發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明特別涵蓋兩個(gè)參數(shù)：a2a受體拮抗劑概念用于治療注意缺陷多動(dòng)障礙的用途以及所述a2a拮抗劑用于治療帕金森氏病和注意缺陷/多動(dòng)障礙的具體劑量。

發(fā)明背景

a2a受體拮抗劑作為打入額葉-紋狀體回路中的多種cns障礙的潛在靶標(biāo)已引起相當(dāng)大的關(guān)注。a2a拮抗劑(伊曲茶堿、瑞德南特(preladenant)和妥德南特(tozadenant))的臨床研發(fā)已經(jīng)聚焦于治療帕金森氏病(pd)。

腺苷a2a受體拮抗劑代表經(jīng)由非多巴胺能機(jī)制治療pd方面的新的前行方式。在pd的背景下，a2a拮抗劑在臨床前模型中在不惡化運(yùn)動(dòng)障礙的情況下改善運(yùn)動(dòng)功能。臨床數(shù)據(jù)支持a2a拮抗作用在pd的運(yùn)動(dòng)組件中的潛力。此外，已經(jīng)顯示a2a拮抗劑在臨床前改善認(rèn)知功能障礙、焦慮和抑郁，從而凸顯了其在pd的神經(jīng)精神組件中具有功效的潛力。迄今為止，用于治療pd的唯一市售a2a受體拮抗劑是伊曲茶堿，其起始劑量為每天20mg-40mg。

化合物504是一種正在研發(fā)的新腺苷a2a受體拮抗劑并且已經(jīng)被披露于專利申請(qǐng)wo2005/063743(化合物504)和wo2010/126082中。本發(fā)明特別披露1)化合物504的低得驚人的新治療劑量，2)與其他a2a拮抗劑相比延長(zhǎng)的半衰期，據(jù)此支持更長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間及其在3)cns障礙，尤其側(cè)重于pd和注意缺陷/多動(dòng)障礙(adhd)中的應(yīng)用。

adhd是一種由以下癥狀表征的慢性且具有高度遺傳性的發(fā)育障礙：注意力缺陷、行為沖動(dòng)、多動(dòng)以及認(rèn)知功能障礙。在全世界，adhd影響5％至10％的學(xué)齡兒童以及多達(dá)5％的成人。盡管adhd的病因?qū)W仍然未知，但是存在新的證據(jù)表明在adhd中，腦成熟被延遲并且皮質(zhì)-皮層以及皮質(zhì)-皮層下回路內(nèi)的連通性被改變。在adhd中，大量文獻(xiàn)指示1)額葉-紋狀體網(wǎng)絡(luò)和2)額顳葉網(wǎng)絡(luò)中的低活化(rubiak(魯比亞k)等人，amjpsychiatry.(美國(guó)精神病學(xué)雜志)1999年6月；156(6):891-6；魯比亞k等人，美國(guó)精神病學(xué)雜志2005年6月；162(6):1067-75以及魯比亞k等人neuropsychopharmacology(神經(jīng)精神藥理學(xué)).2011年7月；36(8):1575-86；epsteinjn(愛(ài)普斯坦jn)等人，jchildpsycholpsychiatry.(兒童心理學(xué)和精神病學(xué)雜志)2007年9月；48(9):899-913)。已經(jīng)將adhd中的額葉-紋狀體低活化與運(yùn)動(dòng)和干擾抑制相聯(lián)系(aronar(阿隆ar)和poldrackra(波特拉克ra).jneurosci.(神經(jīng)科學(xué)雜志)2006年3月1日；26(9):2424-33.；rubiak(魯比亞k)等人，jabnormchildpsychol.(變態(tài)兒童心理學(xué)雜志)2003年6月；31(3):301-13)以及持續(xù)和選擇性注意過(guò)程(smithab(史密斯ab)等人amjpsychiatry.(美國(guó)精神病學(xué)雜志)2006年6月；163(6):1044-51)。

針對(duì)adhd的治療選擇是藥物療法(刺激劑和非刺激劑)、心理教育以及認(rèn)知行為療法。針對(duì)adhd的一線和二線精神藥理學(xué)治療是延長(zhǎng)釋放的刺激劑(基于哌甲酯和安非他命)。已經(jīng)一致地顯示刺激劑可改善兒童以及成人的adhd中的核心癥狀缺陷。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)非刺激劑(特別是阿托西汀)在治療adhd內(nèi)的核心域缺陷方面是有效的。adhd用藥的作用方式仍有待完全闡明，但是迄今為止，證據(jù)表明在刺激劑和非刺激劑用藥兩者情況下觀察到的益處與特別是在前額葉皮質(zhì)中增加的多巴胺(da)和去甲腎上腺素(ne)神經(jīng)傳遞密切相關(guān)。此外，在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)水平上，哌甲酯改善持續(xù)的注意和沖動(dòng)并且同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)化額葉-紋狀體網(wǎng)絡(luò)而不改變內(nèi)側(cè)額葉和顳葉功能障礙(rubiak(魯比亞k)等人neuropsychopharmacology(神經(jīng)精神藥理學(xué)).2011年7月；36(8):1575-86；cubilloa(庫(kù)維略a)等人，jpsychiatrres.(精神病學(xué)研究雜志)2010年7月；44(10):629-39以及庫(kù)維略a等人，cerebcortex.(大腦皮層)2014年1月；24(1):174-85)?？傊?，迄今為止，adhd文獻(xiàn)表明雖然當(dāng)前用藥經(jīng)由改善的額葉-紋狀體連通性和增加的前額da和ne在治療adhd的核心域中是臨床有效的，但是仍有待完全解決許多未滿足的需求，包括與該疾病相關(guān)的認(rèn)知功能障礙(gualtierict(瓜爾蒂耶里ct)和johnsonlg(約翰遜lg).jattendisord.(注意障礙雜志)2008年1月；11(4):459-69；bidwelllc(比德威lc)等人，pharmacolbiochembehav.(藥理學(xué)，生物化學(xué)與行為)2011年8月；99(2):262-7以及swansonj(斯旺森j)等人，neuropsychopharmacology(神經(jīng)精神藥理學(xué)).2011年1月；36(1):207-26)。

盡管adhd患者對(duì)刺激劑有利地響應(yīng)，但是他們帶有依賴可能性、病恥感并且被標(biāo)記上黑盒(blackbox)標(biāo)簽(濫用風(fēng)險(xiǎn)、猝死和自殺傾向)。

刺激劑在治療adhd中是非常有效的，然而對(duì)當(dāng)前用藥的安全性憂慮(參見(jiàn)上文)凸顯了對(duì)鑒定新穎的安全替代品的相當(dāng)大的興趣。最后，雖然非常有效并且發(fā)揮接近1的效應(yīng)值，但是取決于配制品，刺激劑的活性時(shí)長(zhǎng)為3-16小時(shí)，從而在白天改善adhd癥狀。然而，adhd是一種影響工作/學(xué)校以及社會(huì)生活的障礙并且因此，出于改善患者的生活質(zhì)量的目的，需要24小時(shí)用藥以支持早晚的社會(huì)和學(xué)業(yè)運(yùn)作。

當(dāng)前，尚無(wú)用于治療adhd的市售腺苷a2a受體拮抗劑。最近，使用100mg的每天兩次給藥方案在phib/ii概念驗(yàn)證研究中測(cè)試了v-81444(披露于wo2002055082中，化合物14)。對(duì)每天兩次給藥方案的需求得到了v-81444的半衰期為5-7小時(shí)(abstracts(摘要)/journaloftheneurologicalsciences(神經(jīng)科學(xué)雜志)333(2013)，文摘號(hào)：951)并且ki為約2nm的發(fā)現(xiàn)的支持。

