相關(guān)申請的交叉引用

本申請根據(jù)35u.s.c.§119(e)有權(quán)享有在2014年10月31日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/073,268的優(yōu)先權(quán)，所述臨時專利申請由此通過引用以其全部并入本文。

關(guān)于聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)的聲明

本發(fā)明在美國國立衛(wèi)生研究院給予的ca120409下利用政府支持完成。政府擁有本發(fā)明中的某些權(quán)利。

背景技術(shù)：

基因工程化t細(xì)胞的過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移已經(jīng)證明是用于癌癥治療的引人注目的替代方案。然而，在足夠的數(shù)目可以被操縱用于治療前，t細(xì)胞通常必須被擴(kuò)展。存在可以在臨床情況中使用以刺激和擴(kuò)展t細(xì)胞的多種方法，包括使用抗cd3/cd28珠進(jìn)行刺激、在具有或不具有抗cd28抗體的情況下使用抗cd3抗體進(jìn)行刺激、和使用抗原呈遞細(xì)胞的基于細(xì)胞的人工刺激。通過這些不同方法生成的t細(xì)胞展示不同的表型和體外/體內(nèi)功能。

因此，在本領(lǐng)域中對如下改進(jìn)的方法存在需要，所述方法出于生成可以最大地發(fā)揮它們的體內(nèi)效應(yīng)物功能的t細(xì)胞的目的，獲得t細(xì)胞群用于基于t細(xì)胞的過繼免疫療法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

如本文描述的，本發(fā)明涉及用于刺激和擴(kuò)展t細(xì)胞的組合物和方法。

本發(fā)明的一個方面包括用于擴(kuò)展t細(xì)胞群的方法，該方法包括使包括t細(xì)胞的細(xì)胞群電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的mrna，所述嵌合膜蛋白包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括針對分子的抗體或其片段，其中mrna被引入所述群中的細(xì)胞的至少一個中并且在細(xì)胞的表面上表達(dá)；和培養(yǎng)電穿孔的細(xì)胞群，其中包含在其中的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。

在另一方面，本發(fā)明包括用于擴(kuò)展電穿孔的t細(xì)胞群的方法，該方法包括使包括t細(xì)胞的細(xì)胞群電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的mrna，所述嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段，其中mrna被引入所述群中的細(xì)胞的至少一個中并且在細(xì)胞的表面上表達(dá)；和培養(yǎng)電穿孔的細(xì)胞群，其中包含在其中的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。

在又另一方面，本發(fā)明包括包含電穿孔的編碼嵌合膜蛋白的mrna的t細(xì)胞，所述嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段。

在另一方面，本發(fā)明包括電穿孔的t細(xì)胞群，其包括電穿孔的編碼嵌合膜蛋白的mrna，所述嵌合膜蛋白包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括針對分子的抗體或其片段；和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段。

本發(fā)明的另一方面包括用于過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法的方法，其包括施用包括t細(xì)胞的擴(kuò)展的細(xì)胞群至需要其的對象以預(yù)防或治療不利于對象的免疫反應(yīng)，其中擴(kuò)展的細(xì)胞群已經(jīng)根據(jù)如下方法被擴(kuò)展：其包括使包括t細(xì)胞的細(xì)胞群電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的mrna，所述嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段，其中所述群中的細(xì)胞的至少一個表達(dá)嵌合膜蛋白；和培養(yǎng)細(xì)胞群，其中包含在其中的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。

本發(fā)明的還另一方面包括治療與對象中增強(qiáng)的免疫性相關(guān)聯(lián)的疾病或病癥的方法，其包括施用包括t細(xì)胞的擴(kuò)展的細(xì)胞群至需要其的對象，其中擴(kuò)展的細(xì)胞群已經(jīng)根據(jù)如下方法被擴(kuò)展：其包括使包括t細(xì)胞的細(xì)胞群電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的mrna，所述嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段，其中所述群中的細(xì)胞中的至少一個表達(dá)嵌合膜蛋白；和培養(yǎng)群，其中包含在其中的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。

在另一方面，本發(fā)明包括通過本文描述的方法制造的擴(kuò)展的t細(xì)胞群。

在又另一方面，本發(fā)明包括治療對象中的病癥的方法，其包括給對象施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包括在本文描述的方法中生成的修飾的t細(xì)胞。

在還另一方面，本發(fā)明包括本文描述的t細(xì)胞在制造用于治療需要其的對象中的免疫應(yīng)答的藥物中的用途。

在本文描繪的本發(fā)明的上述方面或任何其它方面的多種實(shí)施方式中，待電穿孔的細(xì)胞群選自外周血單核細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、純化的t細(xì)胞群、和t細(xì)胞系。在另一個實(shí)施方式中，待電穿孔的細(xì)胞群包括外周血單核細(xì)胞。在又另一個實(shí)施方式中，待電穿孔的細(xì)胞群包括純化的t細(xì)胞。

在一個實(shí)施方式中，mrna包括體外轉(zhuǎn)錄的rna或合成rna。在另一個實(shí)施方式中，編碼嵌合膜蛋白的mrna進(jìn)一步包括跨膜結(jié)構(gòu)域。在又另一個實(shí)施方式中，編碼嵌合膜蛋白的mrna進(jìn)一步包括鉸鏈結(jié)構(gòu)域。

在另一個實(shí)施方式中，抗體包括選自合成抗體、人抗體、人源化抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈可變片段和其抗原結(jié)合片段。在又另一個實(shí)施方式中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自抗cd3、抗tcr、抗cd28和其組合。

在又另一個實(shí)施方式中，細(xì)胞群中的至少一個細(xì)胞表達(dá)cd3。在另一個實(shí)施方式中，表達(dá)嵌合膜蛋白的至少一個細(xì)胞與表達(dá)cd3的另一個細(xì)胞相互作用。

在又另一個實(shí)施方式中，t細(xì)胞以大約20倍至大約50倍的范圍擴(kuò)展。

在一個實(shí)施方式中，本文描述的方法進(jìn)一步包括將編碼試劑的mrna電穿孔入擴(kuò)展的t細(xì)胞群。在另一個實(shí)施方式中，試劑mrna與嵌合膜蛋白mrna被共電穿孔。在又另一個實(shí)施方式中，本文描述的方法進(jìn)一步包括使用選自cd27、cd28、cd83、cd86、cd127、4-1bbl、il2、il21、il-15、il-7、pd1-cd28和pd1的至少一種分子或細(xì)胞因子刺激擴(kuò)展的t細(xì)胞群。在另一個實(shí)施方式中，本文描述的方法進(jìn)一步包括冷藏培養(yǎng)的t細(xì)胞。

在另一個實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答是自身免疫性疾病。在又另一個實(shí)施方式中，自身免疫性疾病選自獲得性免疫缺陷綜合征(aids)、斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳疾病(aied)、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(alps)、自身免疫性血小板減少性紫癜(atp)、貝切特氏病、心肌病、乳糜瀉-皰疹樣皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(cfids)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(cipd)、疤痕性類天皰瘡、冷凝集素疾病、crest綜合征、克羅恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盤狀狼瘡、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維變性、特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)、iga腎病、胰島素依賴型糖尿病、青少年慢性關(guān)節(jié)炎(斯提耳氏病)、青少年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、美尼爾氏病、混合結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動炎癥、多軟骨炎、多腺體綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、雷諾氏現(xiàn)象、萊特爾綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病(進(jìn)行性全身性硬化癥(pss)，也稱為全身性硬化癥(ss))、斯耶格倫氏綜合征、僵體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、高安氏動脈炎、顳動脈炎/巨細(xì)胞動脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、眼葡萄膜炎、白斑病、韋格納氏肉芽腫病和其任意組合。

在另一個實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答是癌癥。在又另一個實(shí)施方式中，病癥選自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌和甲狀腺癌。

附圖說明

當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時，將更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的下列詳細(xì)描述。出于說明本發(fā)明的目的，在附圖中顯示了當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方式。然而，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于在附圖中顯示的實(shí)施方式的精確布置和手段。

圖1是抗cd3-h5l1-28bb和抗cd3-okt3-28bb的一組載體圖譜。在兩種構(gòu)建體中，抗cd3scfv與cd8鉸鏈區(qū)，接著cd28跨膜區(qū)、cd28胞內(nèi)區(qū)和4-1bb胞內(nèi)區(qū)融合。

圖2是顯示通過電穿孔o(hù)kt-28bbrna刺激的t細(xì)胞的擴(kuò)展的圖。

圖3是顯示擴(kuò)展的t細(xì)胞的表型分析的圖組。通過電穿孔o(hù)kt-28bb或h5l1-28bbrna的t細(xì)胞擴(kuò)展的t細(xì)胞的表型與通過okt3刺激(okt3)或cd28/cd3珠(beads)刺激在刺激后10天擴(kuò)展的t細(xì)胞的表型比較。

圖4是強(qiáng)調(diào)擴(kuò)展的t細(xì)胞的功能的圖組。如指示的，t細(xì)胞使用不同的方法擴(kuò)展10天。okt3：直接添加okt3抗體至pbmc(okt3)；okt-28bb：使用okt3-28bb電穿孔pbmc；h5l1-28bb：使用h5l1-28bb電穿孔pbmc；或珠：直接添加cd3/cd28珠至pbmc。所有組電穿孔有cd19嵌合抗原受體(car)rna以通過使用cd19陽性腫瘤nalm6進(jìn)行刺激來測試t細(xì)胞功能。在rna電穿孔之后18小時，測定電穿孔cd19carrna的t細(xì)胞的cd19car表達(dá)。

圖5，包括圖5a-b，進(jìn)一步描繪了電穿孔有cd19carrna的擴(kuò)展的t細(xì)胞的功能。擴(kuò)展的細(xì)胞在不同比值下的t細(xì)胞：nalm6細(xì)胞下使用nalm6進(jìn)行刺激(圖5a)。標(biāo)繪了cd107a陽性t細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(圖5b)。

圖6是顯示擴(kuò)展的t細(xì)胞的表型分析的圖組。通過okt-28bb或結(jié)合電穿孔其它rna的t細(xì)胞擴(kuò)展10天的t細(xì)胞的表型與通過okt3(okt3)刺激擴(kuò)展的t細(xì)胞的表型比較。

圖7是顯示通過共電穿孔o(hù)kt-28bb與編碼其它分子的rna擴(kuò)展并且電穿孔有cd19carrna，使用cd19陽性細(xì)胞系刺激18小時的t細(xì)胞的干擾素-γ(ifn-γ)產(chǎn)生水平的柱形圖。通過elisa測量ifn-γ的水平。

圖8是顯示通過共電穿孔o(hù)kt-28bb與編碼其它分子(圖10中列舉的)的rna擴(kuò)展并且電穿孔有cd19carrna，使用cd19陽性細(xì)胞系刺激18小時的t細(xì)胞的il-2產(chǎn)生水平的柱形圖。通過elisa測量il-2的水平。

圖9是圖解對于通過共電穿孔o(hù)kt-28bb與編碼其它分子的rna擴(kuò)展并且電穿孔有cd19carrna，使用cd19陽性腫瘤——nalm6；表達(dá)有pdl1的nalm6；或具有hvem的nalm6——進(jìn)行刺激的t細(xì)胞，通過細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)測定測試的t細(xì)胞裂解活性的圖組。

圖10是詳述rna共電穿孔的表格。okt-28bb-1：通過使pbmc僅電穿孔有okt-28bbrna擴(kuò)展的t細(xì)胞。okt-28bb-2至okt-28bb-6：通過使pbmc共電穿孔有okt-28bb和編碼顯示的其它分子的rna的不同組合擴(kuò)展的t細(xì)胞。

圖11是顯示在第0天靜脈內(nèi)注射有1e6nalm6-eso-cbg的nsg小鼠的圖像組。在第7天，靜脈內(nèi)注射1×10⁶個電穿孔ny-eso-ttcr(1g4tcr)rna的okt3-28bbrnat細(xì)胞(rna-t)或cd3/cd28珠t細(xì)胞(beads)。通過生物發(fā)光成像監(jiān)測腫瘤負(fù)荷。結(jié)果顯示與珠刺激的t細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移有tcr的rna-t細(xì)胞的腫瘤控制更好。

圖12是顯示rna-t細(xì)胞的高效慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的圖組。第1天或第2天，采集rnat細(xì)胞并且以0.5ml、1ml或2ml/孔1.5×10⁶個/ml的細(xì)胞濃度等分入24孔板。0.1ml的濃縮的4d5.bbz慢病毒載體(在5×10⁶個/ml的滴度下)被添加至每個孔。作為對照，在如指示的感染復(fù)數(shù)(moi)下，4d5.bbz慢病毒載體在第1天或第2天被添加至cd3/cd28珠刺激的t細(xì)胞。在刺激之后第9天，擴(kuò)展的t細(xì)胞經(jīng)歷流式細(xì)胞術(shù)染色以便檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)的car表達(dá)。

圖13是顯示慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)rnat細(xì)胞的t細(xì)胞擴(kuò)展的圖。結(jié)果指示慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或未轉(zhuǎn)導(dǎo)rnat細(xì)胞二者都與cd3/cd28珠刺激的t細(xì)胞一樣高效地擴(kuò)展。

圖14是顯示慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)rna-t細(xì)胞中的cd107a上調(diào)的圖組。使用her2陽性細(xì)胞系sk-ov3、mcf7和mda231，或her2陰性腫瘤系mda468刺激慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)rnat細(xì)胞或珠刺激的t細(xì)胞4h，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測cd107a表達(dá)。

圖15是顯示慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)rna-t細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的圖組。使用her2陽性細(xì)胞系sk-ov3、mcf7和mda231，或her2陰性腫瘤系mda468刺激慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)rnat細(xì)胞或珠刺激的t細(xì)胞，并且在過夜培育后通過elisa檢測細(xì)胞因子產(chǎn)生。

具體實(shí)施方式

定義

除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然可以在測試本發(fā)明的實(shí)踐中使用與本文描述的那些類似或等價的任何方法和材料，但是本文描述了優(yōu)選的材料和方法。在描述和要求保護(hù)本發(fā)明中，將使用下列術(shù)語。

