專利名稱：特異于類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供能夠結(jié)合類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendrticcells，pDC)的免疫學(xué)試劑(抗體)，表達(dá)這種抗體的細(xì)胞系以及利用這種抗體從包含pDC的組織鑒定和純化類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是引發(fā)T細(xì)胞依賴的免疫應(yīng)答的抗原呈遞細(xì)胞(APC)(Steinman，1991，Ann.Rev.Immunol.9271-296)。在人類中，類漿細(xì)胞DC(pDC)是DC亞型，其特征在于它們的超微結(jié)構(gòu)類似于分泌Ig的漿細(xì)胞(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185(6)1101-1111)，它們獨(dú)特的表面表型(CD4+IL-3R++CD45RA+HLA-DR+)(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185(6)1101-1111；Facchetti等人，1999，Histopathology 35(1)88-9；Res等人，1999，Blood 94(8)2647-57)，以及它們應(yīng)答病毒或包含特定CpG基序的寡脫氧核苷酸(ODN)刺激而產(chǎn)生高水平IFNα的能力(Siegal等人，1999，Science 284(5421)1835-7；Kadowaki等人，2001，J Immunol 166(4)2291-5)以及體外有效誘導(dǎo)遭遇病毒后幼稚T細(xì)胞的啟動(dòng)(priming)和Th-1極化(Cella等人，2000，Nat Immunol 1(4)305-10；Kadowaki等人，2000，J Exp Med192(2)219-26)。據(jù)認(rèn)為pDC起源于T細(xì)胞和B細(xì)胞的共同前體(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185，61101-1111；Res等人，1999.Blood 94，82647-57；Res等人，1999，Blood 94(8)2647-57；Bruno等人，1997，J.Exp.Med.185875-884；Bendriss-Vermare等人，2001，JCI 107835；Spits等人，2000，J.Exp.Med.192(12)1775-84)。
在小鼠中，最近已經(jīng)有幾個(gè)小組將pDC鑒定為CD11clowB220hiGr1low細(xì)胞，其能夠應(yīng)答病毒刺激而產(chǎn)生I型的IFN，平且顯示出類漿細(xì)胞形態(tài)學(xué)(Nakano等人，2001，J.Exp Med，194(8)1171-8；Paturel等人，2001，Nat Immunol.2(12)1144-1150；Bjorck，2001，Blood 98(13)3520-6)。也可通過(guò)在存在FLT3L時(shí)，使骨髓細(xì)胞分化成為樹(shù)突狀細(xì)胞而在體外大量地獲得小鼠pDC。
除其形態(tài)學(xué)、其IFNα產(chǎn)生及其假定的起源外，pDC在其弱的吞噬活性(Grouard等人，1997，J.Exp.Med.185，61101-1111)、其弱的IL-12生產(chǎn)能力(Rissoan等人，1999，Science 2831183-1186)，和誘導(dǎo)其活化的信號(hào)(Kadowaki等人，2001，J.Immunol 166(4)2291-5)方面與骨髓的DC有所不同。雖然活化pDC的募集將通過(guò)幼稚T細(xì)胞活化而引發(fā)免疫性，然而已經(jīng)報(bào)道不成熟的或失活的DC可能通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)T細(xì)胞而誘導(dǎo)免疫耐受性(Jonuleit等人，2001，Trends Immunol.22394；Bell等人，2001，Trends Immunol 2211，Ronearolo等人，2001，JEM 193F5；Jonuleit等人，2000，JEM 1621213)。此外，已經(jīng)顯示pDC誘導(dǎo)分泌IL-10的T細(xì)胞(Rissoan等人，1999，Science 2831183；Liu等人，2001，Nature Immunol 2585)和CD8調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Gilliet等人，2002，J.ExpMed.195(6)695-704)。也已經(jīng)顯示人天然產(chǎn)生IFN的細(xì)胞(HuIPC)在活化自然殺傷(NK)細(xì)胞以殺死受病毒感染的細(xì)胞中起重要作用(Bandyopadhyay等人，1986，J.Exp Med 164(1)180-95)。此外，最近pDC已經(jīng)與自身免疫疾病，特別是紅斑狼瘡相關(guān)(Farkas等人，2001，Am.J.Pathol.159(1)237-43)。