本發(fā)明凸顯了具有新穎作用方式(moa)的、作為低劑量、每天一次adhd用藥的化合物504。除adhd中的認(rèn)知和情感功能障礙之外，新穎moa還凸顯了在adhd核心域內(nèi)具有功效的潛力。此外，雖然增加了功效，但是由于a2amoa和低劑量需求，504可以產(chǎn)生減少的副作用。雖然作為一線和二線治療，但是刺激劑用藥與依從性差相聯(lián)系，特別是在成人群體中，這是由于缺乏對(duì)劑量選擇的可預(yù)測(cè)性。504化合物將在低而窄的劑量范圍中使用，從而支持對(duì)用藥的依從性。最后，與刺激劑相比，每天給藥一次可以支持改善的早晚運(yùn)作。因此，本發(fā)明提供了一種安全且有效的新穎adhd用藥。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及由以下化學(xué)式表示的化合物504

及其藥學(xué)上可接受的鹽

用于以2mg-3mg的劑量作為藥劑使用，如2mg-3mg的每日一次劑量。

在一個(gè)方面中，本發(fā)明涉及用于在治療pd或adhd中使用的化合物504。

此外，本發(fā)明涉及一種使用劑量為2mg-3mg(如2mg或3mg每日劑量)的化合物504治療患有adhd和pd的患者的方法。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1：藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)結(jié)果

使用emax方法估算的在腦片放射自顯影掃描時(shí)大鼠殼核中的受體占用與化合物504血漿濃度。x軸示出了受體占用(％)

圖2：基于大鼠a2a占用和經(jīng)mptp處理的狨猴失能逆轉(zhuǎn)(disabilityreversal)得分預(yù)測(cè)的pd患者體內(nèi)的化合物504血漿濃度范圍的治療有效ec50-80。x軸示出了血漿濃度(ng/ml)，y軸(左側(cè))示出了a2a％ro(受體占用)，y軸(右側(cè))示出了失能逆轉(zhuǎn)。a2a％ro，-非線性擬合受體占用；■失能逆轉(zhuǎn)，-非線性擬合失能逆轉(zhuǎn)。

圖3：使用emax估算的在pet掃描時(shí)殼核中的受體占用與化合物504血漿濃度。x軸示出了cpet(ng/ml)，y軸示出了占用(％)?！?mg，◆3mg，2mg，□1mg○0.5mg，-曲線擬合。

發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明

術(shù)語(yǔ)“化合物504”旨在意指根據(jù)以下化學(xué)式的化合物

及其藥學(xué)上可接受的鹽。

在腦中，a2a受體被大量表達(dá)于紋狀體、伏隔核、蒼白球及嗅球中，在其中這些受體在調(diào)節(jié)谷氨酸和多巴胺的突觸傳遞中發(fā)揮重要作用的其他腦區(qū)中表達(dá)水平較低。在背側(cè)紋狀體中，a2a受體與多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)處于緊密的物理和功能相互作用。a2a受體與d2受體共定位在gaba能紋狀體蒼白球中棘神經(jīng)元上，在那里有證據(jù)表明a2a與d2受體之間的功能性拮抗作用；a2a拮抗作用可以在間接輸出途徑內(nèi)導(dǎo)致與d2激動(dòng)作用類似的響應(yīng)。因此，a2a受體拮抗劑增強(qiáng)皮質(zhì)和基底神經(jīng)節(jié)中的多巴胺能傳遞。

具有多巴胺能和去甲腎上腺素能活性的用藥似乎通過(guò)阻斷多巴胺和去甲腎上腺素再攝取而減少adhd癥狀，并且結(jié)構(gòu)和功能成像研究表明，額葉-皮層下途徑中的功能障礙以及多巴胺能和去甲腎上腺素能系統(tǒng)中的失衡促成adhd的病理生理學(xué)。a2a拮抗劑對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多巴胺釋放的影響和在此呈現(xiàn)的結(jié)果表明化合物504在治療adhd癥狀中應(yīng)是有效的。的確，并且除臨床觀察結(jié)果之外，以下臨床前研究已經(jīng)強(qiáng)調(diào)了a2a受體在adhd中的假定興趣，這些研究展示了a2a拮抗劑在自發(fā)性高血壓大鼠中測(cè)量的注意缺陷(takahashi(高橋)等人，2008，frontbiosci(生物科學(xué)前沿雜志)13:2614-2632；pires(皮雷)等人，2009，behavpharmmarch，第20卷，第2期：134-145)，還有在選擇性注意測(cè)試(五項(xiàng)選擇連續(xù)反應(yīng)時(shí)間任務(wù))中測(cè)量的患有認(rèn)知功能障礙的大鼠(higgins(希金斯)等人behavbrainres(行為大腦研究)(2007)；185(1):32-42)中的有益作用。重要的是，在adhd的治療相關(guān)劑量范圍下，注意缺陷被哌甲酯治療逆轉(zhuǎn)。

在體外，化合物504對(duì)人、狨猴、嚙齒類動(dòng)物及狗a2a受體具有較高親和力(0.1<ki[nmol]<0.3)，如下表所示?；衔?04是一種非常具選擇性的a2a受體拮抗劑，不僅相對(duì)于其他腺苷受體亞型而言，并且相對(duì)于范圍廣泛的cns靶標(biāo)(包括受體、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體)而言。針對(duì)57種復(fù)篩(counter-screen)靶標(biāo)中的任一種，發(fā)現(xiàn)在10μm的結(jié)合抑制小于50％。與a1受體相比，a2a受體的選擇性在人中是872倍，在狨猴中是2700倍，在大鼠中是500倍，在小鼠中是97倍，并且在狗中是1590倍。發(fā)現(xiàn)對(duì)多種其他受體亞型(包括da、5羥色氨酸[5-ht]、乙酰膽堿[ach]、gaba、谷氨酸[glu]、鴉片、大麻素)、離子通道(鈣、鉀)以及轉(zhuǎn)運(yùn)體(腺苷、單胺、血清素、多巴胺及去甲腎上腺素)幾乎沒(méi)有或沒(méi)有親和力。

如本發(fā)明的實(shí)例1所示，使用大鼠紋狀體a2a占用(實(shí)例1)以及更臨床相關(guān)的mptp-損害狨猴中的失能逆轉(zhuǎn)得分(實(shí)例2)評(píng)估化合物504的藥代動(dòng)力學(xué)(pk)/藥效學(xué)(pd)關(guān)系。

在大多數(shù)情況下，給予將給出約80％的受體占用的a2a拮抗劑可以被假設(shè)足以誘導(dǎo)臨床相關(guān)響應(yīng)(mihrara(米哈拉拉)等人jnuclmed(核醫(yī)學(xué)雜志)(2008)49:1183-1188和brooks(布魯克斯)等人synapse(突觸)(2008)62:671-681)。

通過(guò)針對(duì)臨床相關(guān)功效假設(shè)此80％最低a2a占用，在大鼠和狨猴中進(jìn)行pk/pd研究。如圖1，實(shí)例1所示，由大鼠占用emaxpk/pd模型預(yù)測(cè)ec80血漿濃度為1250ng/ml。在狨猴中，由emaxpk/pd建模預(yù)測(cè)出對(duì)應(yīng)的175ng/mlec80血漿濃度(圖2，實(shí)例2)?；谶@些值，可以通過(guò)假設(shè)在人、大鼠和狨猴中的口服清除率為0.6-0.8l/h以及血:腦比相等而預(yù)測(cè)人類劑量范圍。使用此模型，預(yù)測(cè)到每日劑量不能低于3mg并且可以高達(dá)24mg。

