疏水結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)可以包括α螺旋，β桶，β片層，β螺旋，或其任意組合。

當(dāng)在本文中使用時，″效應(yīng)器組分″或″效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域″是在收到合適的信號時，融合蛋白或受體的可以直接或間接促進(jìn)細(xì)胞中的生物學(xué)或生理學(xué)反應(yīng)的胞內(nèi)部分。在某些實(shí)施方案中，效應(yīng)器組分是蛋白，融合蛋白或蛋白復(fù)合體的接收結(jié)合時的信號的部分，或其直接結(jié)合靶分子，這觸發(fā)來自效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域的信號。當(dāng)效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域含有一個或多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或基序(如基于免疫受體酪氨酸的激活基序(itam))時，其可以直接促進(jìn)細(xì)胞響應(yīng)。在其他實(shí)施方案中，效應(yīng)器組分通過結(jié)合一種或多種另外的直接促進(jìn)細(xì)胞響應(yīng)的蛋白而間接促進(jìn)細(xì)胞響應(yīng)。

″接頭″是指這樣的氨基酸序列，其連接兩個蛋白，多肽，肽，結(jié)構(gòu)域，區(qū)域或基序，并且可以提供與兩個亞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用相容的間隔功能以使所得的多肽保持與靶分子的特異性結(jié)合親和性(例如，sctcr)或保持信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(例如，tcr復(fù)合體)。在某些實(shí)施方案中，接頭由約兩個至約35個氨基酸，例如，或約四個至約20個氨基酸或約八個至約15個氨基酸或約15個至約25個氨基酸組成。在另外的實(shí)施方案中，接頭是將重鏈免疫球蛋白可變區(qū)連接至輕鏈免疫球蛋白可變區(qū)或連接t細(xì)胞受體vα/β和cα/β鏈(例如，vα-cα，vβ-cβ，vα-vβ)或?qū)⒏鱲α-cα，vβ-cβ，vα-vβ對連接至鉸鏈或疏水結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)接頭。

″連接氨基酸″或″連接氨基酸殘基″是指多肽的兩個相鄰的基序，區(qū)域或結(jié)構(gòu)域之間如結(jié)合結(jié)構(gòu)域和相鄰的恒定結(jié)構(gòu)域之間或tcr鏈和相鄰的自切割肽之間的一個或多個(例如，約2-10個)氨基酸殘基。連接氨基酸可以產(chǎn)生自融合蛋白的構(gòu)建體設(shè)計(jì)(例如，編碼融合蛋白的核酸分子的構(gòu)建期間使用限制性酶位點(diǎn)產(chǎn)生的氨基酸殘基)。

″改變的組分″或″改變的結(jié)構(gòu)域″或″改變的蛋白″是指與野生型基序，區(qū)域，結(jié)構(gòu)域，肽，多肽或蛋白(例如，野生型胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域cd3ζ，cd134，cd137)的序列同一性為至少85％(例如，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％)的基序，區(qū)域，結(jié)構(gòu)域，肽，多肽或蛋白。

當(dāng)在本文中使用時，修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合中包含的核酸分子編碼的″抗原″是指與疾病或病癥(例如，癌癥)相關(guān)并且作為免疫療法靶標(biāo)的任何生物學(xué)分子(例如，蛋白，碳水化合物)。在某些實(shí)施方案中，抗原可以是抗-獨(dú)特型抗體或其抗-獨(dú)特型抗體結(jié)合片段，或?qū)π揎椀膖細(xì)胞表達(dá)的抗原結(jié)合蛋白(例如，car)具有特異性的抗體或其抗體結(jié)合片段。示例性的抗原包括α-甲胎蛋白(afp)，b7h4，btla，cd3，cd19，cd20，cd25，cd22，cd28，cd30，cd40，cd44v6，cd52，cd56，cd79b，cd80，cd81，cd86，cd134(ox40)，cd137(4-1bb)，cd151，cd276，ca125，cea，ceacam6，c-met，ct-7，ctla-4，egfr，egfrviii，erbb2，erbb3，erbb4，epha2，flt1，flt4，frizzled，o-乙?；?gd2，gd2，ghrhr，ghr，gitr，gp130，hvem，igf1r，il6r，kdr，l1cam，lewisa，lewisy，ltβr，lifrβ，lrp5，mage，間皮素，muc1，ny-eso-1，癌癥特異性新抗原，osmrβ，pd1，pd-l1，pd-l2，psma，ptch1，rank，robo1，ror1，tert，tgfbr2，tgfbr1，tlr7，tlr9，tnfrsf4，tnfr1，tnfr2，酪氨酸酶，tweak-r，或wt-1。

″t細(xì)胞受體″(tcr)是指能夠特異性結(jié)合與mhc受體結(jié)合的抗原肽的免疫球蛋白超家族成員(具有可變結(jié)合結(jié)構(gòu)域，恒定結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)域，和短胞質(zhì)尾部；參見，例如，janeway等，immunobiology：theimmunesysteminhealthanddisease，3^rded.，currentbiologypublications，p.4：33，1997)。tcr可以在細(xì)胞表面上或以可溶形式發(fā)現(xiàn)并且通常由具有α和β鏈(也被分別稱為tcrα和tcrβ)或γ和δ鏈(也被分別稱為tcrγ和tcrδ)的異源二聚體組成。與免疫球蛋白一樣，tcr鏈(例如，α-鏈，β-鏈)的胞外部分含有兩個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，n-端的可變結(jié)構(gòu)域(例如，α-鏈可變結(jié)構(gòu)域或vα，β-鏈可變結(jié)構(gòu)域或vβ；典型地是基于kabat編號的氨基酸1至116(kabat等，″sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，usdept.healthandhumanservices，publichealthservicenationalinstitutesofhealth，1991，5^thed.))，和鄰近細(xì)胞膜的一個恒定結(jié)構(gòu)域(例如，α-鏈恒定結(jié)構(gòu)域或cα，典型地是基于kabat的氨基酸117至259，β-鏈恒定結(jié)構(gòu)域或cβ，典型地是基于kabat的氨基酸117至295)。同樣與免疫球蛋白一樣，所述可變結(jié)構(gòu)域含被框架區(qū)(fr)分隔的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)(參見，例如，jores等，proc.nat′lacad.sci.u.s.a.87：9138，1990；chothia等，emboj.7：3745，1988；還參見lefranc等，dev.comp.immunol.27：55，2003)。在某些實(shí)施方案中，tcr在t細(xì)胞(或t淋巴細(xì)胞)上被發(fā)現(xiàn)并且與cd3復(fù)合體相結(jié)合。本公開中的tcr的來源可以來自各種動物物種，如人，小鼠，大鼠，兔或其他哺乳動物。

在本領(lǐng)域中，已知″cd3″是六條鏈的多蛋白復(fù)合體(參見，abbas和lichtman，2003；janeway等，p172和178，1999)。在哺乳動物中，所述復(fù)合體包含cd3γ鏈，cd3δ鏈，兩條cd3ε鏈，和cd3ζ鏈的同源二聚體。cd3γ，cd3δ和cd3ε鏈?zhǔn)呛瑔蝹€免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白超家族的高度相關(guān)的細(xì)胞表面蛋白。cd3γ，cd3δ和cd3ε鏈的跨膜區(qū)域帶負(fù)電，該特征允許這些鏈與帶正電的t細(xì)胞受體鏈結(jié)合。cd3γ，cd3δ和cd3ε鏈的胞內(nèi)尾部各自含有單個保守的基序，其被稱為基于免疫受體酪氨酸的激活基序或itam，而各cd3ζ鏈具有三個。不希望受制于理論，據(jù)信，itam對于tcr復(fù)合體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能力是重要的。當(dāng)在本文中使用時，cd3可以來自各種動物物種，包括人，小鼠，大鼠或其他哺乳動物。

當(dāng)在本文中使用時，″tcr復(fù)合體″是指通過cd3與tcr的結(jié)合形成的復(fù)合體。例如，tcr復(fù)合體可以由一個cd3γ鏈，一個cd3δ鏈，兩個cd3ε鏈，cd3ζ鏈的同源二聚體，一個tcrα鏈，和一個tcrβ鏈組成。備選地，tcr復(fù)合體可以由一個cd3γ鏈，一個cd3δ鏈，兩個cd3ε鏈，cd3ζ鏈的同源二聚體，一個tcrγ鏈，和一個tcrδ鏈組成。

當(dāng)在本文中使用時，″tcr復(fù)合體的組分″是指tcr鏈(即，tcrα，tcrβ，tcrγ或tcrδ)，cd3鏈(即，cd3γ，cd3δ，cd3ε或cd3ζ)，或由兩個以上tcr鏈或cd3鏈形成的復(fù)合體(例如，tcrα和tcrβ的復(fù)合體，tcrγ和tcrδ的復(fù)合體，cd3ε和cd3δ的復(fù)合體，cd3γ和cd3ε的復(fù)合體，或tcrα，tcrβ，cd3γ，cd3δ，和兩個cd3ε鏈的亞tcr復(fù)合體)。

當(dāng)在本文中使用時，″核酸″或″核酸分子″是指以下任一：脫氧核糖核酸(dna)，核糖核酸(rna)，寡核苷酸，例如通過聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)或通過體外翻譯產(chǎn)生的片段，和通過連接，剪切，核酸內(nèi)切酶作用或核酸外切酶作用中任一產(chǎn)生的片段。在某些實(shí)施方案中，本公開的核酸通過pcr產(chǎn)生。核酸可以由作為天然存在的核苷酸(如脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)，天然存在的核苷酸的類似物(例如，α-對映體形式的天然存在的核苷酸)或兩者的組合的單體組成。修飾的核苷酸可以具有在糖部分，或嘧啶或嘌呤堿基部分中具有修飾或代替糖部分，或嘧啶或嘌呤堿基部分。核酸單體可以通過磷酸二酯鍵或此種連接的類似物相連。磷酸二酯連接的類似物包括硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，苯胺基硫代磷酸酯，苯胺基磷酸酯，氨基磷酸酯等。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的。

術(shù)語″分離的″表示物質(zhì)離開其原始環(huán)境(例如，天然環(huán)境，如果其是天然存在的)。例如，存在于活體動物中的天然存在的核酸或多肽不是分離的，但是與天然系統(tǒng)中共存的物質(zhì)中的一些或全部分離的相同的核酸或多肽是分離的。此種核酸可以是載體的部分和/或此種核酸或多肽可以是組合物(例如，細(xì)胞溶菌產(chǎn)物)的部分，并且仍然是分離的，因?yàn)檫@樣的載體或組合物不是所述核酸或多肽的天然環(huán)境的部分。術(shù)語″基因″表示參與制備多肽鏈的dna區(qū)段；其包括在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域″前導(dǎo)和尾部″以及個體編碼區(qū)段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。

當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語″重組″是指通過引入外源核酸分子而被修飾的細(xì)胞，微生物，核酸分子或載體，或是指被改變以致內(nèi)源核酸分子或基因的表達(dá)受控，去調(diào)或成為組成型的細(xì)胞或微生物，其中此種改變或修飾可以通過基因工程引入。基因改變可以包括，例如，引入編碼一種或多種蛋白或酶的核酸分子(其可以包括表達(dá)控制元件，如啟動子)，或其他核酸分子添加，缺失，置換，或?qū)?xì)胞遺傳物質(zhì)的其他功能破壞或增加的修飾。示例性的修飾包括來自參比或親本分子的異源或同源多肽的編碼區(qū)或其功能片段中的那些。

