蒽環(huán)類二硫化物中間體、抗體?藥物綴合物和方法與流程

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序列表

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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及綴合至蒽環(huán)類二硫化物中間體以形成具有治療或診斷應(yīng)用的抗體-藥物綴合物的抗體?？贵w可被工程化具有對(duì)與蒽環(huán)類二硫化物中間體綴合有反應(yīng)性的游離半胱氨酸氨基酸。本發(fā)明還涉及使用抗體-藥物綴合物化合物用于體外、原位和體內(nèi)診斷或治療哺乳動(dòng)物細(xì)胞或相關(guān)病理學(xué)病狀的方法。

發(fā)明背景

抗體藥物綴合物(ADC)為靶向的化學(xué)治療分子，其通過(guò)將有效的細(xì)胞毒性藥物靶向至抗原表達(dá)腫瘤細(xì)胞、內(nèi)化和釋放藥物而結(jié)合抗體和細(xì)胞毒性藥物的性質(zhì)，從而增強(qiáng)它們的抗腫瘤活性(Carter,P.和Senter,P.(2008)The Cancer Jour.14(3):154-169)。針對(duì)給定靶抗原的成功的ADC開(kāi)發(fā)取決于抗體選擇的優(yōu)化、接頭設(shè)計(jì)和穩(wěn)定性、細(xì)胞毒性藥物效力以及藥物和接頭綴合至抗體的方式(Polakis,P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5:382–387)。

(曲妥珠單抗emtansine，Genentech)最近已被批準(zhǔn)用于治療乳腺癌。曲妥珠單抗emtansine為具有美登素藥物部分DM1的抗體-藥物綴合物，所述美登素藥物部分DM1通過(guò)穩(wěn)定的非二硫化物接頭MCC共價(jià)附接至抗HER2抗體曲妥珠單抗(Phillips G.等(2008)Cancer Res.68:9280-90)。曲妥珠單抗為配制成(Genentech)的抗體，所述在1998年被批準(zhǔn)用于HER2陽(yáng)性乳腺癌療法。

蒽環(huán)類被用于治療許多癌癥諸如白血病、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌和肉瘤。通常使用的蒽環(huán)類包括多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星和柔紅霉素。由糖苷氨基基團(tuán)上的環(huán)化所形成的多柔比星和柔紅霉素的嗎啉類似物具有更大的效力(Acton等(1984)J.Med.Chem.638-645；US 4464529；US 4672057；US 5304687)。奈莫柔比星為在多柔比星的糖苷氨基上具有2-甲氧基嗎啉代基團(tuán)的多柔比星的半合成類似物并且已進(jìn)行臨床評(píng)估(Grandi等(1990)Cancer Treat.Rew.17:133；Ripamonti等(1992)Brit.J.Cancer 65:703)，包括肝細(xì)胞癌的II/III期試驗(yàn)(Sun等(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22,摘要1448；Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research,44:第1版,摘要4649；Pacciarini等(2006)Jour.Clin.Oncology 24:14116)。已制備并且研究了柔紅霉素和多柔比星的免疫綴合物和前藥(Kratz等(2006)Current Med.Chem.13:477-523；Jeffrey等(2006)Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362；Torgov等(2005)Bioconj.Chem.16:717-721；Nagy等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97:829-834；Dubowchik等(2002)Bioorg.&Med.Chem.Letters 12:1529-1532；King等(2002)J.Med.Chem.45:4336-4343；US 6630579)。抗體-藥物綴合物BR96-多柔比星與腫瘤相關(guān)的抗原Lewis-Y特異性反應(yīng)并且已在I期和II期研究中評(píng)估(Saleh等(2000)J.Clin.Oncology 18:2282-2292；Ajani等(2000)Cancer Jour.6:78-81；Tolcher等(1999)J.Clin.Oncology 17:478-484)。

已表征來(lái)自肝微粒體的數(shù)種奈莫柔比星的代謝物(MMDX)，包括PNU-159682(Quintieri等(2005)Clinical Cancer Research,11(4):1608-1617；Beulz-Riche等(2001)Fundamental&Clinical Pharmacology,15(6):373-378；EP 0889898；WO 2004/082689；WO 2004/082579)。PNU-159682在體外比奈莫柔比星和多柔比星具有更顯著的細(xì)胞毒性，并且在體內(nèi)腫瘤模型中有效。PNU-159682被命名為3'-脫氨基-3”,4'-脫水-[2”(S)-甲氧基-3”(R)-氧基-4”-嗎啉基]多柔比星，并且具有以下結(jié)構(gòu)：

PNU-159682，

已描述某些PNU-159682抗體-藥物綴合物(WO 2009/099741；WO 2010/009124；US 8742076；US 8389697)。描述用于制備PNU-159682類似物的方法(US 8470984)。

概述

本發(fā)明包括具有式I的蒽環(huán)類二硫化物中間體：

Ant-L-(Z)_m-X I

其中Ant選自以下結(jié)構(gòu)：

其中波浪線表示與L的附接；

L為選自以下的接頭：–CH₂O–、–CH₂N(R)–、-N(R)-、-N(R)(C₁-C₁₂亞烷基)-、-N(R)(C₂-C₈亞烯基)-、-N(R)(C₂-C₈亞炔基)-、-N(R)(CH₂CH₂O)_n-以及以下結(jié)構(gòu)：

其中波浪線表示與Ant和Z的附接；并且

Z為選自以下的任選間隔物：-CH₂C(O)-、-CH₂C(O)NR(C₁-C₁₂亞烷基)-以及以下結(jié)構(gòu)：

其中波浪線表示與L和X的附接；

R為H、C₁-C₁₂烷基或C₆-C₂₀芳基；

Z¹選自-(C₁-C₁₂亞烷基)-、-(C₂-C₈亞烯基)-、-(C₂-C₈亞炔基)-、-O(C₁-C₁₂亞烷基)-、-O(C₂-C₈亞烯基)-,-O(C₂-C₈亞炔基)-以及-(CH₂CH₂O)_n-；

m為0或1；

n為1至6；

X為吡啶基二硫化物，其中吡啶基任選被選自以下的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代：NO₂、Cl、F和Br；并且

亞烷基、亞烯基、亞炔基、烷基和芳基任選被選自以下的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代：F、Cl、Br、N(CH₃)₂和OCH₃。

本發(fā)明包括共價(jià)附接至抗體以形成具有治療或診斷應(yīng)用的抗體-藥物綴合物(ADC)化合物的蒽環(huán)類二硫化物中間體。

本發(fā)明的另一方面為抗體-藥物綴合物化合物，其包括通過(guò)二硫化物、接頭L和任選的間隔物Z共價(jià)附接至一個(gè)或多個(gè)蒽環(huán)類衍生物藥物部分D的抗體，化合物具有式II：

Ab-S-S-(Z_m-L-D)_p II

或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中：

Ab為結(jié)合至選自(1)-(53)的一個(gè)或多個(gè)腫瘤相關(guān)的抗原或細(xì)胞表面受體的抗體：

(1)BMPR1B(IB型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體)；

(2)E16(LAT1、SLC7A5)；

(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原)；

(4)MUC16(0772P、CA125)；

(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素)；

(6)Napi2b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b)；

(7)Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、腦信號(hào)蛋白5b Hlog、sema結(jié)構(gòu)域、七個(gè)血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(1型和類1型)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和短細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、(腦信號(hào)蛋白)5B)；

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因)；

(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體)；

(10)MSG783(RNF124、假擬蛋白FLJ20315)；

(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白)；

(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)型受體電位陽(yáng)離子通道、亞家族M、成員4)；

(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生的生長(zhǎng)因子)；

(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒受體)或Hs 73792)；

(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相關(guān)β)、B29)；

(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有SH2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶錨定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；

(17)HER2；

(18)NCA；

(19)MDP；

(20)IL20Rα；

(21)短蛋白聚糖；

(22)EphB2R；

(23)ASLG659；

(24)PSCA；

(25)GEDA；

(26)BAFF-R(B細(xì)胞活化因子受體、BLyS受體3、BR3)；

(27)CD22(B細(xì)胞受體CD22-B同種型)；

(28)CD79a(CD79A、CD79α、免疫球蛋白相關(guān)α)；

(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1)；

(30)HLA-DOB(MHC II類分子的β亞基(Ia抗原))；

(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體門控離子通道5)；

(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72、Lyb-2)；

(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)、富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；

(34)FcRH1(Fc受體樣蛋白1)；

(35)FcRH5(IRTA2，免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2)；

(36)TENB2(推定跨膜蛋白聚糖)；

(37)PMEL17(銀同源物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；

(38)TMEFF1(具有EGF樣結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)卵泡抑素樣結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白1；腦腫瘤抑癌蛋白-1)；

(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受體α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；

(40)Ly6E(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；

(41)TMEM46(shisa同源物2(非洲爪蟾)；SHISA2)；

(42)Ly6G6D(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座G6D；Ly6-D、MEGT1)；

(43)LGR5(富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5；GPR49、GPR67)；

(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；

(45)LY6K(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；

(46)GPR19(G蛋白偶聯(lián)的受體19；Mm.4787)；

(47)GPR54(KISS1受體；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；

(48)ASPHD1(含天冬氨酸β羥化酶結(jié)構(gòu)域的1；LOC253982)；

(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；

(50)TMEM118(環(huán)指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；

(51)GPR172A(G蛋白偶聯(lián)的受體172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；

(52)CD33；以及

(53)CLL-1；

D為選自以下結(jié)構(gòu)的蒽環(huán)類衍生物：

其中波浪線表示與L的附接；

其中波浪線表示與D和Z的附接；并且

Z為選自以下的任選間隔物：-CH₂C(O)-、-CH₂C(O)NR(C₁-C₁₂亞烷基)-以及以下結(jié)構(gòu)：

R為H、C₁-C₁₂烷基或C₆-C₂₀芳基；

Z¹選自-(C₁-C₁₂亞烷基)-、-(C₂-C₈亞烯基)-、-(C₂-C₈亞炔基)-以及-(CH₂CH₂O)_n-，

m為0或1；

n為1至6；

p為1至8的整數(shù)；并且

亞烷基、亞烯基、亞炔基、烷基和芳基任選被選自以下的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代：F、Cl、Br、N(CH₃)₂、NO₂和OCH₃。

本發(fā)明的另一方面為藥物組合物，所述藥物組合物包含式II的抗體-藥物綴合物化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。

本發(fā)明的另一方面為式II的抗體-藥物綴合物化合物在制造用于治療哺乳動(dòng)物中的癌癥的藥劑的用途。

本發(fā)明的另一方面為通過(guò)向患者施用包含式II的抗體-藥物綴合物化合物的藥物組合物來(lái)治療癌癥的方法。

本發(fā)明的另一方面為制備式II的抗體-藥物綴合物化合物的方法。

本發(fā)明的另一方面為制品，所述制品包括包含式II的抗體-藥物綴合物化合物的藥物組合物、容器和表示藥物組合物可以用來(lái)治療癌癥的包裝插頁(yè)或標(biāo)簽。

附圖簡(jiǎn)述

圖2示出在5天時(shí)SK-BR-3體外細(xì)胞活力對(duì)Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-59)116、Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-57)109和Thio Hu抗CD33 15G15.3 LC K149C-(LD-59)115的濃度(μg/ml)的曲線圖中的抗體-藥物綴合物的功效。

圖3示出在MMTV-HER2 Fo5轉(zhuǎn)基因乳腺腫瘤隨時(shí)間體內(nèi)擬合的腫瘤體積變化的曲線圖中的抗體-藥物綴合物的功效，所述MMTV-HER2 Fo5轉(zhuǎn)基因乳腺腫瘤在用以下物質(zhì)靜脈內(nèi)給藥一次之后被接種到CRL nu/nu小鼠的乳腺脂肪墊中：媒介物:組氨酸緩沖液#8:20mM組氨酸乙酸鹽(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02％PS 20、Thio Hu抗Her2 7C2 HC A118C-(LD-51)107和Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-51)108。在第0天以3mg/kg靜脈內(nèi)給藥ADC一次。

圖4示出在scid米色小鼠中的KPL4腫瘤模型中，在體內(nèi)擬合的隨時(shí)間的腫瘤體積變化的曲線圖中的抗體-藥物綴合物的功效，所述腫瘤以0.2ml的體積接種在胸部的乳腺脂肪墊中。當(dāng)腫瘤達(dá)到平均腫瘤體積為100-250mm3時(shí)，將它們分成每組8-10個(gè)小鼠的9個(gè)組。在第0天通過(guò)尾靜脈靜脈內(nèi)施用單一治療，如下：(01)媒介物:組氨酸緩沖液#8:20mM組氨酸乙酸鹽(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02％PS 20，(02)Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(乙基馬來(lái)酰亞胺)0.3mg/kg 138，(03)Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(乙基馬來(lái)酰亞胺)1mg/kg 138，(04)Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(乙基馬來(lái)酰亞胺)3mg/kg 138，(05)Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-57)0.3mg/kg 109，(06)Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-57)1mg/kg 109，(07)Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-57)3mg/kg 109，(08)Thio Hu抗CD33 15G15.3 LC K149C-(乙基馬來(lái)酰亞胺)3mg/kg 139以及(09)Thio Hu抗CD33 15G15.3 LC K149C-(LD-57)3mg/kg 110。

圖5示出在MMTV-HER2 Fo5轉(zhuǎn)基因乳腺腫瘤隨時(shí)間體內(nèi)擬合的腫瘤體積變化的曲線圖中的抗體-藥物綴合物的功效，所述MMTV-HER2 Fo5轉(zhuǎn)基因乳腺腫瘤在用以下物質(zhì)靜脈內(nèi)給藥一次之后被接種到CRL nu/nu小鼠的乳腺脂肪墊中：(01)媒介物:組氨酸緩沖液#8:20mM組氨酸乙酸鹽(pH 5.5)、240mM蔗糖、0.02％PS 20，(02)Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-57)1mg/kg 109，(03)Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-57)3mg/kg 109，(04)Thio Hu抗CD33 15G15.3 LC K149C-(LD-57)1mg/kg 110，(05)Thio Hu抗CD33 15G15.3 LC K149C-(LD-57)3mg/kg 110，(06)曲妥珠單抗emtansine 3mg/kg 141以及(07)曲妥珠單抗emtansine 10mg/kg 141。