基于pk/pd建模，相信10mg劑量是臨床相關(guān)的，因?yàn)樗患僭O(shè)為足夠高以具有臨床效果而不會(huì)太高而致誘導(dǎo)任何伴隨此類化合物所觀察到的咖啡因樣副作用。

因此，在第一安全性和耐受性研究中測(cè)試了10mg劑量。該項(xiàng)研究是在被給予單劑量(1mg、5mg或10mg)的總計(jì)17位健康年輕男性(18-45歲)、19位健康老年男性(55-75歲)和14位健康老年女性(55-75歲)以及在三個(gè)分開(kāi)的場(chǎng)合被給予單劑量5mg的12位受試者中進(jìn)行的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照、單劑量遞增研究(實(shí)例3)。14c標(biāo)記的化合物被包括在年輕男性的10mg劑量中并且還在10mg下測(cè)試了食物效應(yīng)。來(lái)自此項(xiàng)研究的結(jié)果顯示，10mg劑量是最大耐受劑量，因?yàn)樵S多患者遭受失眠困擾并且即使在5mg劑量下這些副作用仍出現(xiàn)。

在人類中的此第一研究顯示，10mg和5mg劑量?jī)烧叨际桥R床有效的并且因此支持pk/pd占用數(shù)據(jù)。然而，該臨床劑量產(chǎn)生副作用。另一方面，低于5mg給出關(guān)于可獲得的臨床效果以及受體占用的憂慮。

因?yàn)樵撆R床相關(guān)劑量似乎低于通過(guò)察看來(lái)自大鼠和狨猴的pk/pd數(shù)據(jù)可以假設(shè)的劑量，諸位發(fā)明人決定在人類中進(jìn)行正電子發(fā)射斷層術(shù)(pet)研究，以研究化合物504的人占用(圖3，實(shí)例4)。此項(xiàng)研究是介入性、開(kāi)放標(biāo)簽、pet研究，使用示蹤物[11c]-sch442416在健康年輕男性中研究口服單劑量之后a2a受體的占用?？傆?jì)6位健康年輕男性被給予0.5mg至5mg的口服單劑量。出人意料地，諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在人類中，具有最低不良事件風(fēng)險(xiǎn)的臨床有效每日劑量似乎是可行的，且劑量低達(dá)3mg或甚至2mg(圖3，實(shí)例4)。這對(duì)于被治療受試者而言是高度有益的，因?yàn)檩^低的劑量不僅將伴隨較高劑量的化合物504所觀察到的不良事件(特別是失眠和睡眠時(shí)相節(jié)律紊亂)最小化，而且將涉及此類化合物的其他咖啡因樣體征和癥狀最小化，這些體征和癥狀包括伴隨5mg和10mg劑量所觀察到的頭暈、乏力、頭痛、多汗、體位性低血壓以及心悸(實(shí)例3)。

因此，本發(fā)明涉及化合物504用于以低于或處于3mg的每日劑量用作藥劑的用途，如0.5mg與3mg、1mg與3mg、2mg與3mg之間，約2mg或2mg。具體而言，該化合物可以用于治療pd。

在一個(gè)另外的方面中，該化合物可以被用于藥物組合物或例如片劑中，該藥物組合物或片劑包含低于或處于3mg的每日劑量，如0.5mg與3mg、1mg與3mg、2mg與3mg之間或約2mg或2mg。

本發(fā)明的一個(gè)另外的目的在于提供用于治療adhd的化合物504(實(shí)例5)。顯示化合物504是有效的、具口服活性的a2a受體拮抗劑，它可以引起cgs21680誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)不足(hypolocomotion)的穩(wěn)健體內(nèi)逆轉(zhuǎn)?？缈赡艿膭┝勘┞斗秶衔?04還改善注意表現(xiàn)方面，與a2a受體的拮抗作用一致。照此，這些作用支持化合物504在治療注意缺陷中的潛力。因此，化合物504可以用于治療adhd。該每日劑量可以低于或處于3mg，如0.5mg與3mg、1mg與3mg、2mg與3mg之間或2mg。

化合物504跨劑量水平的平均半衰期相似，范圍從19至25小時(shí)。因此化合物504與用于治療例如adhd的其他市售藥物非常不同，因?yàn)樗梢悦刻毂唤o予一次并且由此當(dāng)受試者已經(jīng)服用該藥物24小時(shí)之后早晨醒來(lái)發(fā)揮作用。adhd的大多數(shù)其他藥物必須被更經(jīng)常地給予，因?yàn)閷?duì)于哌甲酯而言它們僅工作2-12小時(shí)，在賴氨酸安非他命的情況下是8-14小時(shí)，或與由于半衰期為5-7小時(shí)而被每天給予兩次的另一種a2a拮抗劑v-81444相比。

令人希望的是選擇對(duì)于療法而言更有效的給予途徑，其實(shí)例是通過(guò)使用例如片劑而口服給予。

可以使用例如賦形劑(例如，乳糖和甘露醇)、崩解劑(例如，淀粉)、潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂)、粘合劑(例如，羥丙基纖維素)、表面活性劑(例如，脂肪酸酯)以及增塑劑(例如，甘油)生產(chǎn)適于口服給予的制劑(如片劑)。

腸胃外制劑還可以包括一種或多種選自以下各項(xiàng)的輔助組分：描述于口服制劑的以上說(shuō)明中的賦形劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、表面活性劑和增塑劑以及稀釋劑、防腐劑、調(diào)味劑等。

在上述應(yīng)用的情況下，通常可以口服或腸胃外給予化合物504或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在此上下文中，術(shù)語(yǔ)“治療(treatment和treating)”意指管理并護(hù)理患者用于抗擊疾病的目的。該術(shù)語(yǔ)意圖包括對(duì)患者所患的給定疾病的治療的完整范圍，例如給予活性化合物以緩解癥狀或并發(fā)癥、以延遲疾病的進(jìn)展、以緩解或減輕癥狀及并發(fā)癥、和/或以治愈或消除疾病。待治療的患者優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，特別是人類。在此上下文中，“疾病”可以與障礙(disorder)、病癥(condition)、機(jī)能障礙(malfunction)、功能障礙(dysfunction)等同義使用。

實(shí)例

實(shí)例1

通過(guò)體外放射自顯影研究大鼠中的紋狀體a2a占用

該項(xiàng)研究調(diào)查了在向雄性大鼠(雄性cd大鼠(8周齡，日本查爾斯河(charlesriverjapan)))單次口服給予化合物504之后紋狀體中的受體占用。將氚標(biāo)記的sch58561(0.3nmol/l，來(lái)自ge醫(yī)療集團(tuán)(gehealthcare))用作對(duì)a2a受體成像用的示蹤物。通過(guò)將示蹤物與獲得自被給予化合物504的大鼠的腦片一起孵育來(lái)測(cè)定受體占用。

將化合物504(0.06mg/ml)以5ml/kg(0.3mg/kg)的量口服地給予大鼠并且在給予乙醚之后麻醉6和8小時(shí)。之后，將動(dòng)脈和靜脈血液收集進(jìn)包含肝素的管中。之后立即取出腦并包埋進(jìn)oct化合物中并冷凍于用干冰冷卻的2-甲基丁烷中。將冷凍的腦保存在-80℃下直到使用。