當(dāng)在本文中使用時，″突變″是指分別與參比或野生型核酸分子或多肽分子相比的核酸分子或多肽分子的序列變化。突變可能導(dǎo)致若干不同類型的序列變化，包括核苷酸或氨基酸的置換，插入或缺失。在某些實(shí)施方案中，突變是一個或三個密碼子或氨基酸的置換，1至約5個密碼子或氨基酸的缺失，或其組合。

在本領(lǐng)域中，認(rèn)為″保守性置換″是一種氨基酸置換成具有類似性質(zhì)的另一種氨基酸。示例性的保守性置換是本領(lǐng)域中共知的(參見，例如，wo97/09433，第10頁；lehninger，biochemistry，2^ndedition；worthpublishers，inc.ny，ny，pp.71-77，1975；lewin，genesiv，oxforduniversitypress，nyandcellpress，cambridge，ma，p.8，1990)。

術(shù)語″構(gòu)建體″是指含有重組核酸的任意多核苷酸。構(gòu)建體可以存在于載體(例如，細(xì)菌載體，病毒載體)中或可以整合到基因組中。″載體″是能夠轉(zhuǎn)運(yùn)另一種核酸的核酸分子。載體可以是，例如，質(zhì)粒，黏粒，病毒，rna載體或直鏈或環(huán)形dna或rna分子，其可以包括染色體，非染色體，半合成或合成的核酸。示例性的載體是能夠自復(fù)制(游離型載體)或表達(dá)與其相連的核酸的載體(表達(dá)載體)。

病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，細(xì)小病毒(例如，腺相關(guān)病毒)，冠狀病毒，負(fù)鏈rna病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)，彈狀病毒(例如，狂犬病和水皰性口炎病毒)，副粘病毒(例如，麻疹和sendai)，正鏈rna病毒如微小核糖核酸病毒和α病毒，和雙鏈dna病毒，包括腺病毒，皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒1和2型，epstein-barr病毒，巨細(xì)胞病毒)，和痘病毒(例如，牛痘，鳥痘和金絲雀痘)。其他病毒包括例如norwalk病毒，囊膜病毒，黃病毒，呼腸孤病毒，乳多泡病毒，嗜肝性dna病毒，和肝炎病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例包括鳥造白細(xì)胞組織增生肉瘤，哺乳動物c-型，b-型病毒，d型病毒，htlv-blv組，慢病毒，泡沫病毒(coffin，j.m.，retroviridae：thevirusesandtheirreplication，infundamentalvirology，thirdedition，b.n.fields等，eds.，lippincott-ravenpublishers，philadelphia，1996)。

當(dāng)在本文中使用時，″慢病毒載體″表示用于基因遞送的基于hiv的慢病毒載體，其可以是整合的或非整合的，具有較大的包封能力，并且可以轉(zhuǎn)導(dǎo)多種不同的細(xì)胞類型。慢病毒載體通常在將三種(包封，包膜和轉(zhuǎn)移)以上的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到生產(chǎn)細(xì)胞中后產(chǎn)生。與hiv一樣，慢病毒載體通過病毒表面糖蛋白與細(xì)胞表面上的受體的相互作用進(jìn)入靶細(xì)胞。在進(jìn)入后，病毒rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其由病毒反轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合體介導(dǎo)。反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是雙鏈線性病毒dna，其是病毒整合到受感染細(xì)胞的dna中的底物。

術(shù)語″可操作相連″是指單個核酸片斷上的兩個以上的核酸分子結(jié)合以致功能受彼此影響。例如，當(dāng)啟動子能夠影響編碼序列的表達(dá)(即，編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)時，所述啟動子與所述編碼序列是可操作相連的。″不相連″表示相關(guān)的遺傳元件彼此不緊密結(jié)合并且功能互不影響。

當(dāng)在本文中使用時，″表達(dá)載體″是指dna構(gòu)建體，所述dna構(gòu)建體包含與合適的控制序列可操作相連的核酸分子，所述控制序列能夠影響所述核酸分子在合適宿主中的表達(dá)。此種控制序列包括影響轉(zhuǎn)錄的啟動子，任選的控制此種轉(zhuǎn)錄的操縱子序列，編碼合適的mrna核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列，和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。所述載體可以是質(zhì)粒，噬菌體顆粒，病毒，或僅是可能的基因組插入物。在轉(zhuǎn)化到合適的宿主中后，所述載體可以獨(dú)立于宿主基因組進(jìn)行復(fù)制和發(fā)揮功能，或在一些情況中可以整合到基因組本身中。在本說明書中，″質(zhì)?！澹灞磉_(dá)質(zhì)?！?，″病毒″和″載體″通常被可互換地使用。

當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語″表達(dá)″是指基于基因的核酸序列制備多肽的過程。所述過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。

在將核酸序列插入細(xì)胞中的語境中，術(shù)語″引入″表示″轉(zhuǎn)染″或‘轉(zhuǎn)化″或″轉(zhuǎn)導(dǎo)″并且包括對將核酸序列整合到真核或原核細(xì)胞中的提及，其中所述核酸分子可以被整合到細(xì)胞的基因組中(例如，染色體，質(zhì)粒，質(zhì)體，或線粒體dna)，轉(zhuǎn)化成自復(fù)制子，或被瞬時表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mrna)。

當(dāng)在本文中使用時，″異源″或″外源″核酸分子，構(gòu)建體或序列是指這樣的核酸分子或核酸分子的部分，其對于宿主細(xì)胞來說并不是自然的，但是可以與來自宿主細(xì)胞的核酸分子或核酸分子的部分具有同源性。異源或外源核酸分子，構(gòu)建體或序列的來源可以來自不同種屬或物種。在某些實(shí)施方案中，通過例如綴合，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)染，電穿孔等將異源或外源核酸分子添加(即，非內(nèi)源或天然)至宿主細(xì)胞或宿主基因組中，其中所添加的分子可以整合到宿主基因組中或作為染色體外遺傳物質(zhì)存在(例如，作為質(zhì)粒或其他形式的自復(fù)制載體)，并且可以以多個拷貝存在。此外，″異源″是指由引入到宿主細(xì)胞中的外源核酸分子編碼的非天然酶，蛋白或其他活性，即使宿主細(xì)胞編碼同源蛋白或活性。

如本文中所述，可以將超過一種異源或外源核酸分子引入宿主細(xì)胞中，作為分開的核酸分子，作為多個分別受控的基因，作為多順反子核酸分子，作為編碼融合蛋白的單個核酸分子，或其任意組合。例如，如本文中公開的，宿主細(xì)胞可以被修飾成表達(dá)編碼所需的抗原特異性結(jié)合蛋白(例如，car，tcrα和tcrβ)的兩種以上的異源或外源核酸分子。當(dāng)將兩種以上的外源核酸分子引入宿主細(xì)胞中時，要理解的是，兩種以上的外源核酸分子可以被引入作為單個的核酸分子(例如，在單個載體上)，在分開的載體上，在單個位點(diǎn)或多個位點(diǎn)整合到宿主染色體中。提及的異源核酸分子或蛋白活性的數(shù)目是指編碼核酸分子的數(shù)目或蛋白活性的數(shù)目，而不是引入到宿主細(xì)胞中的分開的核酸分子的數(shù)目。

當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語″內(nèi)源″或″天然″是指通常存在于宿主細(xì)胞中的基因，蛋白，或活性。此外，與親本基因，蛋白或活性相比突變，過表達(dá)，改組(shuffled)，復(fù)制或以其他方式改變的基因，蛋白或活性仍被認(rèn)為對所述特定的宿主細(xì)胞是內(nèi)源的或天然的。例如，來自第一基因的內(nèi)源控制序列(例如，啟動子，翻譯減弱序列)可以用于改變或調(diào)節(jié)第二天然基因或核酸分子的表達(dá)，其中第二天然基因或核酸分子的表達(dá)或調(diào)節(jié)不同于親本細(xì)胞中的正常表達(dá)或調(diào)節(jié)。

術(shù)語″同源″或″同源物″是指在宿主細(xì)胞，物種或株系中發(fā)現(xiàn)或來源于其的分子或活性。例如，異源或外源核酸分子可以與天然的宿主細(xì)胞基因具有同源性，并且可以任選地具有改變的表達(dá)水平，不同的序列，改變的活性，或其任意組合。

當(dāng)在本文中使用時，″序列同一性″是指在進(jìn)行序列比對并且在必要時引入空位以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性，并且不認(rèn)為任何保守置換是序列同一性的部分后，一條序列中與另一參比多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。百分比序列同一性值可以使用altschul等(1997)″gappedblastandpsi-blast：anewgenerationofproteindatabasesearchprograms″，nucleicacidsres.25：3389-3402所限定的ncbiblast2.0軟件來產(chǎn)生，其中參數(shù)設(shè)定為缺省值。

當(dāng)在本文中使用時，″過增生病癥″是指與正?；驔]有病的細(xì)胞相比的過度生長或增殖。示例性的過增生病癥包括腫瘤，癌癥，腫瘤組織，癌，前惡性細(xì)胞，以及非腫瘤或非惡性過增生性病癥(例如，腺瘤，纖維瘤，脂肪瘤，平滑肌瘤，血管瘤，再狹窄，以及自體免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，銀屑病，炎性腸病等)。

表達(dá)抗原結(jié)合蛋白或抗原的修飾的細(xì)胞

在某些方面，本公開提供過繼細(xì)胞免疫療法組合物，其包含修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合的群體，其中修飾的細(xì)胞的第一群體是包含編碼抗原結(jié)合蛋白(例如，car)的核酸分子的t細(xì)胞，并且修飾的細(xì)胞的第二群體包含編碼抗原(例如，癌癥特異性抗原，抗-獨(dú)特型抗體或其結(jié)合片段)的核酸分子。在這些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白包含被布置在胞外結(jié)合組分和胞內(nèi)效應(yīng)器組分之間的疏水部分，并且胞外結(jié)合組分對由修飾的細(xì)胞的第二群體編碼的抗原具有特異性。例如，抗原結(jié)合蛋白可以是t細(xì)胞受體(tcr)或嵌合抗原受體。

這些組合物的一個優(yōu)點(diǎn)在于可以將較低劑量的例如抗原特異性cart細(xì)胞施用于患者，然后施用(例如，同時或相繼)表達(dá)被car識別的抗原的細(xì)胞的第二群體將加強(qiáng)過繼免疫療法的效果。另一個優(yōu)點(diǎn)在于，加強(qiáng)效果也可以改善歸巢以致細(xì)胞遷移至目標(biāo)組織。表達(dá)car的t細(xì)胞和人工apc的組合的另一個優(yōu)點(diǎn)是系統(tǒng)性加強(qiáng)過繼免疫療法的效果從而使更多的活性細(xì)胞在腫瘤位點(diǎn)處。