I型干擾素(IFN-α、β或ω)在寄主對(duì)病毒或微生物感染的抗性中發(fā)揮中心作用(Pfeffer等人，1998，Cancer Res 58(12)2489-99；van denBroek等人，1995，Immunol Rev 69(8)4792-6)。最近已經(jīng)在MCMV和VSV感染模型中體內(nèi)證明了pDC在病毒感染中的重要作用(Dalod等人，2002，J Exp Med 195(4)517-28；Barchet等人，2002，J Exp Med195(4)507-16)。實(shí)際上，當(dāng)缺乏小鼠pDC時(shí)，在感染MCMV的小鼠中IFNα的水平顯著降低。在該研究中，用于排空pDC的抗-Gr1處理可能除排空嗜中性粒細(xì)胞外，也可能減少部分巨噬細(xì)胞和活化T細(xì)胞。然而，因?yàn)樗羞@些細(xì)胞不在體外產(chǎn)生IFN-α，并且T或B淋巴細(xì)胞不是體內(nèi)產(chǎn)生IFN-α所需要的，這些數(shù)據(jù)證明要么MIPC是能夠應(yīng)答MCMV感染而體內(nèi)產(chǎn)生I型IFN的唯一細(xì)胞，要么I型IFN的初期產(chǎn)量是為從其他細(xì)胞類型引發(fā)IFN級(jí)聯(lián)生成所必需的(Dalod等人，2002，J Exp Med195(4)p.517-28)。
在人類中，已經(jīng)顯示靜止的pDC特異表達(dá)BDCA-2和BDCA-4(Dzionek等人，2000，J.Immunol.165(11)6037-46)。在小鼠中，迄今為止還沒(méi)有鑒定出這種特異的標(biāo)記物。為了監(jiān)測(cè)、表征和分離pDC，以及為了在動(dòng)物模型中研究其體內(nèi)功能，鑒定出特異于小鼠pDC的新標(biāo)記物將是非常有用的。
發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)提供具有在2003年1月27日，以ATCC保藏號(hào)PTA-4957保藏的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特性的結(jié)合化合物而填補(bǔ)了上述空白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該結(jié)合組合物是抗體或抗體片段。最優(yōu)選地，該單克隆抗體是由雜交瘤ATCC No.PTA-4957產(chǎn)生的單克隆抗體120G8。
本發(fā)明也提供保藏號(hào)為PTA-4957的雜交瘤細(xì)胞系。
本發(fā)明進(jìn)一步提供從含pDC的樣品純化pDC的方法，所述方法包括將所述的樣品與120G8抗體接觸，然后回收已經(jīng)結(jié)合所述抗體的pDC。
最后，本發(fā)明提供從含pDC的樣品鑒定pDC的方法，包括將所述樣品與120G8抗體接觸以形成抗體/pDC復(fù)合物，以及檢測(cè)所述抗體/pDC復(fù)合物的存在以鑒定pDC的步驟。
發(fā)明詳述本發(fā)明部分地基于在小鼠中發(fā)現(xiàn)的特異識(shí)別pDC的抗體。
通過(guò)DC呈遞抗原的T細(xì)胞應(yīng)答特性取決于所涉及的DC亞群和呈遞DC的成熟階段(Steinman等人，2000，J.Exp.Med.191(3)411-6)。不考慮功能可塑性，MDC和pDC能夠分別通過(guò)其分泌IL-12或不分泌IL-12的能力，使T細(xì)胞應(yīng)答的類型向Th1或Th2應(yīng)答極化(Rissoan等人，1999，Science 2831183-1186)。在應(yīng)答病毒中伴隨MDC活化B細(xì)胞(Dubois等人，1999，J.Leukoc.Biol.66224-230)和NK細(xì)胞(Zitvogel等人，2002，J.Exp.Med.195(3)F9-14)，并且pDC產(chǎn)生大量天然的IFNs(Liu，Y.J.，2001，Cell 106(3)259-62)，2種DC亞類也在獲得性和先天性的免疫應(yīng)答之間形成不同的連接。鑒于例如，在小鼠中缺乏能夠識(shí)別靜止和活化的pDC的特異標(biāo)記物，本發(fā)明人已經(jīng)制備出了直接針對(duì)小鼠pDC的mAb。
這個(gè)抗體已經(jīng)命名為120G8，并且是由在2003年1月27日按照布達(dá)佩斯條約，以ATCC保藏號(hào)PTA-4957保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的。120G8mAb可用于從總體細(xì)胞中有選擇地分離pDC。它染色pDC，所述的pDC來(lái)自由離體的總體細(xì)胞或體外骨髓衍生的DC。它不僅識(shí)別起源自小鼠不同器官的pDC，而且識(shí)別起源自不同小鼠品系的pDC。它可用于激發(fā)熒光細(xì)胞分揀術(shù)(FACS)研究、免疫組織化學(xué)(IHC)或組織切片上的免疫組織熒光(IHF)染色。因?yàn)?20G8mAb識(shí)別靜止和活化的pDC，它最有助于研究體外和體內(nèi)的pDC應(yīng)答活化。最后如表型和功能上所確定的，體內(nèi)注射120G8 mAb排空了小鼠的pDC。
如在此所使用的術(shù)語(yǔ)″結(jié)合化合物″包括抗體及其功能性片段，其特異地結(jié)合pDC，并且具有與在此所述的120G8 mAb相同或相似的表位特異性?？赏ㄟ^(guò)它們與120G8 mAb競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合pDC的能力而鑒定具有與120G8 mAb相同或相似的表位特異性的結(jié)合化合物。
實(shí)施例本發(fā)明可通過(guò)下列非限制性的實(shí)施例加以說(shuō)明，其可通過(guò)參考下列材料和方法更容易地進(jìn)行理解。
小鼠、培養(yǎng)基和抗體從Charles River(Iffa-Credo，L’Arbresle，法國(guó))購(gòu)買無(wú)特殊病原體的BALB/cByJ、129SvPas、C57BI/6J、CBA/J、C3H/HeN、DBA/2J、BALB/c-6-8周齡雌性裸鼠。按照由設(shè)立的動(dòng)物委員會(huì)許可的方案并且根據(jù)EEC委員會(huì)指令86/609以及制度化的動(dòng)物護(hù)理和使用方針進(jìn)行所有的小鼠實(shí)驗(yàn)。