使用冷凍切片機(jī)(coldtome，設(shè)定溫度-20℃，佐倉(cāng)市)制備在約前囟1.2mm處的冠狀切片(20μm)并放在載玻片(超冷防凍(superfrost)，松波玻璃(matsunamiglass)；每個(gè)載玻片2或3個(gè)切片)上。將收集在載玻片上的腦切片保存在-80℃下。將七十微升包含0.1或0.3nmol/l的示蹤物的反應(yīng)溶液施加至腦切片上并在室溫下孵育預(yù)設(shè)時(shí)間。使用硅化工具處理包含示蹤物的反應(yīng)溶液。與示蹤物一起孵育之后，將腦切片用冰冷的洗滌溶液洗滌三次，每次1分鐘，并且用冰冷的水沖洗兩次。通過(guò)在0.1mmol/lneca的存在下用制備自未經(jīng)藥物處理的大鼠的腦切片進(jìn)行相同反應(yīng)來(lái)評(píng)估示蹤物的非特異性結(jié)合。將腦切片在室溫下干燥，暴露于暗盒中的成像板(bas-tr2040，富士膠卷公司(fujifilm))，并且在屏蔽盒中留置約24小時(shí)。在以下條件下記錄放射性：分辨率：50μm；灰度：256；靈敏度：10000；寬容度：5。

通過(guò)用乙腈稀釋化合物504來(lái)制備包含0.01μg/ml、0.03μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及30μg/ml的化合物504的溶液而制得血漿樣品用校準(zhǔn)曲線。將溶液以1％vol的乙腈濃度添加至對(duì)照血漿樣品中，以制備包含0.1ng/ml、0.3ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml及300ng/ml的化合物504的血漿樣品。將這些血漿樣品用作校準(zhǔn)曲線樣品。

對(duì)于預(yù)處理血漿樣品，將內(nèi)標(biāo)(i.s.)溶解于乙腈中，以制備0.03μg/ml的i.s.溶液。如有必要，用對(duì)照血漿稀釋血漿樣品。向0.1ml的血漿樣品中添加10μl的i.s.溶液和1ml的10mmol/l乙酸銨并攪拌，以制備預(yù)處理用樣品。使用綠洲hlb提取板(oasishlbextractionplate)(30mg，沃特斯公司(waters))預(yù)處理樣品。用1ml的甲醇和水連續(xù)地調(diào)節(jié)每個(gè)孔。將一毫升預(yù)處理用樣品裝載在孔上。將每個(gè)孔用1ml的5vol％甲醇洗滌之后，用1ml乙腈洗脫分析物。將洗脫物在氮?dú)饬飨抡舭l(fā)并且將殘余物重新溶解于0.1ml重建溶液中。使用unfilter(0.45μm，親水pvdf，沃特曼公司(whatman))將樣品在4℃、約1800xg下離心5分鐘。將濾液的等分部分用于分析。

使用以下公式計(jì)算紋狀體中的a2a受體占用

φ(％)＝(1-(pslkw-bg/a)/(pslctrl-bg/a))*100

其中pslkw-和pslctrl分別是未經(jīng)化合物504處理和經(jīng)化合物504處理的動(dòng)物的roi中的psl值。pls是用于檢測(cè)示蹤物的光激勵(lì)發(fā)光并且roi是紋狀體中的示蹤物測(cè)量感興趣區(qū)。

作為每個(gè)動(dòng)物中的受體占用，使用2或3個(gè)切片(4-6roi)的平均值。

化合物504在血漿中的濃度與捕獲者占用之間的關(guān)系示于圖1中。ec50為121ng/ml(95％置信區(qū)間，113至128ng/ml)。

實(shí)例2

mptp-損害狨猴中的a2a占用

使用更臨床相關(guān)的mptp(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶)-損害狨猴模型中的失能逆轉(zhuǎn)得分評(píng)估化合物504的pk/pd關(guān)系，其中帕金森治療需要預(yù)期80％人紋狀體a2a占用(rose(羅斯)等人(2006)europeanjparm(歐洲藥學(xué)雜志)，546,82-87；uchida(內(nèi)田)等人(2014)jpharmacolsci(藥理科學(xué)雜志)，124,480-485；kanda(坎達(dá))等人(200)expneurol(實(shí)驗(yàn)神經(jīng)學(xué))，162,321-327)。

在將狨猴用于pk/pd測(cè)量之前，狨猴接受若干次mptp方案(單次mptp方案：2mg/kg，連續(xù)3天每天皮下注射)。

首先，在使用半房室pk模型(平衡半衰期<0.5h)評(píng)估潛在滯后之后，基于體外切片放射自顯影，用顳紋狀體a2a占用(0.3mg/kg)的pk/pd建模(emax效應(yīng)模型)確立大鼠血漿濃度與受體占用關(guān)系。從pk/pd建模預(yù)測(cè)大鼠紋狀體占用的ec80為1250ng/ml(還參見(jiàn)圖1)。

其次，建立經(jīng)mptp處理的狨猴(0.1-3mg/kg)的血漿濃度與失能逆轉(zhuǎn)得分的pk/pd建模(emax效應(yīng)模型)，預(yù)測(cè)ec80為175ng/ml，其對(duì)應(yīng)于從擬合的大鼠占用曲線外推來(lái)的>50％a2a占用。在狨猴中不存在任何用于將ec80a2a占用所需的血漿濃度與人用劑量推測(cè)相關(guān)的紋狀體占用數(shù)據(jù)情況下，基于大鼠紋狀體占用的預(yù)測(cè)ec50-80血漿濃度和狨猴失能逆轉(zhuǎn)得分確立了3mg-24mg的每日劑量范圍。

在圖2中，示出了基于大鼠a2a占用和經(jīng)mptp處理的狨猴失能逆轉(zhuǎn)得分預(yù)測(cè)的pd患者體內(nèi)的化合物504血漿濃度范圍的治療有效ec50-80。

實(shí)例3

安全性和耐受性研究

該項(xiàng)研究的主要目標(biāo)在于研究以單劑量向年齡≥18且≤45歲的健康年輕男性以及年齡≥55且≤75歲的老年男性和女性給予的化合物504的安全性和耐受性，這些人的體重指數(shù)(bmi)≥19且≤29kg/m2。以三個(gè)部分進(jìn)行該項(xiàng)研究：部分a、b和c。

部分a和b是單劑量遞增，以分別確定健康年輕男性以及老年男性和女性中的安全性和耐受性。在健康年輕男性中測(cè)試了三個(gè)劑量(同類組a1至a3)：1mg(n＝6)、5mg(n＝6)和10mg(n＝5)；安慰劑(n＝8，共計(jì)三個(gè)同類組)。14c標(biāo)記的化合物504(250nci)被包括在向健康年輕男性給予的10mg劑量中。在健康老年男性和女性中測(cè)試了兩個(gè)劑量(同類組b1和b2)：5mg(n＝9位男性/4位女性)、10mg(n＝4位男性/4位女性)；安慰劑(n＝6位男性/4位女性，共計(jì)三個(gè)同類組)。在部分c中，使用重復(fù)的單劑量來(lái)研究在給予化合物504之后食物的可能效應(yīng)和受試者內(nèi)變異性。在三個(gè)分開(kāi)的場(chǎng)合，總計(jì)12位健康老年男性(n＝6)和女性(n＝6)以隨機(jī)方式各自接受單劑量的化合物5045mg。在一個(gè)場(chǎng)合下，在fda標(biāo)準(zhǔn)高脂肪早餐之后給予化合物504，并且在兩個(gè)場(chǎng)合下，在過(guò)夜禁食之后給予化合物504。每次劑量給予隔開(kāi)至少7天的洗脫期。在部分a和b中，將化合物504作為口服溶液給予(0.25mg/ml)并且在部分c中，將化合物504作為固體配制品給予(5mg膠囊)。

下面概述了在該項(xiàng)研究的部分a、b和c中測(cè)定的化合物504的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