在某些其他方面，將包含編碼抗原的核酸分子的修飾的造血祖先細(xì)胞施用于受試者，其中編碼的抗原在調(diào)節(jié)啟動子的控制下。修飾的造血祖先細(xì)胞將定位于目標(biāo)組織并復(fù)制(例如，骨髓或淋巴結(jié))。然后，在給受試者施用包含編碼抗原結(jié)合蛋白(例如，car)的核酸分子的修飾的t細(xì)胞的第一群體后或與其同時，可以誘導(dǎo)擴(kuò)大的修飾的造血祖先細(xì)胞中抗原的表達(dá)，其中引入的″apc″的數(shù)目遠(yuǎn)大于通過體外擴(kuò)增和施用可獲得的。在某些實(shí)施方案中，在施用前，被施用的細(xì)胞的第二群體被輻照。

在任意前述實(shí)施方案中，抗原結(jié)合蛋白包含結(jié)合組分，疏水部分和胞內(nèi)效應(yīng)器組分。例如，結(jié)合組分可以是抗體可變片段(fv)，tcr可變結(jié)構(gòu)域，受體胞外結(jié)構(gòu)域，或配體。在另外的實(shí)施方案中，結(jié)合組分是包含可變區(qū)接頭的scfv或sctcr，如接頭包含(glyxsery)n，其中x和y獨(dú)立地是1至5的整數(shù)，并且n是1至10的整數(shù)。在另外的實(shí)施方案中，結(jié)合組分對以下各項(xiàng)具有特異性：α-甲胎蛋白(afp)，b7h4，btla，cd3，cd19，cd20，cd25，cd22，cd28，cd30，cd40，cd44v6，cd52，cd56，cd79b，cd80，cd81，cd86，cd134(ox40)，cd137(4-1bb)，cd151，cd276，ca125，cea，ceacam6，c-met，ct-7，ctla-4，egfr，egfrviii，erbb2，erbb3，erbb4，epha2，flt1，flt4，frizzled，o-乙?；?gd2，gd2，ghrhr，ghr，gitr，gp130，hvem，igf1r，il6r，kdr，l1cam，lewisa，lewisy，ltβr，lifrβ，lrp5，mage，間皮素，muc1，ny-eso-1，癌癥特異性新抗原，osmrβ，pd1，pd-l1，pd-l2，psma，ptch1，rank，robo1，ror1，tert，tgfbr2，tgfbr1，tlr7，tlr9，tnfrsf4，tnfr1，tnfr2，酪氨酸酶，tweak-r，或wt-1。

在另外的實(shí)施方案中，疏水部分是跨膜結(jié)構(gòu)域，如cd4，cd8，cd28或cd27跨膜結(jié)構(gòu)域。

在某些實(shí)施方案中，胞內(nèi)效應(yīng)器組分包含以下各項(xiàng)的胞內(nèi)區(qū)：cd3ε，cd3δ，cd3ζ，cd25，cd27，cd28，cd79a，cd79b，cd134，cd137，card11，dap10，fcrα，fcrβ，fcrγ，fyn，hvem，icos，lck，lag3，lat，lrp，nkg2d，notch1，notch2，notch3，notch4，ror2，ryk，slamf1，slp76，ptα，tcrα，tcrβ，trim，zap70，ptch2，或其任意組合。在特別的實(shí)施方案中，胞內(nèi)效應(yīng)器組分包含cd3ζ以及cd27，cd28，cd134和cd137中的一個或多個，或胞內(nèi)效應(yīng)器組分包含lrp，notch1，notch2，notch3，notch4，ror2，或ryk。

在任意前述實(shí)施方案中，修飾的細(xì)胞是免疫系統(tǒng)細(xì)胞，如cd4+t細(xì)胞，cd8+t細(xì)胞，cd4-cd8-雙陰性t細(xì)胞，γδt細(xì)胞，調(diào)節(jié)性t細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞，樹突細(xì)胞，或其任意組合。在某些實(shí)施方案中，t細(xì)胞是幼稚t細(xì)胞，中央記憶型t細(xì)胞，效應(yīng)器記憶型t細(xì)胞，或其任意組合。例如，修飾的t細(xì)胞的第一群體可以基本上由cd4+t細(xì)胞，cd8+t細(xì)胞，或cd4+和cd8+t細(xì)胞兩者組成，并且修飾的細(xì)胞的第二群體包含修飾的人造血祖先細(xì)胞。在其他實(shí)例中，修飾的t細(xì)胞的第一群體可以基本上由cd4+t細(xì)胞，cd8+t細(xì)胞，或cd4+和cd8+t細(xì)胞兩者組成，并且修飾的細(xì)胞的第二群體包含修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞，如基本上由cd4+t細(xì)胞，cd8+t細(xì)胞，或cd4+和cd8+t細(xì)胞兩者組成的細(xì)胞。

在任意前述實(shí)施方案中，修飾的細(xì)胞群體通過使用例如病毒載體，如慢病毒載體或γ-反轉(zhuǎn)錄病毒載體被離體重組修飾。在另外的實(shí)施方案中，被修飾的細(xì)胞群體是同基因的，同種異基因的，或自體的細(xì)胞。在任意前述實(shí)施方案中，修飾的細(xì)胞群體被進(jìn)一步與藥用載體，稀釋劑，或賦形劑配制在一起，如本文中所述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種標(biāo)準(zhǔn)指示在肽或多肽中的特定位置處被置換的氨基酸是否是保守的(或類似的)。例如，類似氨基酸或保守氨基酸置換是這樣的一種，其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基代替。類似的氨基酸可以包括在以下分類中：具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)；具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸)；具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，組氨酸)；具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)；具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)，和具有芳香性側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸)。脯氨酸，被認(rèn)為更難以分類，與具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(例如，亮氨酸，纈氨酸，異亮氨酸，和丙氨酸)共享性質(zhì)。在某些情況中，將谷氨酰胺置換成谷氨酸或?qū)⑻於０分脫Q成天冬氨酸可以被認(rèn)為是類似的置換，原因在于谷氨酰胺和天冬酰胺分別是天冬氨酸和谷氨酸的酰胺衍生物。如本領(lǐng)域中理解的，兩個多肽之間的″相似性″通過將一個多肽的氨基酸序列和置換其的保守氨基酸與第二多肽的序列比較來確定(例如，使用geneworks，align，blast算法，或本文中描述以及本領(lǐng)域中實(shí)施的其他算法)。

在某些實(shí)施方案中，抗原特異性結(jié)合蛋白結(jié)合組分的氨基酸序列與原野生型序列具有至少約90％或至少約95％同一性，前提是(a)至少三或四個cdr沒有突變并且(b)具有突變的cdr僅有多至兩個或三個氨基酸置換，多達(dá)連續(xù)的五個氨基酸缺失，或其組合。

在某些實(shí)施方案中，將編碼抗原結(jié)合蛋白或抗原的核酸分子用于轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞，t細(xì)胞)以用于過繼轉(zhuǎn)移治療。目前用所需核酸轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞的方法的進(jìn)展已被描述(例如，us2004/0087025)為具有使用所需抗原特異性的t-細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移方法(例如，schmitt等，hum.gen.20：1240，2009；dossett等，mol.ther.17：742，2009；till等，blood112：2261，2008；wang等，hum.genether.18：712，2007；kuball等，blood109：2331，2007；us2011/0243972；us2011/0189141；leen等，ann.rev.immunol.25：243，2007)，以致基于本文中的教導(dǎo)，考慮這些方法適用于本文公開的實(shí)施方案。

如本文中所述的抗原結(jié)合蛋白或組分可以根據(jù)用于測定t細(xì)胞活性的本領(lǐng)域接收的多種方法中的任一種在功能上被表征，所述方法包括測定t細(xì)胞結(jié)合，激活或誘導(dǎo)并且還包括測定抗原特異性的t細(xì)胞響應(yīng)。實(shí)例包括測定t細(xì)胞增殖，t細(xì)胞細(xì)胞因子釋放，抗原特異性t細(xì)胞刺激，mhc限制的t細(xì)胞刺激，ctl活性(例如，通過檢測自預(yù)載靶細(xì)胞的⁵¹cr釋放)，t細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)的變化，和t-細(xì)胞功能的其他量度。用于進(jìn)行這些和類似測定的方法可以被發(fā)現(xiàn)于例如lefkovits(immunologymethodsmanual：thecomprehensivesourcebookoftechniques，1998)。還參見currentprotocolsinimmunology；weir，handbookofexperimentalimmunology，blackwellscientific，boston，ma(1986)；mishell和shigii(eds.)selectedmethodsincellularimmunology，freemanpublishing，sanfrancisco，ca(1979)；green和reed，science281：1309(1998)及其中引用的參考文獻(xiàn))。

細(xì)胞因子水平可以根據(jù)本文中所述的和本領(lǐng)域中實(shí)施的方法確定，所述方法包括例如，elisa，elispot，胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，和流式細(xì)胞術(shù)及其組合(例如，胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞術(shù))。免疫應(yīng)答的抗原特異性引發(fā)或刺激所產(chǎn)生的免疫細(xì)胞增殖和克隆擴(kuò)大可以通過以下方式確定：分離淋巴細(xì)胞，如外周血細(xì)胞或來自淋巴結(jié)的細(xì)胞的樣品中的循環(huán)淋巴細(xì)胞，用抗原刺激所述細(xì)胞，并且測量細(xì)胞因子生產(chǎn)，細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞生存力，如通過整合氚化胸苷或非放射性測定，如mtt測定等。本文中所述的免疫原對th1免疫應(yīng)答和th2免疫應(yīng)答之間的平衡的作用可以例如通過確定th1細(xì)胞因子如ifn-γ，il-12，il-2和tnf-β，和type2細(xì)胞因子如il-4，il-5，il-9，il-10和il-13的水平來檢測。

編碼抗原結(jié)合蛋白或抗原的多核苷酸

如本文中所述的分離的或重組的編碼抗原結(jié)合蛋白如car，對抗原特異的高親和性重組tcr，或針對抗原特異性結(jié)合組分的抗原或抗-獨(dú)特型抗體的核酸分子可以根據(jù)分子生物學(xué)或多肽純化領(lǐng)域的多種方法和技術(shù)生產(chǎn)和制備。用于重組制備抗原結(jié)合蛋白如car，對抗原特異的高親和性重組tcr，或針對目的抗原特異性結(jié)合組分的抗原或抗-獨(dú)特型抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建可以通過使用本領(lǐng)域中已知的任何合適的分子生物學(xué)工程改造技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括使用限制性核酸內(nèi)切酶消化，連接，轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒純化，和dna測序，例如sambrook等(1989和2001版本；molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，ny)和ausubel等(currentprotocolsinmolecularbiology(2003))中所述。為了獲得有效轉(zhuǎn)錄和翻譯，各重組表達(dá)構(gòu)建體中的多核苷酸包括至少一個合適的表達(dá)控制序列(也被稱為調(diào)節(jié)性序列)，如前導(dǎo)序列并且特別是與編碼免疫原的核苷酸序列可操作相連的啟動子。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸被進(jìn)行密碼子優(yōu)化以用于在靶宿主細(xì)胞中的有效表達(dá)。

某些實(shí)施方案涉及編碼本文中考慮的多肽(例如，嵌合抗原受體，高親和重組tcr，對抗原結(jié)合蛋白特異的目的抗原和抗-獨(dú)特型抗體)的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，核酸可以是指任意形式的單鏈或雙鏈dna，cdna或rna，并且可以包括核酸的彼此互補(bǔ)的正鏈和負(fù)鏈，包括反義dna，cdna和rna。還包括的是sirna，microrna，rna-dna雜合體，核酶，和dna或rna的其他各種天然存在的或合成的形式。