也理解本文使用的術(shù)語僅出于描述具體實(shí)施方式的目的，并且不意欲是限制性的。

本文使用冠詞“一個”和“一種”，指的是一個或多于一個(即，至少一個)該冠詞的語法對象。舉例而言，“一個要素”意思是一個要素或多于一個要素。

如本文使用的“大約”，當(dāng)指的是可測量的值比如量、時間期間等時，意思是包括從規(guī)定值的±20％或±10％、更優(yōu)選地±5％、甚至更優(yōu)選地±1％、和還更優(yōu)選地±0.1％的變化，因?yàn)檫@樣的變化適于進(jìn)行公開的方法。

如本文使用的術(shù)語“抗體”指的是與抗原特異性地結(jié)合的免疫球蛋白分子。抗體可以是從自然來源或從重組來源獲得的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分?？贵w通常是免疫球蛋白分子的四聚體。四聚體可以是天然存在的或由單鏈抗體或抗體片段重構(gòu)的。抗體還包括二聚體，其可以是天然存在的或由單鏈抗體或抗體片段構(gòu)建的。本發(fā)明中的抗體可以以多種形式存在，包括，例如，多克隆抗體、單克隆抗體、fv、fab和f(ab')2，以及單鏈抗體(scfv)、人源化抗體、和人抗體(harlow等，1999,in:usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny；harlow等，1989in:antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,newyork；houston等，1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等，1988,science242:423-426)。

術(shù)語“抗體片段”指的是完整抗體的一個區(qū)域，并且指的是完整抗體的抗原決定可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于fab；fab'；f(ab')2；和fv片段；線性抗體；scfv抗體；單結(jié)構(gòu)域抗體，比如駱駝科抗體(camelidantibody)(riechmann,1999,journalofimmunologicalmethods231:25-38)，其由對靶標(biāo)展現(xiàn)充分親和力的vl或vh結(jié)構(gòu)域組成；和由抗體片段形成的多特異性的抗體?？贵w片段還包括人抗體或人源化抗體或其人抗體或人源化抗體的片段。

如本文使用的“抗體重鏈”指的是以它們自然存在的構(gòu)象存在于所有抗體分子中的兩種類型的多肽鏈中的較大的鏈。

如本文使用的“抗體輕鏈”指的是以它們自然存在的構(gòu)象存在于所有抗體分子中的兩種類型的多肽鏈中的較小的鏈。α和β輕鏈指的是兩種主要的抗體輕鏈同種型。

如本文使用的術(shù)語“合成抗體”的意思是使用重組dna技術(shù)生成的抗體，比如，例如，如本文描述的由噬菌體表達(dá)的抗體。該術(shù)語也應(yīng)當(dāng)解釋為意思是已經(jīng)由dna分子——其編碼抗體并且該dna分子表達(dá)抗體蛋白或規(guī)定抗體的氨基酸序列——的合成生成的抗體，其中dna或氨基酸序列已經(jīng)使用本領(lǐng)域可獲得和熟知的合成dna或氨基酸序列技術(shù)獲得。

如本文使用的術(shù)語“抗原”或“ag”定義為激發(fā)免疫應(yīng)答的分子。此免疫應(yīng)答可以包括抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細(xì)胞的活化，或二者。技術(shù)人員將理解任何大分子——實(shí)際上包括所有蛋白質(zhì)或肽——可以充當(dāng)抗原。另外，抗原可以由重組或基因組dna生成。技術(shù)人員將理解任何dna——其包括編碼引起免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列——因此編碼如本文使用的術(shù)語“抗原”。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解抗原不必僅僅由基因的全長核苷酸序列編碼。容易顯而易見的是本發(fā)明包括但不限于多于一個基因的部分核苷酸序列的用途，并且這些核苷酸序列以不同的組合布置以引起期望的免疫應(yīng)答。而且，技術(shù)人員將理解抗原根本不必由“基因”編碼。容易顯而易見的是抗原可以被生成、合成或源自生物學(xué)樣品。這樣的生物學(xué)樣品可以包括但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細(xì)胞或生物學(xué)流體。

如本文使用的術(shù)語“自體的”意思是指源自相同個體的任何物質(zhì)，其隨后被再引入該個體。

“同種異體的”指的是衍生自相同物種的不同動物的移植物。

“異種的”指的是衍生自不同物種的動物的移植物。

如本文使用的術(shù)語“癌癥”定義為以畸變細(xì)胞的快速和失控生長表征的疾病。癌細(xì)胞可以局部地擴(kuò)散或通過血流和淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散至身體的其它部分。多種癌癥的實(shí)例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲狀腺癌等。

如本文使用的術(shù)語“嵌合抗原受體”或“car”指的是被工程化以在免疫效應(yīng)細(xì)胞上表達(dá)和特異性地結(jié)合抗原的人工t細(xì)胞受體。car可以被用作使用過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移的療法。t細(xì)胞從患者移出并且進(jìn)行修飾，使得它們表達(dá)特異于具體形式的抗原的受體。例如，在一些實(shí)施方式中，已經(jīng)以對腫瘤相關(guān)抗原的特異性表達(dá)car。car還可以包括胞內(nèi)活化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域——其包括腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)。在一些方面，car包括融合單鏈可變片段(scfv)衍生的單克隆抗體，其被融合至cd3-ζ跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。car設(shè)計的特異性可以源自受體的配體(例如，肽)。在一些實(shí)施方式中，通過重定向表達(dá)特異于腫瘤相關(guān)抗原的car的t細(xì)胞的特異性，car可以靶向癌癥。

術(shù)語“嵌合膜蛋白”指的是工程化膜蛋白，其具有源自一種或多種信號傳導(dǎo)和/或受體分子的胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或能夠活化一種或多種信號傳導(dǎo)和/或受體分子的胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。例如，本文描述的嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段。

如本文使用的，術(shù)語“保守序列修飾”意欲指的是如此氨基酸修飾，其不顯著地影響或改變包含該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性。這樣的保守修飾包括氨基酸置換、添加和缺失。修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)比如定點(diǎn)誘變和pcr-介導(dǎo)的誘變引入本發(fā)明的抗體。保守氨基酸置換是其中氨基酸殘基被替換為具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的置換。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支化側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。因而，本發(fā)明的抗體的cdr區(qū)內(nèi)的一種或多種氨基酸殘基可以被替換為來自相同側(cè)鏈家族的其它氨基酸殘基，并且可以使用本文描述的功能性測定測試改變的抗體結(jié)合至抗原的能力。

如本文使用的術(shù)語“共刺激配體”包括特異性地結(jié)合t細(xì)胞上的關(guān)聯(lián)共刺激分子的抗原呈遞細(xì)胞(例如，aapc、樹突細(xì)胞、b細(xì)胞等)上的分子，由此除了通過例如將tcr/cd3復(fù)合體與負(fù)載有肽的mhc分子結(jié)合提供的初級信號之外，還提供了介導(dǎo)t細(xì)胞應(yīng)答的信號，所述t細(xì)胞應(yīng)答包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配體可以包括但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、可誘導(dǎo)的共刺激配體(icos-l)、細(xì)胞間粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受體、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem、結(jié)合toll配體受體的激動劑或抗體和與b7-h3特異性地結(jié)合的配體。共刺激配體也包括，特別是與存在于t細(xì)胞上的共刺激分子特異性地結(jié)合的抗體，所述共刺激分子比如，但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和與cd83特異性地結(jié)合的配體。

“共刺激分子”指的是t細(xì)胞上的關(guān)聯(lián)結(jié)合配偶體，其與共刺激配體特異性地結(jié)合，由此介導(dǎo)通過t細(xì)胞的共刺激應(yīng)答，比如，但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于mhci類分子、btla和toll配體受體。

術(shù)語“衍生自…”指的是由具體來源生成、合成，或源自具體來源，以便衍生的物質(zhì)與來源相關(guān)。衍生的物質(zhì)不需要與具體來源相同。在一個實(shí)施方式中，抗原衍生自蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施方式中，單鏈可變片段衍生自單克隆抗體。

術(shù)語“電穿孔(electroporate)”、“電穿孔(electroporation)”、“電穿孔的(electroporated)”指的是通過其將電場施加至細(xì)胞質(zhì)膜以增加其通透性的過程。特定持續(xù)時間和形狀的脈沖被施加至細(xì)胞的細(xì)胞膜以將核酸引入細(xì)胞。

“有效量”或“治療有效量”在本文可交換地使用，并且指的是對實(shí)現(xiàn)具體的生物學(xué)結(jié)果有效的如本文描述的化合物、制劑、材料或組合物的量。這樣的結(jié)果可以包括但不限于抑制病毒感染，如通過本領(lǐng)域適合的任何手段測定的。

“編碼”指的是多核苷酸比如基因、cdna或mrna中的核苷酸的特定序列充當(dāng)模板來合成生物學(xué)過程中的其它多聚體和大分子的固有性質(zhì)，所述多聚體和大分子具有核苷酸(即，rrna、trna和mrna)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一種和由其產(chǎn)生的生物學(xué)性質(zhì)。因而，如果對應(yīng)于基因的mrna的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其它生物學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，則該基因編碼蛋白質(zhì)。其核苷酸序列與mrna序列具有同一性并且通常在序列表中提供的編碼鏈，和用作基因或cdna轉(zhuǎn)錄的模板的非編碼鏈兩者，都可以被稱為編碼該基因或cdna的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。

如本文使用的“內(nèi)源的”指的是來自生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)的或在生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生的任何物質(zhì)。

如本文使用的，術(shù)語“外源的”指的是從生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)引入的或在生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外產(chǎn)生的任何物質(zhì)。

如本文使用的，術(shù)語“擴(kuò)展(expand)”和“擴(kuò)展(expansion)”指的是細(xì)胞比如t細(xì)胞的增殖或倍增。

如本文使用的術(shù)語“表達(dá)”定義為由它的啟動子驅(qū)動的特定核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。

“表達(dá)載體”指的是包括重組多核苷酸的載體，所述重組多核苷酸包括可操作地連接至待表達(dá)的核苷酸序列的表達(dá)控制序列。表達(dá)載體包括足夠的用于表達(dá)的順式作用元件；用于表達(dá)的其它元件可以由宿主細(xì)胞供應(yīng)或在體外表達(dá)系統(tǒng)中供應(yīng)。表達(dá)載體包括所有本領(lǐng)域已知的并入重組多核苷酸的那些，比如粘粒、質(zhì)粒(例如，裸露或包含在脂質(zhì)體中)和病毒(例如，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。

如本文使用的，“同源的”指的是兩個聚合物分子之間，例如，兩個核酸分子——比如兩個dna分子或兩個rna分子——之間，或兩個多肽分子之間的亞基序列同一性。當(dāng)兩個分子的二者中的亞基位置被相同的單體亞基占據(jù)時；例如，如果兩個dna分子的每個中的位置被腺嘌呤占據(jù)，則它們在該位置處是同源的。兩個序列之間的同源性是匹配或同源位置的數(shù)目的直接函數(shù)；例如，如果兩個序列中的一半位置(例如，長度為十個亞基的聚合物中的五個位置)是同源的，則兩個序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10個中的9個)是匹配的或同源的，則兩個序列是90％同源的。

“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(比如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗體的其它抗原-結(jié)合子序列)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)的殘基被來自非人物種(供體抗體)比如小鼠、大鼠或兔的cdr的殘基——其具有期望的特異性、親和力和能力——替換。在一些情況下，人免疫球蛋白的fv框架區(qū)(fr)殘基被對應(yīng)的非人殘基替換。另外，人源化抗體可以包括既沒有在接受者抗體中也沒有在輸入的cdr或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。做出這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包括基本上所有至少一種和通常兩種可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有cdr區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有fr區(qū)是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體最佳地還將包括免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見jones等，nature,321:522-525,1986；reichmann等，nature,332:323-329,1988；presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596,1992。

“全人(fullyhuman)”指的是免疫球蛋白，比如抗體，其中整個分子具有人起源或由與人形式的抗體具有同一性的氨基酸序列構(gòu)成。

短語“免疫有效量”、“抗免疫應(yīng)答有效量”、“免疫應(yīng)答-抑制有效量”或“治療量”指的是待施用至對象的本發(fā)明的組合物的量，所述量由醫(yī)師決定，任選地與科學(xué)家協(xié)商，考慮個體在年齡、重量、免疫應(yīng)答、疾病/病癥的類型、和對象(患者)的健康中的差異，使得在對象中獲得期望的結(jié)果。

如本文使用的“指導(dǎo)材料”包括出版物、記錄、圖表或任何其它可以用于傳達(dá)本發(fā)明的組合物和方法的有用性的表達(dá)媒介。本發(fā)明的試劑盒的指導(dǎo)材料可以例如被附加至包含本發(fā)明的核酸、肽和/或組合物的容器，或與包含核酸、肽和/或組合物的容器一起運(yùn)送?？蛇x地，指導(dǎo)材料可以與容器分開地運(yùn)送，目的是指導(dǎo)材料和化合物由接受者配合使用。

“分離的”意思是從自然狀態(tài)改變或移出。例如，天然存在于活動物中的核酸或肽不是“分離的”，但是部分或完全與它的自然狀態(tài)的共存物質(zhì)分開的相同的核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以以基本上純化的形式存在，或可以存在于非自然環(huán)境，比如，例如，宿主細(xì)胞中。

如本文使用的術(shù)語“修飾的”意思是本發(fā)明的分子或細(xì)胞的改變的狀態(tài)或結(jié)構(gòu)。分子可以以許多方式被修飾，包括化學(xué)地、結(jié)構(gòu)地和功能地。細(xì)胞可以通過引入核酸進(jìn)行修飾。

如本文使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)”意思是與缺少治療或化合物的對象中的應(yīng)答水平相比，和/或與在其它方面相同但未治療的對象中的應(yīng)答水平相比，介導(dǎo)對象中的應(yīng)答水平中的可檢測的增加或減少。該術(shù)語包括擾亂和/或影響天然信號或應(yīng)答，從而介導(dǎo)對象——優(yōu)選地，人——中的有益的治療性應(yīng)答。

在本發(fā)明的背景下，使用常見核酸堿基的下列縮寫?！癮”指的是腺苷，“c”指的是胞嘧啶，“g”指的是鳥苷，“t”指的是胸苷，和“u”指的是尿苷。

除非另外規(guī)定，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的簡并形式并且編碼相同的氨基酸序列的所有的核苷酸序列。短語編碼蛋白質(zhì)或rna的核苷酸序列還可以包括內(nèi)含子，其程度為編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以在一些形式中包含內(nèi)含子(一個或多個)。