初級(jí)細(xì)胞于37℃，5％CO2中，生長(zhǎng)在完全的RPMI1640培養(yǎng)基中RPMI1640(Life Technologies，Paisley Park，英國(guó))，其補(bǔ)充有10％(v/v)熱滅活的胎牛血清(FCS，Life Technologies)，2mM L-谷氨酰胺(LifeTechnologies)，80μg/ml Gentallin(Schering Plough，Union，NJ)，10mMHepes(Life Technologies)，50μM β2-巰基乙醇(Sigma，St Louis，MO)。在補(bǔ)充有2mM L-谷氨酰胺，80μg/ml Gentallin的DMEM/F12(LifeTechnologies)中產(chǎn)生雜交瘤的高密度上清液。如果不指定則加入10％(v/v)馬血清(HS，Life Technologies)。除非另作說(shuō)明，所有的抗體都來(lái)自于Pharmingen(San Diego，CA)。
組織制備和細(xì)胞排空通過(guò)吸入CO2殺死小鼠。該方法自始至終將分離的細(xì)胞維持在PBS-FCS-EDTA中補(bǔ)克有5％(v/v)熱滅活的FCS和0.5mM EDFA(Sigma)的PBS(Life Technologies)。通過(guò)處死后立即進(jìn)行心臟穿刺而在過(guò)量的PBS-FCS-EDTA中收集血細(xì)胞。在PBS-FCS-EDTA中壓碎脾臟、胸腺、淋巴結(jié)(部位或外周的(匯集在腹股溝的、腋下的和部位的)、peyer′s小塊，并且通過(guò)25G的針。在NH4Cl溶液(Stem CellTechnologies，Vancouver，BC)中裂解紅血細(xì)胞5分鐘。用冷的PBS-FCS-EDTA從骨上沖洗下骨髓細(xì)胞。
為人類T和B細(xì)胞排空，用抗-CD3分子絡(luò)合物(17A2)的混合物使細(xì)胞在4℃培養(yǎng)30分鐘，備選使用抗-CD8β(53-5.8)、抗-CD19(1D3)或抗-紅血球(TER119)。于4℃連續(xù)攪動(dòng)混合細(xì)胞和山羊抗-大鼠IgG-包被的Dyna珠子(Dynal，Oslo，挪威)15分鐘。利用Dynal磁體移出珠子和附著的細(xì)胞。
利用CD11c+微珠和MiniMacs(Myltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德國(guó))從總的脾臟細(xì)胞、總的骨髓細(xì)胞或排空CD19、CD3、CD8β、TER119的細(xì)胞，通過(guò)陽(yáng)性選擇純化CD11c+細(xì)胞。
為獲得FLT3L中骨髓體外衍生的DC(BM-DC)，將以106個(gè)細(xì)胞/ml接種在24-孔平板中的分離骨髓細(xì)胞，在補(bǔ)充有25ng/ml重組的鼠FLT3L(R&D systems，Abingdon，英國(guó))的完全RPM11640培養(yǎng)基中培養(yǎng)9天。每2-3天更新培養(yǎng)基。
用小鼠類漿細(xì)胞DC免疫接種大鼠使來(lái)自BALB/c小鼠的小鼠脾臟細(xì)胞與包括抗-CD3分子絡(luò)合物(17A2)、抗-CD8β(53-5.8)、抗-CD19(1D3)、抗-CD5(53-7.3)、抗-CD11b(M1/70)、和抗-紅血球(TER119)的大鼠mAb混合物在4℃培養(yǎng)30分鐘，然后利用Dyna珠子移出抗體包被的細(xì)胞。用大鼠抗-Ly6G/C(RB6-8C5)-藻紅蛋白(PE)、倉(cāng)鼠抗-CD11c(HL-3)-生物素、和包含異硫氰酸熒光素(FITC)-標(biāo)記的倉(cāng)鼠抗-CD3ε(145-2C11)、大鼠抗-CD19(1D3)、抗-CD5(53-7.3)、抗-CD11b(M1/70)、和抗-pan NK細(xì)胞(DX5)的混合物在4℃染色排空的細(xì)胞30min。然后用鏈霉抗生物素蛋白-Pe-Cy5(Dako，Glostrup，丹麥)染色細(xì)胞，并且利用FACStar加流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson，Moutain View，CA)分揀CD11c+Grl+CD3s-CD19-CD5-CD11b-DX5-細(xì)胞(pDC)。在PBS(LifeTechnology，Paisley Park，英國(guó))中洗滌分揀的細(xì)胞3次，重懸浮在PBS中并且在-20℃冷凍以備注射使用。
用分揀的pDC免疫一只4周齡的LOU雌性大鼠(Iffa Credo)。方案如下第0天腹膜內(nèi)(ip)注射完全弗氏佐劑(CFA)中的106個(gè)細(xì)胞第14天ip注射不完全弗氏佐劑(IFA)中的106個(gè)細(xì)胞第21天ip注射PBS中的106個(gè)細(xì)胞第35天靜脈內(nèi)(iv)注射PBS中的2.106個(gè)細(xì)胞第38天殺死大鼠并收集脾臟。
利用聚乙二醇-1000(Sigma)使脾臟細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP20融合。將雜種細(xì)胞接種到96-孔平板中并且用補(bǔ)充有10％HS，2mM L-谷氨酰胺，80μg/ml Gentallin，1％培養(yǎng)基添加劑(CRTS，里昂，法國(guó))，10-5M重氮乙酰絲氨酸(Sigma)和5×10-5M次黃嘌呤的DMEM/F12培養(yǎng)。用離體分離的脾臟細(xì)胞、骨髓和脾的CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞篩選上清液的反應(yīng)性。通過(guò)有限稀釋克隆所選擇的雜交瘤。
從無(wú)血清的高密度上清液通過(guò)在Hiload Q柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上進(jìn)行陰離子交換色譜純化mAb 120G8，并且利用標(biāo)準(zhǔn)方法與Alexa488和生物素偶聯(lián)。在Balb/c-裸鼠(Iffa Credo)中產(chǎn)生腹水。利用大鼠Ig亞類試劑盒(Pharmingen，San Diego，CA)通過(guò)ELISA確定Ig同種型。