圖6示出在5天時(shí)BJAB.luc體外細(xì)胞活力對(duì)Thio Hu抗Napi3b 10H1.11.4B LC K149C-(LD-57)121、Thio Hu抗CD22 10F4v3 LC K149C-(LD-57)120、Thio Hu抗Napi3b 10H1.11.4B LC K149C-(LD-59)123、Thio Hu抗CD22 10F4v3 LC K149C-(LD-59)122、Thio Hu抗Napi3b 10H1.11.4B LC K149C-(LD-58)125、Thio Hu抗CD22 10F4v3 LC K149C-(LD-58)124、Thio Hu抗Napi3b 10H1.11.4B LC K149C-(LD-60)127以及Thio Hu抗CD22 10F4v3 LC K149C-(LD-60)126的濃度(μg/ml)的曲線圖中的抗體-藥物綴合物的功效。

圖7示出在5天時(shí)WSU-DLCL2體外細(xì)胞活力對(duì)Thio Hu抗Napi3b 10H1.11.4B LC K149C-(LD-57)121、Thio Hu抗CD22 10F4v3 LC K149C-(LD-57)120、Thio Hu抗Napi3b 10H1.11.4B LC K149C-(LD-59)123、Thio Hu抗CD22 10F4v3 LC K149C-(LD-59)122、Thio Hu抗Napi3b 10H1.11.4B LC K149C-(LD-58)125、Thio Hu抗CD22 10F4v3 LC K149C-(LD-58)124、Thio Hu抗Napi3b 10H1.11.4B LC K149C-(LD-60)127以及Thio Hu抗CD22 10F4v3 LC K149C-(LD-60)126的濃度(μg/ml)的曲線圖中的抗體-藥物綴合物的功效。

示例性實(shí)施方案的詳細(xì)描述

現(xiàn)在將詳細(xì)參考本發(fā)明的某些實(shí)施方案，在所附的結(jié)構(gòu)和式中闡明了本發(fā)明的實(shí)例。盡管將結(jié)合所闡述的實(shí)施方案來(lái)描述本發(fā)明，但應(yīng)理解，它們并不意圖將本發(fā)明限制于那些實(shí)施方案。相反，本發(fā)明意圖覆蓋所有的替代方案、修改和等效物，它們可以被包括在如由權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到與本文描述的方法和材料類似或等效的許多方法和材料，這些方法和材料可以用在本發(fā)明的實(shí)踐中。本發(fā)明決不限于所描述的方法和材料。

除非另外定義，否則本文所用的技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義，并且與以下一致：Singleton等(1994)Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons,New York,NY；以及Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immunobiology,第5版,Garland Publishing,New York)。

定義

除非另有說(shuō)明，否則本文所用的以下術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)意圖具有下列含義：

當(dāng)在本文中使用商品名時(shí)，申請(qǐng)人意圖獨(dú)立地包括商品名產(chǎn)品制劑、仿制藥以及商品名產(chǎn)品的活性藥物成分。

本文中的術(shù)語(yǔ)“抗體”以最廣義使用，并且明確地覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性(Miller等(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)?？贵w可以為鼠的、人的、人源化的、嵌合的或源自其他物種的抗體?？贵w是由能夠識(shí)別和結(jié)合特異性抗原的免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immuno Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有由多種抗體上的CDR所識(shí)別的許多結(jié)合位點(diǎn)，也稱為表位。每種特異性結(jié)合不同表位的抗體具有不同的結(jié)構(gòu)。因此，一種抗原可具有多于一種相應(yīng)的抗體。抗體包含全長(zhǎng)免疫球蛋白分子或全長(zhǎng)免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特異性結(jié)合感興趣的靶抗原的抗原結(jié)合位點(diǎn)或其部分的分子，此類靶包括但不限于癌細(xì)胞或產(chǎn)生與自身免疫病相關(guān)的自身免疫抗體的細(xì)胞。本文公開(kāi)的免疫球蛋白可為任何類型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可源自任何物種。然而，在一個(gè)方面，免疫球蛋白為人、鼠或兔來(lái)源。

“抗體片段”包含全長(zhǎng)抗體的一部分，一般為其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；雙價(jià)抗體；線性抗體；微抗體(Olafsen等(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)、由Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體、CDR(互補(bǔ)決定區(qū))以及任何以上免疫特異性結(jié)合癌細(xì)胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的表位結(jié)合片段、單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本上同種抗體的群體獲得的抗體，即構(gòu)成所述群體的各個(gè)抗體是相同的，除了可以微量存在的可能的天然存在的突變。單克隆抗體具有高度特異性(針對(duì)單一抗原位點(diǎn))。另外，與包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品相反，每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以被合成但不被其他抗體所污染。修飾語(yǔ)“單克隆”指示從基本上同種的抗體群體獲得的抗體的特性并且不應(yīng)解釋為需要通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過(guò)首先由Kohler等(1975)Nature,256:495描述的雜交瘤方法來(lái)制備，或可以通過(guò)重組DNA方法(參見(jiàn)例如：US 4816567；US 5807715)來(lái)制備。單克隆抗體還可以使用在Clackson等(1991)Nature,352:624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)中分離。

本文中的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體以及此類抗體的片段，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的其余部分與源自另一種物種或?qū)儆诹硪环N抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，只要它們表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性(US 4816567；以及Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。本文中的感興趣的嵌合抗體包括“靈長(zhǎng)類化”抗體，其包含源自非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如舊大陸猴、猿等)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列。

本文中的“完整抗體”為包含VL和VH結(jié)構(gòu)域、以及輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(CL)和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3的抗體。恒定結(jié)構(gòu)域可為天然序列恒定結(jié)構(gòu)域(例如人天然序列恒定結(jié)構(gòu)域)或其氨基酸序列變體。完整抗體可具有一種或多種“效應(yīng)子功能”，其是指可歸因于抗體Fc恒定區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的那些生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)子功能的實(shí)例包括C1q結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)；吞噬作用；以及細(xì)胞表面受體諸如B細(xì)胞受體和BCR的下調(diào)。

本文中的術(shù)語(yǔ)“Fc區(qū)”用于定義含有恒定區(qū)的至少一部分的免疫球蛋白重鏈的C-末端區(qū)域。術(shù)語(yǔ)包括天然序列Fc區(qū)和變體Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人IgG重鏈Fc區(qū)從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基末端。然而，F(xiàn)c區(qū)的C末端賴氨酸(Lys447)可以或可以不存在。除非本文中另有說(shuō)明，否則Fc區(qū)或恒定區(qū)的氨基酸殘基的編號(hào)是根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)，也稱為EU索引，如在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所描述。

“框架”或“FR”是指可變結(jié)構(gòu)域殘基而不是高變區(qū)(HVR)殘基?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的FR通常由四個(gè)FR結(jié)構(gòu)域組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中通常以以下序列出現(xiàn)：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

取決于其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，可以將完整抗體指定為不同的“類別”。存在五大類的完整免疫球蛋白抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些類別中的數(shù)種可被進(jìn)一步分成“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對(duì)應(yīng)于不同類別抗體的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型為熟知的。Ig形式包括鉸鏈修飾或無(wú)鉸鏈形式(Roux等(1998)J.Immunol.161:4083-4090；Lund等(2000)Eur.J.Biochem.267:7246-7256；US 2005/0048572；US 2004/0229310)。

“人抗體”為具有對(duì)應(yīng)于由人或人細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列或源自利用人抗體庫(kù)或其他人抗體編碼序列的非人來(lái)源的氨基酸序列的抗體。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。

“人共有框架”為代表在選擇人免疫球蛋白VL或VH框架序列中最通常存在的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的選擇來(lái)自可變結(jié)構(gòu)域序列的亞組。通常，序列的亞組為如在Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亞組。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VL，亞組為如在Kabat等,同上中的亞組κI。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于VH，亞組為如在Kabat等,同上中的亞組III。

“人源化”抗體是指包含來(lái)自非人HVR的氨基酸殘基和來(lái)自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實(shí)施方案中，人源化抗體將包含基本上所有的至少一個(gè)以及通常兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有的或基本上所有的HVR(例如，CDR)對(duì)應(yīng)于非人抗體的HVR，并且所有的或基本上所有的FR對(duì)應(yīng)于人抗體的FR。人源化抗體任選地可以包含源自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分?？贵w(例如，非人抗體)的“人源化形式”是指已經(jīng)歷人源化的抗體。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“高變區(qū)”或“HVR”是指抗體可變結(jié)構(gòu)域的每個(gè)區(qū)域，其在序列上高度可變和/或形成結(jié)構(gòu)限定的環(huán)(“高變環(huán)”)。通常，天然四鏈抗體包含六個(gè)HVR；三個(gè)在VH中(H1、H2、H3)并且三個(gè)在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來(lái)自高變環(huán)和/或來(lái)自“互補(bǔ)決定區(qū)”(CDR)的氨基酸殘基，后者具有最高的序列可變性和/或參與抗原識(shí)別。示例性高變環(huán)發(fā)生在氨基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)處。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)發(fā)生在L1的氨基酸殘基24-34、L2的氨基酸殘基50-56、L3的氨基酸殘基89-97、H1的氨基酸殘基31-35B、H2的氨基酸殘基50-65和H3的氨基酸殘基95-102處。(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除了VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。CDR還包含“特異性決定殘基”或“SDR”，其為接觸抗原的殘基。SDR包含在CDR區(qū)域內(nèi)，被稱為縮短的CDR或a-CDR。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)發(fā)生在L1的氨基酸殘基31-34、L2的氨基酸殘基50-55、L3的氨基酸殘基89-96、H1的氨基酸殘基31-35B、H2的氨基酸殘基50-58和H3的氨基酸殘基95-102處。(參見(jiàn)Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有說(shuō)明，否則HVR殘基和可變結(jié)構(gòu)域中的其他殘基(例如，F(xiàn)R殘基)在本文中根據(jù)Kabat等,同上進(jìn)行編號(hào)。

術(shù)語(yǔ)“可變區(qū)”或“可變結(jié)構(gòu)域”是指參與抗體與抗原結(jié)合的抗體重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域(分別為VH和VL))通常具有類似結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含四個(gè)保守的框架區(qū)(FR)和三個(gè)高變區(qū)(HVR)。(參見(jiàn)，例如，Kindt等Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91頁(yè)(2007))。單個(gè)VH或VL結(jié)構(gòu)域可足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可使用來(lái)自結(jié)合特定抗原的抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域以分別篩選互補(bǔ)的VL或VH結(jié)構(gòu)域文庫(kù)來(lái)分離結(jié)合所述抗原的抗體。參見(jiàn)，例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature 352:624-628(1991)。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠使與其連接的另一種核酸增殖的核酸分子。術(shù)語(yǔ)包括作為自我復(fù)制的核酸結(jié)構(gòu)的載體以及并入已引入所述載體的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。某些載體能夠引導(dǎo)與其可操作連接的核酸的表達(dá)。本文將此類載體稱為“表達(dá)載體”。

“游離半胱氨酸氨基酸”是指半胱氨酸氨基酸殘基，其已被工程化到親本抗體中，具有巰基官能團(tuán)(-SH)并且未配對(duì)成分子內(nèi)或分子間二硫化物橋。

“接頭”、“接頭單元”或“連接”是指包含將抗體與藥物部分共價(jià)附接的原子鏈的化學(xué)部分。在各種實(shí)施方案中，接頭為指定為L(zhǎng)的二價(jià)基團(tuán)。

當(dāng)表示取代基數(shù)量時(shí)，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)”是指在一個(gè)取代基至最高可能數(shù)量的取代基范圍內(nèi)，即通過(guò)取代基替換一個(gè)氫高達(dá)至替換所有氫。術(shù)語(yǔ)“取代基”指代替換母體分子上的氫原子的原子或原子基團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“取代的”指代指定的基團(tuán)具有一個(gè)或多個(gè)取代基。在任何基團(tuán)可以具有多個(gè)取代基并且提供各種可能的取代基的情況下，獨(dú)立地選擇取代基并且不需要為相同的。術(shù)語(yǔ)“未取代的”意指指定的基團(tuán)不具有取代基。術(shù)語(yǔ)“任選取代的”意指指定的基團(tuán)為未取代的或被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，所述取代基獨(dú)立地選自可能的取代基的組。當(dāng)表示取代基數(shù)量時(shí)，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)”意指一個(gè)取代基至最高可能數(shù)量的取代基，即通過(guò)取代基替換一個(gè)氫高達(dá)至替換所有氫。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“烷基”是指具有一至十二個(gè)碳原子(C₁-C₁₂)的任何長(zhǎng)度的飽和的直鏈或支鏈單價(jià)烴基團(tuán)，其中烷基基團(tuán)可以任選被以下描述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，烷基基團(tuán)為一至八個(gè)碳原子(C₁-C₈)，或一至六個(gè)碳原子(C₁-C₆)。烷基基團(tuán)的實(shí)例包括，但不限于甲基(Me，-CH₃)、乙基(Et，-CH₂CH₃)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH₂CH₂CH₃)、2-丙基(i-Pr，異丙基，-CH(CH₃)₂)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，異丁基，-CH₂CH(CH₃)₂)、2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH₃)CH₂CH₃)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH₃)₃)、1-戊基(正戊基，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-戊基(-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₃)、3-戊基(-CH(CH₂CH₃)₂)、2-甲基-2-丁基(-C(CH₃)₂CH₂CH₃)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH₃)CH(CH₃)₂)、3-甲基-1-丁基(-CH₂CH₂CH(CH₃)₂)、2-甲基-1-丁基(-CH₂CH(CH₃)CH₂CH₃)、1-己基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-己基(-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃)、3-己基(-CH(CH₂CH₃)(CH₂CH₂CH₃))、2-甲基-2-戊基(-C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH₃)CH(CH₃)CH₂CH₃)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH₃)CH₂CH(CH₃)₂)、3-甲基-3-戊基(-C(CH₃)(CH₂CH₃)₂)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH₃)₂CH(CH₃)₂)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH₃)C(CH₃)₃、1-庚基、1-辛基等。