術(shù)語“可操作地連接”指的是調(diào)控序列和異源核酸序列之間的功能連接，其導(dǎo)致異源核酸序列的表達(dá)。例如，當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄刑幱谂c第二核酸序列的功能關(guān)系中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動子可操作地連接至編碼序列。通常地，可操作地連接的dna序列是鄰近的，并且在必要時在同一的閱讀框中接合兩個蛋白編碼區(qū)。

免疫原性組合物的“腸胃外”施用包括，例如，皮下(s.c.)、靜脈內(nèi)(i.v.)、肌肉內(nèi)(i.m.)或胸骨內(nèi)注射，或注入技術(shù)。

如本文使用的術(shù)語“多核苷酸”定義為核苷酸鏈。另外，核酸是核苷酸的聚合物。因而，如本文使用的核酸和多核苷酸是可交換的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有核酸是可以被水解為單體“核苷酸”的多核苷酸的一般知識。單體核苷酸可以被水解為核苷。如本文使用的多核苷酸包括但不限于通過本領(lǐng)域可獲得的任何手段獲得的所有的核酸序列，所述手段非限制性地包括重組手段，即，使用普通克隆技術(shù)和pcr^tm等從重組文庫或細(xì)胞基因組克隆核酸序列，和通過合成手段。

如本文使用的，術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可交換地使用，并且指的是由肽鍵共價連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白或肽必須包含至少兩個氨基酸，并且對可以構(gòu)成蛋白質(zhì)或肽的序列的氨基酸的最大數(shù)目沒有限制。多肽包括任何肽或蛋白質(zhì)，所述肽或蛋白質(zhì)包括通過肽鍵相互接合的兩個或更多個氨基酸。如本文使用的，該術(shù)語指的是短鏈，其在本領(lǐng)域中也通常被稱為例如肽、寡肽和寡聚物；和較長鏈二者，其在本領(lǐng)域中通常被稱為蛋白質(zhì)，其具有許多類型?！岸嚯摹卑ɡ缟飳W(xué)活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

如本文使用的術(shù)語“啟動子”定義為起始多核苷酸序列的特異性轉(zhuǎn)錄需要的，由細(xì)胞的合成機(jī)器識別，或合成機(jī)器(machinery)引入的dna序列。

如本文使用的，術(shù)語“啟動子/調(diào)控序列”意思是對于可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列的基因產(chǎn)物的表達(dá)需要的核酸序列。在一些情況下，此序列可以是核心啟動子序列，并且在其它情況下，此序列還可以包括對于基因產(chǎn)物的表達(dá)需要的增強(qiáng)子序列和其它調(diào)控元件。例如，啟動子/調(diào)控序列可以是以組織特異性方式表達(dá)基因產(chǎn)物的序列。

“組成型”啟動子是如下核苷酸序列，當(dāng)其與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時，引起在細(xì)胞的大多數(shù)或所有生理學(xué)條件下在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

“誘導(dǎo)型”啟動子是如下核苷酸序列，當(dāng)其與編碼或規(guī)定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時，引起在基本上僅當(dāng)對應(yīng)于啟動子的誘導(dǎo)物存在于細(xì)胞中時，在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

“組織-特異性”啟動子是如下核苷酸序列，當(dāng)其與編碼基因或由基因規(guī)定的多核苷酸可操作地連接時，引起基本上僅如果細(xì)胞是對應(yīng)于啟動子的組織類型的細(xì)胞，則在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。

“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”指的是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子——其在將信號從細(xì)胞的一個區(qū)域傳遞至細(xì)胞的另一個區(qū)域中發(fā)揮作用——之間的生物化學(xué)關(guān)系。短語“細(xì)胞表面受體”包括分子和分子的復(fù)合體，其能夠跨越細(xì)胞的質(zhì)膜接收信號和傳遞信號?！凹?xì)胞表面受體”的實(shí)例是人cd3或cd28。

“單鏈抗體”指的是通過重組dna技術(shù)形成的抗體，其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈片段經(jīng)由工程化跨度的氨基酸連接至fv區(qū)。生成單鏈抗體的多種方法是已知的，包括在美國專利號4,694,778；bird(1988)science242:423-442；huston等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；ward等(1989)nature334:54454；skerra等(1988)science242:1038-1041中描述的那些。

如本文使用的術(shù)語“特異性地結(jié)合”意思是抗體或配體識別和結(jié)合在樣品中存在的同源結(jié)合配偶體(例如，在t細(xì)胞上存在的刺激和/或共刺激分子)蛋白，但是該抗體或配體基本上不識別或結(jié)合樣品中的其它分子。

術(shù)語“刺激”意思是通過結(jié)合刺激分子(例如，tcr/cd3復(fù)合體)與其關(guān)聯(lián)配體，從而介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件——比如，但不限于經(jīng)tcr/cd3復(fù)合體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)——誘導(dǎo)的初次應(yīng)答。刺激可以介導(dǎo)某些分子的改變的表達(dá)，比如tgf-β的下調(diào)、和/或細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重組等。

“刺激分子”，作為本文使用的術(shù)語，意思是與存在于抗原呈遞細(xì)胞上的關(guān)聯(lián)刺激配體特異性地結(jié)合的t細(xì)胞上的分子。

如本文使用的“刺激配體”意思是如下配體：其當(dāng)存在于抗原呈遞細(xì)胞(例如，aapc、樹突細(xì)胞、b-細(xì)胞等)上時，可以與t細(xì)胞上的關(guān)聯(lián)結(jié)合配偶體(在本文稱為“刺激分子”)特異性地結(jié)合，從而介導(dǎo)t細(xì)胞的初次應(yīng)答，其包括但不限于活化、免疫應(yīng)答的起始、增殖等。刺激配體在本領(lǐng)域是熟知的，并且包括，特別是mhci類分子——負(fù)載有肽、抗cd3抗體、超激動劑抗cd28抗體和超激動劑抗cd2抗體。

術(shù)語“對象”意欲包括其中可以引發(fā)免疫應(yīng)答的活的生物體(例如，哺乳動物)。如其中使用的“對象”或“患者”可以是人或非人哺乳動物。非人哺乳動物包括，例如，家畜和寵物，比如棉羊、?？苿游?、豬科動物、犬科動物、貓科動物和鼠科哺乳動物。優(yōu)選地，對象是人。

如本文使用的“基本上純化的”細(xì)胞是大體上不含其它細(xì)胞類型的細(xì)胞?；旧霞兓募?xì)胞也指的是已經(jīng)與其它細(xì)胞類型——在其天然存在狀態(tài)中與該其它細(xì)胞類型正常相關(guān)聯(lián)——分開的細(xì)胞。在一些情況下，基本上純化的細(xì)胞群指的是均質(zhì)細(xì)胞群。在其它情況下，此術(shù)語簡單地指的是已經(jīng)與在其天然狀態(tài)中與該細(xì)胞正常相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞分開的細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，在體外培養(yǎng)細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，不在體外培養(yǎng)細(xì)胞。

“靶位點(diǎn)”或“靶序列”指的是基因組核酸序列，其限定了在足以發(fā)生結(jié)合的條件下可以與結(jié)合分子特異性地結(jié)合的核酸區(qū)域。

如本文使用的，術(shù)語“t細(xì)胞受體”或“tcr”指的是響應(yīng)于抗原的呈遞參與t細(xì)胞的活化的膜蛋白的復(fù)合體。tcr負(fù)責(zé)識別結(jié)合至主要組織相容性復(fù)合體分子的抗原。tcr由alpha(a)和beta(β)鏈的異二聚體組成，但是在一些細(xì)胞中，tcr由γ和δ(γ/δ)鏈構(gòu)成。tcr可以以α/β和γ/δ形式存在，其是結(jié)構(gòu)上相似的，但是具有不同的解剖學(xué)位置和功能。每個鏈由兩個胞外結(jié)構(gòu)域——可變和恒定結(jié)構(gòu)域——組成。在一些實(shí)施方式中，tcr可以在包括tcr的任何細(xì)胞上被修飾，包括，例如，輔助性t細(xì)胞、細(xì)胞毒性t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞、天然殺傷t細(xì)胞和γδt細(xì)胞。

如本文使用的術(shù)語“治療性的”意思是治療和/或預(yù)防。治療性效果通過疾病狀態(tài)的阻抑、緩解或根除獲得。

如本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”指的是如下過程：通過該過程外源性核酸被轉(zhuǎn)移或引入宿主細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)化的”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞是已經(jīng)被轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)有外源性核酸的細(xì)胞。細(xì)胞包括原代對象細(xì)胞和其子代。

如本文使用的短語“在轉(zhuǎn)錄控制下”或“可操作地連接的”意思是啟動子處于與多核苷酸有關(guān)的正確的位置和取向，以控制通過rna聚合酶的轉(zhuǎn)錄的起始和多核苷酸的表達(dá)。

“載體”是物質(zhì)組合物，其包括分離的核酸，并且其可以用于遞送分離的核酸至細(xì)胞內(nèi)部。眾多載體在本領(lǐng)域是已知的，包括但不限于線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物相關(guān)聯(lián)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因而，術(shù)語“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?。該術(shù)語也應(yīng)當(dāng)解釋為包括便于將核酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞的非質(zhì)粒和非病毒化合物，比如，例如，聚賴氨酸化合物、脂質(zhì)體等。病毒載體的實(shí)例包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體等。

范圍：遍及本公開內(nèi)容，本發(fā)明的多個方面可以以范圍格式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解范圍格式的描述僅僅出于方便和簡潔，并且不應(yīng)當(dāng)解釋為對本發(fā)明的范圍的僵硬限制。因此，范圍的描述應(yīng)當(dāng)被考慮已經(jīng)具體地公開了所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單個數(shù)值。例如，比如1至6的范圍的描述應(yīng)當(dāng)被考慮已經(jīng)具體地公開了子范圍比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及該范圍內(nèi)的單個數(shù)字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范圍的寬度如何，這均適用。

描述

本發(fā)明包括用于擴(kuò)展電穿孔的t細(xì)胞群的方法。該方法包括使包括t細(xì)胞的細(xì)胞群——比如外周血單核細(xì)胞——電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的mrna，其中mrna被引入所述群中的細(xì)胞的至少一個中并且在細(xì)胞的表面上表達(dá)。在一個實(shí)施方式中，嵌合膜蛋白包括與分子比如tcr/cd3結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和共刺激分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在另一個實(shí)施方式中，培養(yǎng)電穿孔的群，其中包含在其中的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。因此，本發(fā)明允許擴(kuò)展來自細(xì)胞群的t細(xì)胞并且制備細(xì)胞用于治療應(yīng)用，比如過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

方法

在一方面，本發(fā)明包括擴(kuò)展t細(xì)胞群的方法，其中方法包括使包括t細(xì)胞的細(xì)胞群——比如外周血單核細(xì)胞——電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的mrna的步驟。嵌合膜蛋白包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括與分子比如tcr/cd3結(jié)合的抗體或其片段。mrna被引入所述群中的細(xì)胞的至少一個中并且在細(xì)胞的表面上表達(dá)，并且培養(yǎng)電穿孔的細(xì)胞群，其中包含在其中的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。

在另一方面，本發(fā)明包括用于擴(kuò)展電穿孔的t細(xì)胞群的方法，其中方法包括使包括t細(xì)胞的細(xì)胞群電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的mrna的步驟。嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段。mrna被引入所述群中的細(xì)胞的至少一個中并且在細(xì)胞的表面上表達(dá)。培養(yǎng)電穿孔的細(xì)胞群，其中包含在其中的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。

在一個實(shí)施方式中，細(xì)胞選自外周血單核細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、純化的t細(xì)胞群、和t細(xì)胞系。

在另一個實(shí)施方式中，本文描述的方法進(jìn)一步包括將編碼試劑的mrna電穿孔入擴(kuò)展的t細(xì)胞群，比如共電穿孔編碼試劑的核酸與編碼嵌合膜蛋白的核酸。

在又另一個實(shí)施方式中，本文描述的方法進(jìn)一步包括使用選自cd27、cd28、cd83、cd86、cd127、4-1bbl、il21、il15、il-7、pd1-cd28和pd1的至少一種分子或細(xì)胞因子刺激擴(kuò)展的t細(xì)胞群。

在還另一個實(shí)施方式中，本文描述的方法進(jìn)一步包括冷藏培養(yǎng)的t細(xì)胞。

引入核酸

將核酸引入細(xì)胞的方法包括物理、生物和化學(xué)方法。用于將多核苷酸比如rna引入宿主細(xì)胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。rna可以使用商業(yè)上可獲得的方法被引入靶細(xì)胞，所述方法包括電穿孔(amaxanucleofector-ii(amaxabiosystems,cologne,germany))、ecm830(btx)(harvardinstruments,boston,mass.)或genepulserii(biorad,denver,colo.)、multiporator(eppendort,hamburggermany)。rna還可以通過如下方法被引入細(xì)胞：使用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、使用聚合物封裝、使用肽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、或使用生物射彈粒子遞送系統(tǒng)比如“基因槍”(參見，例如，nishikawa等humgenether.,12(8):861-70(2001))。

用于將感興趣的多核苷酸引入宿主細(xì)胞的生物學(xué)方法包括使用dna和rna載體。病毒載體，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，已經(jīng)成為最廣泛使用的方法，其用于將基因插入哺乳動物，例如，人細(xì)胞。其它病毒載體可以衍生自慢病毒、痘病毒、i型單純皰疹病毒、腺病毒和腺伴隨病毒等。參見，例如，美國專利號5,350,674和5,585,362。

用于將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的化學(xué)手段包括膠體分散系統(tǒng)，比如大分子復(fù)合體、納米膠囊、微球、珠、和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)——其包括水包油型乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。用作體外和體內(nèi)遞送媒介物的示例性膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體(例如，人工膜囊泡)。