標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以用于重組dna，肽和寡核苷酸合成，免疫測定和組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔，脂轉(zhuǎn)染)。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)可以根據(jù)生產(chǎn)商的說明或如本領(lǐng)域中通常完成的或如本文中所述的進(jìn)行。這些和相關(guān)技術(shù)和方法通?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域中已知的和本文通篇引用和討論的微生物學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，分子遺傳學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，病毒學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)中的各種總體和更具體的參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法。參見，例如，sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，3ded.，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.；currentprotocolsinmolecularbiology(johnwiley和sons，2008年7月更新)；shortprotocolsinmolecularbiology：acompendiumofmethodsfromcurrentprotocolsinmolecularbiology，greenepub.associatesandwiley-interscience；glover，dnacloning：apracticalapproach，vol.i&ii(irlpress，oxforduniv.pressusa，1985)；currentprotocolsinimmunology(編輯：johne.coligan，adam.kruisbeek，davidh.margulies，ethanm.shevach，warrenstrober2001johnwiley&sons，ny，ny)；real-timepcr：currenttechnologyandapplications，編輯：julielogan，kirstinedwards和nicksaunders，2009，caisteracademicpress，norfolk，uk；anand，techniquesfortheanalysisofcomplexgenomes，(academicpress，newyork，1992)；guthrie和fink，guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology(academicpress，newyork，1991)；oligonucleotidesynthesis(n.gait，ed.，1984)；nucleicacidhybridization(b.hames&s.higgins，eds.，1985)；transcriptionandtranslation(b.hames&s.higgins，編輯，1984)；animalcellculture(r.freshney，編輯，1986)；perbal，apracticalguidetomolecularcloning(1984)；next-generationgenomesequencing(janitz，2008wiley-vch)；pcrprotocols(methodsinmolecularbiology)(park，編輯，3^rdedition，2010humanapress)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress，1986)；thetreatise，methodsinenzymology(academicpress，inc.，n.y.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.h.miller和m.p.calos編輯，1987，coldspringharborlaboratory)；harlow和lane，antibodies，(coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1998)；immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayer和walker，編輯，academicpress，london，1987)；handbookofexperimentalimmunology，volumesi-iv(d.m.weir和ccblackwell，編輯，1986)；roitt，essentialimmunology，6thedition，(blackwellscientificpublications，oxford，1988)；embryonicstemcells：methodsandprotocols(methodsinmolecularbiology)(kurstadturksen，編輯，2002)；embryonicstemcellprotocols：volumei：isolationandcharacterization(methodsinmolecularbiology)(kurstadturksen，編輯，2006)；embryonicstemcellprotocols：volumeii：differentiationmodels(methodsinmolecularbiology)(kurstadturksen，編輯，2006)；humanembryonicstemcellprotocols(methodsinmolecularbiology)(kursadturksen編輯，2006)；mesenchymalstemcells：methodsandprotocols(methodsinmolecularbiology)(darwinj.prockop，donaldg.phinney，和brucea.bunnell編輯，2008)；hematopoieticstemcellprotocols(methodsinmolecularmedicine)(christophera.klug和craigt.jordan編輯，2001)；hematopoieticstemcellprotocols(methodsinmolecularbiology)(kevind.bunting編輯，2008)neuralstemcells：methodsandprotocols(methodsinmolecularbiology)(lesliep.weiner編輯，2008)。

某些實(shí)施方案包括包含在載體中的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定適用于本文中公開的特定事實(shí)方案的載體。典型的載體可以包含能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其相連的另一個核酸或能夠在宿主生物體中復(fù)制的核酸分子。載體的一些實(shí)例包括質(zhì)粒，病毒載體，黏粒等。一些載體能夠在其被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型(episomal)哺乳動物載體)，而其他載體可以在引入到宿主細(xì)胞中后被整合到宿主細(xì)胞的基因組中并且由此隨宿主基因組一起復(fù)制。此外，一些載體能夠指引與其可操作相連的基因的表達(dá)(這些載體可被稱為″表達(dá)載體″)。根據(jù)相關(guān)的實(shí)施方案，要進(jìn)一步理解的是，如果一種或多種試劑(例如，編碼抗原結(jié)合蛋白如car，對抗原特異的高親和重組tcr，或針對抗原特異性結(jié)合組分的抗原或抗-獨(dú)特型抗體的多核苷酸，如本文中所述)被共同施用于受試者，各試劑可以位于分開的或相同的載體中，并且可以將多個載體(各自含有不同試劑相同試劑)引入至細(xì)胞或細(xì)胞群體或施用于受試者。

在某些實(shí)施方案中，本公開的編碼抗原結(jié)合蛋白或抗原的核酸可以與載體的某些元件可操作相連。例如，影響其所連接的編碼序列的表達(dá)和加工所需的多核苷酸序列可以被可操作相連。表達(dá)控制序列可以包括合適的轉(zhuǎn)錄起始，終止，啟動子和增強(qiáng)子序列；有效的rna加工信號如剪接和多腺苷酸化信號；穩(wěn)定胞質(zhì)mrna的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列(即，kozak共有序列)；增強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性的序列；和可能地增強(qiáng)蛋白分泌的序列。如果表達(dá)控制序列與目的基因是連續(xù)的，則其可以被可操作相連，并且表達(dá)控制序列反式或遠(yuǎn)距離作用從而控制目的基因。

在特別的實(shí)施方案中，重組表達(dá)載體被遞送至合適的細(xì)胞，例如，造血干細(xì)胞，t細(xì)胞，抗原遞呈細(xì)胞(例如，樹突細(xì)胞)等。重組表達(dá)載體可以因此還包括，例如，淋巴組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(tre)如b淋巴細(xì)胞，t淋巴細(xì)胞，或樹突細(xì)胞特異性tre。淋巴組織特異性tre是本領(lǐng)域中已知的(參見，例如，thompson等，mol.cell.biol.12：1043，1992)；todd等，j.exp.med.177：1663，1993)；penix等，j.exp.med.178：1483，1993)。

除了載體以外，某些實(shí)施方案涉及包含本文中公開的載體的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本領(lǐng)域中可獲得許多合適的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以包括可以接收載體或核酸和/或蛋白整合的任何個體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，以及任何后代細(xì)胞。該術(shù)語還涵蓋宿主細(xì)胞的后代，不論在基因或表型上是相同還是不同。合適的宿主細(xì)胞可以取決于載體并且可以包括哺乳動物細(xì)胞，動物細(xì)胞，人細(xì)胞，猿細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，酵母細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。通過使用病毒載體，經(jīng)由磷酸鈣沉淀的轉(zhuǎn)化，deae-葡聚糖，電穿孔，顯微注射或其他方法，可以誘導(dǎo)這些細(xì)胞整合載體或其他材料。例如，參見sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual2ded.(coldspringharborlaboratory，1989)。

治療方法

在某些方面，本公開涉及用于治療過增生疾病或病癥(例如，表征為抗原過表達(dá))的方法，所述方法是通過向人受試者施用有效量的組合物，所述組合物包含修飾的人t細(xì)胞的群體，所述修飾的人t細(xì)胞包含編碼抗原結(jié)合蛋白的核酸分子，其中所述抗原結(jié)合蛋白包含被布置在胞外結(jié)合組分和胞內(nèi)效應(yīng)器組分之間的疏水部分；和修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合的群體，所述修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合包含編碼被抗原結(jié)合蛋白的胞外結(jié)合組分特異性識別的抗原的核酸分子。在某些實(shí)施方案中，施用步驟可以重復(fù)多次并且持續(xù)數(shù)周，數(shù)月或多達(dá)兩年以上的時間。

在某些實(shí)施方案中，過增生疾病是血液學(xué)惡性腫瘤或?qū)嶓w癌。示例性的血液學(xué)惡性腫瘤包括急性成淋巴細(xì)胞白血病(all)，急性髓細(xì)胞白血病(aml)，慢性髓細(xì)胞白血病(cml)，慢性嗜曙紅細(xì)胞白血病(cel)，骨髓增生異常綜合征(mds)，非霍奇金淋巴瘤(nhl)，或多發(fā)性骨髓瘤(mm)。示例性的實(shí)體癌包括膽管癌，膀胱癌，骨和軟組織癌，腦瘤，乳腺癌，宮頸癌，結(jié)腸癌，結(jié)直腸腺癌，結(jié)直腸癌，硬纖維瘤，胚胎癌，子宮內(nèi)膜癌，食道癌，胃癌，胃腺癌，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，婦科腫瘤，頭頸鱗狀細(xì)胞癌，肝癌，肺癌，惡性黑素瘤，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，胰腺導(dǎo)管腺癌，原發(fā)性星形細(xì)胞瘤，原發(fā)性甲狀腺癌，前列腺癌，腎癌，腎細(xì)胞癌，橫紋肌肉瘤，皮膚癌，軟組織肉瘤，睪丸生殖細(xì)胞瘤，尿道上皮癌，子宮肉瘤，或子宮癌。

在另外的方面，本公開涉及用于治療受試者中的疾病的方法，所述方法是通過(a)向受試者施用有效量的修飾的人t細(xì)胞的群體，所述修飾的人t細(xì)胞包含核酸分子，所述核酸分子編碼抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白包含被布置在胞外結(jié)合組分和胞內(nèi)效應(yīng)器組分之間的疏水部分；(b)向所述受試者施用有效量的修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合的群體，所述修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合包含編碼所述抗原的核酸分子，其中來自步驟(a)的修飾的人t細(xì)胞的抗原結(jié)合蛋白的胞外結(jié)合組分對由該步驟(b)的修飾的細(xì)胞的群體編碼的抗原具有特異性；和(c)任選地重復(fù)步驟(a)，步驟(b)或步驟(a)和(b)兩者；從而通過過繼細(xì)胞免疫療法治療疾病。

在另外的方面，本公開涉及用于改善過繼細(xì)胞免疫療法的方法，所述方法是通過(a)向受試者施用有效量的修飾的人t細(xì)胞的群體，所述修飾的人t細(xì)胞包含核酸分子，所述核酸分子編碼抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白包含被布置在胞外結(jié)合組分和胞內(nèi)效應(yīng)器組分之間的疏水部分；和(b)向所述受試者施用有效量的修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合的群體，所述修飾的人造血祖先細(xì)胞，修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其組合包含編碼所述抗原的核酸分子，其中來自步驟(a)的修飾的人t細(xì)胞的抗原結(jié)合蛋白的胞外結(jié)合組分對由該步驟(b)的修飾的細(xì)胞的群體編碼的抗原具有特異性。這些施用(如本文所述，可以重復(fù))由此提高，增大或增強(qiáng)過繼細(xì)胞免疫療法的效力。