FACS分析對(duì)于所有的FACS分析，首先將維持在PBS-FCS-EDTA中的細(xì)胞與未標(biāo)記抗-CD16/32的大鼠Ab培養(yǎng)15分鐘以確保封閉Fc受體，然后用指明的Abs在4℃染色30分鐘。用FACScan流式細(xì)胞儀分析染色細(xì)胞。用同種型相配的大鼠或倉(cāng)鼠Ig作為陰性對(duì)照。當(dāng)沒(méi)有使用PerCpCy5.5染色時(shí)，利用FL3通路控制輸出(gated out)自發(fā)熒光的細(xì)胞。
對(duì)于120G8+細(xì)胞表面表型，用Alexa-488-標(biāo)記的120G8，PE-標(biāo)記的抗體(抗-CD3ε、CD19、DX5、CD11c、CD45R/B220、Lv6C、Lv6G/C(Gr1、RB6-8C5)、CD11b、I-Ad、H2-Kd)和APC-標(biāo)記的倉(cāng)鼠抗-CD11c(HL-3)染色分離的細(xì)胞。對(duì)于染色在FLT3L中培養(yǎng)指定天數(shù)的BM-DC，用120G8 Alexa488、抗-CD11c-PE、抗-CD11b-PerCpCy5.5和抗-CD45R/B220-APC染色細(xì)胞。對(duì)于不同器官中的120G8+和120G8-CD11c+細(xì)胞的表面表型，用120G8-Alexa488、抗-CD45R/B220-PE、抗-Ly6C-生物素和抗-CD11c-APC染色分離的細(xì)胞。用PerCP-Cy5.5鏈霉抗生物素蛋白(Pharmingen)顯示生物素?；目?Ly6C。
為分析小鼠器官中的DC亞型細(xì)胞頻率，用大鼠120G8-Alexa488、抗-CD19和抗-CD3ε-PerCPCy5.5、抗-CD11c-APC和抗-CD8α-PE或抗-CD11b-PE染色在PBS-FCS-EDTA中維持的脾臟細(xì)胞。利用FL3通路控制輸出CD19+/CD3ε+細(xì)胞用于分析。結(jié)果表示為總的脾臟細(xì)胞中指定的細(xì)胞亞型的頻率。
細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生對(duì)于細(xì)胞活化，在缺乏或存在指明的刺激時(shí)，在完全的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)指明的細(xì)胞(對(duì)于未分揀的細(xì)胞為106個(gè)細(xì)胞/ml，而對(duì)于分揀的細(xì)胞為0.5×106個(gè)細(xì)胞/ml)。以每ml 100個(gè)血球凝集素單位的終濃度向培養(yǎng)物加入甲醛-滅活的人流感病毒，菌株NK/TM/138/00(由N.Kuehn，Aventis Pasteur，Val de Reuil，法國(guó)惠贈(zèng))。除非另作說(shuō)明，從MWGBiotech(慕尼黑，德國(guó))購(gòu)買硫代磷酸酯(phosphorothioate)CpG ODNs，(TCA TTG GAA AAC GTT CTT CGG GGC G)(SEQ IDNO1)并以10μg/ml的終濃度加以使用。以指明的終濃度使用重組的小鼠IFN-α(Hycult Biotechnology，Uden，荷蘭)。以2ng/ml的終濃度使用重組的小鼠IFN-γ(R&D)。
對(duì)于120G8+細(xì)胞生產(chǎn)細(xì)胞因子，使脾臟細(xì)胞在4℃與包括抗-CD3分子絡(luò)合物、抗-CD8β、抗-CD19和抗-紅血球(TER119)的mAb混合物培養(yǎng)30分鐘，然后利用Dyna珠子移出抗體包被的細(xì)胞。用大鼠120G8-Alexa488、倉(cāng)鼠抗-CD11c(HL-3)-藻紅蛋白(PE)在4℃染色排空的細(xì)胞30分鐘。然后利用FACStar加流式細(xì)胞儀(BectonDickinson)分揀細(xì)胞，進(jìn)行洗滌并接種在96孔培養(yǎng)平板中，進(jìn)行20-24h指明的刺激。在20-24h收集上清液并儲(chǔ)存在-20℃以備用于通過(guò)特異的ELISAs分析IFN-α和IL-12(p40或p70)(分別為PBL BiomedicalLaboratories，New Brunswick，NJ和R&D Systems)。
對(duì)于細(xì)胞活化后的120G8表達(dá)，用指明的刺激培養(yǎng)分離細(xì)胞20-24h。然后染色經(jīng)刺激的細(xì)胞，對(duì)于CD11c+活化的細(xì)胞用120G8-Alexa488、抗-CD11b-PerCpCy5.5和或和抗-CD45R/B220-PE染色，對(duì)于總的脾臟細(xì)胞用120G8-Alexa488和與PE偶聯(lián)的指明mAbs染色。對(duì)于后者的實(shí)驗(yàn)，利用FL2通路控制輸入(gated in)指明的細(xì)胞。
組織切片上120G8的免疫染色將脾臟包埋在OCT-化合物(Miles)中，在液氮中快速冷凍，并且儲(chǔ)存在-80℃以備用于進(jìn)一步的分析。將8微米厚的低溫切片于-20℃在80％丙酮(Sigma)中固定20分鐘，在室溫下干燥并冷凍儲(chǔ)存直到染色。在PBS(Life Technology)中使切片再水合。分別利用特異的試劑盒(Vector Laboratory，Burlingame，CA)和0.3％的H2O2(Sigma)分別中和抗生物素蛋白/生物素和過(guò)氧化物酶組織含量。用2％的標(biāo)準(zhǔn)小鼠血清(Dako，Glostrup，丹麥)封閉切片，并在室溫下進(jìn)行染色。對(duì)于各種小鼠組織中120G8+細(xì)胞的原位分布，順序地用未標(biāo)記的120G8 Ab染色切片60分鐘、偶聯(lián)生物素的山羊抗-大鼠(Jackson Immunoresearch)染色60分鐘，偶聯(lián)過(guò)氧化物酶(Sigma)的外抗生物素蛋白(extravidin)染色30分鐘，并且用過(guò)氧化物酶底物(AEC，Sigma)顯示。用蘇木精(Vector Laboratory)進(jìn)行復(fù)染。對(duì)于免疫組織熒光分析，順序地用未標(biāo)記的120G8 Ab染色切片60分鐘，偶聯(lián)Alexa488的山羊抗-大鼠(Molecular Probes，Leiden，荷蘭)染色60分鐘，2％大鼠血清、偶聯(lián)生物素和鏈霉抗生物素蛋白-Alexa594的指明Abs(Molecular Probes)染色。