適于使用的脂質(zhì)可以從商業(yè)來源獲得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(“dmpc”)可以從sigma,st.louis,mo獲得；磷酸二鯨蠟酯(“dcp”)可以從k&klaboratories(plainview,ny)獲得；膽固醇(“choi”)可以從calbiochem-behring獲得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“dmpg”)和其它脂質(zhì)可以從avantipolarlipids,inc.(birmingham,al)獲得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂質(zhì)的原液可以被保存在大約-20℃下。氯仿被用作唯一的溶劑，因?yàn)樗燃状几菀渍舭l(fā)?！爸|(zhì)體”是通用術(shù)語，其包括通過生成封閉的脂雙層或聚集體而形成的多種單層和多層脂質(zhì)媒介物。脂質(zhì)體可以表征為具有囊泡結(jié)構(gòu)，其具有磷脂雙層膜和內(nèi)部水性介質(zhì)。多層脂質(zhì)體具有由水性介質(zhì)分開的多個脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮在過量的水性溶液中時，它們自發(fā)形成。在形成封閉的結(jié)構(gòu)和使水與溶解的溶質(zhì)陷入脂雙層之間前，脂質(zhì)組分經(jīng)歷自我重排(ghosh等，1991glycobiology5:505-10)。然而，也包括與正常的囊泡結(jié)構(gòu)相比溶液中具有不同結(jié)構(gòu)的組合物。例如，脂質(zhì)可以呈現(xiàn)膠束結(jié)構(gòu)或僅僅作為脂質(zhì)分子的非均一聚集體存在。同樣考慮的是脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-核酸復(fù)合體。

不管用于將外源性核酸引入宿主細(xì)胞或以其它方式使細(xì)胞暴露于本發(fā)明的抑制劑的方法如何，為了確認(rèn)核酸在宿主細(xì)胞中的存在，可以進(jìn)行多種測定。這樣的測定包括，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的“分子生物學(xué)”測定，比如dna印跡和rna印跡、rt-pcr和pcr；“生物化學(xué)”測定，比如檢測特定肽的存在或不存在，例如，通過免疫學(xué)手段(ellsa和蛋白質(zhì)印跡)或通過本文描述的鑒定試劑的測定，其落入本發(fā)明范圍內(nèi)。

rna

在一個實(shí)施方式中，rna被引入靶細(xì)胞。在另一個實(shí)施方式中，rna是包括體外轉(zhuǎn)錄的rna或合成rna的mrna。使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)-生成的模板通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生rna。來自任何來源的感興趣的dna可以通過pcr直接轉(zhuǎn)化為使用適當(dāng)?shù)囊锖蛂na聚合酶的體外mrna合成的模板。dna的來源可以是，例如，基因組dna、質(zhì)粒dna、噬菌體dna、cdna、合成的dna序列或任何其它適當(dāng)?shù)膁na來源。體外轉(zhuǎn)錄的期望的模板是嵌合膜蛋白。舉例而言，模板編碼抗體、抗體的片段或抗體的一部分。又舉例而言，模板包括胞外結(jié)構(gòu)域——其包括抗體比如抗cd3的單鏈可變結(jié)構(gòu)域；和共刺激分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方式中，rna嵌合膜蛋白的模板編碼嵌合膜蛋白，其包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括針對分子的抗體或其片段；和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段。

pcr可以用于生成體外轉(zhuǎn)錄mrna——其隨后被引入細(xì)胞——的模板。用于進(jìn)行pcr的方法是本領(lǐng)域熟知的。用于pcr的引物設(shè)計為具有與待用作pcr的模板的dna的區(qū)域基本上互補(bǔ)的區(qū)域。如本文使用的“基本上互補(bǔ)”指的是其中引物序列中大部分或所有的堿基是互補(bǔ)的，或一個或多個堿基是非互補(bǔ)的或錯配的核苷酸的序列?；旧匣パa(bǔ)的序列能夠與預(yù)期dna靶標(biāo)在用于pcr的退火條件下退火或雜交。引物可以設(shè)計為與dna模板的任何部分基本上互補(bǔ)。例如，引物可以設(shè)計為擴(kuò)增在細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄的基因部分(開放閱讀框)，其包括5'和3'utr。引物也可以設(shè)計為擴(kuò)增編碼感興趣的具體結(jié)構(gòu)域的基因部分。在一個實(shí)施方式中，引物設(shè)計為擴(kuò)增包括所有或部分的5'和3'utr的人cdna的編碼區(qū)。通過本領(lǐng)域熟知的合成方法生成可用于pcr的引物?！罢蛞铩笔前c待擴(kuò)增的dna序列上游的dna模板上的核苷酸基本上互補(bǔ)的核苷酸區(qū)域的引物。本文使用的“上游”指的是待擴(kuò)增的dna序列相對于編碼鏈的5'位置。“反向引物”是包含與待擴(kuò)增的dna序列下游的雙鏈dna模板基本上互補(bǔ)的核苷酸區(qū)域的引物。本文使用的“下游”指的是待擴(kuò)增的dna序列相對于編碼鏈的3'位置。

還可以使用具有促進(jìn)rna的穩(wěn)定性和/或翻譯效率的能力的化學(xué)結(jié)構(gòu)。rna優(yōu)選地具有5'和3'utr。在一個實(shí)施方式中，5'utr的長度在零和3000個核苷酸之間。待添加至編碼區(qū)的5'和3'utr序列的長度可以通過不同的方法改變，包括但不限于設(shè)計用于pcr的引物，其退火至utr的不同區(qū)域。使用此方法，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以修改實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄的rna之后最佳翻譯效率所需要的5'和3'utr長度。

5'和3'utr可以是感興趣的基因的天然存在的內(nèi)源性5'和3'utr?？蛇x地，可以通過將utr序列并入正向和反向引物或通過模板的任何其它修飾添加對感興趣的基因非內(nèi)源性的utr序列。使用對感興趣的基因非內(nèi)源性的utr序列可以有用于修改rna的穩(wěn)定性和/或翻譯效率。例如，已知3'utr序列中的富au元件可以降低mrna的穩(wěn)定性。因此，3'utr可以被選擇或設(shè)計以基于本領(lǐng)域熟知的utr的性質(zhì)增加轉(zhuǎn)錄的rna的穩(wěn)定性。

在一個實(shí)施方式中，5'utr可以包含內(nèi)源基因的kozak序列。可選地，當(dāng)正通過如上面描述的pcr添加對感興趣的基因非內(nèi)源性的5'utr時，可以通過添加5'utr序列重新設(shè)計共有的kozak序列。kozak序列可以增加一些rna轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率，但是似乎不是所有rna高效翻譯所需要的。對于許多mrna的kozak序列的要求是本領(lǐng)域已知的。在其它實(shí)施方式中，5'utr可以源自rna基因組在細(xì)胞中穩(wěn)定的rna病毒。在其它實(shí)施方式中，多種核苷酸類似物可以用于3'或5'utr以阻礙mrna的核酸外切酶降解。

為了能夠?qū)崿F(xiàn)從dna模板合成rna而不需要基因克隆，轉(zhuǎn)錄的啟動子應(yīng)當(dāng)附加至待轉(zhuǎn)錄的序列上游的dna模板。當(dāng)作為rna聚合酶的啟動子起作用的序列被添加至正向引物的5'末端時，rna聚合酶啟動子并入待轉(zhuǎn)錄的開放閱讀框上游的pcr產(chǎn)物。在一個實(shí)施方式中，啟動子是t7聚合酶啟動子，如本文其它地方描述的。其它有用的啟動子包括但不限于t3和sp6rna聚合酶啟動子。t7、t3和sp6啟動子的共有的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的。

在一個實(shí)施方式中，mrna具有5'末端上的帽和3'聚腺苷酸尾，其決定核糖體結(jié)合、翻譯的起始和mrna在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。在環(huán)狀dna模板，例如，質(zhì)粒dna上，rna聚合酶產(chǎn)生不適于在真核細(xì)胞中表達(dá)的長的多聯(lián)體產(chǎn)物(concatamericproduct)。在3'utr的末端處線性化的質(zhì)粒dna的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正常大小的mrna，其在真核轉(zhuǎn)染中無效，即使其在轉(zhuǎn)錄之后被聚腺苷酸化。

在線性dna模板上，噬菌體t7rna聚合酶可以使轉(zhuǎn)錄物的3'末端延伸超過模板的最后一個堿基(schenborn和mierendorf,nucacidsres.,13:6223-36(1985)；nacheva和berzal-herranz,eur.j.biochem.,270:1485-65(2003))。

將聚a/t一段序列(stretch)整合入dna模板的常規(guī)方法是分子克隆。然而，整合入質(zhì)粒dna的聚a/t序列可以引起質(zhì)粒不穩(wěn)定，這就是為什么從細(xì)菌細(xì)胞獲得的質(zhì)粒dna模板經(jīng)常被缺失和其它畸變高度污染。這使得克隆程序不僅費(fèi)力且耗時，而且經(jīng)常不可靠。這就是為什么允許構(gòu)建具有聚a/t3'一段序列的dna模板而沒有克隆的方法是高度期望的。

轉(zhuǎn)錄的dna模板的聚a/t區(qū)段可以在pcr期間通過使用包含聚t尾——比如100個t尾(大小可以是50-5000個t)——的反向引物產(chǎn)生，或在pcr后通過任何其它方法產(chǎn)生，所述方法包括但不限于dna連接或體外重組。聚腺苷酸尾也為rna提供穩(wěn)定性并且減少它們的降解。通常，聚腺苷酸尾的長度與轉(zhuǎn)錄的rna的穩(wěn)定性正相關(guān)。在一個實(shí)施方式中，聚腺苷酸尾在100和5000個腺苷之間。

rna的聚腺苷酸尾可以在體外轉(zhuǎn)錄之后使用聚腺苷酸聚合酶——比如大腸桿菌聚腺苷酸聚合酶(e-pap)——進(jìn)一步延伸。在一個實(shí)施方式中，使聚腺苷酸尾的長度從100個核苷酸增加至300和400個核苷酸之間導(dǎo)致rna的翻譯效率增加大約兩倍。額外地，不同的化學(xué)基團(tuán)附加至3'末端可以增加mrna穩(wěn)定性。這樣的附加可以包含修飾的/人工的核苷酸、適配體和其它化合物。例如，atp類似物可以使用聚腺苷酸聚合酶并入聚腺苷酸尾。atp類似物可以進(jìn)一步增加rna的穩(wěn)定性。

5'帽也為rna分子提供穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過本文公開的方法產(chǎn)生的rna包括5'帽。使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的技術(shù)提供5'帽(cougot,等，trendsinbiochem.sci.,29:436-444(2001)；stepinski,等，rna,7:1468-95(2001)；elango,等，biochim.biophys.res.commun.,330:958-966(2005))。

通過本文公開的方法產(chǎn)生的rna還可以包含內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)序列。ires序列可以是起始帽-獨(dú)立性核糖體結(jié)合至mrna并且促進(jìn)翻譯起始的任何病毒序列、染色體序列或人工設(shè)計的序列?？梢园ㄟm于細(xì)胞電穿孔的任何溶質(zhì)，其可以包含促進(jìn)細(xì)胞通透性和生存力的因子，比如糖、肽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、抗氧化劑和表面活性劑。

在一些實(shí)施方式中，編碼嵌合膜蛋白的mrna被電穿孔入細(xì)胞。在一個實(shí)施方式中，編碼嵌合膜蛋白的mrna是體外轉(zhuǎn)錄的mrna。

公開的方法可以在癌癥、干細(xì)胞、急性和慢性感染、和自身免疫性疾病領(lǐng)域中的基礎(chǔ)研究和療法中應(yīng)用于調(diào)節(jié)t細(xì)胞活性，其包括評估基因修飾的t細(xì)胞殺傷靶癌細(xì)胞的能力。

方法還提供了通過改變例如啟動子或輸入rna的量在寬的范圍內(nèi)控制表達(dá)水平的能力，其使得可能單獨(dú)地調(diào)控表達(dá)水平。另外，基于pcr的mrna生產(chǎn)技術(shù)極大地促進(jìn)具有不同結(jié)構(gòu)和它們的結(jié)構(gòu)域組合的嵌合受體mrna的設(shè)計。例如，相同細(xì)胞中的多種嵌合受體上的不同的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)物/共刺激物(costimulator)結(jié)構(gòu)域的改變允許決定受體組合的結(jié)構(gòu)，其評估抗多抗原靶標(biāo)的最高水平的細(xì)胞毒性，和同時對正常細(xì)胞的最低細(xì)胞毒性。

本發(fā)明的rna轉(zhuǎn)染方法的一個優(yōu)勢是rna轉(zhuǎn)染大體上是瞬時和無載體的。rna轉(zhuǎn)基因可以在簡短的體外細(xì)胞活化之后被遞送至淋巴細(xì)胞并且在其中表達(dá)，其作為最小的表達(dá)盒而不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下，轉(zhuǎn)基因整合入宿主細(xì)胞基因組是不可能的。由于rna的轉(zhuǎn)染效率和其均勻修飾整個淋巴細(xì)胞群的能力，細(xì)胞的克隆不是必需的。

使用體外-轉(zhuǎn)錄的rna(ivt-rna)的t細(xì)胞的基因修飾利用均已經(jīng)成功在多種動物模型中測試的兩種不同的策略。借助脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或電穿孔，使用體外-轉(zhuǎn)錄的rna轉(zhuǎn)染細(xì)胞。使用各種修飾穩(wěn)定ivt-rna是期望的，以便實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的ivt-rna的延長表達(dá)。

一些ivt載體在文獻(xiàn)中是已知的，其以標(biāo)準(zhǔn)化方式用作體外轉(zhuǎn)錄的模板并且其已經(jīng)被基因修飾為使得產(chǎn)生穩(wěn)定的rna轉(zhuǎn)錄物。用于本領(lǐng)域的目前的方案基于具有下列結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體：使得能夠rna轉(zhuǎn)錄的5'rna聚合酶啟動子，接著是由非翻譯區(qū)域(utr)在3'和/或5'為側(cè)翼的感興趣的基因，和包含50-70個a核苷酸的3'聚腺嘌呤基盒。體外轉(zhuǎn)錄之前，環(huán)狀質(zhì)粒在聚腺嘌呤基盒下游通過ii型限制酶(對應(yīng)于切割位點(diǎn)的識別序列)線性化。聚腺嘌呤基盒因而對應(yīng)于轉(zhuǎn)錄物中的后面的聚腺苷酸序列。作為此程序的結(jié)果，在線性化后一些核苷酸仍作為部分酶切割位點(diǎn)并且延伸或掩蓋3'末端處的聚腺苷酸序列。尚不清楚此非生理學(xué)突出端是否影響從這樣的構(gòu)建體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。

rna具有優(yōu)于更傳統(tǒng)的質(zhì)?；虿《痉椒ǖ脑S多優(yōu)勢。來自rna來源的基因表達(dá)不需要轉(zhuǎn)錄并且在轉(zhuǎn)染后快速地產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物。進(jìn)一步，由于rna必須僅接近細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核，并且因此典型的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)致極高的轉(zhuǎn)染率。此外，基于質(zhì)粒的方法需要驅(qū)動感興趣的基因表達(dá)的啟動子在研究的細(xì)胞中是活性的。