化合物504在健康年輕男性中的單劑量藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)-部分a

呈現(xiàn)出了算術(shù)平均值(cv％)。呈現(xiàn)出了tmax的中值(min，max)。n＝受試者的數(shù)目

化合物504在健康老年男性和女性中的單劑量藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)-部分b

呈現(xiàn)出了算術(shù)平均值(cv％)。呈現(xiàn)出了tmax的中值(min，max)。n＝受試者的數(shù)目

食物對(duì)化合物504在老年男性和女性中的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響的統(tǒng)計(jì)分析-部分c

an＝11

ci＝置信區(qū)間；ls＝最小二乘法；n＝受試者的數(shù)目

部分a和b的結(jié)果顯示，化合物504在每個(gè)劑量下都被迅速吸收，其中給藥后的中值tmax為0.75至1.75小時(shí)。達(dá)到cmax之后，化合物504的血漿濃度趨于穩(wěn)定，直到給藥后大約5小時(shí)；之后，平均血漿濃度下降，盡管個(gè)別血漿濃度波動(dòng)。如通過(guò)auc0-24和cmax所測(cè)定的，向化合物504暴露似乎以近似劑量成比例方式在劑量范圍1mg至10mg內(nèi)增加?？鐒┝康钠骄鵷1/2是類似的并且范圍從19至25小時(shí)。

在部分b中，在男性與女性之間在向化合物504的暴露方面不存在顯著差異。性別之間以及5mg與10mg之間的平均t1/2大體類似。

在健康年輕受試者和老年受試者之間在化合物504的藥代動(dòng)力學(xué)曲線方面不存在明顯差異。

在部分c中，食物延遲了化合物504的吸收；在進(jìn)食狀態(tài)下，平均tmax出現(xiàn)在大約2至3小時(shí)后。在進(jìn)食狀態(tài)下的平均cmax比禁食狀態(tài)下低大約23％?；赼uc0-inf和auc0-t，與禁食狀態(tài)相比，在進(jìn)食狀態(tài)下在給予化合物5045mg之后的總體暴露在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并沒(méi)有顯著差異。在每種飲食狀態(tài)下，向化合物504的總體暴露(基于平均auc的檢查)在男性中似乎比在女性中高。對(duì)于男性而言，跨禁食劑量的受試者內(nèi)變異性(cv％)較低，對(duì)于auc0-inf和cmax而言分別是27％和16％。對(duì)于女性而言，變異性較高，其中auc0-inf和cmax的cv％分別為59％和23％。

在部分a中，向健康年輕男性給予化合物504的單劑量1mg、5mg和10mg。

總計(jì)，在化合物504劑量組中的17位受試者中的13位具有36起ae并且安慰劑組中的8位受試者中的2位具有3起ae(不良事件)。

失眠是最常見(jiàn)的不良事件，報(bào)告在化合物5045mg組中的4位受試者身上并且被化合物50410mg組中的所有5位受試者所報(bào)告。在安慰劑或化合物5041mg組中的受試者未報(bào)告失眠。失眠通常在給藥后大約14至16小時(shí)報(bào)告，這對(duì)應(yīng)于大約23:00至01:00的時(shí)鐘時(shí)間。失眠中的八起事件是輕度的并且一個(gè)是中度的。失眠通常在2.5至6.25小時(shí)內(nèi)解決；在2位受試者中，失眠持續(xù)了大約2天。

在部分b中，向健康老年男性和女性給予化合物504的單劑量5mg和10mg。

總計(jì)，在化合物504劑量組的21位受試者中的16位具有53起ae并且安慰劑組的10位受試者中的5位具有7起ae。

在化合物50410mg組中三位受試者具有5起嚴(yán)重不良事件：1位女性失眠，情感不穩(wěn)定并且躁動(dòng)；1位男性血壓升高；1位女性室性早搏。室性早搏發(fā)生在遙測(cè)術(shù)過(guò)程中(給藥后大約3小時(shí))，并且直到給藥后1天4小時(shí)間歇性地看到早搏。在研究完成之后，該受試者被交給一名獨(dú)立外聘心臟病專家，他對(duì)該受試者進(jìn)行檢查，并且在給藥后51天在霍爾特(holter)記錄中檢測(cè)到類似事件。

在部分b中的化合物504劑量組中發(fā)生率最高的ae是失眠和躁動(dòng)，這與該項(xiàng)研究的部分a中的發(fā)現(xiàn)一致。10mg劑量被認(rèn)為接近老年受試者的最大耐受劑量。

在部分c中，當(dāng)在進(jìn)食和禁食狀態(tài)下給予時(shí)，向健康老年受試者給予化合物504的單劑量5mg是安全且可耐受的。

總計(jì)，12位受試者中的11位具有90起ae，其中的15起事件是中度的并且3起事件是嚴(yán)重的。這3起嚴(yán)重事件發(fā)生在1位受試者身上：躁動(dòng)，情感不穩(wěn)定和注意干擾，它們分別在化合物504的第三單劑量(5mg，禁食)之后30分鐘、1小時(shí)和給藥后1小時(shí)出現(xiàn)。在1.5天之后在未經(jīng)治療的情況下解決了這些事件，并且在這段時(shí)間里，該受試者還中度焦慮和輕度失眠。

發(fā)生率最高的ae是失眠并且有12起輕度失眠事件和2起中度失眠事件。此發(fā)現(xiàn)與該項(xiàng)研究的部分a和b中的發(fā)現(xiàn)一致。

實(shí)例4

研究a2a受體占用的人類pet研究

該項(xiàng)研究被設(shè)計(jì)成開(kāi)放標(biāo)簽、正電子發(fā)射斷層術(shù)(pet)研究，使用[11c]-sch442416作為示蹤化合物研究在單次口服給藥化合物504之后年輕健康男性體內(nèi)的a2a受體占用。

該項(xiàng)研究由以下項(xiàng)組成：篩選期，磁共振成像(mri)掃描，安全性基線，治療期(基線pet掃描、化合物504給藥和兩次治療pet掃描)以及隨訪。

在該項(xiàng)研究中有3個(gè)同類組，每個(gè)同類包括2位受試者。同類組a1中的兩位受試者接受5mg化合物504；在同類組a2中，1位受試者接受0.5mg化合物504并且1位受試者接受1mg化合物504；在同類組a3中，1位受試者接受2mg化合物504并且1位受試者接受3mg化合物504。

綜述了受試者數(shù)目、化合物504的劑量以及評(píng)估時(shí)間點(diǎn)并且基于來(lái)自先前同類組的原始藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)以及安全性和耐受性數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)整。

在篩選期(第-28至-4天)，進(jìn)行安全性篩選程序并通過(guò)磁共振成像(mri)掃描證實(shí)受試者合格性(第-21至-2天)。在第-1天，合格受試者獲準(zhǔn)進(jìn)入診所。在第1天，在接受單劑量的化合物504之前進(jìn)行基線pet掃描。在給藥后大約2小時(shí)進(jìn)行第二次pet掃描(pet2)，此時(shí)是最大化合物504血漿濃度(tmax)的估算時(shí)間。同類組a1中的受試者在給藥后大約24小時(shí)進(jìn)行第三次pet掃描(pet3)并且同類組a2和a3中的受試者在給藥后大約26小時(shí)進(jìn)行第三次pet掃描(pet3)。受試者接受pet示蹤物[11c]-sch442416，之后立即進(jìn)行各個(gè)pet掃描。