在任意前述實(shí)施方案中，所述方法被用于治療病毒疾病，細(xì)菌疾病，癌癥，炎性疾病，免疫疾病，或年齡相關(guān)性疾病。

在任意前述實(shí)施方案中，將所述方法與編碼包含結(jié)合組分，疏水部分和胞內(nèi)效應(yīng)器組分的抗原結(jié)合蛋白的細(xì)胞一起使用。例如，結(jié)合組分可以是抗體可變片段(fv)，tcr可變結(jié)構(gòu)域，受體胞外結(jié)構(gòu)域，或配體。在另外的實(shí)施方案中，結(jié)合組分是包含可變區(qū)接頭的scfv或sctcr，如接頭包含(glyxsery)n，其中x和y獨(dú)立地是1至5的整數(shù)，并且n是1至10的整數(shù)。在另外的實(shí)施方案中，結(jié)合組分對以下各項(xiàng)具有特異性：α-甲胎蛋白(afp)，b7h4，btla，cd3，cd19，cd20，cd25，cd22，cd28，cd30，cd40，cd44v6，cd52，cd56，cd79b，cd80，cd81，cd86，cd134(ox40)，cd137(4-1bb)，cd151，cd276，ca125，cea，ceacam6，c-met，ct-7，ctla-4，egfr，egfrviii，erbb2，erbb3，erbb4，epha2，flt1，flt4，frizzled，o-乙?；?gd2，gd2，ghrhr，ghr，gitr，gp130，hvem，igf1r，il6r，kdr，l1cam，lewisa，lewisy，ltβr，lifrβ，lrp5，mage，間皮素，muc1，ny-eso-1，癌癥特異性新抗原，osmrβ，pd1，pd-l1，pd-l2，psma，ptch1，rank，robol，ror1，tert，tgfbr2，tgfbr1，tlr7，tlr9，tnfrsf4，tnfr1，tnfr2，酪氨酸酶，tweak-r，或wt-1。在這些實(shí)施方案的任一個中，來自修飾的人t細(xì)胞的抗原結(jié)合蛋白的胞外結(jié)合組分針對過表達(dá)抗原的疾病細(xì)胞。

在另外的實(shí)施方案中，疏水部分是跨膜結(jié)構(gòu)域，如cd4，cd8，cd28或cd27跨膜結(jié)構(gòu)域。

在某些實(shí)施方案中，胞內(nèi)效應(yīng)器組分包含以下各項(xiàng)的胞內(nèi)區(qū)：cd3ε，cd3δ，cd3ζ，cd25，cd27，cd28，cd79a，cd79b，cd134，cd137，card11，dap10，fcrα，fcrβ，fcrγ，fyn，hvem，icos，lck，lag3，lat，lrp，nkg2d，notch1，notch2，notch3，notch4，ror2，ryk，slamf1，slp76，ptα，tcrα，tcrβ，trim，zap70，ptch2，或其任意組合。在特別的實(shí)施方案中，胞內(nèi)效應(yīng)器組分包含cd3ζ以及cd27，cd28，cd134和cd137中的一個或多個，或胞內(nèi)效應(yīng)器組分包含lrp，notch1，notch2，notch3，notch4，ror2或ryk。

在任意前述實(shí)施方案中，所述方法提供修飾的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，如cd4+t細(xì)胞，cd8+t細(xì)胞，cd4-cd8-雙陰性t細(xì)胞，γδt細(xì)胞，調(diào)節(jié)性t細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞，樹突細(xì)胞，或其任意組合的用途。在某些實(shí)施方案中，t細(xì)胞是幼稚t細(xì)胞，中央記憶型t細(xì)胞，效應(yīng)器記憶型t細(xì)胞，或其任意組合。例如，修飾的t細(xì)胞的第一群體可以基本上由cd4+t細(xì)胞，cd8+t細(xì)胞，或cd4+和cd8+t細(xì)胞兩者組成，并且修飾的細(xì)胞的第二群體包含修飾的人造血祖先細(xì)胞。在其他實(shí)例中，修飾的t細(xì)胞的第一群體可以基本上由cd4+t細(xì)胞，cd8+t細(xì)胞，或cd4+和cd8+t細(xì)胞兩者組成，并且修飾的細(xì)胞的第二群體包含修飾的人免疫系統(tǒng)細(xì)胞，如基本上由cd4+t細(xì)胞，cd8+t細(xì)胞，或cd4+和cd8+t細(xì)胞兩者組成的細(xì)胞。

在任意前述實(shí)施方案中，所述方法提供修飾的細(xì)胞群體的用途，所述修飾的細(xì)胞群體經(jīng)由例如病毒載體如慢病毒載體或γ-反轉(zhuǎn)錄病毒載體而被在離體重組修飾。在另外的實(shí)施方案中，被修飾的細(xì)胞群體是同基因的，同種異基因的，或自體的細(xì)胞。在任意前述實(shí)施方案中，修飾的細(xì)胞群體被進(jìn)一步與如本文中所述的藥用載體，稀釋劑，或賦形劑配制在一起。

在任意前述實(shí)施方案中，所述方法包括靜脈內(nèi)施用所述修飾的細(xì)胞群體。

在任意前述實(shí)施方案中，所述方法包括向所述受試者施用多個劑量的來自步驟(a)的修飾的t細(xì)胞，多個劑量的來自步驟(b)的修飾的細(xì)胞，或其組合。例如，多個劑量的來自步驟(a)的修飾的t細(xì)胞以約一周至約四周的施用間隔施用。在某些實(shí)施方案中，將來自步驟(a)的修飾的t細(xì)胞與來自步驟(b)的修飾的細(xì)胞同時或相繼施用。在另外的實(shí)施方案中，在施用來自步驟(a)的修飾的t細(xì)胞后的約1天至約28天施用來自步驟(b)的修飾的細(xì)胞的初始劑量。

在任意前述實(shí)施方案中，所述方法包括在施用來自步驟(a)的修飾的t細(xì)胞的約24小時內(nèi)相繼地施用來自步驟(b)的修飾的細(xì)胞，或在施用來自步驟(b)的修飾的細(xì)胞的約24小時內(nèi)相繼地施用來自步驟(a)的修飾的t細(xì)胞。在具體的實(shí)施方案中，初始施用包括施用包含來自步驟(a)的修飾的t細(xì)胞和來自步驟(b)的修飾的細(xì)胞的混合物的組合物，前提是在將所述混合物施用于受試者之前，來自步驟(b)的細(xì)胞不激活來自步驟(a)的細(xì)胞。在另外的實(shí)施方案中，在施用來自步驟(a)的修飾的t細(xì)胞后的多至約365天，以一個或多個間隔以一個或多個劑量進(jìn)一步施用來自步驟(b)的修飾的細(xì)胞。在任意前述實(shí)施方案中，來自步驟(b)的修飾的細(xì)胞包含修飾的造血祖先細(xì)胞或基本上由其組成，或包含t細(xì)胞或基本上由其組成。

在任意前述實(shí)施方案中，來自步驟(a)的修飾的t細(xì)胞以約10⁶個細(xì)胞/m²至約10¹¹個細(xì)胞/m²的劑量被施用于受試者并且來自步驟(b)的修飾的t細(xì)胞被以約10⁶個細(xì)胞/m²至約10¹¹個細(xì)胞/m²的劑量施用于受試者，其中任一或兩種修飾的細(xì)胞群體的劑量可以重復(fù)，如本文中所述。

受試者中存在過增生疾病或惡性病癥是指在受試者中存在發(fā)育異常，癌性和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，包括例如瘤形成，腫瘤，非接觸抑制的或致癌轉(zhuǎn)化的細(xì)胞等(例如，實(shí)體癌；血液癌癥，包括淋巴瘤和白血病，如急性髓細(xì)胞白血病，慢性髓細(xì)胞白血病等)，其是本領(lǐng)域中已知的并且其診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)是已確定的(例如，hanahan和weinberg，2011cell144：646；hanahan和weinberg2000cell100：57；cavallo等，2011canc.immunol.immunother.60：319；kyrigideis等，2010j.carcinog.9：3)。在某些實(shí)施方案中，此種癌細(xì)胞可以是急性髓細(xì)胞白血病，b-細(xì)胞成淋巴細(xì)胞白血病，t-細(xì)胞成淋巴細(xì)胞白血病或骨髓瘤的細(xì)胞，包括能夠起始和連續(xù)移植任何所述類型的癌癥的癌癥干細(xì)胞(參見，例如，park等，molec.therap.17：219，2009)。

在另一個方面，本公開提供用于抑制惡性腫瘤(例如，實(shí)體惡性腫瘤或血液惡性腫瘤)的生長，轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移生長的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用有效量的編碼本文中提供的多肽復(fù)合體的細(xì)胞或其組合物。

本文中公開的組合物和方法適用于多種癌癥，包括實(shí)體惡性腫瘤和血液惡性腫瘤?？芍委煹陌┌Y類型包括乳腺，前列腺，胰腺，結(jié)腸和直腸的腺癌；所有形式的支氣管原肺癌(包括扁平細(xì)胞癌，腺癌，小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)；骨髓的；黑素瘤；肝細(xì)胞瘤；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；乳頭狀瘤；胺前體攝取脫羧細(xì)胞瘤(apudoma)；迷芽瘤；鰓原瘤；惡性類癌綜合征；類癌心臟??；和癌(例如，walker，基底細(xì)胞，基底扁平(basosquamous)，brown-pearce，導(dǎo)管，ehrlich腫瘤，krebs2，默克爾(merkel)細(xì)胞，粘蛋白，非小細(xì)胞肺，燕麥細(xì)胞，乳頭狀，硬癌，細(xì)支氣管，支氣管原，扁平細(xì)胞，和過渡細(xì)胞)?？芍委煹钠渌愋偷陌┌Y包括：組織細(xì)胞??；白血??；惡性組織細(xì)胞增多癥；霍奇金??；非霍奇金淋巴瘤；漿細(xì)胞瘤；網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖；黑素瘤；腎細(xì)胞癌；軟骨母細(xì)胞瘤；軟骨瘤；軟骨肉瘤；纖維瘤；纖維肉瘤；巨細(xì)胞瘤；組織細(xì)胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；間皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；顱咽管瘤；無性細(xì)胞瘤；錯構(gòu)瘤；間葉瘤；中腎瘤；肌肉瘤；成釉細(xì)胞瘤；牙骨質(zhì)瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋養(yǎng)細(xì)胞瘤。

此外，還考慮可適用于治療以下類型的癌癥：腺瘤；膽管瘤；膽脂瘤；圓柱瘤(cyclindroma)；囊腺癌；囊腺瘤；粒層細(xì)胞瘤；兩性胚細(xì)胞瘤；肝瘤；汗腺腺瘤；胰島細(xì)胞瘤；萊迪希細(xì)胞瘤；乳頭狀瘤；塞爾托利細(xì)胞瘤；黃瘤樣泡膜細(xì)胞性纖維瘤；平滑肌瘤(leimyoma)；平滑肌肉瘤；成肌細(xì)胞瘤；肌瘤(myomma)；肌肉瘤；橫紋肌瘤；橫紋肌肉瘤；室管膜瘤；神經(jīng)節(jié)瘤；膠質(zhì)瘤；髓母細(xì)胞瘤；腦膜瘤；神經(jīng)鞘瘤；神經(jīng)細(xì)胞瘤；神經(jīng)上皮瘤；神經(jīng)纖維瘤；神經(jīng)瘤；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤；非嗜鉻神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤；和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤?？芍委煹陌┌Y類型還包括血管角化瘤；血管淋巴樣增生伴嗜酸細(xì)胞增多(angiolymphoidhyperplasiawitheosinophilia)；致硬化血管瘤(angiomasclerosing)；血管瘤病；血管球瘤；血管內(nèi)皮瘤；血管瘤(hemangioma)；血管外皮細(xì)胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果體瘤；癌肉瘤；軟骨肉瘤；葉狀囊性肉瘤；纖維肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；橫紋肌肉瘤；肉瘤；腫瘤；新生纖維瘤病(neurofibromatosis)；和宮頸發(fā)育不良。