在另一方面，rna構(gòu)建體通過電穿孔可以被遞送入細(xì)胞。參見，例如，如在us2004/0014645、us2005/0052630a1、us2005/0070841a1、us2004/0059285a1、us2004/0092907a1中教導(dǎo)的將核酸構(gòu)建體電穿孔入哺乳動物細(xì)胞的制劑和方法。包括電穿孔任何已知的細(xì)胞類型所需要的電場強(qiáng)度在內(nèi)的多個參數(shù)在相關(guān)研究文獻(xiàn)以及領(lǐng)域中的眾多專利和申請中通常是已知的。參見例如，美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264和美國專利號7,173,116。用于電穿孔的治療性應(yīng)用的設(shè)備是商業(yè)上可獲得的，例如，medpulser^tmdna電穿孔治療系統(tǒng)(inovio/genetronics,sandiego,calif.)，并且描述在專利比如美國專利號6,567,694；美國專利號6,516,223、美國專利號5,993,434、美國專利號6,181,964、美國專利號6,241,701和美國專利號6,233,482中；電穿孔也可以用于體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染，例如，如在us20070128708a1中描述的。電穿孔也可以用于將核酸體外遞送入細(xì)胞。因此，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何的許多可用的裝置和電穿孔系統(tǒng)將包括核酸的表達(dá)構(gòu)建體電穿孔-介導(dǎo)施用入細(xì)胞提供了令人激動的遞送感興趣的rna至靶細(xì)胞的新手段。

t細(xì)胞的來源

在擴(kuò)展之前，從對象獲得t細(xì)胞的來源。對象的非限制性實(shí)例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠和其轉(zhuǎn)基因物種。優(yōu)選地，對象是人。t細(xì)胞可以從大量來源獲得，包括外周血單核細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、脾臟組織、臍帶和腫瘤。在某些實(shí)施方式中，可以使用本領(lǐng)域可獲得的任意數(shù)目的t細(xì)胞系。在某些實(shí)施方式中，t細(xì)胞可以使用技術(shù)人員已知的任意數(shù)目的技術(shù)比如ficoll分離從自對象收集的血液單位獲得。在一個實(shí)施方式中，來自個體的循環(huán)血的細(xì)胞通過單采血液成分術(shù)或白細(xì)胞提取法獲得。單采血液成分術(shù)產(chǎn)物通常包含淋巴細(xì)胞，其包括t細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、b細(xì)胞、其它成核的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板?？梢郧逑从蓡尾裳撼煞中g(shù)收集的細(xì)胞以移除血漿級分并將細(xì)胞放置在適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)基中，用于隨后的處理步驟，所述緩沖液或培養(yǎng)基比如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)或清洗溶液，其缺少鈣并且可以缺少鎂或可以缺少許多——如果不是全部的話——二價陽離子。在清洗后，細(xì)胞可以重懸在各種生物相容性緩沖液中，比如，例如，無ca、無mg的pbs?？蛇x地，可以移除單采血液成分術(shù)樣品的非期望的組分，并且將細(xì)胞直接重懸在培養(yǎng)基中。

在另一個實(shí)施方式中，t細(xì)胞通過裂解紅細(xì)胞和耗減單核細(xì)胞，例如，通過經(jīng)過percoll^tm梯度的離心，從外周血分離?？蛇x地，t細(xì)胞可以從臍帶分離。無論如何，t細(xì)胞的特定亞群可以進(jìn)一步通過陽性或陰性選擇技術(shù)分離。

這樣分離的臍帶血單核細(xì)胞可以耗減表達(dá)某些抗原——其包括但不限于cd34、cd8、cd14、cd19和cd56——的細(xì)胞。這些細(xì)胞的耗減可以使用分離的抗體、包括抗體的生物學(xué)樣品比如腹水、結(jié)合至物理載體的抗體和細(xì)胞結(jié)合抗體完成。

通過陰性選擇富集t細(xì)胞群可以使用針對表面標(biāo)志物——其對陰性選擇的細(xì)胞獨(dú)特——的抗體的組合完成。優(yōu)選的方法是細(xì)胞分選和/或選擇，其經(jīng)由陰性磁性免疫粘附或使用針對在陰性選擇的細(xì)胞上存在的細(xì)胞表面標(biāo)志物的單克隆抗體的混合物的流式細(xì)胞術(shù)。例如，為了通過陰性選擇富集cd4+細(xì)胞，單克隆抗體混合物通常包括針對cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗體。

對于通過陽性或陰性選擇分離期望的細(xì)胞群，可以改變細(xì)胞和表面(例如，顆粒比如珠)的濃度。在某些實(shí)施方式中，可以期望顯著地減小珠和細(xì)胞混合在一起的體積(即，增加細(xì)胞的濃度)，以確保細(xì)胞和珠的最大接觸。例如，在一個實(shí)施方式中，使用20億個細(xì)胞/ml的濃度。在一個實(shí)施方式中，使用10億個細(xì)胞/ml的濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用多于1億個細(xì)胞/ml。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×10⁶個細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。在又另一個實(shí)施方式中，使用75、80、85、90、95或100×10⁶個細(xì)胞/ml的細(xì)胞濃度。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，可以使用125或150×10⁶個細(xì)胞/ml的濃度。使用高濃度可以導(dǎo)致增加的細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活化和細(xì)胞擴(kuò)展。

在清洗步驟后，t細(xì)胞也可以被冷凍，其不需要單核細(xì)胞移除步驟。盡管不希望被理論所束縛，但通過移除細(xì)胞群中的粒細(xì)胞和在一定程度上移除單核細(xì)胞，冷凍和隨后的解凍步驟提供了更均一的產(chǎn)物。在移除血漿和血小板的清洗步驟后，細(xì)胞可以被懸浮在冷凍溶液中。雖然很多冷凍溶液和參數(shù)是本領(lǐng)域已知的，并且將在此背景下是有用的，但是在非限制性實(shí)例中，一種方法包括使用包含20％dmso和8％人血清白蛋白的pbs，或其它合適的細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基。細(xì)胞然后以每分鐘1℃的速率冷凍至-80℃，并且儲存在液氮儲罐的蒸汽相中?？梢允褂檬芸乩鋬龅钠渌椒ㄒ约霸?20℃下或液氮中即刻不受控的冷凍。

在一個實(shí)施方式中，細(xì)胞群可以包括外周血單核細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、純化的t細(xì)胞群、和t細(xì)胞系。在另一個實(shí)施方式中，待電穿孔的細(xì)胞群包括外周血單核細(xì)胞。在又另一個實(shí)施方式中，待電穿孔的細(xì)胞群包括純化的t細(xì)胞。

嵌合膜蛋白

本發(fā)明的嵌合膜蛋白包括胞外和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域包括靶特異性結(jié)合元件，比如抗體。在一個實(shí)施方式中，嵌合膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域靶向包括但不限于tcr、cd3、cd28等的t細(xì)胞上的分子。

胞外結(jié)構(gòu)域

本發(fā)明包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括針對t細(xì)胞上的分子的抗體或其片段。分子可以包括共刺激t細(xì)胞的任何分子，比如，但不限于tcr、cd3、cd28或其組合。在一個實(shí)施方式中，胞外結(jié)構(gòu)域可以包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包括抗cd3抗體、抗tcr抗體、抗cd28抗體或其組合的cd3結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

在另一個實(shí)施方式中，胞外結(jié)構(gòu)域可以包括結(jié)合至抗原的抗體的任何片段，其包括但不限于合成抗體、人抗體、人源化抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈可變片段、和其片段的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些情況下，胞外結(jié)構(gòu)域源自相同的物種——嵌合膜蛋白將最終用于其中——是有利的。例如，對于用于人，嵌合膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域包括人抗體或其片段可以是有利的。因而，在一個實(shí)施方式中，胞外結(jié)構(gòu)域包括人抗體或其片段。

在一個實(shí)施方式中，抗體是合成抗體、人抗體、人源化抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體、單鏈可變片段和其抗原-結(jié)合片段。

胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域

胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包括共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)。共刺激信號傳導(dǎo)區(qū)指的是共刺激分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。共刺激分子是除抗原受體或其配體之外的細(xì)胞表面分子，其是淋巴細(xì)胞對抗原高效應(yīng)答所需要的。

嵌合膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)活化t細(xì)胞的效應(yīng)物功能中的至少一種。術(shù)語“效應(yīng)物功能”指的是細(xì)胞的專有功能。例如，t細(xì)胞的效應(yīng)物功能可以是包括分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞溶解活性或輔助活性。因而，術(shù)語“胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”指的是轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)物功能信號并且指導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行專有功能的蛋白質(zhì)部分。雖然經(jīng)常可以采用整個胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，但是在很多情況下，不必需使用整個鏈。就使用胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的截短部分而言，這樣的截短部分可以用于替代完整的鏈，只要它轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)物功能信號。術(shù)語胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域因而意思是包括足以轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)物功能信號的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的任何截短部分。

用于嵌合膜蛋白的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的非限制性實(shí)例包括cd28、4-1bb、t細(xì)胞受體(tcr)、共刺激分子的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的任何片段，這些序列的任何衍生物或變體，具有相同功能性能力的任何合成序列，和其任意組合。

嵌合膜蛋白的其它結(jié)構(gòu)域

在嵌合膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，或在嵌合膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域之間，可以并入間隔結(jié)構(gòu)域。如本文使用的，術(shù)語“間隔結(jié)構(gòu)域”通常意思是起將跨膜結(jié)構(gòu)域連接至多肽鏈中的胞外結(jié)構(gòu)域或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域作用的任何寡肽或多肽。間隔結(jié)構(gòu)域可以包括多至300個氨基酸，優(yōu)選地10至100個氨基酸和最優(yōu)選地25至50個氨基酸。

在一些實(shí)施方式中，嵌合膜蛋白進(jìn)一步包括跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方式中，嵌合膜蛋白進(jìn)一步包括鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一個實(shí)施方式中，編碼嵌合膜蛋白的mrna進(jìn)一步包括跨膜和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，比如cd28跨膜結(jié)構(gòu)域和cd8-α鉸鏈結(jié)構(gòu)域。

人抗體

對于在人體內(nèi)使用抗體，使用人抗體可以是優(yōu)選的。完全人抗體對于人對象的治療性處理是特別期望的。人抗體可以通過各種本領(lǐng)域已知的方法制造，所述方法包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗體文庫的噬菌體展示方法，其包括對這些技術(shù)的改進(jìn)。還參見美國專利號4,444,887和4,716,111；和pct公布wo98/46645、wo98/50433、wo98/24893、wo98/16654、wo96/34096、wo96/33735和wo91/10741；其每篇通過引用以其全部并入本文。人抗體還可以是如此抗體，其中重鏈和輕鏈由源自一個或多個人dna來源的核苷酸序列編碼。

人抗體還可以使用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白但可以表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來產(chǎn)生。例如，人重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因復(fù)合體可以被隨機(jī)地或通過同源重組引入小鼠胚胎干細(xì)胞?？蛇x地，除人重鏈和輕鏈基因之外，人可變區(qū)、恒定區(qū)和多變區(qū)也可以被引入小鼠胚胎干細(xì)胞。通過同源重組，可以與引入人免疫球蛋白基因座分開地或同時地使小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因非功能性。例如，已經(jīng)描述了在嵌合和種系突變小鼠中純合缺失抗體重鏈j區(qū)(jh)基因?qū)е聝?nèi)源性抗體產(chǎn)生的完全抑制。修飾的胚胎干細(xì)胞被擴(kuò)展并且顯微注射入胚泡以產(chǎn)生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以產(chǎn)生表達(dá)人抗體的純合后代。轉(zhuǎn)基因小鼠以正常的方式使用選擇的抗原——例如本發(fā)明的多肽的全部或部分——進(jìn)行免疫。針對選擇的靶標(biāo)的抗體可以使用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)從免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得。由轉(zhuǎn)基因小鼠聚藏(harbor)的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在b細(xì)胞分化期間重排，并且隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因而，使用這樣的技術(shù)可能產(chǎn)生治療上有用的igg、iga、igm和ige抗體，包括但不限于igg1(γ1)和igg3。對于此技術(shù)用于產(chǎn)生人抗體的綜述，參見lonberg和huszar(int.rev.immunol.,13:65-93(1995))。對于此技術(shù)用于產(chǎn)生人抗體和人單克隆抗體以及用于生產(chǎn)這樣的抗體的方案的詳細(xì)討論，參見，例如，pct公布號wo98/24893、wo96/34096和wo96/33735；和美國專利號5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其每篇通過引用以其全部并入本文。此外，可以與公司比如abgenix,inc.(freemont,calif.)和genpharm(sanjose,calif.)簽訂合同以使用與上面描述的類似的技術(shù)提供針對選擇的抗原的人抗體。對于在種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移人類種系免疫球蛋白基因陣列在抗原攻擊之后將導(dǎo)致產(chǎn)生人抗體的具體討論，參見，例如，jakobovits等，proc.natl.acad.sci.usa,90:2551(1993)；jakobovits等，nature,362:255-258(1993)；bruggermann等，yearinimmunol.,7:33(1993)；和duchosal等，nature,355:258(1992)。

人抗體也可以源自噬菌體展示文庫(hoogenboom等，j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等，j.mol.biol.,222:581-597(1991)；vaughan等，naturebiotech.,14:309(1996))。噬菌體展示技術(shù)(mccafferty等，nature,348:552-553(1990))可以用于從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(v)結(jié)構(gòu)域基因所有組成成分在體外產(chǎn)生人抗體和抗體片段。根據(jù)此技術(shù)，將抗體v結(jié)構(gòu)域基因符合讀框地克隆入絲狀噬菌體比如m13或fd的主要或次要外殼蛋白基因，并且在噬菌體顆粒的表面上作為功能性抗體片段展示。因?yàn)榻z狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈dna拷貝，所以基于抗體的功能性質(zhì)的選擇也導(dǎo)致選擇編碼展示那些性質(zhì)的抗體的基因。因而，噬菌體模擬了b細(xì)胞的一些性質(zhì)。噬菌體展示可以以各種形式進(jìn)行；對于其綜述，參見，例如，johnson,kevins,和chiswell,davidj.,currentopinioninstructuralbiology3:564-571(1993)。數(shù)種來源的v基因片段可以用于噬菌體展示。clackson等，nature,352:624-628(1991)從源自未免疫小鼠脾臟的v基因的小的隨機(jī)組合文庫分離了抗唑酮抗體的多樣化陣列。可以構(gòu)建來自未免疫人供體的v基因所有組成成分，并且抗原(包括自體抗原)的多樣化陣列的抗體可以大體上遵循下列描述的技術(shù)進(jìn)行分離：marks等，j.mol.biol.,222:581-597(1991)或griffith等，emboj.,12:725-734(1993)。還參見美國專利號5,565,332和5,573,905，其每篇通過引用以其全部并入本文。