所有受試者從第-1天直到在第4天完成72小時(shí)給藥后安全性評(píng)估，被限制在該診所。在第6天進(jìn)行隨訪評(píng)估(直到之前1天和之后2天)。對(duì)于每位受試者，該項(xiàng)研究的總持續(xù)時(shí)間(從篩選到隨訪)大約2.5至3.5周。

pet示蹤物[11c]-sch442416被提供為11ml無(wú)菌且無(wú)熱原的1型玻璃小瓶中的放射性藥物，以靜脈內(nèi)給藥用溶液的形式。[11c]-sch442416溶液由多達(dá)10％乙醇和90％生理鹽水組成并且經(jīng)大約20秒作為大約20ml的生理鹽水/乙醇溶液中以靜脈內(nèi)推注而給予。對(duì)于每次pet掃描而言，每位受試者最多接受500mbq的[11c]-sch442416。

在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，抽取血液樣品用于化合物504的藥物濃度分析并且評(píng)估安全性和耐受性。

主要入選標(biāo)準(zhǔn)

男性，年齡25與55歲之間(包括極值)，體重指數(shù)(bmi)在18.5kg/m²與30kg/m²之間(包括極值)

藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估

針對(duì)每位受試者計(jì)算化合物504的以下藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)：從零至無(wú)窮大的血漿濃度-時(shí)間曲線下面積(auc0-inf)；從零至?xí)r間tlast的血漿濃度-時(shí)間曲線下面積(auc0-t)；觀察到的最大血漿濃度(cmax)；針對(duì)每次給藥后pet掃描計(jì)算的pet掃描時(shí)的血漿濃度(cpet)；口服清除率(cl/f)；血漿中的表觀消除半衰期(t1/2)；對(duì)應(yīng)于cmax出現(xiàn)的標(biāo)稱時(shí)間(tmax)；最后可定量濃度的時(shí)間(tlast)以及表觀分布容積(vz/f)。

藥效學(xué)評(píng)估

使用簡(jiǎn)化組織參考方法(srtm)分析pet數(shù)據(jù)。此方法假設(shè)了類似于富含靶標(biāo)的區(qū)域的參考區(qū)域(在此情況下是小腦)，除了它沒(méi)有靶標(biāo)受體之外。利用的srtm實(shí)施直接估算相對(duì)于非可取代組分(bpnd)的結(jié)合潛力，可以將該結(jié)合潛力看作特異性結(jié)合的度量。

然后可以將感興趣區(qū)(roi)中的受體占用(ro)直接計(jì)算為：ro＝100×(1-bpnd(給藥后)/bpnd(基線))

背側(cè)殼核和蒼白球是具有最高特異性信號(hào)的兩個(gè)roi并且因此計(jì)算這些roi的ro。

統(tǒng)計(jì)方法學(xué)

使用以下分析集：

所有經(jīng)處理受試者集(all-subjects-treatedset)(asts)-給予化合物504以及由此的[11c]-sch442416的所有受試者

藥效學(xué)集(pds)-進(jìn)行至少一次有效imp后pet掃描和對(duì)應(yīng)的cpet有效評(píng)估的所有受試者

使用非房室分析估算化合物504的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

列出結(jié)合潛力和估算的ro并相對(duì)于cpet以圖形方式呈現(xiàn)。

通過(guò)應(yīng)用emax模型借助回歸分析化合物504的血漿濃度與估算的a2a受體占用之間隨時(shí)間的關(guān)系并進(jìn)行研究。

結(jié)果

圖3示出了使用emax估算的在pet掃描時(shí)殼核中的受體占用與化合物504血漿濃度。

化合物504以1至2小時(shí)的tmax被迅速吸收，這對(duì)應(yīng)于第一次給藥后pet掃描(pet2)的時(shí)間。在殼核中估算的emax和ec50值是88％和31.0ng/ml并且在蒼白球中是101％和68.9ng/ml。emax模型總體上似乎非常適合殼核數(shù)據(jù)，針對(duì)蒼白球數(shù)據(jù)的變異性較高；兩組分析的殘余圖沒(méi)有顯示出證據(jù)來(lái)表明該模型的假設(shè)是無(wú)效的。

從這些數(shù)據(jù)，顯而易見(jiàn)的是處于或低于3mg的劑量足以達(dá)到80％的占用。

實(shí)例5

此項(xiàng)研究的目的在于關(guān)于長(zhǎng)埃文斯(longevans)大鼠在注意測(cè)試(五項(xiàng)選擇連續(xù)反應(yīng)時(shí)間任務(wù)(5-csrtt；robbins(羅賓斯)，psychopharmacology(精神藥理學(xué))(berl)(2002)163(3-4):362-80))中的表現(xiàn)，研究化合物504。

此項(xiàng)研究由3個(gè)階段組成。

(1)化合物504對(duì)抗由選擇性a2a受體激動(dòng)劑cgs21680誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)不足的研究(higgins(希金斯)等人behavbrainres(行為大腦研究)(2007)；185(1):32-42)。此項(xiàng)測(cè)試作為用于確立功能性地阻斷中樞介導(dǎo)的a2a受體介導(dǎo)的響應(yīng)所需的化合物504劑量的藥效學(xué)測(cè)定。在相當(dāng)于行為測(cè)試的時(shí)間點(diǎn)還測(cè)量了化合物504的血漿水平，以確定藥物的藥理學(xué)相關(guān)劑量下的血漿暴露。

(2)基于從(1)確立的劑量，在5-csrtt的4個(gè)變體中測(cè)試了化合物504，這些變體被設(shè)計(jì)用于測(cè)量藥物對(duì)不同表現(xiàn)方面的影響。(a)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行測(cè)試，即相當(dāng)于動(dòng)物訓(xùn)練的最終條件，即刺激持續(xù)時(shí)間(sd)0.75秒(s)，試驗(yàn)間隔(iti)5s，100次試驗(yàn)。此條件的目的在于測(cè)量在標(biāo)準(zhǔn)條件下藥物對(duì)表現(xiàn)的影響。(b)在延長(zhǎng)的(長(zhǎng))iti條件下進(jìn)行測(cè)試，即低事件率，sd0.3s，iti5s、7.5s、10s，120次試驗(yàn)。此條件的目的在于測(cè)量在需要?jiǎng)游镅舆t其響應(yīng)的較低事件率下藥物對(duì)表現(xiàn)的影響。(c)在短iti條件下進(jìn)行測(cè)試，即高事件率，sd0.3s，iti3s、4s、5s，120次試驗(yàn)。此條件的目的在于測(cè)量在需要?jiǎng)游镅杆偬幚砀杏X(jué)信息的高事件率下藥物對(duì)表現(xiàn)的影響。(d)在擴(kuò)大的試驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)試，即sd0.3s，iti5s，250次試驗(yàn)。此條件的目的在于測(cè)量在擴(kuò)大的試驗(yàn)下藥物對(duì)表現(xiàn)的影響，從而測(cè)試持續(xù)注意或警覺(jué)。

(3)關(guān)于很好地熟習(xí)測(cè)試儀器的大鼠中的基線自發(fā)活動(dòng)研究化合物504。

以蒸餾水中的0.5w/v％甲基纖維素400(粘度：400cp)的劑型測(cè)試劑量0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.06mg/kg、0.1mg/kg。將藥物以5ml/kg的體積口服給予。

階段1：

將六十只(60)雄性長(zhǎng)埃文斯大鼠(3月齡)分成6個(gè)組，每組n＝10只大鼠。下表列出了這6個(gè)組：

表1.階段1的處理概述

在活動(dòng)測(cè)試之前60分鐘，通過(guò)口服強(qiáng)飼給予化合物504。在活動(dòng)測(cè)試之前10分鐘，皮下給予cgs21680。在自動(dòng)化medassociates活動(dòng)測(cè)試箱中測(cè)量監(jiān)測(cè)大鼠的自發(fā)性活動(dòng)的活動(dòng)測(cè)試持續(xù)20分鐘。追蹤場(chǎng)的尺寸為17”wx17”lx12”h，將感應(yīng)條固定在地面以上1”以追蹤行進(jìn)的距離，并且將第二組感應(yīng)條放在地面以上6”以測(cè)量垂直運(yùn)動(dòng)和直立活動(dòng)。在追蹤軟件上設(shè)定的參數(shù)是：分辨率-50ms，盒大小-4梁，休息延遲-500ms以及走動(dòng)觸發(fā)器-2個(gè)。