本文所用的術(shù)“亞烷基”是指具有一至十二個(gè)碳原子(C₁-C₁₂)的任何長(zhǎng)度的飽和的直鏈或支鏈二價(jià)烴基團(tuán)，其中亞烷基基團(tuán)可以任選被以下描述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，亞烷基基團(tuán)為一至八個(gè)碳原子(C₁-C₈)，或一至六個(gè)碳原子(C₁-C₆)。亞烷基基團(tuán)的實(shí)例包括，但不限于亞甲基(-CH₂-)、亞乙基(-CH₂CH₂-)、亞正丙基(-CH₂CH₂CH₂-)、亞異丙基(-CH(CH₃)CH₂-)、亞異丁基(-C(CH₃)₂CH₂-)等。

術(shù)語(yǔ)“烯基”是指具有二至八個(gè)碳原子(C₂-C₈)的任何長(zhǎng)度的直鏈或支鏈單價(jià)烴基團(tuán)，其中具有至少一個(gè)不飽和部位，即碳-碳sp²雙鍵，其中烯基基團(tuán)可以任選被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代，并且包括具有“順式”和“反式”取向或替代地“E”和“Z”取向的基團(tuán)。實(shí)例包括，但不限于乙烯基(ethylenyl)或乙烯基(vinyl)(-CH＝CH₂)、烯丙基(-CH₂CH＝CH₂)、巴豆基(-CH(CH3)CH＝CH₂)等。

術(shù)語(yǔ)“亞烯基”是指具有二至八個(gè)碳原子(C₂-C₈)的任何長(zhǎng)度的直鏈或支鏈二價(jià)烴基團(tuán)，其中具有至少一個(gè)不飽和部位，即碳-碳sp²雙鍵，其中亞烯基基團(tuán)可以任選被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代，并且包括具有“順式”和“反式”取向或替代地“E”和“Z”取向的基團(tuán)。實(shí)例包括，但不限于亞乙烯基(ethylenylene)或亞乙烯基(vinylene)(-CH＝CH-)、亞烯丙基(-CH₂CH＝CH-)、亞巴豆基(-CH(CH3)CH＝CH-)等。

術(shù)語(yǔ)“炔基”是指具有二至八個(gè)碳原子(C₂-C₈)的任何長(zhǎng)度的直鏈或支鏈單價(jià)烴基團(tuán)，其中具有至少一個(gè)不飽和部位，即碳-碳sp三鍵，其中炔基基團(tuán)可以任選被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。實(shí)例包括，但不限于乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基，-CH₂C≡CH)等。

術(shù)語(yǔ)“亞炔基”是指具有二至八個(gè)碳原子(C₂-C₈)的任何長(zhǎng)度的直鏈或支鏈二價(jià)烴基團(tuán)，其中具有至少一個(gè)不飽和部位，即碳-碳sp三鍵，其中亞炔基基團(tuán)可以任選被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。實(shí)例包括，但不限于亞乙炔基(-C≡C-)、亞丙炔基(亞炔丙基，-CH₂C≡C-)、亞2-丁炔基(-CH(CH₃)C≡C-)等。

術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)(carbocycle)”、“碳環(huán)基”、“碳環(huán)(carbocyclic ring)”和“環(huán)烷基”是指具有作為單環(huán)的3至12個(gè)碳原子(C₃-C₁₂)或作為雙環(huán)的7至12個(gè)碳原子的單價(jià)非芳香族飽和的或部分不飽和的環(huán)。具有7至12個(gè)原子的雙環(huán)碳環(huán)可以例如排列成雙環(huán)[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統(tǒng)，并且具有9或10個(gè)環(huán)原子的雙環(huán)碳環(huán)可以排列成雙環(huán)[5,6]或[6,6]系統(tǒng)，或排列成橋接系統(tǒng)諸如雙環(huán)[2.2.1]庚烷、雙環(huán)[2.2.2]辛烷和雙環(huán)[3.2.2]壬烷。螺環(huán)部分也包括在此定義的范圍內(nèi)。單環(huán)碳環(huán)的實(shí)例包括，但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、1-環(huán)戊-1-烯基、1-環(huán)戊-2-烯基、1-環(huán)戊-3-烯基、環(huán)己基、1-環(huán)己-1-烯基、1-環(huán)己-2-烯基、1-環(huán)己-3-烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基、環(huán)癸基、環(huán)十一烷基、環(huán)十二烷基等。碳環(huán)基基團(tuán)任選被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。

“芳基”意指通過(guò)從母體芳環(huán)系統(tǒng)的單個(gè)碳原子中去除一個(gè)氫原子而衍生得到的6-20個(gè)碳原子(C₆-C₂₀)的單價(jià)芳烴基團(tuán)。一些芳基基團(tuán)以示例性結(jié)構(gòu)表示為“Ar”。芳基包括雙環(huán)基團(tuán)，所述雙環(huán)基團(tuán)包括稠合至飽和的、部分不飽和的環(huán)的芳環(huán)、或芳香族碳環(huán)。通常的芳基基團(tuán)包括，但不限于衍生自苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、聯(lián)苯基、茚基、二氫茚基、1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫萘基等的基團(tuán)。芳基基團(tuán)任選被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。

“亞芳基”意指通過(guò)從母體芳環(huán)系統(tǒng)的兩個(gè)碳原子中去除兩個(gè)氫原子而衍生得到的6-20個(gè)碳原子(C₆-C₂₀)的二價(jià)芳烴基團(tuán)。一些亞芳基基團(tuán)以示例性結(jié)構(gòu)表示為“Ar”。亞芳基包括雙環(huán)基團(tuán)，所述雙環(huán)基團(tuán)包括稠合至飽和的、部分不飽和的環(huán)的芳環(huán)、或芳香族碳環(huán)。通常的亞芳基基團(tuán)包括，但不限于衍生自苯(亞苯基)、取代的苯、萘、蒽、亞聯(lián)苯基、亞茚基、亞二氫茚基、1,2-二氫萘、1,2,3,4-四氫萘基等的基團(tuán)。亞芳基基團(tuán)任選被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基取代。

術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)(heterocycle)”、“雜環(huán)基”和“雜環(huán)(heterocyclic ring)”在本文中可互換使用并且是指具有3至約20個(gè)環(huán)原子的飽和的或部分不飽和的(即，在環(huán)內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵和/或三鍵)碳環(huán)基團(tuán)，其中至少一個(gè)環(huán)原子為選自氮、氧、磷和硫的雜原子，剩余的環(huán)原子為碳，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子任選被以下所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。雜環(huán)可為具有3至7個(gè)環(huán)成員(2至6個(gè)碳原子和選自N、O、P和S的1至4個(gè)雜原子)的單環(huán)或具有7至10個(gè)環(huán)成員(4至9個(gè)碳原子和選自N、O、P和S的1至6個(gè)雜原子)的雙環(huán)，例如：雙環(huán)[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統(tǒng)。雜環(huán)描述于Paquette,Leo A.；“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968)，具體為第1章、第3章、第4章、第6章、第7章和第9章；“The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs”(John Wiley&Sons,New York,1950至今)，具體為第13卷、第14卷、第16卷、第19卷和第28卷；以及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566?！半s環(huán)基”還包括其中雜環(huán)基團(tuán)與飽和的、部分不飽和的環(huán)、或芳香族碳環(huán)或雜環(huán)稠合的基團(tuán)。雜環(huán)的實(shí)例包括，但不限于嗎啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯烷-1-基、硫代嗎啉-4-基、S-二氧代硫代嗎啉-4-基、氮雜環(huán)辛烷-1-基、氮雜環(huán)丁烷-1-基、八氫吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮雜環(huán)庚烷-1-基、吡咯烷基、四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫吡喃基、二氫吡喃基、四氫噻喃基、哌啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基、噻烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮雜環(huán)丁烷基、氧雜環(huán)丁烷基、硫雜環(huán)丁烷基、高哌啶基、氧雜環(huán)庚烷基、硫雜環(huán)庚烷基、氧氮雜基、二氮雜環(huán)庚烷基、硫氮雜環(huán)庚基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氫吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二烷基、1,3-二氧戊環(huán)基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊烷基、二氫吡喃基、二氫噻吩基、二氫呋喃基、吡唑烷基咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮雜雙環(huán)[3.1.0]己烷基、3-氮雜雙環(huán)[4.1.0]庚烷基、氮雜雙環(huán)[2.2.2]己烷基、3H-吲哚基喹嗪基和N-吡啶基脲。螺環(huán)部分也包括在此定義的范圍內(nèi)。其中2個(gè)環(huán)原子被氧代(＝O)部分取代的雜環(huán)基團(tuán)的實(shí)例為嘧啶酮基和1,1-二氧代-硫代嗎啉基。本文中的雜環(huán)基團(tuán)任選被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。

術(shù)語(yǔ)“雜芳基”是指具有5元環(huán)、6元環(huán)或7元環(huán)的單價(jià)芳香族基團(tuán)，并且包括5-20個(gè)原子的稠環(huán)系統(tǒng)(所述稠環(huán)系統(tǒng)中至少一個(gè)為芳香族的)，含有獨(dú)立地選自氮、氧和硫的一個(gè)或多個(gè)雜原子。雜芳基基團(tuán)的實(shí)例為吡啶基(包括例如，2-羥基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、1-甲基-1H-苯并[d]咪唑、[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶、嘧啶基(包括例如，4-羥基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、異噻唑基、吡咯基、喹啉基、異喹啉基、四氫異喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、噠嗪基、三嗪基、異吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、二氮雜萘基和呋喃并吡啶基。雜芳基基團(tuán)任選被本文所述的一個(gè)或多個(gè)取代基獨(dú)立地取代。

雜環(huán)基團(tuán)或雜芳基基團(tuán)在可能的情況下可為碳(碳連接)或氮(氮連接)鍵合的。舉例而非限制，碳鍵合的雜環(huán)或雜芳基鍵合在吡啶的位置2、3、4、5或6；噠嗪的位置3、4、5或6；嘧啶的位置2、4、5或6；吡嗪的位置2、3、5或6；呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯的位置2、3、4或5；噁唑、咪唑或噻唑的位置2、4或5；異噁唑、吡唑或異噻唑的位置3、4或5；氮丙啶的位置2或3；氮雜環(huán)丁烷的位置2、3或4；喹啉的位置2、3、4、5、6、7或8；或異喹啉的位置1、3、4、5、6、7或8。

舉例而非限制，氮鍵合的雜環(huán)或雜芳基鍵合在氮丙啶、氮雜環(huán)丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的位置1；異吲哚或異吲哚啉的位置2；嗎啉的位置4和咔唑或β-咔啉的位置9。

術(shù)語(yǔ)“手性”是指具有鏡像配偶體(mirror image partner)的不可重疊(non-superimposability)性質(zhì)的分子，而術(shù)語(yǔ)“非手性”是指在其鏡像配偶體上可以重疊的分子。

術(shù)語(yǔ)“立體異構(gòu)體”是指具有相同化學(xué)組成，但是關(guān)于原子或基團(tuán)在空間上的排列不同的化合物。

“非對(duì)映異構(gòu)體”是指具有兩個(gè)或更多個(gè)手性中心并且其分子不是彼此的鏡像的立體異構(gòu)體。非對(duì)映異構(gòu)體具有不同的物理性質(zhì)，例如熔點(diǎn)、沸點(diǎn)、光譜性質(zhì)和反應(yīng)性?？稍诟叻直媛史治龇椒ㄖT如電泳和色譜法下可分離非對(duì)映異構(gòu)體的混合物。

“對(duì)映異構(gòu)體”是指化合物的彼此為不可重疊的鏡像的兩個(gè)立體異構(gòu)體。

本文使用的立體化學(xué)定義和慣例一般遵循S.P.Parker編著,McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book公司,New York；以及Eliel,E.和Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。許多有機(jī)化合物以光學(xué)活性形式存在，即，它們能夠旋轉(zhuǎn)平面偏振光的平面。在描述光學(xué)活性化合物時(shí)，前綴D和L、或R和S,用于指代分子關(guān)于其手性中心的絕對(duì)構(gòu)型。前綴d和l或(+)和(-)用于表示化合物的平面偏振光的旋轉(zhuǎn)標(biāo)記，其中用(-)或1表示化合物為左旋的。具有(+)或d前綴的化合物為右旋的。對(duì)于給定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些立體異構(gòu)體為相同的，不同之處在于它們?yōu)楸舜说溺R像。還可以將特定的立體異構(gòu)體稱為對(duì)映異構(gòu)體，并且此類異構(gòu)體的混合物經(jīng)常被稱為對(duì)映異構(gòu)體混合物。50:50的對(duì)映異構(gòu)體混合物被稱為外消旋混合物或外消旋物，其可以出現(xiàn)在化學(xué)反應(yīng)或過(guò)程中一直沒(méi)有立體選擇性或立體特異性的情況下。術(shù)語(yǔ)“外消旋混合物”和“外消旋物”是指兩種沒(méi)有光學(xué)活性的對(duì)映異構(gòu)體種類的等摩爾混合物。

本文所用的短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”是指抗體-藥物綴合物(ADC)的藥學(xué)上可接受的有機(jī)鹽或無(wú)機(jī)鹽。示例性鹽包括，但不限于：硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、單寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸鹽、龍膽酸鹽(gentisinate)、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、蔗糖鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽和雙羥萘酸鹽(pamoate)(即，1,1’-亞甲基-雙(2-羥基-3-萘甲酸鹽))鹽。藥學(xué)上可接受的鹽可涉及引入另一種分子諸如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他平衡離子。平衡離子可為使母體化合物上的電荷穩(wěn)定的任何有機(jī)或無(wú)機(jī)部分。此外，藥學(xué)上可接受的鹽在其結(jié)構(gòu)中可具有多于一個(gè)帶電原子。多個(gè)帶電原子為藥學(xué)上可接受的鹽的一部分的情況可具有多個(gè)平衡離子。因此，藥學(xué)上可接受的鹽可具有一個(gè)或多個(gè)帶電原子和/或一個(gè)或多個(gè)平衡離子。