人抗體也可以通過體外活化的b細(xì)胞生成(參見，美國專利號5,567,610和5,229,275，其每篇通過引用以其全部并入本文)。人抗體也可以使用雜交瘤技術(shù)體外生成，比如，但不限于roder等(methodsenzymol.,121:140-167(1986))描述的。

人源化抗體

可選地，在一些實(shí)施方式中，非人抗體是人源化的，其中抗體的特異性序列或區(qū)域被修飾以增加與人中天然產(chǎn)生的抗體的相似性。在一個實(shí)施方式中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人源化的。

“人源化”抗體保留與原始抗體相似的抗原特異性。然而，使用人源化的某些方法，可以增加抗體對人cd3抗原的結(jié)合親和力和/或特異性——使用“定向進(jìn)化”的方法，如由wu等，j.mol.biol.,294:151(1999)描述的，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文。

人源化抗體具有從非人來源引入其的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基通常被稱為“輸入”殘基，其通常取自“輸入”可變結(jié)構(gòu)域。因而，人源化抗體包括來自非人免疫球蛋白分子的一個或多個cdr和來自人的框架區(qū)?？贵w的人源化是本領(lǐng)域熟知的，并且可以大體上遵循winter與合作者的方法進(jìn)行(jones等，nature,321:522-525(1986)；riechmann等，nature,332:323-327(1988)；verhoeyen等，science,239:1534-1536(1988))，其通過將嚙齒動物cdr或cdr序列置換為相應(yīng)的人抗體序列，即cdr-移植(ep239,400；pct公布號wo91/09967；和美國專利號4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文)。在這樣的人源化嵌合抗體中，實(shí)質(zhì)上小于完整人可變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被來自非人物種的相應(yīng)的序列置換。實(shí)際中，人源化抗體通常是其中一些cdr殘基和可能的一些fr殘基被來自嚙齒動物抗體中的類似位點(diǎn)的殘基置換的人抗體?？贵w的人源化也可以通過貼面(veneering)或表面重建(resurfacing)(ep592,106；ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等，proteinengineering,7(6):805-814(1994)；和roguska等，pnas,91:969-973(1994))或鏈改組(美國專利號5,565,332)實(shí)現(xiàn)，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文。

用于制造人源化抗體的人可變結(jié)構(gòu)域——輕和重二者——的選擇降低抗原性。根據(jù)所謂的“最佳擬合”方法，嚙齒動物抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列針對已知的人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個文庫進(jìn)行篩選。最接近于嚙齒動物的人序列然后被接受為用于人源化抗體的人框架(fr)(sims等，j.immunol.,151:2296(1993)；chothia等，j.mol.biol.,196:901(1987)，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文)。另一種方法使用源自特定的輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于數(shù)種不同的人源化抗體(carter等，proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；presta等，j.immunol.,151:2623(1993)，其內(nèi)容通過引用以其全部并入本文)。

抗體可以被人源化，且保留對靶抗原的高親和力以及其它有利的生物學(xué)性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，人源化抗體通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和多種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備。三維免疫球蛋白模型是一般可獲得的并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。圖解和展示選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序是可獲得的。檢查這些展示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合靶抗原的能力的殘基。以此方式，fr殘基可以從接受者和輸入序列選擇并組合，使得實(shí)現(xiàn)期望的抗體特性，比如對靶抗原的增加的親和力。一般而言，cdr殘基直接地和最實(shí)質(zhì)性地參與影響抗原結(jié)合。

t細(xì)胞的擴(kuò)展

在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明包括包含電穿孔的mrna的t細(xì)胞，所述電穿孔的mrna編碼嵌合膜蛋白，所述嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段。本發(fā)明還包括電穿孔的或擴(kuò)展的t細(xì)胞群，其包括電穿孔的編碼嵌合膜蛋白的mrna，所述嵌合膜蛋白包括包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的胞外結(jié)構(gòu)域，所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括針對分子的抗體或其片段；和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段。在另一個實(shí)施方式中，mrna被引入細(xì)胞群的至少一個中并且在細(xì)胞的表面上表達(dá)。

在一個實(shí)施方式中，待電穿孔和擴(kuò)展的t細(xì)胞的來源是外周血單核細(xì)胞。

通常，t細(xì)胞通過與表面接觸被增殖，所述表面具有附加至其的刺激cd3/tcr復(fù)合體相關(guān)信號的試劑和刺激t細(xì)胞表面上的共刺激分子的配體。本發(fā)明包括擴(kuò)展電穿孔的t細(xì)胞群的方法，其包括培養(yǎng)電穿孔的群，其中該群內(nèi)包含的電穿孔的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。在一個實(shí)施方式中，細(xì)胞群中的至少一個細(xì)胞表達(dá)cd3。不固執(zhí)于任何具體理論，表達(dá)cd3的細(xì)胞可以與嵌合膜蛋白——其在電穿孔的細(xì)胞的表面上表達(dá)——接觸和結(jié)合。表達(dá)嵌合膜蛋白的至少一個細(xì)胞可以與表達(dá)cd3的另一個細(xì)胞相互作用。這可以刺激電穿孔的t細(xì)胞的擴(kuò)展。

如本文公開的數(shù)據(jù)所展現(xiàn)的，通過本文公開的方法擴(kuò)展電穿孔的t細(xì)胞可以增加大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍、或更大，和其之間的任何和所有全部或部分整數(shù)。在一個實(shí)施方式中，t細(xì)胞擴(kuò)展大約20倍至大約50倍的范圍。

在培養(yǎng)之后，在將細(xì)胞傳代至另一個培養(yǎng)設(shè)備之前，t細(xì)胞可以在培養(yǎng)設(shè)備中的細(xì)胞培養(yǎng)基中培育一段時間或直到細(xì)胞達(dá)到用于最佳傳代的匯合或高細(xì)胞密度。培養(yǎng)設(shè)備可以是一般用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的任何培養(yǎng)設(shè)備。一段時間可以是適于細(xì)胞體外培養(yǎng)的任何時間。t細(xì)胞培養(yǎng)基可以在t細(xì)胞培養(yǎng)期間的任何時間被更換。優(yōu)選地，t細(xì)胞培養(yǎng)基大約每2至3天更換一次。然后從培養(yǎng)設(shè)備收獲t細(xì)胞，于是t細(xì)胞可以被立即使用或冷藏儲存以備后用。在一個實(shí)施方式中，方法進(jìn)一步包括冷藏培養(yǎng)的t細(xì)胞。

可以使用在美國專利號5,199,942(通過引用并入本文)中描述的方法進(jìn)一步擴(kuò)展細(xì)胞。擴(kuò)展，比如在美國專利號5,199,942中描述的，可以附加至本文描述的其它擴(kuò)展方法。簡言之，對于快速擴(kuò)展方案(rep)，t細(xì)胞的離體培養(yǎng)和擴(kuò)展包括添加細(xì)胞生長因子，比如在美國專利號5,199,942中描述的那些，或其它因子，比如flt3-l、il-1、il-2、il-3和c-kit配體，例如在dudley等，j.immunol.,26(4):332-342,2003中描述的那些。

在一方面，擴(kuò)展t細(xì)胞的方法可以進(jìn)一步包括分離t細(xì)胞和隨后的電穿孔，接著培養(yǎng)。

如本文描述的培養(yǎng)步驟(與如本文描述的試劑接觸)可以非常短，例如少于24小時比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時。如本文進(jìn)一步描述的培養(yǎng)步驟(與如本文描述的試劑接觸)可以較長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

多種術(shù)語用于描述培養(yǎng)中的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)物通常指的是取自活的生物體并且在受控條件下生長的細(xì)胞。原代細(xì)胞培養(yǎng)物是直接取自生物體的細(xì)胞、組織或器官并且是在第一次傳代培養(yǎng)前的培養(yǎng)物。當(dāng)它們在促進(jìn)細(xì)胞生長和/或分裂的條件下被放置在生長培養(yǎng)基中時，細(xì)胞在培養(yǎng)中被擴(kuò)展，產(chǎn)生更大的細(xì)胞群。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)中被擴(kuò)展時，通常通過細(xì)胞數(shù)目加倍需要的時間量——另外稱為倍增時間——測量細(xì)胞增殖速率。

每一輪傳代培養(yǎng)被稱為傳代。當(dāng)細(xì)胞被傳代培養(yǎng)時，它們被稱為已經(jīng)被傳代。特異性細(xì)胞群或細(xì)胞系有時稱為或表征為其已經(jīng)被傳代的次數(shù)。例如，已經(jīng)被傳代十次的培養(yǎng)的細(xì)胞群可以被稱為p10培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物，即，從組織分離細(xì)胞之后的第一次培養(yǎng)物被指定為p0。在第一次傳代培養(yǎng)之后，細(xì)胞被描述為繼代培養(yǎng)物(p1或第1代)。在第二次傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞成為三級培養(yǎng)物(tertiaryculture)(p2或第2代)，以此類推。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在傳代的時期期間可以存在許多群倍增；因此培養(yǎng)物的群倍增數(shù)大于傳代數(shù)。在傳代之間的時期期間的細(xì)胞擴(kuò)展(即，群倍增數(shù))取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基質(zhì)、培養(yǎng)基、和傳代之間的時間。

在一個實(shí)施方式中，細(xì)胞可以被培養(yǎng)數(shù)小時(大約3小時)至大約14天或其之間的任何小時的整數(shù)值。適于t細(xì)胞培養(yǎng)的條件包括適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(例如，最小必需培養(yǎng)基或rpmi培養(yǎng)基1640或x-vivo15，(lonza))，其可以包含增殖和生存必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白細(xì)胞介素-2(il-2)、胰島素、ifn-γ、il-4、il-7、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ、和tnf-α、或技術(shù)人員已知的用于細(xì)胞生長的任何其它添加劑。用于細(xì)胞生長的其它添加劑包括但不限于表面活性劑、人血漿蛋白粉(plasmanate)和還原劑比如n-乙酰半胱氨酸和2-巰基乙醇。培養(yǎng)基可以包括rpmi1640、aim-v、dmem、mem、α-mem、f-12、x-vivo15、和x-vivo20、optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸鈉和維生素，無血清或補(bǔ)充有適當(dāng)量的血清(或血漿)或限定的激素組、和/或足夠t細(xì)胞生長和擴(kuò)展的量的細(xì)胞因子(一種或多種)?？股兀缜嗝顾睾玩溍顾?，僅被包括在實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物中，而不在被注入對象的細(xì)胞培養(yǎng)物中。靶細(xì)胞被維持在支持生長必需的條件下，例如，適當(dāng)?shù)臏囟?例如，37℃)和氣氛(例如，空氣加5％co2)。

用于培養(yǎng)t細(xì)胞的培養(yǎng)基可以包括可以共刺激t細(xì)胞的試劑。例如，可以刺激cd3的試劑是cd3的抗體，并且可以刺激cd28的試劑是cd28的抗體。這是因?yàn)椋缬杀疚墓_的數(shù)據(jù)所展現(xiàn)的，通過本文公開的方法分離的細(xì)胞可以擴(kuò)展大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一個實(shí)施方式中，通過培養(yǎng)電穿孔的群，t細(xì)胞擴(kuò)展大約20倍至大約50倍或更多的范圍。

在另一個實(shí)施方式中，擴(kuò)展t細(xì)胞的方法可以進(jìn)一步包括分離擴(kuò)展的t細(xì)胞，用于進(jìn)一步的應(yīng)用。在又另一個實(shí)施方式中，擴(kuò)展的方法可以進(jìn)一步包括隨后電穿孔擴(kuò)展的t細(xì)胞，接著培養(yǎng)。隨后的電穿孔可以包括將編碼試劑的mrna電穿孔入擴(kuò)展的t細(xì)胞群，其中試劑進(jìn)一步刺激t細(xì)胞。試劑可以刺激t細(xì)胞，比如通過刺激進(jìn)一步的擴(kuò)展、效應(yīng)物功能或另一種t細(xì)胞功能。在一個實(shí)施方式中，試劑mrna與嵌合膜蛋白mrna被共電穿孔。在另一個實(shí)施方式中，試劑mrna在培養(yǎng)電穿孔的群后被電穿孔。

在另一個實(shí)施方式中，方法進(jìn)一步包括使用選自cd3、cd27、cd28、cd83、cd86、cd127、4-1bbl和pd1的至少一種共刺激分子刺激擴(kuò)展的t細(xì)胞群。

療法

本文描述的t細(xì)胞可以包括在組合物中用于治療。組合物可以包括藥物組合物并且進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體?？梢允┯弥委熡行Я康陌╰細(xì)胞的藥物組合物。

在一方面，本發(fā)明包括用于刺激針對對象中的靶細(xì)胞或組織的t細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，其包括給對象施用有效量的包括編碼嵌合膜蛋白的mrna的t細(xì)胞，所述嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段，其中所述群中的細(xì)胞的至少一個表達(dá)嵌合膜蛋白?？梢允┯胻細(xì)胞以誘導(dǎo)靶細(xì)胞或組織的裂解，比如其中誘導(dǎo)的裂解是抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)。

在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明包括用于過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法的方法。該方法包括施用包括t細(xì)胞的擴(kuò)展的細(xì)胞群至需要其的對象以預(yù)防或治療不利于對象的病癥。在此實(shí)施方式中，擴(kuò)展的細(xì)胞群根據(jù)如下方法被擴(kuò)展：其包括使包括t細(xì)胞的細(xì)胞群電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的mrna，所述嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段，其中所述群中的細(xì)胞的至少一個表達(dá)嵌合膜蛋白；和培養(yǎng)細(xì)胞群，其中包含在其中的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。