同樣可適用于本文中公開的組合物和方法的另外的示例性癌癥是b-細(xì)胞癌癥，包括b-細(xì)胞淋巴瘤[如多種形式的霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(nhl)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤]，白血病[如急性成淋巴細(xì)胞白血病(all)，慢性淋巴細(xì)胞白血病(cll)，多毛細(xì)胞白血病和慢性成肌細(xì)胞白血病]和骨髓瘤(如多發(fā)性骨髓瘤)。另外的b細(xì)胞癌癥包括小淋巴細(xì)胞淋巴瘤，b-細(xì)胞前淋巴細(xì)胞白血病，淋巴質(zhì)漿細(xì)胞淋巴瘤，脾邊緣區(qū)淋巴瘤，血漿細(xì)胞骨髓瘤，孤立性骨漿細(xì)胞瘤，骨外漿細(xì)胞瘤，黏膜相關(guān)淋巴組織(malt)的結(jié)外邊緣區(qū)b-細(xì)胞淋巴瘤，結(jié)邊緣區(qū)b-細(xì)胞淋巴瘤，濾泡淋巴瘤，套細(xì)胞淋巴瘤，彌漫性大b-細(xì)胞淋巴瘤，縱隔(胸腺)大b-細(xì)胞淋巴瘤，血管內(nèi)大b-細(xì)胞淋巴瘤，原發(fā)性滲出性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤/白血病，不確定惡性潛能的b-細(xì)胞增殖，淋巴瘤樣肉芽腫病，和移植后淋巴增生性疾病。

在某些實(shí)施方案中，可用于抑制實(shí)體惡性腫瘤的生長或?qū)嶓w惡性腫瘤或血液惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移生長的編碼抗原結(jié)合蛋白的細(xì)胞包括特異性結(jié)合腫瘤或癌細(xì)胞上的癌癥抗原和第二靶抗原的那些。

如醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，術(shù)語″治療(treat)″和“治療(treatment)”是指受試者(即，患者，宿主，其可以是人或非人動物)的疾病，病癥或癥狀的醫(yī)療處理(參見，例如，stedman’smedicaldictionary)。通常，合適的劑量和治療方案提供一種或多種抗原結(jié)合蛋白(例如，car)或?qū)θ税锌乖哂刑禺愋缘母哂H和性重組tcr，表達(dá)其的宿主t細(xì)胞，和任選地輔助治療(例如，細(xì)胞因子如il-2，il-15，il-21或其任意組合)，其量足以提供治療或預(yù)防益處。治療性治療或預(yù)防性或防止性方法所產(chǎn)生的治療或預(yù)防益處包括，例如改善的臨床結(jié)果，其中目的是防止或延遲或以其他方式減弱(例如，相對于未治療的對照以具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的方式降低)非所需的生理學(xué)改變或病癥，或防止或延遲或以其他方式減弱此種疾病或病癥的擴(kuò)張或嚴(yán)重度。治療受試者產(chǎn)生的有益的或所需的臨床結(jié)果包括消除，減輕或緩解所治療的疾病或病癥產(chǎn)生的或與其相關(guān)的癥狀；減少癥狀的出現(xiàn)；提高生活質(zhì)量；更長的無病狀態(tài)(即，降低受試者呈現(xiàn)作為進(jìn)行疾病診斷基礎(chǔ)的癥狀的可能性或傾向)；減弱疾病的程度；穩(wěn)定(即，不惡化)疾病的狀態(tài)；延遲或減慢疾病進(jìn)展；改善或減輕疾病狀態(tài)；和消退(部分或全部)，不管是可檢測的還是不可檢測的；或總體存活。

″治療″也可以表示：與受試者不接受治療的情況下的預(yù)期存活相比，存活延長。需要本文中所述方法和組合物的受試者包括已經(jīng)患有疾病或病癥的那些，以及傾向于發(fā)展疾病或病癥或具有其風(fēng)險的受試者。需要預(yù)防治療的受試者包括要在其中預(yù)防疾病，病癥或癥狀(即，減小疾病或病癥發(fā)生或復(fù)發(fā)的可能性)的受試者。本文中所述的組合物(及包含所述組合物的制劑)和方法提供的臨床益處可以通過以下方式評估：設(shè)計(jì)和進(jìn)行體外測定，臨床前研究，和意在受益于組合物施用的受試者中的臨床研究，如實(shí)施例中所述。

表達(dá)對人疾病相關(guān)抗原具有特異性的抗原結(jié)合蛋白或高親和性重組tcr的細(xì)胞，以及表達(dá)靶抗原的細(xì)胞，如本文中所述，可以以在藥物或生理學(xué)可用或適當(dāng)?shù)馁x形劑或載體中的形式被施用于受試者。藥物可用賦形劑是生物學(xué)相容性載體，例如，生理鹽水，其在本文中被詳細(xì)描述，其適用于向人或其他非人哺乳動物對象施用。

治療有效劑量是能夠在治療的人或非人哺乳動物中產(chǎn)生臨床上所需的結(jié)果的用于過繼轉(zhuǎn)移的宿主t細(xì)胞(表達(dá)對人疾病相關(guān)抗原具有特異性的抗原結(jié)合蛋白或高親和性重組tcr)和表達(dá)靶抗原的細(xì)胞的量(即，足以以在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的方式引起或增強(qiáng)針對過表達(dá)抗原的細(xì)胞的特異性t細(xì)胞免疫應(yīng)答(例如，細(xì)胞毒性t細(xì)胞反應(yīng))的量)。如醫(yī)藥領(lǐng)域中已知的，任一患者的劑量取決于許多因素，包括患者大小，重量，體表面積，年齡，施用的具體治療，性別，給藥時間和途徑，總體健康和同時施用的其他藥物。劑量可以變化，但是施用如本文中所述的包含重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的優(yōu)選劑量為約10⁶個細(xì)胞/m²，約5x10⁶個細(xì)胞/m²，約10⁷個細(xì)胞/m²，約5x10⁷個細(xì)胞/m²，約10⁸個細(xì)胞/m²，約5x10⁸個細(xì)胞/m²，約10⁹個細(xì)胞/m²，約5x10⁹個細(xì)胞/m²，約10¹⁰個細(xì)胞/m²，約5x10¹⁰個細(xì)胞/m²，或約10¹¹個細(xì)胞/m²。

藥物組合物可以以如由醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員確定的適合于要治療(或預(yù)防)的疾病或病癥的方式施用。組合物施用的適當(dāng)劑量和合適的持續(xù)時間和頻率將由以下因素決定：患者的健康狀況，患者的大小(即，重量，質(zhì)量或體面積)，患者疾病的類型和嚴(yán)重度，活性成分的特定形式，和給藥方法。通常，適當(dāng)?shù)膭┝亢椭委煼桨柑峁┑慕M合物的量足以提供治療和/或預(yù)防益處(如本文中所述的，包括改善的臨床結(jié)果，如更高頻率的完全或部分消退，或更長的無病和/或總體存活，或減輕癥狀嚴(yán)重度)。對于預(yù)防性用途，劑量應(yīng)當(dāng)足以預(yù)防與疾病或病癥相關(guān)的疾病，延遲其發(fā)作，或減輕其嚴(yán)重度。根據(jù)本文中所述方法施用的免疫原性組合物的預(yù)防性益處可以通過進(jìn)行臨床前(包括體外和體內(nèi)動物研究)和臨床研究并分析由其獲得的數(shù)據(jù)確定，所述數(shù)據(jù)的獲得是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地實(shí)施的適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)，生物學(xué)和臨床方法和技術(shù)。

與抗原過表達(dá)相關(guān)的癥狀包括任何這樣的疾病或病癥，其中抗原相關(guān)細(xì)胞或分子事件的活性缺乏，活性過度或不正?；钚源嬖?，并且典型地由受影響的細(xì)胞(例如，白血病細(xì)胞)中與正常細(xì)胞相比不正常高的(具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性)水平的抗原表達(dá)所致。具有此種疾病或病癥的受試者將受益于利用本文所述的實(shí)施方案的組合物或方法的治療。一些與抗原過表達(dá)相關(guān)的病癥因此可以包括急性以及慢性病癥和疾病，如使受試者易患特定疾病的那些病理學(xué)癥狀。

一些與抗原過表達(dá)相關(guān)的病癥的實(shí)例包括過增生疾病，其是指受試者中激活的和/或增殖的細(xì)胞(其也可以是在轉(zhuǎn)錄方面活性過度的)的狀態(tài)，包括腫瘤，贅生物，癌癥，惡性腫瘤等。除了激活的和/或增殖的細(xì)胞以外，過增生疾病還可以包括細(xì)胞死亡過程的異?；蚴д{(diào)，不論是通過壞死還是凋亡。細(xì)胞死亡過程的此種異?？梢耘c多種病癥相關(guān)，包括癌癥(包括原發(fā)性、次生性惡性腫瘤以及轉(zhuǎn)移瘤)或其他病癥。

根據(jù)某些實(shí)施方案，實(shí)際上表征為抗原表達(dá)或過表達(dá)的任何類型的癌癥都可以通過使用本文中公開的組合物和方法治療，所述癌癥類型包括血液學(xué)癌癥(例如，白血病，包括急性髓細(xì)胞白血病(aml)，t或b細(xì)胞淋巴瘤，骨髓瘤等)。此外，″癌癥″可以是指任何加速的細(xì)胞增殖，包括實(shí)體瘤，腹水瘤，血液或淋巴或其他惡性腫瘤；結(jié)締組織惡性腫瘤；轉(zhuǎn)移疾病；器官或干細(xì)胞移植后的最小殘留疾病；多抗藥性癌癥，原發(fā)性或繼發(fā)性惡性腫瘤，與惡性腫瘤相關(guān)的血管發(fā)生，或其他形式的癌癥。在本發(fā)明公開的實(shí)施方案內(nèi)還考慮具體的實(shí)施方案，其中僅包括一種上述類型的疾病，或其中具體病癥可以被排除而不管其是否表征為靶抗原過表達(dá)。

本文中考慮的某些治療或預(yù)防方法包括施用宿主細(xì)胞(其可以是自體的，同種異基因的或同基因的)，所述宿主細(xì)胞包含所需的如本文中所述的核酸分子，所述核酸分子被穩(wěn)定地整合到細(xì)胞的染色體中。例如，此種細(xì)胞組合物可以在體外使用自體的，同種異基因的或同基因的免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞，抗原遞呈細(xì)胞，天然殺傷細(xì)胞)產(chǎn)生從而將所需的靶向抗原的t-細(xì)胞組合物與表達(dá)抗原的細(xì)胞組合物一起施用于受試者作為過繼免疫療法。