體內(nèi)治療對(duì)于CpG處理，在注射入麻醉小鼠的眼窩后靜脈中之前將每只小鼠30μL的陽(yáng)離子脂質(zhì)體制劑(DOTAP，Roche，曼海姆，德國(guó))與170μLPBS中的5μg CpG ODN在聚苯乙烯試管中混合10分鐘。CpG注射6小時(shí)后，收集脾臟并且準(zhǔn)備免疫染色。
對(duì)于體內(nèi)排空120G8+細(xì)胞，用最適量的120G8腹水腹膜內(nèi)注射小鼠。對(duì)于pDC排空的FACS分析，注射120G8后24h，分離脾臟細(xì)胞并且用抗-Ly6C-FITC、抗-CD45R/B220-PE，抗-CD11cAPC和抗-CD 19-PerCpCy5.5或抗-CD3ε-PerCpCy5.5染色。對(duì)于CpG處理后評(píng)估120G8+細(xì)胞體內(nèi)協(xié)助產(chǎn)生細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)，在第-1天和在CpG處理的時(shí)候用120G8腹水腹膜內(nèi)注射小鼠。CpG注射6h后，通過(guò)處死后立即進(jìn)行心臟穿刺術(shù)而收集血液。通過(guò)在37℃凝固30分鐘和離心從全血制備血清，冷凍血清以備用于分析細(xì)胞因子含量。通過(guò)流式細(xì)胞光度術(shù)分離脾臟細(xì)胞以評(píng)估排空效率。
實(shí)施例1選擇針對(duì)小鼠pDC反應(yīng)的單克隆抗體120G8篩選來(lái)自2400個(gè)雜交瘤的上清液與總的小鼠脾臟細(xì)胞制品中小于5％的細(xì)胞的反應(yīng)性，并進(jìn)一步篩選與排空CD3+、CD19+、TER119+、CD11b+細(xì)胞的脾臟的反應(yīng)性。將由融合產(chǎn)生的25個(gè)平板中的5個(gè)96孔平板于-80℃冷凍在補(bǔ)充有10％DMSO的HS中。解凍這5個(gè)平板中的2個(gè)，如上所述用完全的DMEM F12喂養(yǎng)，并且通過(guò)在總的脾臟細(xì)胞上(小于5％)進(jìn)行FACS染色來(lái)第二次篩選上清液。分析所選擇上清液在骨髓和脾臟CD11c+細(xì)胞上的反應(yīng)性。發(fā)現(xiàn)來(lái)自命名為120G8的一個(gè)雜交瘤的上清液只與骨髓CD11c+細(xì)胞的主要亞型(60-70％)，和脾臟CD11c+細(xì)胞的次要CD11clow亞型(10-20％)起作用。通過(guò)有限稀釋克隆該雜交瘤。一旦選擇出與親本系具有相似反應(yīng)性，所得到的克隆通過(guò)有限稀釋進(jìn)一步加以克隆，并且選擇在小鼠CD11c+細(xì)胞上具有最高反應(yīng)性的克隆，即具有產(chǎn)生Ab的最高能力的克隆(克隆6)。
該抗體是從腹水和高密度的上清液中的親本和克隆6產(chǎn)生的。如ELISA所確定的，發(fā)現(xiàn)Mab 120G8是IgG1/κ同種型。因?yàn)槠⑴K中的120G8+細(xì)胞似乎也是特別感興趣的CD11c+B220+Gr1+細(xì)胞(以前定義為小鼠pDC)，選擇mAb 120G8用于進(jìn)一步研究。
實(shí)施例2120G8 mAb與產(chǎn)生小鼠IFN-α的細(xì)胞[pDC]是高度反應(yīng)性的利用偶聯(lián)Alexa 488的120G8和譜系特異標(biāo)記物的雙免疫熒光研究，進(jìn)一步在未刺激的脾臟細(xì)胞上檢驗(yàn)120G8 mAb的反應(yīng)性。120G8 Ab染色在正向和側(cè)面散布中同質(zhì)的新鮮分離的脾細(xì)胞小亞型。這個(gè)亞型不表達(dá)TER119(紅細(xì)胞譜系標(biāo)記物)、CD19(B細(xì)胞譜系標(biāo)記物)、CD3ε(T細(xì)胞譜系標(biāo)記物)和DX5(Nk細(xì)胞譜系標(biāo)記物)。所有的120G8+細(xì)胞也是CD11clow，證實(shí)Ab染色脾臟DC的亞型。這些結(jié)果代表至少3次實(shí)驗(yàn)。
其次，體外測(cè)試120G8 mAb特異識(shí)別產(chǎn)生IFN-α的細(xì)胞(IPC)的能力。已經(jīng)證明CD11c+脾細(xì)胞是應(yīng)答流感病毒而體外產(chǎn)生下量IFNα的唯一細(xì)胞(Paturel等人，Nat Immunol，2001)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)從排空CD3+CD19+CD8β+TER119+細(xì)胞的脾臟細(xì)胞純化CD11c+120G8+和CD11c+120G8-細(xì)胞。通過(guò)滅活的流感病毒或CpG如上所述體外刺激2種亞型。進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)并得到相似的結(jié)果。來(lái)自用培養(yǎng)基單獨(dú)培養(yǎng)的這兩種分揀群體的IFN-α和IL-12p40的產(chǎn)生低于ELISA檢測(cè)水平。在流感病毒和CpG刺激后只有CD11c+細(xì)胞的120G8+亞型產(chǎn)生IFN-α。由120G8-分揀細(xì)胞應(yīng)答流感病毒和CpG產(chǎn)生的IFN-α的水平極低或觀察不到。120G8+細(xì)胞也能夠應(yīng)答這兩種刺激而產(chǎn)生IL-12p40，但對(duì)于CpG刺激，其水平低于包括CD11ChighDC的120G8-細(xì)胞亞型。這與上述顯示CD8α+CD11chighDC能夠應(yīng)答各種刺激而產(chǎn)生高量IL-12的上述數(shù)據(jù)相符合。