在本文中使用了下列縮寫并且具有指定定義：BME為β-巰基乙醇，Boc為N-(叔丁氧基羰基)，cit為瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)，DCC為1,3-二環(huán)己基碳二亞胺，DCM為二氯甲烷，DEA為二乙胺，DEAD為偶氮二羧酸二乙酯，DEPC為二乙基磷?；杷狨?，DIAD為偶氮二羧酸二異丙酯，DIEA為N,N-二異丙基乙胺，DMA為二甲基乙酰胺，DMAP為4-二甲基氨基吡啶，DME為乙二醇二甲醚(或1,2-二甲氧基乙烷)，DMF為N,N-二甲基甲酰胺，DMSO為二甲亞砜，DTT為二硫蘇糖醇，EDCI為1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，EEDQ為2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氫喹啉，ES-MS為電噴霧質(zhì)譜，EtOAc為乙酸乙酯，F(xiàn)moc為N-(9-芴基甲氧基羰基)，gly為甘氨酸，HATU為O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽，HOBt為1-羥基苯并三唑，HPLC為高壓液相色譜，ile為異亮氨酸，lys為賴氨酸，MeCN(CH₃CN)為乙腈，MeOH為甲醇，Mtr為4-茴香基二苯基甲基(或4-甲氧基三苯甲基)，NHS為N-羥基琥珀酰亞胺，PBS為磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7)，PEG為聚乙二醇或乙二醇單元(-OCH₂CH₂-)，Ph為苯基，Pnp為對(duì)硝基苯基，MC為6-馬來(lái)酰亞氨基己?；?，phe為L(zhǎng)-苯基丙氨酸，PyBrop為溴代三吡咯烷基膦六氟磷酸鹽，SEC為大小排阻色譜，Su為琥珀酰亞胺，TFA為三氟乙酸，TLC為薄層色譜，UV為紫外線，并且val為纈氨酸。

半胱氨酸工程化的抗體

本發(fā)明的化合物包括包含半胱氨酸工程化的抗體的抗體-藥物綴合物，其中野生型或親本抗體的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被半胱氨酸氨基酸(THIOMAB^TM)替換。任何形式的抗體可為如此工程化的，即突變的。例如，親本Fab抗體片段可被工程化以形成半胱氨酸工程化的Fab。類似地，親本單克隆抗體可被工程化以形成THIOMAB^TM。應(yīng)注意，由于IgG抗體的二聚體性質(zhì)，單個(gè)位點(diǎn)突變產(chǎn)生Fab抗體片段中的單個(gè)工程化的半胱氨酸殘基，而單個(gè)位點(diǎn)突變產(chǎn)生全長(zhǎng)THIOMAB^TM中的兩個(gè)工程化的半胱氨酸殘基。評(píng)價(jià)具有替換的(“工程化的”)半胱氨酸(Cys)殘基的突變體的新引入的、工程化的半胱氨酸巰基基團(tuán)的反應(yīng)性。巰基反應(yīng)性值為0至1.0范圍內(nèi)的相對(duì)數(shù)值術(shù)語(yǔ)并且可測(cè)量任何半胱氨酸工程化的抗體。本發(fā)明的半胱氨酸工程化的抗體的巰基反應(yīng)性值在0.6至1.0；0.7至1.0；或0.8至1.0的范圍內(nèi)。

半胱氨酸氨基酸可在抗體的重鏈(HC)或輕鏈(LC)中的反應(yīng)位點(diǎn)上工程化并且所述半胱氨酸氨基酸不形成鏈內(nèi)或分子間二硫化物鍵(Junutula等,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan等(2009)Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249；Shen等(2012)Nature Biotech.,30(2):184-191；Junutula等(2008)Jour of Immun.Methods 332:41-52)。工程化的半胱氨酸巰基可與接頭試劑或本發(fā)明的接頭-藥物中間體反應(yīng)，所述接頭-藥物中間體具有巰基反應(yīng)性的親電吡啶基二硫化物基團(tuán)以形成具有半胱氨酸工程化的抗體(THIOMAB^TM)和藥物(D)部分的ADC。因此，可以設(shè)計(jì)、控制并且知道藥物部分的位置?？煽刂扑幬镓?fù)載，因?yàn)楣こ袒陌腚装彼釒€基基團(tuán)通常以高產(chǎn)率與巰基反應(yīng)性的接頭試劑或接頭-藥物中間體反應(yīng)。通過(guò)在重鏈或輕鏈上的單個(gè)位點(diǎn)處取代而對(duì)抗體進(jìn)行工程化以引入半胱氨酸氨基酸，得到對(duì)稱抗體上的兩個(gè)新半胱氨酸?？蓪?shí)現(xiàn)接近2的藥物負(fù)載并且接近均勻的綴合產(chǎn)物ADC。

本發(fā)明的半胱氨酸工程化的抗體優(yōu)選保留其野生型、親本抗體對(duì)應(yīng)部分的抗原結(jié)合能力。因此，半胱氨酸工程化的抗體能夠結(jié)合，優(yōu)選特異性地結(jié)合抗原。此類抗原包括，例如腫瘤相關(guān)的抗原(TAA)、細(xì)胞表面受體蛋白和其他細(xì)胞表面分子、跨膜蛋白、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、細(xì)胞存活調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子、與組織發(fā)育或分化相關(guān)(例如，已知或懷疑在功能上有助于組織發(fā)育或分化)的分子、淋巴因子、細(xì)胞因子、涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的分、涉及血管發(fā)生的分子和與血管生成(例如，已知或懷疑在功能上有助于血管生成)的分子。腫瘤相關(guān)的抗原可為簇分化因子(即，CD蛋白)。半胱氨酸工程化的抗體能夠結(jié)合的抗原可為以上提到的分類之一的子集成員，其中所述分類的其他子集包括具有相異特征(相對(duì)于感興趣的抗原)的其他分子/抗原。

半胱氨酸工程化的抗體可以被制備用于通過(guò)還原和再氧化鏈內(nèi)二硫化物基團(tuán)而與接頭-藥物中間體綴合(實(shí)施例19)。

可在治療癌癥的本發(fā)明的抗體-藥物綴合物中有用的半胱氨酸工程化的抗體包括，但不限于針對(duì)細(xì)胞表面受體和腫瘤相關(guān)的抗原(TAA)的抗體。腫瘤相關(guān)的抗原為本領(lǐng)域中已知的，并且可以使用本領(lǐng)域熟知的方法和信息來(lái)制備用于產(chǎn)生抗體。嘗試發(fā)現(xiàn)用于癌癥診斷和療法的有效細(xì)胞靶標(biāo)，研究者已尋求鑒定跨膜或其他腫瘤相關(guān)的多肽，與在一個(gè)或多個(gè)正常非癌細(xì)胞上相比，所述多肽特異性地表達(dá)在一個(gè)或多個(gè)特定類型的癌細(xì)胞的表面上。通常，與在非癌細(xì)胞表面上相比，此類腫瘤相關(guān)的多肽更豐富地表達(dá)在癌細(xì)胞表面上。此類腫瘤相關(guān)的細(xì)胞表面抗原多肽的鑒定引起通過(guò)基于抗體的療法特異性靶向癌細(xì)胞以用于破壞的能力。

腫瘤相關(guān)的抗原TAA的實(shí)例包括，但不限于以下列出的TAA(1)-(51)。為了方便起見(jiàn)，關(guān)于這些抗原的信息(所述信息的全部為本領(lǐng)域中已知的)在以下列出，并且包括名稱、替代名稱、Genbank登錄號(hào)和原始參考文獻(xiàn)、下列美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的核酸和蛋白質(zhì)序列鑒定慣例。對(duì)應(yīng)于TAA(1)-(53)的核酸和蛋白質(zhì)序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)諸如GenBank中可獲得。被抗體靶向的腫瘤相關(guān)的抗原包括相對(duì)于在引用參考中鑒定的序列而具有至少約70％、80％、85％、90％或95％序列同一性，或表現(xiàn)出基本上與具有引用參考中存在的序列的TAA相同的生物性質(zhì)或特征的所有氨基酸序列變體和同種型。例如，具有變異序列的TAA通常能夠特異性地結(jié)合抗體，所述抗體特異性地結(jié)合具有所列出的相應(yīng)序列的TAA。在本文中具體列舉的參考文獻(xiàn)中的序列和公開(kāi)內(nèi)容明確地通過(guò)引用并入。

腫瘤相關(guān)的抗原：

(1)BMPR1B(IB型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體，Genbank登錄號(hào)NM_001203)

ten Dijke,P.等Science 264(5155):101-104(1994)，Oncogene 14(11):1377-1382(1997))；WO2004063362(權(quán)利要求2)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；US2003134790-A1(第38-39頁(yè))；WO2002102235(權(quán)利要求13；第296頁(yè))；WO2003055443(第91-92頁(yè))；WO200299122(實(shí)施例2；第528-530頁(yè))；WO2003029421(權(quán)利要求6)；WO2003024392(權(quán)利要求2；圖112)；WO200298358(權(quán)利要求1；第183頁(yè))；WO200254940(第100-101頁(yè))；WO200259377(第349-350頁(yè))；WO200230268(權(quán)利要求27；第376頁(yè))；WO200148204(實(shí)施例；圖4)

NP_001194 IB型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體/pid＝NP_001194.1-

交叉引用：MIM:603248；NP_001194.1；AY065994

(2)E16(LAT1、SLC7A5，Genbank登錄號(hào)NM_003486)

Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999)，Nature 395(6699):288-291(1998)，Gaugitsch,H.W.等(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273)；WO2004048938(實(shí)施例2)；WO2004032842(實(shí)施例IV)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO200278524(實(shí)施例2)；WO200299074(權(quán)利要求19；第127-129頁(yè))；WO200286443(權(quán)利要求27；第222頁(yè)、第393頁(yè))；WO2003003906(權(quán)利要求10；第293頁(yè))；WO200264798(權(quán)利要求33；第93-95頁(yè))；WO200014228(權(quán)利要求5；第133-136頁(yè))；US2003224454(圖3)；WO2003025138(權(quán)利要求12；第150頁(yè))；

NP_003477溶質(zhì)載體家族7(陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，y+

系統(tǒng))，成員5/pid＝NP_003477.3-智人

交叉引用：MIM:600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1

(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原，Genbank登錄號(hào)NM_012449)

Cancer Res.61(15),5857-5860(2001)，Hubert,R.S.等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528)；WO2004065577(權(quán)利要求6)；WO2004027049(圖1L)；EP1394274(實(shí)施例11)；WO2004016225(權(quán)利要求2)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；US2003157089(實(shí)施例5)；US2003185830(實(shí)施例5)；US2003064397(圖2)；WO200289747(實(shí)施例5；第618-619頁(yè))；WO2003022995(實(shí)施例9；圖13A，實(shí)施例53；第173頁(yè)，實(shí)施例2；圖2A)；

NP_036581前列腺的六跨膜表皮抗原

交叉引用：MIM:604415；NP_036581.1；NM_012449_1

(4)0772P(CA125、MUC16，Genbank登錄號(hào)AF361486)

J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001))；WO2004045553(權(quán)利要求14)；WO200292836(權(quán)利要求6；圖12)；WO200283866(權(quán)利要求15；第116-121頁(yè))；US2003124140(實(shí)施例16)；US 798959。交叉引用：GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1

(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素，Genbank登錄號(hào)NM_005823)Yamaguchi,N.等Biol.Chem.269(2),805-808(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996)，J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995))；WO2003101283(權(quán)利要求14)；(WO2002102235(權(quán)利要求13；第287-288頁(yè))；WO2002101075(權(quán)利要求4；第308-309頁(yè))；WO200271928(第320-321頁(yè))；WO9410312(第52-57頁(yè))；交叉引用：MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1

(6)Napi3b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b，Genbank登錄號(hào)NM_006424)

J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002)，Genomics 62(2):281-284(1999)，F(xiàn)eild,J.A.等(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582)；WO2004022778(權(quán)利要求2)；EP1394274(實(shí)施例11)；WO2002102235(權(quán)利要求13；第326頁(yè))；EP875569(權(quán)利要求1；第17-19頁(yè))；WO200157188(權(quán)利要求20；第329頁(yè))；WO2004032842(實(shí)施例IV)；WO200175177(權(quán)利要求24；第139-140頁(yè))；

交叉引用：MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1

Nagase T.等(2000)DNA Res.7(2):143-150)；WO2004000997(權(quán)利要求1)；WO2003003984(權(quán)利要求1)；WO200206339(權(quán)利要求1；第50頁(yè))；WO200188133(權(quán)利要求1；第41-43頁(yè)、第48-58頁(yè))；WO2003054152(權(quán)利要求20)；WO2003101400(權(quán)利要求11)；

登錄號(hào)：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1。Genew；HGNC:10737；

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因，Genbank登錄號(hào)AY358628)；Ross等(2002)Cancer Res.62:2546-2553；US2003129192(權(quán)利要求2)；US2004044180(權(quán)利要求12)；US2004044179(權(quán)利要求11)；US2003096961(權(quán)利要求11)；US2003232056(實(shí)施例5)；WO2003105758(權(quán)利要求12)；US2003206918(實(shí)施例5)；EP1347046(權(quán)利要求1)；WO2003025148(權(quán)利要求20)；

交叉引用：GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1

(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體，Genbank登錄號(hào)AY275463)；

Nakamuta M.等Biochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991；Ogawa Y.等Biochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991；Arai H.等Jpn.Circ.J.56,1303-1307,1992；Arai H.等J.Biol.Chem.268,3463-3470,1993；Sakamoto A.,Yanagisawa M.等Biochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991；Elshourbagy N.A.等J.Biol.Chem.268,3873-3879,1993；Haendler B.等J.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992；Tsutsumi M.等Gene 228,43-49,1999；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；Bourgeois C.等J.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997；Okamoto Y.等Biol.Chem.272,21589-21596,1997；Verheij J.B.等Am.J.Med.Genet.108,223-225,2002；Hofstra R.M.W.等Eur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997；Puffenberger E.G.等Cell 79,1257-1266,1994；Attie T.等,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995；Auricchio A.等Hum.Mol.Genet.5:351-354,1996；Amiel J.等Hum.Mol.Genet.5,355-357,1996；Hofstra R.M.W.等Nat.Genet.12,445-447,1996；Svensson P.J.等Hum.Genet.103,145-148,1998；Fuchs S.等Mol.Med.7,115-124,2001；Pingault V.等(2002)Hum.Genet.111,198-206；WO2004045516(權(quán)利要求1)；WO2004048938(實(shí)施例2)；WO2004040000(權(quán)利要求151)；WO2003087768(權(quán)利要求1)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO200261087(圖1)；WO2003016494(圖6)；WO2003025138(權(quán)利要求12；第144頁(yè))；WO200198351(權(quán)利要求1；第124-125頁(yè))；EP522868(權(quán)利要求8；圖2)；WO200177172(權(quán)利要求1；第297-299頁(yè))；US2003109676；US6518404(圖3)；US5773223(權(quán)利要求1a；第31-34欄)；WO2004001004；