當(dāng)在本文中使用時，組合物或治療的施用是指將其遞送至受試者，不管遞送途徑或方式如何。施用可以連續(xù)地或間歇地并且腸胃外地實(shí)施。施用可以是用于治療已被確認(rèn)為患有認(rèn)可的癥狀，疾病或疾病狀態(tài)的受試者，或用于治療易具有此種癥狀，疾病或疾病狀態(tài)或有發(fā)展出此種癥狀，疾病或疾病狀態(tài)的風(fēng)險的受試者。與輔助性治療共同施用可以包括以任何次序和以任何用藥方案同時和/或順序遞送多種試劑(例如，抗原特異性重組宿主t細(xì)胞和表達(dá)抗原的細(xì)胞以及一種或多種細(xì)胞因子；免疫抑制治療如鈣神經(jīng)素抑制劑，皮質(zhì)類固醇，微管抑制劑，低劑量的霉酚酸前藥，或其任意組合)。

在某些實(shí)施方案中，多個劑量的如本文中所述的重組宿主t細(xì)胞被施用于受試者，其可以約兩周至約四周的施用間隔施用，并且受試者可以被任選地與重組(修飾的)t細(xì)胞的施用同時地、共同或相繼地施用以如本文中所述的表達(dá)抗原的細(xì)胞。在另外的實(shí)施方案中，細(xì)胞因子被相繼地施用，前提是在細(xì)胞因子施用前受試者被施用以重組宿主t細(xì)胞至少三或四次。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞因子被皮下施用(例如，il-2，il-15，il-21)。在另外的實(shí)施方案中，受治療的受試者還接受免疫抑制治療，如鈣神經(jīng)素抑制劑，皮質(zhì)類固醇，微管抑制劑，低劑量的霉酚酸前藥，或其任意組合。在另外的實(shí)施方案中，受治療的受試者已經(jīng)接受了非骨髓根除或骨髓根除造血細(xì)胞移植(例如，自體的，同種異基因的)，其中所述治療可以在骨髓根除或非骨髓根除造血細(xì)胞移植后至少兩個月至至少三個月被施用。

治療或藥物組合物的有效量是指足以在所需的劑量并且在所需的時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)如本文中所述的理想的臨床結(jié)果或有益治療的量。有效量可以在一次或多次施用中被遞送。如果施用是向已知或被確認(rèn)具有疾病或疾病狀態(tài)的受試者，則術(shù)語″治療量″可以關(guān)于治療使用，而″預(yù)防有效量″可以用以描述向易具有疾病或疾病狀態(tài)(例如，復(fù)發(fā))或具有發(fā)展出疾病或疾病狀態(tài)(例如，復(fù)發(fā))的風(fēng)險的受試者施用有效量作為預(yù)防性措施。

car-ctl免疫應(yīng)答的水平可以通過本文中描述的和本領(lǐng)域中常規(guī)實(shí)施的多種免疫學(xué)方法中的任一種確定。car-ctl免疫應(yīng)答的水平可以在施用任一本文所述的修飾的造血干細(xì)胞，免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如，t細(xì)胞)或其任意組合之前和之后確定。用于確定ctl活性的細(xì)胞毒性測定可以使用本領(lǐng)域中常規(guī)實(shí)施的若干技術(shù)和方法中的任一種進(jìn)行(參見，例如，henkart等，″cytotoxict-lymphocytes″infundamentalimmunology，paul(ed.)(2003lippincottwilliams&wilkins，philadelphia，pa)，1127-50頁，及其中引用的參考文獻(xiàn))。

抗原特異性t細(xì)胞反應(yīng)典型地通過根據(jù)任何本文中所述的t細(xì)胞功能參數(shù)(例如，增殖，細(xì)胞因子釋放，ctl活性，改變的細(xì)胞表面標(biāo)志物表型等)比較觀察到的t細(xì)胞反應(yīng)來確定，所述比較可以在暴露于在適當(dāng)環(huán)境中的同源抗原(例如，用于引發(fā)或激活修飾的t細(xì)胞的抗原或ag-apc)的t細(xì)胞和代替地暴露于結(jié)構(gòu)上不同或不相關(guān)的對照抗原的來自相同來源群體的t細(xì)胞之間進(jìn)行。與對照抗原的反應(yīng)相比，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更大的對同源抗原的反應(yīng)表示抗原特異性。

生物學(xué)樣品可以獲得自受試者以用于確定如本文中所述的免疫應(yīng)答的存在和水平。當(dāng)在本文中使用時，″生物學(xué)樣品″可以是血液樣品(由其可制備血清或血漿)，活檢樣本，體液(例如，肺灌洗液，腹水，黏膜洗液，滑液)，骨髓，淋巴結(jié)，組織外植體，器官培養(yǎng)物或來自受試者或生物學(xué)來源的任何其他組織或細(xì)胞制劑。生物學(xué)樣品也可以獲得自接受任何免疫原性組合物之前的受試者，所述生物學(xué)樣品可用作對照用以確定基線(即，免疫療法前的)數(shù)據(jù)。

本文中公開的藥物組合物可以被提供于單位劑量或多劑量容器(如密封的安瓿或小瓶)中。此種容器可以被冷凍以保持制劑的穩(wěn)定性直至。在某些實(shí)施方案中，單位劑量包含的如本文中所述的重組宿主細(xì)胞的劑量為約10⁶個細(xì)胞/m²至約10¹¹個細(xì)胞/m²。開發(fā)合適的用藥和治療方案以用于將本文中所述的特定組合物用于多種治療方案中，包括例如，腸胃外或靜脈內(nèi)施用或制劑。

如果在腸胃外施用所述受試者組合物，則所述組合物還可以包含無菌的含水或油質(zhì)溶液或懸浮液。合適的無毒性腸胃外可用的稀釋劑或溶劑包括水，林格溶液，等滲鹽溶液，1，3-丁二醇，乙醇，丙二醇或聚乙二醇(與水的混合物)。水溶液或水性懸浮液還可以包含一種或多種緩沖劑，如乙酸鈉，檸檬酸鈉，硼酸鈉或酒石酸鈉。當(dāng)然，任何用于制備任何劑量單位制劑的物質(zhì)應(yīng)當(dāng)是藥物純的并且在所用的量應(yīng)當(dāng)是基本上無毒性的。此外，活性化合物可以被結(jié)合到持續(xù)釋放制劑和劑型中。當(dāng)在本文中使用時，劑量單位形式是指適用作受治受試者的單一劑量的物理上離散的單位；各單位可以包含經(jīng)計(jì)算的預(yù)定量的重組細(xì)胞或活性物質(zhì)以與合適的藥物載體一起產(chǎn)生所需的治療效果。

通常，合適的劑量和治療方案提供的活性分子或細(xì)胞的量足以提供治療或預(yù)防性益處。此種反應(yīng)可以通過與未治療的受試者相比確定受治療的受試者中改善的臨床結(jié)果(例如，更高頻率的消退，完全或部分，或更長的無病存活)來監(jiān)測。對腫瘤蛋白的預(yù)先存在的免疫應(yīng)答的提高通常與改善的臨床結(jié)果相關(guān)。此種免疫應(yīng)答通常可以使用標(biāo)準(zhǔn)增殖，細(xì)胞毒性或細(xì)胞因子測定評估，所述測定是本領(lǐng)域中常規(guī)的并且可以使用獲得自治療前后的受試者的樣品進(jìn)行。

實(shí)施例

實(shí)施例1

針對過繼轉(zhuǎn)移免疫療法的ror1car-t細(xì)胞的表征

人和獼猴4-1bb和cd3ζ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子是高度保守的(95％)，并且cd3ζ的基于免疫受體酪氨酸的激活基序有100％同一性。為了保證ror1car在獼猴t細(xì)胞中起作用，給t細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)以編碼人或獼猴4-1bb和cd3ζ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的ror1car，并且評估ror1⁺靶細(xì)胞的識別。為了提供選擇標(biāo)志物以純化轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細(xì)胞，將編碼獼猴tcd19的序列結(jié)合到載體中t2a核糖體滑動元件的下游(berger等，j.med.primatol.40：88，2011)。轉(zhuǎn)導(dǎo)有含人4-1bb/cd3ζ的ror1car或含獼猴4-1bb/cd3ζ的ror1car的獼猴t細(xì)胞對k562/ror1腫瘤細(xì)胞的識別是相當(dāng)?shù)?圖1a)。因此，利用含人信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體的體內(nèi)安全性研究被用于檢測該載體的潛在的臨床翻譯。

對于過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，外周血樣品獲得自三只成年獼猴，并且來自各動物的pbmc被用抗-cd3/cd28mab刺激，然后用ror1car反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞。通過tcd19的共表達(dá)測量的cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞的平均轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為28.2％(6.6-58.1％)并且轉(zhuǎn)導(dǎo)后4-5天的免疫-磁性選擇使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞富集至大于90％的純度(圖1b)。在擴(kuò)大后，進(jìn)行第二免疫-磁性選擇以純化cd4⁺和cd8⁺car-t細(xì)胞，并且將各亞組分別擴(kuò)大以允許配制1∶1混合物。這保證在各過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中的均一的ror1car-t細(xì)胞組合物。此外，產(chǎn)生被修飾成表達(dá)egfrt或tcd34的自體的cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞，并且制備成轉(zhuǎn)導(dǎo)了對照的cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞的1∶1混合物以用于與ror1car-t細(xì)胞共灌輸。

在與k562/ror1細(xì)胞共培養(yǎng)后，通過細(xì)胞毒性，增殖和細(xì)胞因子-釋放測定確定ror1car在cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞中的功能。與cd4⁺ror1car-t細(xì)胞相比，cd8⁺ror1car-t細(xì)胞溶解k562/ror1靶標(biāo)的效率更高(圖1c)，并且兩個亞組都擴(kuò)增并產(chǎn)生細(xì)胞因子以特異性地響應(yīng)于k562/ror1細(xì)胞(圖1d)。

實(shí)施例2

ror1car-t細(xì)胞在體內(nèi)是有功能的

為了確定是否可以安全地轉(zhuǎn)移自體ror1car-t細(xì)胞并且為了分析其體內(nèi)持久性和遷移，將1x10⁸個ror1car-t細(xì)胞/kg(cd4∶cd8之比為1∶1)的劑量施用于單只獼猴。該細(xì)胞劑量低于安全施用于獼猴的cmv特異性t細(xì)胞的劑量，但是等于或超過在用于cdl9⁺b細(xì)胞惡性腫瘤的car-t細(xì)胞療法的臨床試驗(yàn)中使用的劑量(maus等，blood123：2625，2014)。同時，向細(xì)胞持久性和遷移的對照施用相同劑量的egfrt⁺t細(xì)胞。在t細(xì)胞灌輸后監(jiān)測動物的發(fā)熱，呼吸窘迫，食欲，腹瀉和體重?fù)p失，并在灌輸前后檢測血液樣品的cbc，血清化學(xué)和細(xì)胞因子水平。在該細(xì)胞劑量沒有觀察到立即或延遲的臨床異常。除了在t-細(xì)胞灌輸前為了鎮(zhèn)靜動物而肌肉內(nèi)(i.m.)注射克他命(ketamine)后在獼猴中觀察到的來源于肌肉的肌氨酸磷酸激酶(cpk)的短暫增加以外，體重，cbc和血清化學(xué)保持在正常限度內(nèi)(圖2a)。ifn-γ和il-6的血漿水平在ror1car-t細(xì)胞后第1天升高，但是到第3天回到正常(圖2b)。在向單獨(dú)的動物轉(zhuǎn)移高5倍細(xì)胞劑量的僅轉(zhuǎn)導(dǎo)有標(biāo)志物基因的自體t細(xì)胞后，沒有觀察到ifn-γ和il-6的增加(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明灌輸ror1car-t細(xì)胞后升高的細(xì)胞因子水平反映了體內(nèi)car-t細(xì)胞的瞬時激活。