實(shí)施例3120G8+CD11c+脾細(xì)胞的表面表型先前已經(jīng)描述小鼠pDC是脾臟中的CD11c+Gr1+B220+細(xì)胞(Paturel，2001，Nagano，2001，Bjorck，2001)，和從骨髓細(xì)胞體外衍生的DC中的CD11c+B220+CD11b-細(xì)胞。為了研究120G8+細(xì)胞的表面表型，與120G8-CD11c+DC相比較，用120G8、CD11c和幾個(gè)偶聯(lián)PE的Abs染色離體分離的CD11c+和在FLT3L中體外衍生的DC。當(dāng)分析離體分離的脾臟CD11c+細(xì)胞時(shí)，120G8+細(xì)胞是B220high、Gr1low、Ly6Chigh、CD11b-、CD8αneg/low、IAdlow和H-2Kd+，而CD11c+120G8-細(xì)胞是B220neg/low、Grl-、Ly6Cneg/low、CD11b+/-、CD8αneg/hi、IAdlow/high和H-2Kd+。1208G8表型與先前描述的小鼠pDC表面表型符合。此外，120G8也染色先前鑒定的在FLT3L-刺激的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物中體外衍生的CD11b-CD11c+B220+小鼠pDC(BM-DC)。當(dāng)分析BM-DC時(shí)，120G8+細(xì)胞是B220high、Gr1neg/low、Ly6Chigh、CD11b-，而120G8-細(xì)胞是B220neg/low、Gr1-、Ly6Cneg、CD11b+。
因此，120G8mAb對(duì)小鼠脾臟pDC和體外衍生的pDC均可染色。
實(shí)施例4120G8是小鼠pDC分化的早期標(biāo)記物在pDC體外分化的第6天和第10天之間研究BM-DC(FLT3L)上的120G8 mAb染色。用120G8、CD11c、CD11b和B220染色細(xì)胞。從第6天到第10天，120G8 mAb不染色CD11c-細(xì)胞。然而，早在培養(yǎng)6天后所有的120G8+細(xì)胞都是CD11c+CD11b-B220+細(xì)胞。也可檢測(cè)到B220+CD11c+120G8-的亞型，其是CD11b+，并且最可能來(lái)源于CD11b+骨髓樣DC。雖然從第6天(70％)至第8天(90％)CD11c+細(xì)胞的百分比增加，并且直到第10天保持恒定，從第6天(23％)至第8天(38％)，CD11c+細(xì)胞中120G8+細(xì)胞的百分比緩慢增加，并且其后迅速降低(在第10天為4％)。這些結(jié)果表明120G8 mAb是小鼠pDC沿其體外分化的早期標(biāo)記物。
實(shí)施例5各種淋巴器官中120G8+細(xì)胞的表面表型在來(lái)自Balb/c小鼠的脾臟、骨髓、血液、胸腺、外周和腸系膜淋巴結(jié)中研究120G8 mAb的染色。用120G8、抗-CD45R/B220、抗-Ly6C和抗-CD11c Abs四重表面染色分析分離的細(xì)胞。研究在CD11c+120G8+和CD11c+120G8-細(xì)胞上的Ly6C和B220表達(dá)。在所有試驗(yàn)的器官和血液中，CD11c+120G8+都是B220highLy6Chigh。相反地，沒(méi)有CD11c+120G8-是B220highLy6Chigh。這表明120G8mAb可識(shí)別小鼠pDC(CD11c+B22OhighLy6Chigh)細(xì)胞，而與pDC分離自哪些組織無(wú)關(guān)。
實(shí)施例6不同小鼠品系中120G8+細(xì)胞的頻率進(jìn)一步研究120G8 mAb與來(lái)自不同小鼠品系的pDC反應(yīng)的能力。120G8 mAb與分離自BALB/cByJ、129SvPas、C57BI/6J、CBA/J、C3H/HeN和DBA/2J小鼠的脾臟pDC起反應(yīng)。進(jìn)一步研究來(lái)自這6個(gè)不同小鼠品系的總的脾臟細(xì)胞當(dāng)中120G8+DC亞型的頻率。從相同年齡的小鼠(每個(gè)小鼠品系3只小鼠，進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn))分離脾臟細(xì)胞，并用120G8、CD11c、CD19和CD3ε染色?？刂戚敵鯟D19/CD3ε+細(xì)胞用于分析?？偟钠⑴K細(xì)胞當(dāng)中pDC頻率的分析顯示其變化取決于所考慮的小鼠品系，例如C57/BI6小鼠顯示最低的脾臟pDC頻率(總的脾臟細(xì)胞的0.6％+/-0.06)，而129Sv小鼠顯示最高頻率(總的脾臟細(xì)胞的1.94％+/-0.37)。
實(shí)施例7組織切片上120G8的免疫組織化學(xué)染色通過(guò)免疫組織化學(xué)分析胸腺、脾臟、peyer′s小決、外周淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)來(lái)檢驗(yàn)120G8+細(xì)胞的原位分布。在所有的這些器官中，可檢測(cè)到120G8+的單個(gè)細(xì)胞。在一些器官(例如胸腺)中，可在內(nèi)皮細(xì)胞上檢測(cè)到一些低的染色。也在腸被絨毛上檢測(cè)到一些低的染色。