(10)MSG783(RNF124、假擬蛋白FLJ20315，Genbank登錄號(hào)NM_017763)；

WO2003104275(權(quán)利要求1)；WO2004046342(實(shí)施例2)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO2003083074(權(quán)利要求14；第61頁(yè))；WO2003018621(權(quán)利要求1)；WO2003024392(權(quán)利要求2；圖93)；WO200166689(實(shí)施例6)；

交叉引用：LocusID:54894；NP_060233.2；NM_017763_1

(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關(guān)基因1、前列腺癌相關(guān)蛋白1、六次跨膜的前列腺上皮抗原2、六次跨膜的前列腺蛋白，Genbank登錄號(hào)AF455138)

Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002))；WO2003087306；US2003064397(權(quán)利要求1；圖1)；WO200272596(權(quán)利要求13；第54-55頁(yè))；WO200172962(權(quán)利要求1；圖4B)；WO2003104270(權(quán)利要求11)；WO2003104270(權(quán)利要求16)；US2004005598(權(quán)利要求22)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；US2003060612(權(quán)利要求12；圖10)；WO200226822(權(quán)利要求23；圖2)；WO200216429(權(quán)利要求12；圖10)；

交叉引用：GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1

(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)型受體電位陽(yáng)離子通道、亞家族M、成員4、Genbank登錄號(hào)NM_017636)

Xu,X.Z.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001)，Cell 109(3):397-407(2002),J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003))；US2003143557(權(quán)利要求4)；WO200040614(權(quán)利要求14；第100-103頁(yè))；WO200210382(權(quán)利要求1；圖9A)；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO200230268(權(quán)利要求27；第391頁(yè))；US2003219806(權(quán)利要求4)；WO200162794(權(quán)利要求14；圖1A-D)；

交叉引用：MIM:606936；NP_060106.2；NM_017636_1

(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生的生長(zhǎng)因子，Genbank登錄號(hào)NP_003203或NM_003212)

Ciccodicola,A.等EMBO J.8(7):1987-1991(1989),Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991))；US2003224411(權(quán)利要求1)；WO2003083041(實(shí)施例1)；WO2003034984(權(quán)利要求12)；WO200288170(權(quán)利要求2；第52-53頁(yè))；WO2003024392(權(quán)利要求2；圖58)；WO200216413(權(quán)利要求1；第94-95頁(yè)、第105頁(yè))；WO200222808(權(quán)利要求2；圖1)；US5854399(實(shí)施例2；第17-18欄)；US5792616(圖2)；

交叉引用：MIM:187395；NP_003203.1；NM_003212_1

(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒受體)或Hs.73792Genbank登錄號(hào)M26004)

Fujisaku等(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125)；Weis J.J.等J.Exp.Med.167,1047-1066,1988；Moore M.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987；Barel M.等Mol.Immunol.35,1025-1031,1998；Weis J.J.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986；Sinha S.K.等(1993)J.Immunol.150,5311-5320；WO2004045520(實(shí)施例4)；US2004005538(實(shí)施例1)；WO2003062401(權(quán)利要求9)；WO2004045520(實(shí)施例4)；WO9102536(圖9.1-9.9)；WO2004020595(權(quán)利要求1)；

登錄號(hào)：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1。

(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相關(guān)β)、B29，Genbank登錄號(hào)NM_000626或11038674)

Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131，Blood(2002)100(9):3068-3076，Muller等(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625)；WO2004016225(權(quán)利要求2、圖140)；WO2003087768,US2004101874(權(quán)利要求1、第102頁(yè))；WO2003062401(權(quán)利要求9)；WO200278524(實(shí)施例2)；US2002150573(權(quán)利要求5、第15頁(yè))；US5644033；WO2003048202(權(quán)利要求1、第306頁(yè)和第309頁(yè))；WO 99/558658；US6534482(權(quán)利要求13、圖17A/B)；WO200055351(權(quán)利要求11、第1145-1146頁(yè))；

交叉引用：MIM:147245；NP_000617.1；NM_000626_1

(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有SH2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶錨定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C，Genbank登錄號(hào)NM_030764、AY358130)

Genome Res.13(10):2265-2270(2003)，Immunogenetics 54(2):87-95(2002)，Blood 99(8):2662-2669(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001)，Xu,M.J.等(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775；WO2004016225(權(quán)利要求2)；WO2003077836；WO200138490(權(quán)利要求5；圖18D-1-18D-2)；WO2003097803(權(quán)利要求12)；WO2003089624(權(quán)利要求25)；

交叉引用：MIM:606509；NP_110391.2；NM_030764_1

(17)HER2(ErbB2，Genbank登錄號(hào)M11730)

Coussens L.等Science(1985)230(4730):1132-1139)；Yamamoto T.等Nature 319,230-234,1986；Semba K.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985；Swiercz J.M.等J.Cell Biol.165,869-880,2004；Kuhns J.J.等J.Biol.Chem.274,36422-36427,1999；Cho H.-S.等Nature 421,756-760,2003；Ehsani A.等(1993)Genomics 15,426-429；WO2004048938(實(shí)施例2)；WO2004027049(圖1I)；WO2004009622；WO2003081210；WO2003089904(權(quán)利要求9)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；US2003118592；WO2003008537(權(quán)利要求1)；WO2003055439(權(quán)利要求29；圖1A-B)；WO2003025228(權(quán)利要求37；圖5C)；WO200222636(實(shí)施例13；第95-107頁(yè))；WO200212341(權(quán)利要求68；圖7)；WO200213847(第71-74頁(yè))；WO200214503(第114-117頁(yè))；WO200153463(權(quán)利要求2；第41-46頁(yè))；WO200141787(第15頁(yè))；WO200044899(權(quán)利要求52；圖7)；WO200020579(權(quán)利要求3；圖2)；US5869445(權(quán)利要求3；第31-38欄)；WO9630514(權(quán)利要求2；第56-61頁(yè))；EP1439393(權(quán)利要求7)；WO2004043361(權(quán)利要求7)；WO2004022709；WO200100244(實(shí)施例3；圖4)；

登錄號(hào)：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1.EMBL；M11761；AAA35808.1。

(18)NCA(CEACAM6，Genbank登錄號(hào)M18728)；

Barnett T.等Genomics 3,59-66,1988；Tawaragi Y.等Biochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903,2002；WO2004063709；EP1439393(權(quán)利要求7)；WO2004044178(實(shí)施例4)；WO2004031238；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO200278524(實(shí)施例2)；WO200286443(權(quán)利要求27；第427頁(yè))；WO200260317(權(quán)利要求2)；

登錄號(hào)：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728；

(19)MDP(DPEP1，Genbank登錄號(hào)BC017023)

Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002))；WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO200264798(權(quán)利要求33；第85-87頁(yè))；JP05003790(圖6-8)；WO9946284(圖9)；

交叉引用：MIM:179780；AAH17023.1；BC017023_1

(20)IL20Rα(IL20Ra、ZCYTOR7，Genbank登錄號(hào)AF184971)；

Clark H.F.等Genome Res.13,2265-2270,2003；Mungall A.J.等Nature 425,805-811,2003；Blumberg H.等Cell 104,9-19,2001；Dumoutier L.等J.Immunol.167,3545-3549,2001；Parrish-Novak J.等J.Biol.Chem.277,47517-47523,2002；Pletnev S.等(2003)Biochemistry 42:12617-12624；Sheikh F.等(2004)J.Immunol.172,2006-2010；EP1394274(實(shí)施例11)；US2004005320(實(shí)施例5)；WO2003029262(第74-75頁(yè))；WO2003002717(權(quán)利要求2；第63頁(yè))；WO200222153(第45-47頁(yè))；US2002042366(第20-21頁(yè))；WO200146261(第57-59頁(yè))；WO200146232(第63-65頁(yè))；WO9837193(權(quán)利要求1；第55-59頁(yè))；

登錄號(hào)：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1。

(21)短蛋白聚糖(BCAN、BEHAB，Genbank登錄號(hào)AF229053)

Gary S.C.等Gene 256,139-147,2000；Clark H.F.等Genome Res.13,2265-2270,2003；Strausberg R.L.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,16899-16903,2002；US2003186372(權(quán)利要求11)；US2003186373(權(quán)利要求11)；US2003119131(權(quán)利要求1；圖52)；US2003119122(權(quán)利要求1；圖52)；US2003119126(權(quán)利要求1)；US2003119121(權(quán)利要求1；圖52)；US2003119129(權(quán)利要求1)；US2003119130(權(quán)利要求1)；US2003119128(權(quán)利要求1；圖52)；US2003119125(權(quán)利要求1)；WO2003016475(權(quán)利要求1)；WO200202634(權(quán)利要求1)；

(22)EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3、Tyro5，Genbank登錄號(hào)NM_004442)

Chan,J.和Watt,V.M.,Oncogene 6(6),1057-1061(1991)，Oncogene 10(5):897-905(1995)，Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998)，Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000))；WO2003042661(權(quán)利要求12)；WO200053216(權(quán)利要求1；第41頁(yè))；WO2004065576(權(quán)利要求1)；WO2004020583(權(quán)利要求9)；WO2003004529(第128-132頁(yè))；WO200053216(權(quán)利要求1；第42頁(yè))；

交叉引用：MIM:600997；NP_004433.2；NM_004442_1

(23)ASLG659(B7h，Genbank登錄號(hào)AX092328)

US20040101899(權(quán)利要求2)；WO2003104399(權(quán)利要求11)；WO2004000221(圖3)；US2003165504(權(quán)利要求1)；US2003124140(實(shí)施例2)；US2003065143(圖60)；WO2002102235(權(quán)利要求13；第299頁(yè))；US2003091580(實(shí)施例2)；WO200210187(權(quán)利要求6；圖10)；WO200194641(權(quán)利要求12；圖7b)；WO200202624(權(quán)利要求13；圖1A-1B)；US2002034749(權(quán)利要求54；第45-46頁(yè))；WO200206317(實(shí)施例2；第320-321頁(yè)，權(quán)利要求34；第321-322頁(yè))；WO200271928(第468-469頁(yè))；WO200202587(實(shí)施例1；圖1)；WO200140269(實(shí)施例3；第190-192頁(yè))；WO200036107(實(shí)施例2；第205-207頁(yè))；WO2004053079(權(quán)利要求12)；WO2003004989(權(quán)利要求1)；WO200271928(第233-234頁(yè)、第452-453頁(yè))；WO 0116318；

(24)PSCA(前列腺干細(xì)胞抗原前體，Genbank登錄號(hào)AJ297436)

Reiter R.E.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998；Gu Z.等Oncogene 19,1288-1296,2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788；WO2004022709；EP1394274(實(shí)施例11)；US2004018553(權(quán)利要求17)；WO2003008537(權(quán)利要求1)；WO200281646(權(quán)利要求1；第164頁(yè))；WO2003003906(權(quán)利要求10；第288頁(yè))；WO200140309(實(shí)施例1；圖17)；US2001055751(實(shí)施例1；圖1b)；WO200032752(權(quán)利要求18；圖1)；WO9851805(權(quán)利要求17；第97頁(yè))；WO9851824(權(quán)利要求10；第94頁(yè))；WO9840403(權(quán)利要求2；圖1B)；

登錄號(hào)：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1。

(25)GEDA(Genbank登錄號(hào)AY260763)；

AAP14954脂肪瘤HMGIC融合-配偶類蛋白/pid＝AAP14954.1-智人

物種：智人(人)

WO2003054152(權(quán)利要求20)；WO2003000842(權(quán)利要求1)；WO2003023013(實(shí)施例3、權(quán)利要求20)；US2003194704(權(quán)利要求45)；

交叉引用：GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1

(26)BAFF-R(B細(xì)胞活化因子受體、BLyS受體3、BR3，Genbank登錄號(hào)AF116456)；BAFF受體/pid＝NP_443177.1-智人

Thompson,J.S.等Science 293(5537),2108-2111(2001)；WO2004058309；WO2004011611；WO2003045422(實(shí)施例；第32-33頁(yè))；WO2003014294(權(quán)利要求35；圖6B)；WO2003035846(權(quán)利要求70；第615-616頁(yè))；WO200294852(第136-137欄)；WO200238766(權(quán)利要求3；第133頁(yè))；WO200224909(實(shí)施例3；圖3)；

交叉引用：MIM:606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600

(27)CD22(B細(xì)胞受體CD22-B同種型、BL-CAM、Lyb-8、Lyb8、SIGLEC-2、FLJ22814，Genbank登錄號(hào)AK026467)；

Wilson等(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003072036(權(quán)利要求1；圖1)；

交叉引用：MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1

(28)CD79a(CD79A、CD79α、免疫球蛋白相關(guān)α、與Igβ(CD79B)共價(jià)相互作用并且在表面上與Ig M分子形成復(fù)合物、轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及B細(xì)胞分化的信號(hào)的B細(xì)胞特異性蛋白，pI：4.84，MW：25028TM：2[P]基因染色體：19q13.2，Genbank登錄號(hào)NP_001774.10)

WO2003088808；US20030228319；WO2003062401(權(quán)利要求9)；US2002150573(權(quán)利要求4、第13-14頁(yè))；WO9958658(權(quán)利要求13、圖16)；WO9207574(圖1)；US5644033；Ha等(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531；Mueller等(1992)Eur.J.Biochem.22:1621-1625；Hashimoto等(1994)Immunogenetics 40(4):287-295；Preud’homme等(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146；Yu等(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchi等(1988)EMBO J.7(11):3457-3464；

(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1，一種G蛋白偶聯(lián)的受體，其由CXCL13趨化因子活化，在淋巴細(xì)胞遷移和體液防御中發(fā)揮功能，在HIV-2感染和可能的AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的發(fā)展中起作用)；372aa，pI：8.54MW：41959TM：7[P]基因染色體：11q23.3，Genbank登錄號(hào)NP_001707.1)

WO2004040000；WO2004015426；US2003105292(實(shí)施例2)；US6555339(實(shí)施例2)；WO200261087(圖1)；WO200157188(權(quán)利要求20、第269頁(yè))；WO200172830(第12-13頁(yè))；WO200022129(實(shí)施例1、第152-153頁(yè)、實(shí)施例2、第254-256頁(yè))；WO9928468(權(quán)利要求1、第38頁(yè))；US5440021(實(shí)施例2、第49-52欄)；WO9428931(第56-58頁(yè))；WO9217497(權(quán)利要求7、圖5)；Dobner等(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799；Barella等(1995)Biochem.J.309:773-779；