在另一個實(shí)施方式中，提供了治療與對象中增強(qiáng)的免疫性相關(guān)聯(lián)的疾病或病癥的方法，其包括施用包括t細(xì)胞的擴(kuò)展的細(xì)胞群至需要其的對象。擴(kuò)展的細(xì)胞群已經(jīng)根據(jù)如下方法被擴(kuò)展：其包括使包括t細(xì)胞的細(xì)胞群電穿孔有編碼嵌合膜蛋白的mrna，所述嵌合膜蛋白包括針對cd3的單鏈可變片段(scfv)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域——其包括cd28和4-1bb的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的片段，其中所述群中的細(xì)胞的至少一個表達(dá)嵌合膜蛋白；和培養(yǎng)細(xì)胞群，其中包含在其中的t細(xì)胞擴(kuò)展至少10倍。

如本文描述生成的擴(kuò)展的t細(xì)胞是均一的并且具備t細(xì)胞功能。進(jìn)一步，擴(kuò)展的t細(xì)胞可以被施用至哺乳動物，優(yōu)選地人，以阻抑免疫反應(yīng)，比如自身免疫性疾病比如糖尿病、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、gvhd、增強(qiáng)性同種異體移植耐受誘導(dǎo)(enhancingallografttoleranceinduction)、移植排斥等共有的那些免疫反應(yīng)。此外，本發(fā)明的細(xì)胞可以用于任何病癥的治療，其中減弱的或以其他方式抑制的免疫應(yīng)答，尤其是細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，對于治療或減輕疾病是期望的。

如本文描述生成的擴(kuò)展的t細(xì)胞還可以用于治療自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的實(shí)例包括但不限于獲得性免疫缺陷綜合征(aids，其是具有自身免疫組分的病毒性疾病)、斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內(nèi)耳疾病(aied)、自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征(alps)、自身免疫性血小板減少性紫癜(atp)、貝切特氏病、心肌病、乳糜瀉-皰疹樣皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(cfids)、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(cipd)、疤痕性類天皰瘡、冷凝集素疾病、crest綜合征、克羅恩病、德戈斯氏病、青少年型皮肌炎、盤狀狼瘡、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維變性、特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)、iga腎病、胰島素依賴型糖尿病、青少年慢性關(guān)節(jié)炎(斯提耳氏病)、青少年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、美尼爾氏病、混合結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動炎癥、多軟骨炎、多腺體綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬變、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、雷諾氏現(xiàn)象、萊特爾綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病(進(jìn)行性全身性硬化癥(pss)，還稱為全身性硬化癥(ss))、斯耶格倫氏綜合征、僵體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、高安氏動脈炎、顳動脈炎/巨細(xì)胞動脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、眼葡萄膜炎、白斑病和韋格納氏肉芽腫病。

如本文描述生成的擴(kuò)展的t細(xì)胞還可以用于治療炎性障礙。炎性障礙的實(shí)例包括但不限于慢性和急性炎性障礙。炎性障礙的實(shí)例包括阿爾茨海默病、哮喘、特異性變態(tài)反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、動脈粥樣硬化、支氣管哮喘、濕疹、腎小球性腎炎、移植物抗宿主疾病、溶血性貧血、骨關(guān)節(jié)炎、敗血癥、中風(fēng)、組織和器官移植、血管炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病和呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilatorinducedlunginjury)。

在另一個實(shí)施方式中，本文描述的t細(xì)胞可以用于制造用于治療需要其的對象中的免疫應(yīng)答的藥物。

本發(fā)明的細(xì)胞可以被施用至動物，優(yōu)選地哺乳動物，甚至更優(yōu)選地人，以治療癌癥。此外，本發(fā)明的細(xì)胞可以用于治療與癌癥相關(guān)的任何病癥，尤其是針對腫瘤細(xì)胞(一種或多種)的細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，其中治療或減輕疾病是期望的。癌癥的實(shí)例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲狀腺癌等。

本發(fā)明的細(xì)胞可以以劑量和途徑施用，并且有時在適當(dāng)?shù)呐R床前和臨床實(shí)驗(yàn)和試驗(yàn)中確定。細(xì)胞組合物可以在這些范圍內(nèi)的劑量下被施用多次。本發(fā)明的細(xì)胞的施用可以與如本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的可用于治療期望的疾病或病癥的其它方法組合。

待施用的本發(fā)明的細(xì)胞可以對于經(jīng)歷治療的對象是自體的、同種異體的或異種的。

本發(fā)明的細(xì)胞的施用可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何常規(guī)方式實(shí)施。本發(fā)明的細(xì)胞可以通過氣溶膠吸入、注射、吞咽、輸注、植入或移植施用至對象。本文描述的組合物可以被經(jīng)動脈地、皮下地、皮內(nèi)地、瘤內(nèi)地、結(jié)內(nèi)地、髓內(nèi)地、肌肉內(nèi)地、通過靜脈內(nèi)(i.v.)注射、或腹膜內(nèi)地施用至患者。在其它情況下，本發(fā)明的細(xì)胞被直接注入對象中的炎癥部位、對象中的局部疾病部位、淋巴結(jié)、器官、腫瘤等。

還可以使用任意數(shù)目的基體施用本文描述的細(xì)胞。本發(fā)明利用這樣的基體——在充當(dāng)人工淋巴器官的新背景內(nèi)——支持、維持或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，其通常通過t細(xì)胞的調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明可以利用那些基體組合物和制劑，其已經(jīng)展現(xiàn)了在組織工程化中的實(shí)用性。因此，可以用于本發(fā)明的組合物、裝置和方法的基體的類型事實(shí)上是無限制的并且可以包括生物學(xué)和合成基體二者。在一個具體的實(shí)例中，利用由美國專利號5,980,889；5,913,998；5,902,745；5,843,069；5,787,900；或5,626,561陳述的組合物和裝置，如同這些專利通過引用以其全部并入本文一樣?；w包括一般與如下相關(guān)聯(lián)的特征：當(dāng)施用至哺乳動物宿主時是相容性的?；w可以由天然和/或合成材料形成?；w可以是不可生物降解的——在期望在動物的體內(nèi)留下永久性結(jié)構(gòu)或可移動結(jié)構(gòu)比如植入物的情況下；或可生物降解的?；w可以采用海綿、植入物、管、telfa墊、纖維、中空纖維、凍干組分、凝膠、粉末、多孔組合物、或納米顆粒的形式。此外，基體可以被設(shè)計以允許持續(xù)釋放接種的細(xì)胞或產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其它活性劑。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的基體是柔性的和彈性的，并且可以被描述為半固體支架，其對物質(zhì)比如無機(jī)鹽、水性流體和包括氧的溶解的氣體試劑(gaseousagent)是可透過的。

基體在本文被用作生物相容性物質(zhì)的實(shí)例。然而，本發(fā)明不限于基體，并且因而，無論術(shù)語基體(一種或多種)在什么地方出現(xiàn)，這些術(shù)語應(yīng)當(dāng)被解讀為包括如下裝置和其它物質(zhì)：其允許細(xì)胞滯留或細(xì)胞穿越；是生物相容性的；和能夠允許大分子穿越直接通過物質(zhì)，以便物質(zhì)自身是半透膜或與具體的半透性物質(zhì)協(xié)同使用。

藥物組合物

本發(fā)明的藥物組合物可以包括如本文描述的擴(kuò)展的t細(xì)胞群，與一種或多種藥學(xué)或生理學(xué)上可接受載體、稀釋劑或賦形劑組合。這樣的組合物可以包括緩沖液比如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物比如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸比如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑比如edta或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發(fā)明的組合物優(yōu)選地配制用于靜脈內(nèi)施用。

本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防)的疾病的方式施用。施用的數(shù)量和頻率將由如下因素確定，比如患者的病癥、和患者疾病的類型和嚴(yán)重度，但是可以由臨床試驗(yàn)確定適當(dāng)?shù)膭┝俊?/p>

通?？梢砸?guī)定包括本文描述的擴(kuò)展的t細(xì)胞的藥物組合物可以以10⁴至10⁹個細(xì)胞/kg體重的劑量，優(yōu)選地10⁵至10⁶個細(xì)胞/kg體重的劑量——包括在那些范圍內(nèi)的所有整數(shù)值——施用。t細(xì)胞組合物也可以以這些劑量施用多次。細(xì)胞可以通過使用免疫療法中公知的注入技術(shù)(參見，例如rosenberg等，neweng.j.ofmed.319:1676,1988)施用。具體患者的最佳劑量和治療方案可以通過監(jiān)測患者的疾病跡象和相應(yīng)地調(diào)節(jié)治療而由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。

在某些實(shí)施方式中，可以期望給對象施用活化的t細(xì)胞，并且隨后重新抽取(redraw)血液(或進(jìn)行單采血液成分術(shù))，根據(jù)本發(fā)明活化來自其的t細(xì)胞，并且將這些活化和擴(kuò)展的t細(xì)胞再注入患者。此過程可以每幾周實(shí)施多次。在某些實(shí)施方式中，來自10ml至400ml的血液抽取物的t細(xì)胞可以被活化。在某些實(shí)施方式中，來自20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml的血液抽取物的t細(xì)胞被活化。不被理論所束縛，使用此多重血液抽取/多重再輸注方案，可以選擇出某些t細(xì)胞群。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，使用本文描述的方法或本領(lǐng)域已知的將t細(xì)胞擴(kuò)展至治療性水平的其它方法活化和擴(kuò)展的細(xì)胞，協(xié)同任意數(shù)目的相關(guān)治療形式(例如，之前、同時或之后)被施用至患者，所述治療形式包括但不限于使用如下藥劑的治療：比如抗病毒療法、用于ms患者的西多福韋和白細(xì)胞介素-2、阿糖胞苷(也稱為ara-c)或那他珠單抗(natalizumab)治療，或用于牛皮癬患者的依法利珠單抗(efalizumab)治療，或用于pml患者的其它治療。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的t細(xì)胞可以與如下組合使用：化療，輻射，免疫抑制劑，比如，環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和fk506，抗體，或其它免疫燒蝕劑(immunoablativeagent)比如campath、抗cd3抗體或其它抗體療法、細(xì)胞毒素、氟達(dá)拉濱、環(huán)孢菌素、fk506、雷帕霉素、麥考酚酸、類固醇類、fr901228、細(xì)胞因子和照射。這些藥物抑制鈣依賴性磷酸酶——神經(jīng)鈣蛋白(環(huán)孢菌素和fk506)或抑制對生長因子誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)重要的p70s6激酶(雷帕霉素)。(liu等，cell66:807-815,1991；henderson等，immun.73:316-321,1991；bierer等，curr.opin.immun.5:763-773,1993)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物協(xié)同(例如，之前、同時或之后)骨髓移植、t細(xì)胞燒蝕療法——使用化療劑比如氟達(dá)拉濱、外部光束放射療法(xrt)、環(huán)磷酰胺，或抗體比如okt3或campath——被施用至患者。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞組合物在b細(xì)胞燒蝕療法——比如與cd20反應(yīng)的藥劑，例如，利妥昔單抗——之后被施用。例如，在一個實(shí)施方式中，對象可以經(jīng)歷高劑量化療的標(biāo)準(zhǔn)治療，接著進(jìn)行外周血干細(xì)胞移植。在某些實(shí)施方式中，在移植之后，對象接受本發(fā)明的擴(kuò)展的免疫細(xì)胞的注入。在額外的實(shí)施方式中，擴(kuò)展的細(xì)胞在外科手術(shù)之前或之后施用。

施用至患者的上面治療的劑量將隨著正在治療的病癥的精確性質(zhì)和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可以根據(jù)本領(lǐng)域接受的實(shí)踐進(jìn)行。例如，campath的劑量對于成年患者將一般在1至大約100mg的范圍中，通常每天施用，持續(xù)1和30天之間的時期。雖然在一些情況下可以使用多至40mg每天的較大的劑量(在美國專利號6,120,766中描述)，但是優(yōu)選的日劑量是1至10mg每天。

應(yīng)當(dāng)理解將在本發(fā)明中有用的方法和組合物不限于在實(shí)施例中陳述的具體的制劑。下列實(shí)施例被提出以便于為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制造和使用細(xì)胞，擴(kuò)展和培養(yǎng)方法，本發(fā)明的治療方法的完整的公開內(nèi)容和描述，并且不意欲限制本發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍。

除非另外指示，本發(fā)明的實(shí)踐采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其充分地在技術(shù)人員的見識內(nèi)。這樣的技術(shù)在如下文獻(xiàn)中充分地說明，比如，“molecularcloning:alaboratorymanual”,第四版(sambrook,2012)；“oligonucleotidesynthesis”(gait,1984)；“cultureofanimalcell”(freshney,2010)；“methodsinenzymology”“handbookofexperimentalimmunology”(weir,1997)；“genetransfervectorsformammaliancells”(miller和calos,1987)；“shortprotocolsinmolecularbiology”(ausubel,2002)；“polymerasechainreaction:principles,applicationsandtroubleshooting”,(babar,2011)；“currentprotocolsinimmunology”(coligan,2002)。這些技術(shù)適用于產(chǎn)生本發(fā)明的多核苷酸和多肽，并且因此，可以在進(jìn)行和實(shí)踐本發(fā)明中考慮。將在下列部分中討論具體實(shí)施方式的特別有用的技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例

通過參考下列實(shí)驗(yàn)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。除非另外規(guī)定，這些實(shí)施例僅出于說明目的提供，并且不意欲是限制性的。因而，本發(fā)明決不應(yīng)當(dāng)解釋為限制于下列實(shí)施例，而是應(yīng)當(dāng)解釋為包括由于本文提供的教導(dǎo)而變得顯而易見的任何和所有的變化。

在沒有進(jìn)一步描述的情況下，相信使用在先的描述和下列說明性實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以制造和利用本發(fā)明的化合物，并且實(shí)踐要求保護(hù)的方法。下列工作實(shí)施例因此具體地指出本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，并且不解釋為以任何方式限制本公開內(nèi)容的其余部分。