實(shí)施例8體外活化后在小鼠pDC上維持120G8BDCA2、CD123、BDCA4是3種通常用于檢測(cè)人pDC的標(biāo)記物。然而眾所周知，在體外活化的人pDCs非常迅速地下調(diào)這些標(biāo)記物。因此迄今為止很難原位檢測(cè)活化的pDC。在小鼠中，通常通過(guò)用抗-CD11c和抗-CD45R/B220復(fù)染來(lái)檢測(cè)pDC(靜止或活化的)，但是該組合染色其他的細(xì)胞，例如B細(xì)胞。為了評(píng)估靜止和活化的pDC上的120G8染色，在有或沒(méi)有滅活的流感病毒和CpG ODN 1668(TCC ATG ACG TTCCTG ATG CT)(SEQ ID NO2)時(shí)，體外培養(yǎng)來(lái)自129Sv小鼠的MACS純化的CD11c+脾細(xì)胞20h。在所有試驗(yàn)的狀況中，120G8 mAb染色的平均熒光強(qiáng)度在小的CD11c+B22highCD11b-亞型(pDC)上保持恒定。盡管在流感病毒和CpG刺激后檢測(cè)到一些CD11c+B220hi120G8-，那些細(xì)胞也表達(dá)CD11b，表明一些骨髓樣DC可上調(diào)B220，而不是120G8，進(jìn)一步證實(shí)pDC上120G8染色的特異性。
為了進(jìn)一步證實(shí)120G8 mAb也可體內(nèi)染色活化的pDC，如所描述的方法用CpG處理129Sv小鼠。在CpG注射后6h分離脾臟細(xì)胞，并且對(duì)DC亞型研究DC上表達(dá)的活化標(biāo)記物。120G8+細(xì)胞上調(diào)DC活化分子，例如CD40、CD86，并且在用CpG體內(nèi)刺激后調(diào)節(jié)至更少程度的CD8α和MHC類型II分子。在對(duì)照和CpG處理的小鼠中，那些細(xì)胞顯示相同水平的CD11c(低)和CD11b(陰性)，并且pDC中120G8染色的平均熒光強(qiáng)度保持恒定。因此120G8 mAb在體外和體內(nèi)都識(shí)別靜止和活化的pDC。
實(shí)施例9在來(lái)自正常和CpG活化的小鼠脾臟的120G8+細(xì)胞定位雖然一些研究已經(jīng)顯示人pDC位于T細(xì)胞區(qū)，應(yīng)答HSV感染而產(chǎn)生IFNα的細(xì)胞位于小鼠脾臟的邊緣區(qū)(Eloranta，Alm，Scand J Immunol，1999)。如實(shí)施例7中呈現(xiàn)的免疫組織化學(xué)染色研究表明正常小鼠中脾臟的pDC位于T細(xì)胞區(qū)。由于120G8 mAb似乎是原位染色靜止和活化的pDC的獨(dú)特工具，為了在脾臟中追蹤小鼠pDC定位，我們?nèi)缢枋龅姆椒ㄓ肅pG處理129Sv小鼠。通過(guò)用在CpG處理后6h的脾臟中用綠色熒光(Alexa488熒光染料)染色120G8+細(xì)胞和用紅色熒光(Alexa594熒光染料、抗-CD3ε、抗-CD19、抗-CD11c(N418克隆)和抗-CD11bmAbs)染色T、B、DC或巨噬細(xì)胞的共染色，進(jìn)行免疫熒光原位分析來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)研究。我們注意到在該實(shí)驗(yàn)條件下，由于pDC低表達(dá)CD11c，120G8+細(xì)胞不能被CD11c染色。因此通過(guò)CD11c原位染色只檢測(cè)到CD11chigh。用120G8分析連續(xù)切片的CD19、CD3或CD11b共染色。在靜止的動(dòng)物中，120G8mAb染色來(lái)自T細(xì)胞區(qū)(CD3染色)和邊緣區(qū)(CD11b染色)的細(xì)胞。在B細(xì)胞區(qū)(CD19染色)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)120G8+細(xì)胞。在紅漿(red pulp)和T細(xì)胞區(qū)之間的橋連通道中檢測(cè)到CD11chigh細(xì)胞(CD11c染色)，但是沒(méi)有顯示與pDC相同的分布模式。
在CpG活化的脾臟中，120G8 mAb染色來(lái)自邊緣區(qū)的細(xì)胞。在B或T細(xì)胞區(qū)沒(méi)有或幾乎沒(méi)有檢測(cè)到120G8+細(xì)胞。相反，在T細(xì)胞區(qū)可檢測(cè)到大流量的CD11chigh細(xì)胞。
因此，120G8mAb可用于直接地原位追蹤應(yīng)答活化的pDC遷移。
實(shí)施例10120G8細(xì)胞的體內(nèi)排空終止了IFN-α的產(chǎn)生在上述的研究中，已經(jīng)通過(guò)用抗-Ly6G/C(Gr1)處理排空那些細(xì)胞而證明pDC在病毒感染中的作用。這個(gè)處理，除pDC和中性粒細(xì)胞外，也可能減少部分巨噬細(xì)胞和活化的T細(xì)胞。因此通過(guò)利用120G8特異地排空pDC可能對(duì)于體內(nèi)研究具有很大的用途。腹膜內(nèi)注射或不注射120G8 mAb的BALB/c小鼠，24h后，在未處理和120G8處理的小鼠(每組3只小鼠)中分離脾臟細(xì)胞，用于FACS分析脾臟細(xì)胞中Ly6C+B220+CD11c+的頻率，以及CD19或CD3ε污染細(xì)胞的水平。用120G8 Ab體內(nèi)處理降低脾臟Ly6C+B220+CD11c+細(xì)胞的頻率。此外，剩余的Ly6C+B220+CD11c+細(xì)胞不全是pDC，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)CD3(42％)并且表達(dá)較少的CD19(18％)。