(30)HLA-DOB(MHC II類分子的β亞基(Ia抗原)，其結(jié)合肽并且將它們呈遞給CD4+ T淋巴細(xì)胞)；273aa，pI：6.56MW：30820TM：1[P]基因染色體：6p21.3，Genbank登錄號(hào)NP_002111.1)

Tonnelle等(1985)EMBO J.4(11):2839-2847；Jonsson等(1989)Immunogenetics 29(6):411-413；Beck等(1992)J.Mol.Biol.228:433-441；Strausberg等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；Servenius等(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766；Beck等(1996)J.Mol.Biol.255:1-13；Naruse等(2002)Tissue Antigens 59:512-519；WO9958658(權(quán)利要求13、圖15)；US6153408(第35-38欄)；US5976551(第168-170欄)；US6011146(第145-146欄)；Kasahara等(1989)Immunogenetics 30(1):66-68；Larhammar等(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119；

(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體門控離子通道5，一種由細(xì)胞外ATP門控的離子通道，可參與突觸傳遞和神經(jīng)發(fā)生，缺陷可促成特發(fā)性逼尿肌不穩(wěn)定的病理生理)；422aa)，pI：7.63,MW：47206TM：1[P]基因染色體：17p13.3，Genbank登錄號(hào)NP_002552.2)

Le等(1997)FEBS Lett.418(1-2):195-199；WO2004047749；WO2003072035(權(quán)利要求10)；Touchman等(2000)Genome Res.10:165-173；WO200222660(權(quán)利要求20)；WO2003093444(權(quán)利要求1)；WO2003087768(權(quán)利要求1)；WO2003029277(第82頁(yè))；

(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72、Lyb-2)PROTEIN SEQUENCE Full maeaity...tafrfpd(1..359；359aa)，pI：8.66,MW：40225TM：1[P]基因染色體：9p13.3，Genbank登錄號(hào)NP_001773.1)

WO2004042346(權(quán)利要求65)；WO2003026493(第51-52頁(yè)、第57-58頁(yè))；WO200075655(第105-106頁(yè))；Von Hoegen等(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877；Strausberg等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 99:16899-16903；

(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白，調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化和細(xì)胞凋亡，功能喪失與患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者體內(nèi)的疾病活性增加相關(guān))；661aa，pI：6.20,MW：74147TM：1[P]基因染色體：5q12，Genbank登錄號(hào)NP_005573.1)

US2002193567；WO9707198(權(quán)利要求11、第39-42頁(yè))；Miura等(1996)Genomics 38(3):299-304；Miura等(1998)Blood 92:2815-2822；WO2003083047；WO9744452(權(quán)利要求8、第57-61頁(yè))；WO200012130(第24-26頁(yè))；

(34)FcRH1(Fc受體樣蛋白1，一種針對(duì)含有C2型Ig樣和ITAM結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的推定受體、可在B淋巴細(xì)胞分化中起作用)；429aa，pI：5.28,MW：46925TM：1[P]基因染色體：1q21-1q22，Genbank登錄號(hào)NP_443170.1)

WO2003077836；WO200138490(權(quán)利要求6、圖18E-1-18-E-2)；Davis等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci USA 98(17):9772-9777；WO2003089624(權(quán)利要求8)；EP1347046(權(quán)利要求1)；WO2003089624(權(quán)利要求7)；

(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2，一種可在B細(xì)胞發(fā)育和淋巴瘤生成中起作用的推定免疫受體；在一些B細(xì)胞惡性腫瘤中通過(guò)易位導(dǎo)致基因調(diào)節(jié)異常)；977aa，pI：6.88MW：106468TM：1[P]基因染色體：1q21,Genbank登記號(hào)人：AF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK090423、AK090475、AL834187、AY358085；小鼠：AK089756、AY158090、AY506558；NP_112571.1

WO2003024392(權(quán)利要求2、圖97)；Nakayama等(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127；WO2003077836；WO200138490(權(quán)利要求3、圖18B-1-18B-2)；

(36)TENB2(TMEFF2、腦腫瘤抑癌蛋白(tomoregulin)、TPEF、HPP1、TR、推定的跨膜蛋白聚糖，與生長(zhǎng)因子和卵泡抑制素(follistatin)的EGF/神經(jīng)生長(zhǎng)因子(heregulin)家族有關(guān))；374aa，NCBI登錄號(hào)：AAD55776、AAF91397、AAG49451，NCBI RefSeq：NP_057276；NCBI基因：23671；OMIM：605734；SwissProt Q9UIK5；Genbank登錄號(hào)AF179274；AY358907；CAF85723；CQ782436

WO2004074320(SEQ ID NO 810)；JP2004113151(SEQ ID NOS 2、4、8)；WO2003042661(SEQ ID NO 580)；WO2003009814(SEQ ID NO 411)；EP1295944(第69-70頁(yè))；WO200230268(第329頁(yè))；WO200190304(SEQ ID NO 2706)；US2004249130；US2004022727；WO2004063355；US2004197325；US2003232350；US2004005563；US2003124579；Horie等(2000)Genomics 67:146-152；Uchida等(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602；Liang等(2000)Cancer Res.60:4907-12；Glynne-Jones等(2001)Int J Cancer.Oct 15；94(2):178-84；

(37)PMEL17(銀同源物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；ME20；gp100)BC001414；BT007202；M32295；M77348；NM_006928；McGlinchey,R.P.等(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(33),13731-13736；Kummer,M.P.等(2009)J.Biol.Chem.284(4),2296-2306；

(38)TMEFF1(具有EGF樣結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)卵泡抑素樣結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白1；腦腫瘤抑癌蛋白-1)；H7365；C9orf2；C9ORF2；U19878；X83961；NM_080655；NM_003692；Harms,P.W.(2003)Genes Dev.17(21),2624-2629；Gery,S.等(2003)Oncogene 22(18):2723-2727；

(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受體α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；U95847；BC014962；NM_145793NM_005264；Kim,M.H.等(2009)Mol.Cell.Biol.29(8),2264-2277；Treanor,J.J.等(1996)Nature 382(6586):80-83；

(40)Ly6E(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；NP_002337.1；NM_002346.2；de Nooij-van Dalen,A.G.等(2003)Int.J.Cancer 103(6),768-774；Zammit,D.J.等(2002)Mol.Cell.Biol.22(3):946-952；

(41)TMEM46(shisa同源物2(非洲爪蟾)；SHISA2)；NP_001007539.1；NM_001007538.1；Furushima,K.等(2007)Dev.Biol.306(2),480-492；Clark,H.F.等(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；

(42)Ly6G6D(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座G6D；Ly6-D、MEGT1)；NP_067079.2；NM_021246.2；Mallya,M.等(2002)Genomics 80(1):113-123；Ribas,G.等(1999)J.Immunol.163(1):278-287；

(43)LGR5(富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5；GPR49、GPR67)；NP_003658.1；NM_003667.2；Salanti,G.等(2009)Am.J.Epidemiol.170(5):537-545；Yamamoto,Y.等(2003)Hepatology 37(3):528-533；

(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；NP_066124.1；NM_020975.4；Tsukamoto,H.等(2009)Cancer Sci.100(10):1895-1901；Narita,N.等(2009)Oncogene 28(34):3058-3068；

(45)LY6K(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；NP_059997.3；NM_017527.3；Ishikawa,N.等(2007)Cancer Res.67(24):11601-11611；de Nooij-van Dalen,A.G.等(2003)Int.J.Cancer 103(6):768-774；

(46)GPR19(G蛋白偶聯(lián)的受體19；Mm.4787)；NP_006134.1；NM_006143.2；Montpetit,A.和Sinnett,D.(1999)Hum.Genet.105(1-2):162-164；O'Dowd,B.F.等(1996)FEBS Lett.394(3):325-329；

(47)GPR54(KISS1受體；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；NP_115940.2；NM_032551.4；Navenot,J.M.等(2009)Mol.Pharmacol.75(6):1300-1306；Hata,K.等(2009)Anticancer Res.29(2):617-623；

(48)ASPHD1(含天冬氨酸β羥化酶結(jié)構(gòu)域的1；LOC253982)；NP_859069.2；NM_181718.3；Gerhard,D.S.等(2004)Genome Res.14(10B):2121-2127；

(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；NP_000363.1；NM_000372.4；Bishop,D.T.等(2009)Nat.Genet.41(8):920-925；Nan,H.等(2009)Int.J.Cancer 125(4):909-917；

(50)TMEM118(環(huán)指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；NP_001103373.1；NM_001109903.1；Clark,H.F.等(2003)Genome Res.13(10):2265-2270；Scherer,S.E.等(2006)Nature 440(7082):346-351

(51)GPR172A(G蛋白偶聯(lián)的受體172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；NP_078807.1；NM_024531.3；Ericsson,T.A.等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(11):6759-6764；Takeda,S.等(2002)FEBS Lett.520(1-3):97-101。

(52)CD33，結(jié)合唾液酸的免疫球蛋白樣凝集素家族的成員，為67kDa糖基化的跨膜蛋白。除了定向型骨髓單核細(xì)胞和紅系祖細(xì)胞外，CD33還在大多數(shù)骨髓性和單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞上表達(dá)。在最早的多能干細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞或非造血系統(tǒng)癌細(xì)胞上未示出(Sabbath等,(1985)J.Clin.Invest.75:756-56；Andrews等,(1986)Blood 68:1030-5)。CD33在其細(xì)胞質(zhì)尾部上含有兩個(gè)酪氨酸殘基，所述殘基中的每一個(gè)后跟類似于在許多抑制性受體中示出的基于免疫受體酪氨酸的抑制性基序(ITIM)的疏水性殘基。

(53)CLL-1(CLEC12A、MICL和DCAL2)，編碼C型凝集素/C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(CTL/CTLD)超家族。此家族的成員共享共同的蛋白質(zhì)折疊并且具有各種功能，諸如細(xì)胞粘附、細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、糖蛋白反轉(zhuǎn)并且在炎癥和免疫應(yīng)答上起作用。由此基因編碼的蛋白質(zhì)為粒細(xì)胞和單核細(xì)胞功能的陰性調(diào)節(jié)因子。替代地，已描述數(shù)種此基因的剪接轉(zhuǎn)錄物變體，但這些變體中的一些的全長(zhǎng)性質(zhì)尚未確定。此基因與染色體12p13上的天然殺傷基因復(fù)合物區(qū)中的其他CTL/CTLD超家族成員密切相關(guān)(Drickamer K(1999)Curr.Opin.Struct.Biol.9(5):585–90；van Rhenen A等,(2007)Blood 110(7):2659–66；Chen CH等(2006)Blood 107(4):1459–67；Marshall AS等(2006)Eur.J.Immunol.36(8):2159–69；Bakker AB等(2005)Cancer Res.64(22):8443–50；Marshall AS等(2004)J.Biol.Chem.279(15):14792–802)。已示出CLL-1為II型跨膜受體，其包含單個(gè)C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域(所述結(jié)構(gòu)域未被預(yù)測(cè)結(jié)合鈣或糖)、柄區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和含有ITIM基序的短細(xì)胞質(zhì)尾部。

抗CD22抗體

表3中的ADC的抗CD22抗體包含根據(jù)US 8226945的三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)和三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)：

抗HER2抗體

在某些實(shí)施方案中，表3的ADC包含抗HER2抗體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗HER2抗體包括如在US 5821337的表3中所述的人源化抗HER2抗體，例如huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8，所述專利確切地以引用的方式并入本文。那些抗體含有人框架區(qū)與結(jié)合HER2的鼠抗體(4D5)的互補(bǔ)決定區(qū)。人源化抗體huMAb4D5-8又稱為曲妥珠單抗，以商品名HERCEPTIN商業(yè)上可在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗HER2抗體包括如在US7862817中所述的人源化抗HER2抗體，例如人源化2C4。示例性人源化2C4抗體為帕妥珠單抗，以商品名PERJETA商業(yè)上可

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ADC的抗HER2抗體包括稱為7C2的人源化抗HER2抗體。

在一些實(shí)施方案中，用于制備表3的ADC的半胱氨酸工程化的THIOMAB^TM抗體具有在輕鏈149賴氨酸位點(diǎn)處引入的半胱氨酸殘基(LC K149C)。在其他實(shí)施方案中，半胱氨酸工程化的THIOMAB^TM抗體具有在重鏈118丙氨酸位點(diǎn)(EU編號(hào))處引入的半胱氨酸殘基(HC A118C)。替代地，此位點(diǎn)通過(guò)順序編號(hào)為121或通過(guò)Kabat編號(hào)為114。

抗CD33抗體

表2中的ADC的抗CD33抗體15G15.33包含三個(gè)輕鏈高變區(qū)(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)和三個(gè)重鏈高變區(qū)(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)

表5中的ADC的抗CD33抗體15G15.33包含SEQ ID NO：13的輕鏈可變區(qū)和/或SEQ ID NO：14的重鏈可變區(qū)。

EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGVNSVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPWTFGQGTKVEIK

(SEQ ID NO：13)

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGIFSNHAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAFMELSSLRSEDTAVYYCAREWADVFDIWGQGTMVTVSS

(SEQ ID NO：14)

抗CD33抗體9C3和其他實(shí)施方案

9C3 V_L

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK

(SEQ ID NO：21)

9C3 V_H

EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADSVKGRFNISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS

(SEQ ID NO：22)

9C3.2 V_L

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK

(SEQ ID NO：23)

9C3.2 V_H

EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADSVKGRFTISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS

(SEQ ID NO：24)

9C3.3 V_L

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK

(SEQ ID NO：25)

9C3.3 V_H

EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADSVKGRFSISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS

(SEQ ID NO：26)

9C3.4 V_L

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK

(SEQ ID NO：27)

9C3.4 V_H

EVQLVESGGALIQPGGSLRLSCVASGFTISGNYMSWVRQAPGKGLEWVSLIYSGDSTYYADSVKGRFAISRDISKNTVYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDGYYVSDMVVWGKGTTVTVSS

(SEQ ID NO：28)