現(xiàn)在描述在進(jìn)行本文公開的實(shí)驗(yàn)中使用的材料和方法。

體外轉(zhuǎn)錄(ivt)mrna載體的構(gòu)建。使用公共可獲得的序列信息通過pcr合成和/或擴(kuò)增并裝配所有基因。使用公共可獲得的測序信息，通過替換pgem-gfp.64a的gfp，將pcr產(chǎn)物亞克隆入基于pgem.64a的載體以產(chǎn)生基于pgem.64a的ivt載體。

rna體外轉(zhuǎn)錄(ivt)。使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒比如mmessaget7ultra(ambion,inc)生成ivtrna。使用rna純化方案比如rneasy微型試劑盒(qiagen,inc.,valencia,ca)純化ivtrna產(chǎn)物。純化的rna以1-2mg/ml在無rnase的水中洗脫。

t細(xì)胞的rna電穿孔。經(jīng)受電穿孔的pbmc或擴(kuò)展的t細(xì)胞使用opti-mem(invitrogen)清洗三次并且以1-3×10⁸個/ml的終濃度重懸在opti-mem中。隨后，0.1ml的細(xì)胞與10μgivtrna(或如指示的)混合并且使用電穿孔儀比如btxem830(harvardapparatusbtx,holliston,ma,usa)在2-mm小池中進(jìn)行電穿孔。

t細(xì)胞刺激和擴(kuò)展。pbmc電穿孔有編碼抗cd3scfv-28bb的rna并且在補(bǔ)充有300μ/mlil-2的r10培養(yǎng)基中培養(yǎng)。具有il-2的新鮮培養(yǎng)基從電穿孔后第3天開始每隔一天添加至培養(yǎng)物。在刺激之后第9天測試t細(xì)胞表型和功能。cd3/cd28珠刺激的t細(xì)胞或通過添加okt3抗體至pbmc擴(kuò)展的t細(xì)胞被用作對照。

對電穿孔的t細(xì)胞的car檢測。細(xì)胞被清洗并且懸浮在fac緩沖液(pbs加0.1％疊氮化鈉和0.4％bsa)中。生物素-標(biāo)記的多克隆山羊抗小鼠f(ab)2抗體(對于鼠scfv)或抗人抗f(ab)2(對于人scfv)(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)被添加至細(xì)胞并且在4℃下培育25分鐘，然后清洗兩次。然后，使用藻紅蛋白-標(biāo)記的鏈親和素(bdpharmingen,sandiego,ca)對細(xì)胞染色。

elisa和luminex測定。靶細(xì)胞——表達(dá)cd19的不同的腫瘤細(xì)胞系——被清洗并且以10⁶個細(xì)胞/ml懸浮在r10培養(yǎng)基中。每種靶細(xì)胞類型的十萬個細(xì)胞被添加至96孔圓底板(corning)的2個孔。效應(yīng)t細(xì)胞培養(yǎng)物——電穿孔cd19carrna的t細(xì)胞群——被清洗并且以10⁶個細(xì)胞/ml懸浮在r10中。十萬個效應(yīng)t細(xì)胞與96孔板的指示孔中的靶細(xì)胞組合。此外，準(zhǔn)備包含單獨(dú)的t細(xì)胞的孔。平板在37℃下培育18至20小時。在培育后，使用標(biāo)準(zhǔn)方法(pierce,rockford,il)收獲上清液并且使其經(jīng)歷elisa測定。

cd107a染色。細(xì)胞以1:1的e:t(10⁵效應(yīng)物：10⁵靶標(biāo))平板接種在96孔板中的160μl完全rpmi培養(yǎng)基中。添加20μl的藻紅蛋白-標(biāo)記的抗cd107a抗體(bdpharmingen,sandiego,ca)，并且細(xì)胞在37℃下培育1小時，然后添加golgistop并且培育另外的2.5小時。在2.5小時后，添加10μlfitc-抗cd8和apc-抗cd3并且細(xì)胞在37℃下培育30min。在培育后，使用facs緩沖液清洗樣品一次。使用bdfacscalibur(bdbiosciences)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)采集，并且使用flowjo(treestarinc,ashland,or)進(jìn)行分析。

基于熒光素酶的ctl測定。生成nalm6-cbg(或轉(zhuǎn)導(dǎo)有pdl1或hvem的nalm6-cbg)并且如下在基于熒光素酶的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(ctl)測定的修改版本中使用。nalm6-cbg細(xì)胞被清洗并且以1×10⁵個細(xì)胞/ml重懸在r10培養(yǎng)基中，并且100μl的cbg-標(biāo)記的細(xì)胞與不同比值的t細(xì)胞(例如30:1、15:1等)在37℃下培育過夜。100μl的混合物被轉(zhuǎn)移至96孔白色酶標(biāo)板，100μl的底物被添加并且立即測定發(fā)光。

seqidno:1

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seqidno:2

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seqidno:5

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seqidno:7

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現(xiàn)在描述本文公開的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

具有電穿孔的cd3scfv-28bbrna的t細(xì)胞擴(kuò)展與使用抗cd3okt3抗體刺激的t細(xì)胞一樣高效。來自針對cd3的抗體(okt3或h5l1)的單鏈可變片段(scfv)結(jié)構(gòu)域通過pcr被合成和/或擴(kuò)增，被連接至cd8跨膜結(jié)構(gòu)域、cd28和4-1bb胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，并且被亞克隆入基于pgem.64arna的載體(圖1)。rna由修飾的pgem.64a構(gòu)建體(okt3-28bbrna或h5l1rna)合成并且被電穿孔入外周血單核細(xì)胞(pbmc)。在從兩個正常的pbmc供體獲得的pbmc群中評估t細(xì)胞擴(kuò)展。在okt3-28bbrna電穿孔后擴(kuò)展的pbmc與使用抗cd3okt3抗體培育的pbmc比較。結(jié)果展現(xiàn)了在okt3-28bbrna電穿孔后擴(kuò)展的t細(xì)胞與在okt3抗體刺激后的t細(xì)胞擴(kuò)展一樣高效(圖2)。

由電穿孔cd3scfv-28bbrna的pbmc擴(kuò)展的t細(xì)胞展示出與okt3抗體刺激的t細(xì)胞類似的表型并且具有更優(yōu)越的效應(yīng)物功能。評估通過不同方法擴(kuò)展的t細(xì)胞的表型，所述方法包括使用okt3刺激pbmc、使用抗cd3/抗cd28包被的珠(beads)刺激純化的t細(xì)胞、或使pbmc電穿孔有okt-28bbrna或h5l1-28bbrna。結(jié)果展現(xiàn)了通過使pbmc電穿孔有編碼okt-28bb或h5l1-28bb的rna獲得的t細(xì)胞的表型與來自使用okt3抗體刺激的pmbc的t細(xì)胞的表型類似，其包括大量的效應(yīng)記憶t細(xì)胞(cd45ro+/cd62l-)，而抗cd3/抗cd28珠刺激的t細(xì)胞展示出一致為中央記憶表型的表型(cd45ro+/cd62l+)(圖3)。

在電穿孔有編碼cd19car的rna后，進(jìn)一步評估t細(xì)胞的功能性。電穿孔的cd19carrna的表達(dá)在t細(xì)胞群的每個中類似(圖4)。在共培育t細(xì)胞與cd19陽性腫瘤細(xì)胞系nalm6后，對從okt3抗體刺激的pbmc、電穿孔o(hù)kt-28bbrna的pbmc、電穿孔h5l1-28bbrna的pbmc、和抗cd3/抗cd28珠刺激的pbmc獲得的電穿孔cd19carrna的t細(xì)胞群評估cd107a上調(diào)(圖5a和5b)。結(jié)果展現(xiàn)了電穿孔o(hù)kt-28bbrna的t細(xì)胞與使用okt3抗體或抗cd3/抗cd28珠刺激的t細(xì)胞相比更高的cd107a表達(dá)。與okt3抗體和cd3/cd28珠二者刺激的t細(xì)胞相比，從電穿孔o(hù)kt-28bbrna的pbmc獲得的t細(xì)胞具有更穩(wěn)健的功能——其通過抗腫瘤活性評估。

通過共電穿孔有編碼共刺激分子、開關(guān)受體(switchreceptor)和細(xì)胞因子的rna進(jìn)一步優(yōu)化擴(kuò)展的t細(xì)胞。為了測試通過rna電穿孔添加額外的分子是否可以進(jìn)一步增強(qiáng)通過擴(kuò)展電穿孔rna的pbmc獲得的t細(xì)胞，如圖10中列舉的，okt-28bbrna與編碼共刺激分子、開關(guān)受體或細(xì)胞因子的rna以不同的組合混合。從電穿孔rna的pbmc獲得的t細(xì)胞的表型和功能性與從okt3抗體刺激的pbmc獲得的t細(xì)胞比較。表型分析在圖6中顯示。與由okt3抗體刺激獲得的t細(xì)胞相比，由okt-28bbrna電穿孔獲得的t細(xì)胞(okt-28bb-1)展示出中央記憶t細(xì)胞表型。由okt-28bbrna電穿孔獲得的大約54.54％的t細(xì)胞對由okt3抗體刺激獲得的大約25.08％的t細(xì)胞是ccr7/cd62l雙陽性細(xì)胞。

而且，電穿孔其它rna——編碼程序性細(xì)胞死亡1(pd1)、cd83、cd86、4-1bbl、pd1-cd28或il-21的rna——以及okt-28bbrna增加t細(xì)胞擴(kuò)展。在okt-28bb-2和okt-28bb-6中，t細(xì)胞擴(kuò)展從大約64.85％(okt-28bb-5)進(jìn)一步增加至大約69.21％(okt-28bb-3)。pd1在從電穿孔有單獨(dú)的okt-28bbrna的pbmc獲得的t細(xì)胞中顯著地上調(diào)，然而，在從電穿孔o(hù)kt-28bbrna的pbmc獲得的t細(xì)胞中檢測到大約32.37％的pd1/cd27雙陽性細(xì)胞，與之相對，在從okt3抗體刺激的pbmc獲得的t細(xì)胞中檢測到6.24％pd1/cd27雙陽性細(xì)胞。在t細(xì)胞擴(kuò)展步驟期間共電穿孔其它rna還在一些擴(kuò)展的t細(xì)胞群——okt-28bb-6(9.30％)和okt-28bb-2(14.08％)——中降低pd1表達(dá)。

在電穿孔有cd19carrna(cd19cart細(xì)胞)并且使用表達(dá)cd19的不同腫瘤細(xì)胞系培育的擴(kuò)展的t細(xì)胞中評估細(xì)胞因子產(chǎn)生——干擾素-γ(圖7)和il-2(圖8)。在使用不同的cd19腫瘤細(xì)胞系培育后，共電穿孔有其它rna導(dǎo)致來自cd19carrnat細(xì)胞的可變水平的分泌的ifn-γ。與從okt3抗體刺激的pbmc獲得的cd19carrnat細(xì)胞相比，由從電穿孔有okt-28bbrna的pbmc獲得的cd19carrnat細(xì)胞分泌更高水平的il-2。

還測定cd19carrnat細(xì)胞的裂解能力。cd19carrnat細(xì)胞與cd19陽性細(xì)胞系nalm6和轉(zhuǎn)導(dǎo)有pll1或hvem的nalm6一起培育。裂解活性在一些cd19carrnat細(xì)胞——具體地是okt-288bb-2和okt-28bb-4——中降低(圖9)。相比之下，電穿孔cd19carrna的okt-28bb-1和okt-28bb-3t細(xì)胞中的裂解活性與從okt3抗體刺激pbmc獲得的cd19carrnat細(xì)胞一樣好。雖然通過okt-28bbrna電穿孔擴(kuò)展的cd19carrnat細(xì)胞生成更多的中央記憶t細(xì)胞，但是它們能夠與okt3抗體刺激的t細(xì)胞——其主要是效應(yīng)記憶細(xì)胞——一樣高效地殺傷腫瘤細(xì)胞(圖10)。

作為概念驗(yàn)證，nsg小鼠在第0天注射有1e6nalm6-eso-cbg(靜脈內(nèi))。在第7天，(靜脈內(nèi))注射1×10⁶個電穿孔ny-eso-ttcr(1g4tcr)rna的okt3-28bbrnat細(xì)胞(rna-t)或cd3/cd28珠t細(xì)胞(beads)。通過生物發(fā)光成像監(jiān)測腫瘤負(fù)荷。圖11顯示與珠刺激的t細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)移有tcr的rna-t細(xì)胞中觀察到更好的腫瘤控制。

為了測試慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入rna-t細(xì)胞的效率，第1天或第2天，采集rnat細(xì)胞并且以0.5ml、1ml或2ml/孔1.5×10⁶個/ml的細(xì)胞濃度等分入24孔板。0.1ml的濃縮的4d5.bbz慢病毒載體(在5×10⁶個/ml的滴度下)被添加至每個孔。作為對照，在如指示的感染復(fù)數(shù)(moi)下，4d5.bbz慢病毒載體在第1天或第2天被添加至cd3/cd28珠刺激的t細(xì)胞。在刺激之后第9天，擴(kuò)展的t細(xì)胞經(jīng)歷流式細(xì)胞術(shù)染色(圖12)以便檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)的car表達(dá)。

圖13中顯示的結(jié)果指示慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或未轉(zhuǎn)導(dǎo)rnat細(xì)胞二者都與cd3/cd28珠刺激的t細(xì)胞一樣高效地擴(kuò)展。

然后使用her2陽性細(xì)胞系sk-ov3、mcf7和mda231，或her2陰性腫瘤系mda468刺激慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)rnat細(xì)胞或珠刺激的t細(xì)胞4h，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測cd107a表達(dá)，參見圖14。

慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)rna-t細(xì)胞中的細(xì)胞因子產(chǎn)生與珠刺激的t細(xì)胞比較。使用her2陽性細(xì)胞系sk-ov3、mcf7和mda231，或her2陰性腫瘤系mda468刺激慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)rnat細(xì)胞或珠刺激的t細(xì)胞4h。當(dāng)在過夜培育后通過elisa分析細(xì)胞因子水平時，慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)rnat細(xì)胞比珠刺激的t細(xì)胞產(chǎn)生更多的il-2和ifn-γ(圖15)。

本文引用的每個和每種專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容由此通過引用以其全部并入本文。雖然已經(jīng)參照具體的實(shí)施方式公開了本發(fā)明，但是明顯的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計本發(fā)明的其它實(shí)施方式和變型而不背離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍。所附權(quán)利要求意欲解釋為包括所有這樣的實(shí)施方式和等價變型。

序列表

<110>賓夕法尼亞大學(xué)董事會

趙陽兵

x·劉

c·祝恩

<120>刺激和擴(kuò)展t細(xì)胞的組合物和方法

<130>046483-7035(01037)

<150>62/073,268

<151>2014-10-31

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1263

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<213>智人

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