為了評(píng)估120G8排空對(duì)IFNα生產(chǎn)的影響，在CpG處理129Sv小鼠(每組3只小鼠)后6h，預(yù)先排空或不排空120G8+細(xì)胞來(lái)分析seric IFNα和IL 12的產(chǎn)生。對(duì)于兩個(gè)細(xì)胞因子，對(duì)照小鼠血清(單獨(dú)地DOTAP)都是陰性的。120G8處理完全消除了由CpG處理(對(duì)于正常的小鼠為13300pg/ml+/-1500，對(duì)于120G8處理的小鼠為小于150pg/ml)誘導(dǎo)的IFNα產(chǎn)生，同時(shí)導(dǎo)致對(duì)IL-12產(chǎn)生的小的抑制，p40和p70兩者(對(duì)于正常的小鼠為IL-12p701240pg/ml+/-540，對(duì)于120G8處理的小鼠為300pg/ml+/-74；對(duì)于正常的小鼠為IL-12p405806pg/ml+/-1135，對(duì)于120G8處理的小鼠為4250pg/ml+/-1170)。因此120G8 mAb可用于排除小鼠體內(nèi)產(chǎn)生IFNα的細(xì)胞。
實(shí)施例11存在IFNα?xí)r在B細(xì)胞上120G8表達(dá)上調(diào)120G8 mAb只染色分離自正常小鼠的總的靜止細(xì)胞當(dāng)中的pDC。我們研究其它的細(xì)胞是否在細(xì)胞因子活化后也可被120G8染色。從Balb/c小鼠分離脾臟細(xì)胞并且在存在細(xì)胞因子的情況下培養(yǎng)24h。然后在這些細(xì)胞上分析用120G8和抗-CD19、CD4、CD8β或CD11c mAbs的復(fù)染。利用FL3通路控制輸出自發(fā)熒光的細(xì)胞。這證明，在B細(xì)胞和CD11c+DC上，而不是在T CD4+或T CD8+DC上，應(yīng)答100U/ml的IFN-α上調(diào)被120G8 mAb識(shí)別的抗原。在應(yīng)答IFNγ、IL-12或TNFα中沒(méi)有觀察到這種上調(diào)。然而B(niǎo)細(xì)胞上120G8染色的平均熒光強(qiáng)度仍然保持比pDC上的低至少一個(gè)量級(jí)(log)。
對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，產(chǎn)生本發(fā)明的許多改進(jìn)和變化而不背離其精神和范圍是顯而易見(jiàn)的。在此只是通過(guò)實(shí)施例的方式來(lái)提供所述的具體實(shí)施方案，并且本發(fā)明只受到所附權(quán)利要求的條款的限定，伴隨有這些權(quán)利要求的等同物所賦予的全部范圍。
序列表<110>Schering Corporation<120>特異于類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞的抗體<130>SF06011WI01<150>US 60/443,244<151>2003-01-28<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(ODN)<400>1tcattggaaa acgttcttcg gggcg 25<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸(ODN)<400>2cccatgacgt tcctgatgct 20
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合化合物，其具有由ATCC保藏號(hào)PTA-4957保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特性。
2.權(quán)利要求1的結(jié)合化合物，其是抗體或抗體片段。
3.一種由ATCC保藏號(hào)PTA-4957保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段。
4.由以ATCC保藏號(hào)PTA-4957保藏的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的單克隆抗體。
5.以ATCC保藏號(hào)PTA-4957保藏的雜交瘤細(xì)胞系。
6.一種用于從包含類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞的樣品中純化所述類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞的方法，所述的方法包括將所述的樣品與權(quán)利要求1的結(jié)合化合物接觸，然后回收已經(jīng)結(jié)合所述結(jié)合化合物的類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞的步驟。
7.一種用于從包含類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞的樣品中鑒定所述類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞的方法，所述的方法包括將所述的樣品與權(quán)利要求1的結(jié)合化合物接觸，以形成抗體/類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞復(fù)合物；以及檢測(cè)所述復(fù)合物的存在的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠結(jié)合類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞(pDC)的免疫學(xué)試劑(抗體)，表達(dá)這種抗體的細(xì)胞系以及利用這種抗體從包含pDC的組織鑒定和純化類漿細(xì)胞樹(shù)突狀細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)G01N33/563GK1745104SQ200480003047
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2004年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月28日
發(fā)明者C·帕圖雷爾, G·特林基里, J·－J·賓 申請(qǐng)人:先靈公司