在一周的洗脫期之后，將在活動(dòng)研究中使用的20只大鼠重新分成4個(gè)新組，每組n＝5只，并且各自用在活動(dòng)研究中使用的劑量(0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.06mg/kg及0.1mg/kg)的化合物504進(jìn)行處理。在給予藥物后10min、20min、60min及120min，即在與活動(dòng)研究(和階段2：五項(xiàng)選擇實(shí)驗(yàn))相一致的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)由隱靜脈放血收集最少400ul的全血。收集血液并轉(zhuǎn)移進(jìn)k3edta管中。允許這些管在室溫下停留大約2分鐘并且放在濕冰上直到離心。使血液在4℃下于離心機(jī)中以3,500rpm的速度旋轉(zhuǎn)15分鐘。分離血漿并放進(jìn)標(biāo)記的0.75mlmatrix管中并加帽。將血漿管放進(jìn)matrix架中并存儲(chǔ)在-80℃冷凍機(jī)中。在通過(guò)心臟穿刺收集血液之后的最終時(shí)間點(diǎn)(給予藥物后120分鐘)，提取腦組織并沿著中線對(duì)切。將沒(méi)有小腦的一個(gè)半球放進(jìn)15ml預(yù)稱重腦管中而丟棄另一部分。將腦管稱重，在干冰上冷凍，并存儲(chǔ)在-80℃下。將腦組織和血漿樣品在干冰上運(yùn)至贊助商處。將由贊助商確定化合物504的血液和腦水平。

階段2：

經(jīng)大約2-3個(gè)月的時(shí)間，在5-csrtt中訓(xùn)練十六只(16)實(shí)驗(yàn)初試雄性長(zhǎng)埃文斯大鼠的漸近表現(xiàn)。針對(duì)每個(gè)時(shí)段的最終刺激持續(xù)時(shí)間(sd)為0.75s，5s試驗(yàn)間隔(iti)，5s有限持續(xù)時(shí)間(lh)，100次試驗(yàn)訓(xùn)練這些大鼠。在這些條件下的目標(biāo)表現(xiàn)水平在>80％準(zhǔn)確度且<20％遺漏的范圍內(nèi)。一旦表現(xiàn)穩(wěn)定便開(kāi)始用化合物504進(jìn)行藥物測(cè)試。

在訓(xùn)練該組動(dòng)物之后，在同一大鼠同類組中根據(jù)各種實(shí)驗(yàn)任務(wù)(參見(jiàn)下表2)測(cè)試多項(xiàng)藥物研究?；趤?lái)自階段1的結(jié)果確立化合物504的劑量。此項(xiàng)研究設(shè)計(jì)由4個(gè)實(shí)驗(yàn)構(gòu)成，其中每個(gè)實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間為2-3周并且每個(gè)實(shí)驗(yàn)之間的間隔期為1周。

表2.階段2的5-csrtt時(shí)間表概述

階段3：

經(jīng)三個(gè)90分鐘時(shí)段使十六只(16)雄性長(zhǎng)埃文斯大鼠熟習(xí)medassociates測(cè)試活動(dòng)箱(17”wx17”lx12”h)。使用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)，以每個(gè)實(shí)驗(yàn)循環(huán)之間的洗脫期為2-3天，經(jīng)90min時(shí)段研究化合物504和安非他命(1mg/kg)對(duì)運(yùn)動(dòng)行為的影響。整個(gè)時(shí)段的總行進(jìn)距離和直立計(jì)數(shù)是主要度量。測(cè)試了4個(gè)劑量(0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.06mg/kg及0.1mg/kg)下的化合物504，單劑量(1mg/kg)下的安非他命加運(yùn)載體對(duì)照。

結(jié)果

a2a受體激動(dòng)劑cgs21680。

用cgs21680(可獲得自例如默克密理博集團(tuán)(merckmilliporecorporation))(1mg/kgsc)進(jìn)行預(yù)處理在用運(yùn)載體處理的大鼠中產(chǎn)生穩(wěn)健的運(yùn)動(dòng)不足。與運(yùn)載體處理的對(duì)照相比，均在20min測(cè)試期間測(cè)量的自發(fā)活動(dòng)(被定義為總行進(jìn)距離)和直立分別減少92％和99％。在cgs21680之前50min口服給予的化合物504(0.01-0.1mg/kg)以近似(未計(jì)算)0.06mg/kg的ed50產(chǎn)生對(duì)cgs-運(yùn)動(dòng)不足的劑量相關(guān)拮抗作用。在0.1mg/kg的較高劑量下，化合物504完全逆轉(zhuǎn)cgs誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)不足。注意到化合物504對(duì)直立和走動(dòng)事件的測(cè)量的類似影響。正式分析揭示了處理對(duì)行進(jìn)距離(f5,56＝33.9、p<0.01)、直立(f5,56＝35.1，p<0.01)和走動(dòng)事件(f5,56＝37.7，p<0.01)的主要影響。在每種情況下，化合物504在0.06mg/kg和0.1mg/kg劑量下顯著逆轉(zhuǎn)cgs-運(yùn)動(dòng)不足，其中0.1mg/kg劑量位于運(yùn)載體基線處。

盡管未通過(guò)ivs進(jìn)行來(lái)自用化合物504預(yù)處理的動(dòng)物的生物分析測(cè)量，但是這些數(shù)據(jù)被包括在本報(bào)告中，用于與行為測(cè)量進(jìn)行比較?；衔?04在劑量范圍0.01mg/kg-0.1mg/kg展示了有序的劑量-血漿暴露關(guān)系。在60min和90min兩個(gè)取樣期下cgs-運(yùn)動(dòng)不足的逆轉(zhuǎn)與血漿[藥物]之間的近乎線性關(guān)系都很明顯，所述取樣期對(duì)應(yīng)于測(cè)試時(shí)間。在這些時(shí)間點(diǎn)，在0.03mg/kg-0.1mg/kg化合物504的藥理學(xué)活性劑量范圍，血漿水平的范圍達(dá)到150ng/ml-400ng/ml。

階段2：如通過(guò)五項(xiàng)選擇連續(xù)反應(yīng)時(shí)間任務(wù)所測(cè)量的，化合物504對(duì)注意表現(xiàn)的影響。

在大約10周的時(shí)間內(nèi)，針對(duì)5-csrtt訓(xùn)練16只雄性長(zhǎng)埃文斯大鼠。在此組之中，在0.75ssd、5siti、100次試驗(yàn)、5slh的最終基線條件下，15只可靠地滿足>80％正確響應(yīng)且<20％錯(cuò)過(guò)試驗(yàn)的表現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)于大多數(shù)研究，樣品大小為15，其中所有大鼠以均衡順序接受每次處理。

標(biāo)準(zhǔn)條件：首先在標(biāo)準(zhǔn)基線條件下針對(duì)5-csrtt表現(xiàn)評(píng)估化合物504(0.01mg/kg-1mg/kg，口服)。總計(jì)15只大鼠用于此研究同類組中。注意到處理對(duì)正確潛伏期(f4,56＝3.26，p＝0.02)和過(guò)早響應(yīng)(f4,56＝3.53，p＝0.01)的主要影響?；衔?04在劑量0.03mg/kg-0.1mg/kg下顯著提高響應(yīng)速度(即降低正確潛伏期)，并且提高過(guò)早響應(yīng)，盡管這僅在0.1mg/kg劑量下達(dá)到顯著。所有其他測(cè)量(如％正確、#正確/不正確響應(yīng)、遺漏、食物盒潛伏期(magazinelatency))在測(cè)試劑量下不受化合物504影響。