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)選自以下的HVR的抗CD33抗體：(a)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。

一方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VH HVR序列的抗體：(a)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H3。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在另一實(shí)施方案中，抗體包含含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H2。在另一實(shí)施方案中，抗體包含(a)含有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的HVR-H1；(b)含有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的HVR-H2；和(c)含有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的HVR-H3。

另一方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VL HVR序列的抗體：(a)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體包含(a)含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的HVR-L2；和(c)含有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的HVR-L3。

另一方面，本發(fā)明的抗體包含(a)含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VH HVR序列的VH結(jié)構(gòu)域：(i)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含選自SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H3；和(b)含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)或全部三個(gè)選自以下的VL HVR序列的VL結(jié)構(gòu)域：(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L3。

另一方面，本發(fā)明提供包含以下的抗體：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L2；和(f)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L3。

在任何以上實(shí)施方案中，抗CD33抗體為人源化的。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗CD33抗體包含如在任何以上實(shí)施方案中的HVR，并且還包含人受體框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些實(shí)施方案中，人受體框架為人VLκI共有(VL_KI)框架和/或VH框架VH₁。在某些實(shí)施方案中，人受體框架為包含任何一種以下突變的人VLκI共有(VL_KI)框架和/或VH框架VH₁。

另一方面，抗CD33抗體包含與SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和/或SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)序列。在某些實(shí)施方案中，與SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和/或SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH序列相對(duì)于參考序列含有取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗CD33抗體保留結(jié)合CD33的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和/或SEQ ID NO:28中總共有1至10個(gè)氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些實(shí)施方案中，在SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和/或SEQ ID NO:28中總共有1至5個(gè)氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失發(fā)生在HVR以外的區(qū)域(即，在FR中)。任選地，抗CD33抗體包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和/或SEQ ID NO:28的VH序列，包括所述序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，VH包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的HVR-H2和(c)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的HVR-H3。

另一方面，提供抗CD33抗體，其中抗體包含與SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)。在某些實(shí)施方案中，與SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相對(duì)于參考序列含有取代(例如，保守性取代)、插入或缺失，但包含所述序列的抗CD33抗體保留結(jié)合CD33的能力。在某些實(shí)施方案中，在SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:27中總共有1至10個(gè)氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些實(shí)施方案中，在SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:27中總共有1至5個(gè)氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些實(shí)施方案中，取代、插入或缺失發(fā)生在HVR以外的區(qū)域(即，在FR中)。任選地，抗CD33抗體包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:27的VL序列，包括所述序列的翻譯后修飾。在具體實(shí)施方案中，VL包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自以下的HVR：(a)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的HVR-L3。

另一方面，提供抗CD33抗體，其中抗體包含如在以上提供的任何實(shí)施方案中的VH和如在以上提供的任何實(shí)施方案中的VL。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體分別包含SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:21的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體分別包含SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:23的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體分別包含SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:25的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體分別包含SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:27的VH和VL序列，包括那些序列的翻譯后修飾。

又一方面，本文提供與本文提供的抗CD33抗體結(jié)合相同表位的抗體。例如，在某些實(shí)施方案中，提供與分別包含SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和/或SEQ ID NO:28的VH序列和SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25和/或SEQ ID NO:27的VL序列的抗CD33抗體結(jié)合相同表位的抗體。

在本發(fā)明的又一方面，根據(jù)任何以上實(shí)施方案的抗CD33抗體為單克隆抗體，包括人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗CD33抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙抗體或F(ab’)₂片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體為基本上全長(zhǎng)的抗體，例如，如本文所定義的IgG1抗體、IgG2a抗體或其他抗體類別或同種型。

又一方面，根據(jù)任何以上實(shí)施方案的抗CD33抗體可以單獨(dú)或組合并入如下所述的任何特征。

親本抗體還可為包含白蛋白結(jié)合肽(ABP)序列的融合蛋白(Dennis等(2002)J Biol Chem.277:35035-35043(表III和表IV，第35038頁(yè))；和WO 2001/45746的第12-13處，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。

為了通過(guò)誘變來(lái)制備半胱氨酸工程化的抗體，編碼起始多肽的氨基酸序列變體的DNA通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法來(lái)制備。這些方法包括，但不限于通過(guò)定點(diǎn)(或寡核苷酸介導(dǎo)的)誘變、PCR誘變以及之前制備的編碼多肽的DNA的盒誘變。還可通過(guò)限制性片段操控或通過(guò)與合成寡核苷酸重疊延伸PCR來(lái)構(gòu)建重組抗體的變體。誘變引物編碼半胱氨酸密碼子替換物。可采用標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)來(lái)產(chǎn)生編碼此類突變半胱氨酸工程化的抗體的DNA。一般指導(dǎo)可見(jiàn)于Sambrook等Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；和Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,N.Y.,1993。

可使用重組方法和組合物來(lái)產(chǎn)生抗體，例如，如US 4816567所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸編碼包含抗體VL的氨基酸序列和/或包含抗體VH的氨基酸序列(例如，抗體的輕鏈和/或重鏈)。在另一實(shí)施方案中，提供包含此類核酸的一種或多種載體(例如，表達(dá)載體)。在另一實(shí)施方案中，提供包含此類核酸的宿主細(xì)胞。在一個(gè)此類實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含(例如，用以下載體轉(zhuǎn)化)：(1)包含核酸的載體，所述核酸編碼包含抗體VL的氨基酸序列和包含抗體VH的氨基酸序列，或(2)包含編碼含有抗體VL的氨基酸序列的核酸的第一載體和包含編碼含有抗體VH的氨基酸序列的核酸的第二載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為真核的，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞(例如，Y0、NS0、Sp20細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括在合適于表達(dá)抗體的條件下培養(yǎng)包含編碼如上所提供的抗體的核酸的宿主細(xì)胞，并且任選地，從宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)回收抗體。

對(duì)于重組生產(chǎn)，將編碼例如如上所述的抗體的核酸分離，并且插入一種或多種載體中以用于在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)。可使用常規(guī)程序?qū)⒋祟惡怂崛菀椎胤蛛x并且進(jìn)行測(cè)序(例如，通過(guò)使用寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針能夠特異性結(jié)合編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因)。合適于克隆或表達(dá)編碼抗體的載體的宿主細(xì)胞包括本文所述的原核或真核細(xì)胞。例如，可以在細(xì)菌中產(chǎn)生抗體，特別是在不需要糖基化和Fc效應(yīng)子功能時(shí)。對(duì)于抗體片段和多肽在細(xì)菌中的表達(dá)，參見(jiàn)，例如，US 5648237、US 5789199和US 5840523，還有Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編著,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254頁(yè),描述抗體片段在大腸桿菌中的表達(dá)。)表達(dá)后，可以將抗體在可溶性級(jí)分中從細(xì)菌細(xì)胞團(tuán)糊中分離，并且可以進(jìn)一步純化。除了原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母是合適于編碼抗體的載體的克隆或表達(dá)宿主，包括其糖基化途徑已被“人源化”從而導(dǎo)致產(chǎn)生具有部分或完全人糖基化樣式的抗體的真菌和酵母菌株。參見(jiàn)Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。合適于表達(dá)糖基化抗體的宿主細(xì)胞也來(lái)源于多細(xì)胞生物體(無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物)。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物和昆蟲(chóng)細(xì)胞。已鑒定出許多桿狀病毒株，其可以與昆蟲(chóng)細(xì)胞一起使用，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞。植物細(xì)胞培養(yǎng)物也可以用作宿主，諸如在US 5959177、US 6040498、US 6420548、US 7125978和US 6417429(描述用于在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生抗體的PLANTIBODIES^TM技術(shù))中描述的那些。也可以使用脊椎動(dòng)物細(xì)胞作為宿主。例如，適合于在懸浮液中生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系可能是有用的。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的其他實(shí)例為由SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7)；人胚腎系(293或293細(xì)胞，如描述于例如Graham等,J.Gen Virol.36:59(1977)；幼年倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)細(xì)(TM4細(xì)胞，如描述于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)；猴腎細(xì)胞(CV1)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA)；犬腎細(xì)胞(MDCK；布法羅大鼠肝細(xì)胞(BRL 3A)；人肺細(xì)胞(W138)；人肝細(xì)胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細(xì)胞，如描述于例如Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC 5細(xì)胞；和FS4細(xì)胞。其他有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，包括DHFR^-CHO細(xì)胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤細(xì)胞系諸如Y0、NS0和Sp2/0。關(guān)于合適于抗體產(chǎn)生的某些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的綜述，參見(jiàn)，例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo編著,Humana Press,Totowa,NJ),第255-268(2003)。

定點(diǎn)誘變?yōu)橛糜谥苽淙〈凅w即突變蛋白的一種方法(Carter(1985)等Nucleic Acids Res.13:4431-4443；Ho等(1989)Gene(Amst.)77:51-59；和Kunkel等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488)。起始DNA通過(guò)首先使編碼所需突變的寡核苷酸與此類起始DNA的單鏈雜交來(lái)改變。雜交后，使用DNA聚合酶來(lái)合成整個(gè)第二鏈，使用雜交的寡核苷酸作為引物并且使用起始DNA的單鏈作為模板。因此，編碼所需突變的寡核苷酸被并入在所得到的雙鏈DNA中。定點(diǎn)誘變可在表達(dá)質(zhì)粒中表達(dá)待誘變的蛋白質(zhì)的基因內(nèi)進(jìn)行，并且可對(duì)所得到的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)所需半胱氨酸替換突變的引入(Liu等(1998)J.Biol.Chem.273:20252-20260)。定點(diǎn)誘變方案和形式為廣泛可獲得的，例如多定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene,La Jolla,CA)。

PCR誘變還合適于制備起始多肽的氨基酸序列變體。參見(jiàn)Higuchi,(1990)的PCR方案，第177-183頁(yè),Academic Press；Ito等(1991)Gene 102:67-70；Bernhard等(1994)Bioconjugate Chem.,5:126-132；和Vallette等(1989)Nuc.Acids Res.,17:723-733。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)少量模板DNA用作PCR中的起始原料時(shí)，在序列上稍微不同于模板DNA中的相應(yīng)區(qū)的引物可用于產(chǎn)生相對(duì)大量的特異性DNA片段，所述DNA片段僅在其中引物不同于模板的位置處不同于模板序列。

用于制備變體、盒誘變的另一種方法基于Wells等(1985)Gene,34:315-323描述的技術(shù)。起始原料為包含待突變的起始多肽DNA的質(zhì)粒(或其他載體)。鑒定了待突變的起始DNA中的密碼子。在鑒定的突變位點(diǎn)的每一側(cè)上必須存在獨(dú)特的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。如果不存在此類限制性位點(diǎn)，可以使用以上描述的寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法來(lái)產(chǎn)生所述限制性位點(diǎn)，以便在起始多肽DNA中的適當(dāng)位置處引入它們。在這些位點(diǎn)處切割質(zhì)粒DNA使其線性化。使用標(biāo)準(zhǔn)程序合成編碼限制性位點(diǎn)之間的DNA序列但含有所需突變的雙鏈寡核苷酸，其中分開(kāi)合成寡核苷酸的兩個(gè)鏈并且然后使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)雜交在一起。此雙鏈寡核苷酸稱為盒。此盒被設(shè)計(jì)成具有與線性化的質(zhì)粒的末端相容的5'端和3'端，這樣使得它可以直接連接至質(zhì)?！，F(xiàn)在此質(zhì)粒含有突變的DNA序列。含有編碼半胱氨酸替換物的突變DNA可通過(guò)DNA測(cè)序來(lái)證實(shí)。

還通過(guò)使用雙鏈質(zhì)粒DNA作為模板的寡核苷酸定向誘變通過(guò)基于PCR的誘變來(lái)產(chǎn)生單個(gè)突變(Sambrook和Russel,(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版；Zoller等(1983)Methods Enzymol.100:468-500；Zoller,M.J.和Smith,M.(1982)Nucl.Acids Res.10:6487-6500)。

在某些實(shí)施方案中，可以將一種或多種氨基酸修飾引入本文提供的抗體的Fc區(qū)中，由此產(chǎn)生Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可以包含在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處包含氨基酸修飾(例如取代)的人Fc區(qū)序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋具有一些但不是所有效應(yīng)子功能的抗體變體，所述效應(yīng)子功能使其成為用于如下應(yīng)用的期望候選物，其中抗體的體內(nèi)半衰期為重要的，而某些效應(yīng)子功能(諸如補(bǔ)體和ADCC)為不必要的或有害的?？梢赃M(jìn)行體外和/或體內(nèi)細(xì)胞毒性測(cè)定來(lái)證實(shí)CDC和/或ADCC活性的減少/缺失。例如，可以進(jìn)行Fc受體(FcR)結(jié)合測(cè)定來(lái)確?？贵w缺乏FcγR結(jié)合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結(jié)合能力。

蒽環(huán)類二硫化物中間體

本發(fā)明的抗體-藥物綴合物化合物包含蒽環(huán)類二硫化物中間體，其包含在酮基處用二硫化物基團(tuán)衍生化的PNU-15682部分。

蒽環(huán)類二硫化物中間體具有下式：

Ant-L-(Z)_m-X I

其中Ant選自以下結(jié)構(gòu)：

其中波浪線表示與L的附接；

其中波浪線表示與Ant和Z的附接；并且

Z為選自以下的任選間隔物：-CH₂C(O)-、-CH₂C(O)NR(C₁-C₁₂亞烷基)-以及以下結(jié)構(gòu)：

其中波浪線表示與L和X的附接；

R為H、C₁-C₁₂烷基或C₆-C₂₀芳基；

Z¹選自-(C₁-C₁₂亞烷基)-、-(C₂-C₈亞烯基)-、-(C₂-C₈亞炔基)-、-O(C₁-C₁₂亞烷基)-、-O(C₂-C₈亞烯基)-,-O(C₂-C₈亞炔基)-以及-(CH₂CH₂O)_n-；

m為0或1；

n為1至6；

X為吡啶基二硫化物，其中吡啶基任選被選自以下的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代：NO₂、Cl、F、CN和Br；并且

亞烷基、亞烯基、亞炔基、烷基和芳基任選被選自以下的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代：F、Cl、Br、N(CH₃)₂、NO₂和OCH₃。