對ror1car-t細(xì)胞和對照t細(xì)胞在血液中的頻率的分析揭示了在灌輸后最早的時間點(diǎn)開始的差異。在灌輸后一天在血液中檢測到的ror1car-t細(xì)胞的頻率為0.3％的cd4⁺和0.8％的cd8⁺t細(xì)胞(7個細(xì)胞/μl和6個細(xì)胞/μl)，并且在隨后的2周保持在4-11個細(xì)胞/μl的水平。對照cd4⁺和cd8⁺egfrt⁺t細(xì)胞在第1天的頻率更高(6.2％的cd4⁺和4.6％的cd8⁺t細(xì)胞，對應(yīng)于137個細(xì)胞/μl和36個細(xì)胞/μl)。在隨后的4周時間，egfrt⁺t細(xì)胞逐漸衰減至6-13個細(xì)胞/μl的穩(wěn)定水平(圖2c-d)。對轉(zhuǎn)基因特異性序列的qpcr分析確認(rèn)不同模式的體內(nèi)持久性(圖2e)。

持久性數(shù)據(jù)指示，ror1car-t細(xì)胞可能從血液遷移，可能到可以表達(dá)ror1的組織中。之前證明，骨髓(bm)中不成熟b細(xì)胞的亞組表達(dá)ror1并且過繼轉(zhuǎn)移的獼猴t細(xì)胞遷移至bm和淋巴結(jié)(ln)(hudecek等，blood116：4532，2010)。因此，檢測在灌輸前以及在灌輸后第5天獲得的bm和ln樣品的等分試樣是否存在ror1⁺b細(xì)胞和轉(zhuǎn)移的t細(xì)胞兩者。egfrt⁺和ror1car-t細(xì)胞存在于灌輸后第5天的bm和ln樣品中，但是存在的ror1car-t細(xì)胞的頻率是對照egfrt⁺t細(xì)胞的1.1-2.3倍(圖3a)。用于檢測cd19⁺cd45^intermediateb細(xì)胞的亞組的門控策略被用于bm細(xì)胞懸浮液，所述懸浮液含有在人中表達(dá)ror1的前-bii-大階段的b-細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。在t-細(xì)胞灌輸前獲得的bm中的cd19⁺cd45^intermediateb細(xì)胞(8.3％)的亞組上檢測ror1表達(dá)，并且該亞組在轉(zhuǎn)移ror1car-t細(xì)胞后第5天獲得的bm樣品中被除去(圖3b)。ror1^-的外周血cd19⁺b細(xì)胞的計(jì)數(shù)證明在研究的28天里ror1car-t細(xì)胞對成熟cd19⁺b細(xì)胞庫沒有影響(圖3c)。這些結(jié)果證明，轉(zhuǎn)移的ror1car-t細(xì)胞遷移至bm并識別和除去ror1⁺b-細(xì)胞前體，但是并不引起器官毒性或減少循環(huán)的成熟b細(xì)胞。

為了確認(rèn)ror1car-t細(xì)胞在體內(nèi)保持功能性，將在灌輸后一周獲得的pbmc用k562/ror1細(xì)胞，pma/離子霉素，或單獨(dú)的培養(yǎng)基刺激。灌輸前pbmc和ror1car-t細(xì)胞充當(dāng)測定中的對照。刺激4小時后，分析所述細(xì)胞的cd107a表達(dá)，cd107a是通過cd8⁺t細(xì)胞的抗原識別后脫粒的標(biāo)志物(chan和kaur，j.immunol.methods325：20，2007)。在刺激后在體內(nèi)持續(xù)的cd8⁺ror1car-t細(xì)胞亞組中檢測到cd107a表達(dá)的增加，并且該增加的水平與在灌輸前在ror1car-t細(xì)胞中觀察到的水平類似(圖3d)。因此，在體內(nèi)在血液內(nèi)持續(xù)的轉(zhuǎn)移的ror1car-t細(xì)胞仍然具有功能，這指示b-細(xì)胞前體消耗后觀察到的器官毒性的缺少不是由于ror1car-t細(xì)胞的功能障礙。

實(shí)施例3

在體內(nèi)ror1car-t細(xì)胞響應(yīng)抗原

更高car-t細(xì)胞劑量的灌輸對于治療ror1⁺惡性腫瘤可能是必需的并且可能對正常組織顯示毒性，特別是如果體內(nèi)通過識別表達(dá)高水平ror1的腫瘤細(xì)胞而使car-t細(xì)胞被激活。在獼猴中b細(xì)胞上的ror1-表達(dá)的分析期間，觀察到，與人不同，一些動物在ln中具有高頻率的表達(dá)ror1的成熟b細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。選擇兩只在ln中具有高水平的ror1⁺b細(xì)胞的動物用于更高劑量(5x10⁸/kg)的ror1car-t細(xì)胞的安全性分析，因?yàn)榈谝恢粍游镏械谋憩F(xiàn)表明ror1⁺b細(xì)胞的減少為car-t細(xì)胞的體內(nèi)功能提供替代方案。將tcd34用作這些動物中的對照t細(xì)胞中的標(biāo)志物基因，因?yàn)閏d34富集比egfrt選擇更有效，這有助于獲得該實(shí)驗(yàn)所需的更高的t-細(xì)胞劑量。為了使體內(nèi)激活ror1car-t細(xì)胞可以顯示毒性的可能性最大化，如果之前沒有觀察到毒性，則使用施用car-t細(xì)胞后5天被轉(zhuǎn)染成表達(dá)細(xì)胞-表面tror1的的自體t細(xì)胞的灌輸(圖4a)。

更高劑量的ror1car-t細(xì)胞被很好地耐受并且雖然cd4⁺和cd8⁺ror1car-t細(xì)胞在兩種動物中都可被容易地檢測到，但是與對照tcd34t細(xì)胞相比，在過繼轉(zhuǎn)移后一天在血液中再次觀察到ror1car-t細(xì)胞的頻率減小(圖4b)。峰值頻率的差異不反映可能影響遷移的標(biāo)志物基因的獨(dú)特性質(zhì)，因?yàn)閷φ談游镏袃H用tcd19或tcd34標(biāo)記的t細(xì)胞的共灌輸在體內(nèi)提供同等高水平的兩種群體(數(shù)據(jù)未顯示)。

針對轉(zhuǎn)移的t細(xì)胞的存在，對來自獲得自灌輸后第3天的各動物的pbmc，bm和ln的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行染色。在兩種動物中，ror1car-t細(xì)胞在bm中的出現(xiàn)頻率比在pbmc中更高，但是對照tcd34⁺t細(xì)胞卻不是這樣，并且ror1car-t細(xì)胞在ln中的頻率超過了對照tcd34⁺t細(xì)胞的頻率(圖4c)。在過繼轉(zhuǎn)移后第3天bm和ln中ror1car-t細(xì)胞的積聚符合與處理前的bm和ln相比ror1⁺b細(xì)胞＞65％-80％的減少(參見圖4d和4e)。這些數(shù)據(jù)與在用較低劑量的ror1car-t細(xì)胞處理的第一只動物中觀察到的數(shù)據(jù)一致，并且顯示轉(zhuǎn)移的ror1car-t細(xì)胞自血液中遷移出并且積聚在存在ror1⁺b細(xì)胞的位點(diǎn)。

為了確定體內(nèi)系統(tǒng)性激活ror1car-t細(xì)胞是否可能顯示毒性，將被轉(zhuǎn)導(dǎo)成表達(dá)tror1的自體t細(xì)胞(tror⁺t細(xì)胞)灌輸?shù)礁鲃游镏小Ｔ隗w外，自體ror1car-t細(xì)胞對tror1-修飾的t細(xì)胞的識別與對k562/ror1細(xì)胞一樣有效(數(shù)據(jù)未顯示)。tror⁺t細(xì)胞的灌輸在任一動物中都不引起急性副作用，并且觀察到在5-7天的時間里，cd4⁺和cd8⁺ror1car-t細(xì)胞分別增加至30個細(xì)胞/μl和52個細(xì)胞/μl(a13011)，以及22個細(xì)胞/μl和34個細(xì)胞/μl(a13002)(圖5a)。這表示在內(nèi)源性或tcd34標(biāo)記的cd4⁺和cd8⁺t細(xì)胞的數(shù)目基本不變的情況下ror1car-t細(xì)胞多達(dá)7.7倍(a13011)和4.3倍(a13002)的增加(圖5a-b)。為了確定在體內(nèi)ror1car-t細(xì)胞是否消除tror⁺t細(xì)胞，檢測t-apc激發(fā)后第1，5和7天獲得的pbmc樣品是否存在循環(huán)tror⁺t細(xì)胞。在a13011中，在轉(zhuǎn)移后第1天，tror⁺t細(xì)胞的出現(xiàn)頻率為1.0％的cd8⁺t細(xì)胞，并且這些細(xì)胞中的大部分與輸入tror1⁺t細(xì)胞相比僅顯示低水平的ror1表達(dá)(圖5c)。重要地，到第5天和第7天，ror1^低t細(xì)胞分別進(jìn)一步衰減至0.3％和＜0.1％的cd8⁺t細(xì)胞的頻率(圖5c)。在a13002中觀察到類似模式的tror⁺t細(xì)胞持久性，其中僅很少的ror1^低t細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)(數(shù)據(jù)未顯示)。相比而言，在向動物灌輸這些t細(xì)胞后的第1，5和7天，tror1⁺t細(xì)胞在血液中的頻率為5.5％，8.6％和8.0％，而沒有可檢測的ror1car-t細(xì)胞(圖5c和5d)。

總而言之，這證明表達(dá)被car修飾的t細(xì)胞識別的相同抗原的重組制備的″抗原遞呈細(xì)胞″(在此情況中為產(chǎn)生抗原的t細(xì)胞，但是其他免疫系統(tǒng)細(xì)胞并且甚至是造血干細(xì)胞都可以被用作apc)能夠促進(jìn)或增強(qiáng)過繼轉(zhuǎn)移免疫療法。

以上描述的各種實(shí)施方案可以被組合以提供進(jìn)一步的實(shí)施方案。本說明書中提及的和/或在申請數(shù)據(jù)表中列出的所有美國專利，美國專利申請公布，美國專利申請，外國專利，外國專利申請和非專利出版物通過引用完整地結(jié)合于此。如有需要，實(shí)施方案的各個方面可以被改變成采用不同專利，申請和出版物的概念以提供進(jìn)一步的實(shí)施方案。

根據(jù)以上詳述，對實(shí)施方案可以進(jìn)行這些和其他改變。總體上，在以下權(quán)利要求中，使用的術(shù)語不應(yīng)當(dāng)被視為將權(quán)利要求限制到說明書和權(quán)利要求中公開的具體實(shí)施方案，而是應(yīng)當(dāng)被視為包括所有可能的實(shí)施方案以及所述權(quán)利要求所給予的全部等效范圍。因此，權(quán)利要求不受本公開的限制。