長(zhǎng)iti：接下來(lái)，在長(zhǎng)iti條件下測(cè)試化合物504(0.03mg/kg-0.06mg/kg，口服)。同類組大小為15。延長(zhǎng)iti對(duì)過(guò)早響應(yīng)(f2,28＝93.3，p<0.01)并且還有正確/不正確試驗(yàn)和遺漏數(shù)目(f2,28>7.9，p<0.01)具有顯著影響，盡管％正確和正確潛伏期不受影響?；衔?04或luxiti相互作用對(duì)除過(guò)早響應(yīng)(f2,28＝4.25，p＝0.02)之外的任何測(cè)量都沒(méi)有主要影響，過(guò)早響應(yīng)被化合物504(0.06mg/kg)提高。在此相同劑量下，在長(zhǎng)iti下化合物504特異地降低準(zhǔn)確度的非顯著趨勢(shì)是明顯的(f2,28＝2.62，p＝0.09)。

還針對(duì)全部多個(gè)iti取平均的處理分析了來(lái)自此實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。處理僅有的主要影響是過(guò)早響應(yīng)(f2,28＝4.24，p＝0.02)。

短iti：在短iti條件下測(cè)試化合物504(0.03mg/kg-0.06mg/kg，口服)。同類組大小為14(由于表現(xiàn)不一致一只大鼠被移出(m3))。縮短iti對(duì)過(guò)早響應(yīng)、#正確/不正確試驗(yàn)、遺漏具有顯著影響(f2,26>3.42，p<0.05)，其中縮短iti增加任務(wù)難度。正確百分比受iti影響(f2,26＝3.61，p＝0.04)。注意到處理對(duì)％正確、不正確響應(yīng)、遺漏、過(guò)早響應(yīng)的主要影響(f2,26>4.91，p<0.01)，這反映出就選擇準(zhǔn)確度而言，化合物504在此條件下，特別是在短(3s)iti下改善了表現(xiàn)。

還針對(duì)全部多個(gè)iti取平均的處理分析了來(lái)自此實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。注意到處理對(duì)以下測(cè)量的主要影響：％正確、#不正確響應(yīng)、遺漏、過(guò)早響應(yīng)(f2,26>4.75，p<0.01)，其中化合物504針對(duì)每個(gè)測(cè)量都改善表現(xiàn)，即提高％正確，降低不正確響應(yīng)和遺漏。正確潛伏期具有臨界顯著性(f2,26＝3.31，p＝0.05)，反映出化合物504提高響應(yīng)速度的趨勢(shì)。

擴(kuò)大的250次試驗(yàn)：在擴(kuò)大的250次試驗(yàn)條件下測(cè)試化合物504(0.03mg/kg-0.1mg/kg，口服)。由于對(duì)評(píng)估時(shí)段持續(xù)時(shí)間的表現(xiàn)的重要性，這些數(shù)據(jù)與被組織成5塊每塊50次試驗(yàn)的試驗(yàn)一起呈現(xiàn)。同類組大小為13，由于表現(xiàn)不一致兩只大鼠被移出。

在這些時(shí)段的過(guò)程中，經(jīng)運(yùn)載體預(yù)處理的大鼠在前150次試驗(yàn)(箱子1-3)表現(xiàn)出約80％正確響應(yīng)的穩(wěn)定水平，然而此準(zhǔn)確度到箱子5降至52％+10％準(zhǔn)確度，其中4/13大鼠在第5個(gè)箱子過(guò)程中不能完成任何正確試驗(yàn)。正確響應(yīng)從箱子1-3中的平均25-27次響應(yīng)下降到箱子5中的14.6+3.3次響應(yīng)。遺漏(即開(kāi)始試驗(yàn)但未完成)也跨時(shí)段增加，其中在箱子1中8.2+1.4次遺漏，到箱子5上升至19.1+4.4次遺漏。重要的是要注意到，獲得的回報(bào)的這種下降不是由于飽腹感，因?yàn)槿绻谙喈?dāng)于250次試驗(yàn)時(shí)間表的時(shí)間段內(nèi)這些大鼠可以自由接近250個(gè)食物團(tuán)，則所有食物團(tuán)被消耗。相反，這種下降似乎反映出繼續(xù)任務(wù)的警覺(jué)或動(dòng)機(jī)下降。

用化合物504(0.03mg/kg-0.1mg/kg，口服)進(jìn)行預(yù)處理保護(hù)免于％正確和正確響應(yīng)數(shù)目下降，以及在箱子4和5中的遺漏增加-特別是在0.06mg/kg-0.1mg/kg劑量下。在化合物504的0.1mg/kg劑量下，所有大鼠在箱子5中完成至少13次正確試驗(yàn)。因此，注意到處理x箱子對(duì)正確響應(yīng)(f12,144＝4.58，p<0.01)和遺漏(f12,96＝3.27，p<0.01)數(shù)目的顯著相互作用，反映出在化合物504預(yù)處理之后在箱子4和5中表現(xiàn)改善(命中率較高)。相對(duì)于運(yùn)載體對(duì)照，在經(jīng)化合物504(0.1mg/kg)預(yù)處理的大鼠中總正確試驗(yàn)也顯著增加。正確百分比具有臨界顯著性(處理x箱子相互作用：f12,144＝1.54，p＝0.1)。

階段3：化合物504對(duì)熟習(xí)大鼠的自發(fā)活動(dòng)的影響：與安非他命相比。

在90min測(cè)試時(shí)段中，化合物504(0.01mg/kg-1mg/kg，口服)在自發(fā)活動(dòng)方面產(chǎn)生劑量相關(guān)增加，被測(cè)量為行進(jìn)距離(f5,70＝21.7，p<0.01)和直立計(jì)數(shù)(f5,70＝17.9，p<0.01)。這種影響的幅值在0.06mg/kg-0.1mg/kg劑量下趨于穩(wěn)定?；衔?04的效應(yīng)值顯著小于被包括在同一項(xiàng)研究中的單劑量急性安非他命(1mg/kgip)的效應(yīng)值。

還評(píng)估了由化合物504和安非他命產(chǎn)生的自發(fā)活動(dòng)變化的時(shí)間過(guò)程?；衔?04活性在前10min時(shí)間塊(timebin)過(guò)程中達(dá)到頂峰，并且在90min時(shí)段中逐漸下降?；衔?04的所有劑量的效應(yīng)時(shí)間格局都類似。

顯示化合物504是有效的、具口服活性的a2a受體拮抗劑，它可以在范圍從0.01mg/kg-0.1mg/kg的劑量下引起cgs21680誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)不足的穩(wěn)健體內(nèi)逆轉(zhuǎn)，所述范圍對(duì)應(yīng)于范圍為100ng/ml-450ng/ml的血漿濃度?？绱讼嗤瑒┝?并且可能是暴露)范圍，化合物504還改善在5-csrtt中測(cè)量的大鼠的注意表現(xiàn)方面，與a2a受體的拮抗作用一致。確切地說(shuō)，在siti方案下準(zhǔn)確度和正確響應(yīng)數(shù)目的增加(即高事件率)以及還有改善擴(kuò)大試驗(yàn)的表現(xiàn)表明了持續(xù)注意/警覺(jué)方面的改善。照此，這些作用支持化合物504在adhd治療中的潛力。