X的示例性實(shí)施方案為：

其中波浪線表示與L或Z的附接；

R¹為NO₂、Cl、F、CN或Br，并且q為0、1或2。

不限于具體機(jī)理或作用，在蒽環(huán)類二硫化物中間體的吡啶基環(huán)上存在吸電子基團(tuán)R¹；NO₂、Cl、F或Br加速了與半胱氨酸工程化的抗體的半胱氨酸巰基的反應(yīng)。在半胱氨酸巰基被引入在抗體上的位阻或反應(yīng)性較低的部位上的情況下，此類蒽環(huán)類二硫化物中間體得到相對(duì)于相應(yīng)未取代的吡啶基類似物(R¹＝H)更有效的綴合。

示例性接頭-藥物中間體為式Ia-c：

和

其中R¹為NO₂、Cl、F、CN或Br；并且q為0、1或2。

示例性接頭-藥物中間體包括其中R¹為NO₂并且q為1。

示例性接頭-藥物中間體為式Id：

有用于制備本發(fā)明的抗體-藥物綴合物的示例性蒽環(huán)類二硫化物、接頭-藥物中間體包括在表1中。蒽環(huán)類二硫化物、接頭-藥物(LD)中間體的合成描述于實(shí)施例1中。

表1蒽環(huán)類二硫化物、接頭-藥物中間體

抗體-藥物綴合物(ADC)

本發(fā)明的抗體-藥物綴合物(ADC)化合物包含連接至有效的蒽環(huán)類藥物部分的對(duì)腫瘤相關(guān)的抗原具有特異性的抗體，并且包括具有治療活性、對(duì)多種過(guò)度增殖性病癥(包括癌癥)有效的那些。藥物部分的生物活性通過(guò)綴合至抗體來(lái)調(diào)節(jié)。本發(fā)明的ADC選擇性地將有效劑量的蒽環(huán)類藥物或毒素遞送至腫瘤細(xì)胞或部位，從而可以實(shí)現(xiàn)更大的選擇性(即更低的有效劑量)，同時(shí)提高治療指數(shù)(“治療窗口”)。在示例性實(shí)施方案中，ADC化合物包含綴合(即通過(guò)接頭共價(jià)附接)至蒽環(huán)類藥物部分的半胱氨酸工程化的抗體。

本發(fā)明的抗體-藥物綴合物化合物包含通過(guò)二硫化物、接頭L和任選的間隔物Z共價(jià)附接至一個(gè)或多個(gè)蒽環(huán)類衍生物藥物部分D的抗體，化合物具有式II：

Ab-S-S-(Z_m-L-D)_p II

或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中：

Ab為結(jié)合至選自(1)-(53)的一個(gè)或多個(gè)腫瘤相關(guān)的抗原或細(xì)胞表面受體的抗體：

(1)BMPR1B(IB型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體)；

(2)E16(LAT1、SLC7A5)；

(3)STEAP1(六次跨膜的前列腺上皮抗原)；

(4)MUC16(0772P、CA125)；

(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核細(xì)胞強(qiáng)化因子、間皮素)；

(6)Napi2b(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質(zhì)載體家族34(磷酸鈉)、成員2、II型鈉依賴性磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3b)；

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因)；

(9)ETBR(內(nèi)皮縮血管肽B型受體)；

(10)MSG783(RNF124、假擬蛋白FLJ20315)；

(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬時(shí)型受體電位陽(yáng)離子通道、亞家族M、成員4)；

(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生的生長(zhǎng)因子)；

(14)CD21(CR2(補(bǔ)體受體2)或C3DR(C3d/愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒受體)或Hs 73792)；

(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相關(guān)β)、B29)；

(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有SH2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶錨定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；

(17)HER2；

(18)NCA；

(19)MDP；

(20)IL20Rα；

(21)短蛋白聚糖；

(22)EphB2R；

(23)ASLG659；

(24)PSCA；

(25)GEDA；

(26)BAFF-R(B細(xì)胞活化因子受體、BLyS受體3、BR3)；

(27)CD22(B細(xì)胞受體CD22-B同種型)；

(28)CD79a(CD79A、CD79α、免疫球蛋白相關(guān)α)；

(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受體1)；

(30)HLA-DOB(MHC II類分子的β亞基(Ia抗原))；

(31)P2X5(嘌呤能受體P2X配體門控離子通道5)；

(32)CD72(B細(xì)胞分化抗原CD72、Lyb-2)；

(33)LY64(淋巴細(xì)胞抗原64(RP105)、富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；

(34)FcRH1(Fc受體樣蛋白1)；

(35)FcRH5(IRTA2，免疫球蛋白超家族受體易位相關(guān)2)；

(36)TENB2(推定跨膜蛋白聚糖)；和

(37)PMEL17(銀同源物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；

(38)TMEFF1(具有EGF樣結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)卵泡抑素樣結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白1；腦腫瘤抑癌蛋白-1)；

(39)GDNF-Ra1(GDNF家族受體α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；

(40)Ly6E(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；

(41)TMEM46(shisa同源物2(非洲爪蟾)；SHISA2)；

(42)Ly6G6D(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座G6D；Ly6-D、MEGT1)；

(43)LGR5(富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5；GPR49、GPR67)；

(44)RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；

(45)LY6K(淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；

(46)GPR19(G蛋白偶聯(lián)的受體19；Mm.4787)；

(47)GPR54(KISS1受體；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；

(48)ASPHD1(含天冬氨酸β羥化酶結(jié)構(gòu)域的1；LOC253982)；

(49)酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；

(50)TMEM118(環(huán)指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；

(51)GPR172A(G蛋白偶聯(lián)的受體172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；

(52)CD33；以及

(53)CLL-1；

D為選自以下結(jié)構(gòu)的蒽環(huán)類衍生物：

其中波浪線表示與L的附接；

其中波浪線表示與D和Z的附接；并且

Z為選自以下的任選間隔物：-CH₂C(O)-、-CH₂C(O)NR(C₁-C₁₂亞烷基)-以及以下結(jié)構(gòu)：

R為H、C₁-C₁₂烷基或C₆-C₂₀芳基；

Z¹選自-(C₁-C₁₂亞烷基)-、-(C₂-C₈亞烯基)-、-(C₂-C₈亞炔基)-以及-(CH₂CH₂O)_n-，

m為0或1；

n為1至6；并且

p為1至8的整數(shù)。

表2抗體-藥物綴合物(ADC)

DAR＝藥物/抗體比平均值

A118C(EU編號(hào))＝A121C(順序編號(hào))＝A114C(Kabat編號(hào))

野生型(“WT”)，半胱氨酸工程化的突變抗體(“thio”)，輕鏈(“LC”)，重鏈(“HC”)，6-馬來(lái)酰亞氨基己酰基(“MC”)，馬來(lái)酰亞氨基丙?；?“MP”)，纈氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)，對(duì)氨基芐基(“PAB”)和對(duì)氨基芐氧基羰基(“PABC”)。

表3不可裂解的、非二硫化物比較物ADC：

體外細(xì)胞增殖測(cè)定

通常，通過(guò)以下方式測(cè)量抗體-藥物綴合物(ADC)的細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制活性：使具有受體蛋白例如HER2的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于細(xì)胞培養(yǎng)基中的ADC的抗體；將細(xì)胞培養(yǎng)約6小時(shí)至約5天的時(shí)期；并且測(cè)量細(xì)胞活力?；诩?xì)胞的體外測(cè)定用于測(cè)量本發(fā)明的ADC的活力(增殖)、細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)(半胱天東酶活化)。

通過(guò)細(xì)胞增殖測(cè)定來(lái)測(cè)量抗體-藥物綴合物(ADC)的體外效力(實(shí)施例4)。本發(fā)明的ADC在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面示出驚人和不可預(yù)料的效力。ADC的效力與細(xì)胞的靶抗原表達(dá)相關(guān)。測(cè)試的綴合物能夠結(jié)合表達(dá)在細(xì)胞表面上的特異性抗原并且在體外引起那些細(xì)胞的死亡。

發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定為商業(yè)上可獲得的(Promega公司,Madison,WI)，基于鞘翅目(Coleoptera)熒光素酶的重組表達(dá)的均相測(cè)定方法(US 5583024；US5674713；US5700670)。此細(xì)胞增殖測(cè)定基于對(duì)存在的ATP(一種代謝活性細(xì)胞的指示物)的定量來(lái)確定培養(yǎng)物中存活細(xì)胞的數(shù)量(Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US 6602677)。測(cè)定在96孔板中進(jìn)行，使其易于自動(dòng)化高通量篩選(HTS)(Cree等(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404)。均相測(cè)定操作涉及將單一試劑(試劑)直接添加至在補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中。不需要細(xì)胞洗滌、去除培養(yǎng)基和多個(gè)移液步驟。在添加試劑并且混合之后，系統(tǒng)用10分鐘在384孔形式下檢測(cè)少至15個(gè)細(xì)胞/孔。可以用ADC連續(xù)處理細(xì)胞，或可以對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行處理并且與ADC分離。通常，短暫處理(即3小時(shí))的細(xì)胞示出與連續(xù)處理的細(xì)胞相同的效力。

均一的“添加-混合-測(cè)量”形式引起細(xì)胞裂解并且產(chǎn)生與存在的ATP量成正比的發(fā)光信號(hào)。ATP的量直接與培養(yǎng)物中存在的細(xì)胞數(shù)量成正比。測(cè)定產(chǎn)生由熒光素酶反應(yīng)產(chǎn)生的“輝光型”發(fā)光信號(hào)，根據(jù)細(xì)胞類型和所使用的培養(yǎng)基，其具有通常大于五小時(shí)的半衰期。以相對(duì)發(fā)光單位(RLU)來(lái)反應(yīng)存活細(xì)胞。通過(guò)重組熒火蟲(chóng)熒光素酶與伴隨的ATP至AMP轉(zhuǎn)化和光子產(chǎn)生來(lái)對(duì)底物甲蟲(chóng)熒光素進(jìn)行氧化性脫羧。

基于細(xì)胞的體外測(cè)定用于測(cè)量本發(fā)明的ADC的活力(增殖)、細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)(半胱天東酶活化)。通常，通過(guò)以下方式測(cè)量抗體-藥物綴合物(ADC)的細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制活性：使表達(dá)抗原諸如Her2或MUC16多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于細(xì)胞培養(yǎng)基中的ADC；將細(xì)胞培養(yǎng)約6小時(shí)至約5天的時(shí)期；并且測(cè)量細(xì)胞活力。有用于抗MUC16 ADC的細(xì)胞增殖測(cè)定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括：(1)MUC16多肽表達(dá)細(xì)胞系OVCAR-3；(2)被工程化成穩(wěn)定表達(dá)其細(xì)胞表面上的MUC16的一部分的PC3衍生的細(xì)胞系(PC3/MUC16)；(3)不表達(dá)MUC16多肽的親本PC3細(xì)胞系；和(4)不表達(dá)MUC16多肽但攜帶用于驅(qū)動(dòng)外源性MUC16表達(dá)的載體的PC3細(xì)胞系(PC3/neo)。

圖1示出在5天時(shí)SK-BR-3體外細(xì)胞活力對(duì)Thio Hu抗Her2 7C2 HC A118C-(LD-57)114、Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-57)109和Thio Hu抗CD33 15G15.3 LC K149C-(LD-57)110的濃度(μg/ml)的曲線圖中的抗體-藥物綴合物的功效。Her2抗原高度表達(dá)在SK-BR-3細(xì)胞中?？笻er2 ADC 114和抗Her2 ADC 109示出線性的、劑量響應(yīng)的細(xì)胞殺傷活性。輕鏈K149C突變ADC 109示出與重鏈A118C突變ADC 114相比相同或稍微更有效的細(xì)胞殺傷活性。對(duì)照、脫靶的抗CD33 ADC 110示出較低的活性。

圖2示出在5天時(shí)SK-BR-3體外細(xì)胞活力與Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-59)116、Thio Hu抗Her2 7C2 LC K149C-(LD-57)109和Thio Hu抗CD33 15G15.3 LC K149C-(LD-59)115的濃度(μg/ml)的曲線圖中的抗體-藥物綴合物的功效?？笻er2 ADC 116和抗Her2 ADC 109示出線性的、劑量響應(yīng)的細(xì)胞殺傷活性。具有未取代的、位阻較小的乙基二硫化物接頭109的抗體-藥物綴合物109示出與甲基取代的、較大位阻的二硫化物接頭ADC-116相比相同或稍微更有效的細(xì)胞殺傷活性。

體內(nèi)功效

可以通過(guò)小鼠中的腫瘤異種移植物研究來(lái)測(cè)量本發(fā)明的抗體-藥物綴合物(ADC)的體內(nèi)功效(實(shí)施例22)。通過(guò)小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)抑制來(lái)測(cè)量抗體-藥物綴合物(ADC)的體內(nèi)功效(實(shí)施例21)。本發(fā)明的ADC在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面示出驚人和不可預(yù)料的效力。ADC的功效與腫瘤細(xì)胞的靶抗原表達(dá)相關(guān)。

通過(guò)將癌細(xì)胞的同種移植物或異種移植物植入在嚙齒動(dòng)物中并且用ADC處理腫瘤來(lái)體內(nèi)測(cè)量抗體-藥物綴合物的功效。取決于細(xì)胞系、ADC與存在于癌細(xì)胞上的受體的抗體結(jié)合特異性、給藥方案和其他因素來(lái)預(yù)期可變結(jié)果。使用表達(dá)中等水平至高水平腫瘤相關(guān)的抗原諸如Her2、MUC16和CD33的轉(zhuǎn)基因外植體小鼠模型來(lái)測(cè)量ADC的體內(nèi)功效。用ADC治療受試者一次并且在3-6周內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以便測(cè)量腫瘤倍增時(shí)間、對(duì)數(shù)細(xì)胞殺傷和腫瘤萎縮。進(jìn)行后續(xù)的劑量-響應(yīng)和多劑量實(shí)驗(yàn)。

例如，可以通過(guò)高表達(dá)HER2轉(zhuǎn)基因外植體小鼠模型來(lái)測(cè)量本發(fā)明的抗HER2ADC的體內(nèi)功效(Phillips等(2008)Cancer Res.68:9280-90)。同種移植物由Fo5mmtv轉(zhuǎn)基因小鼠增殖，所述小鼠不響應(yīng)于或較差地響應(yīng)于療法。用特定劑量水平(mg/kg)的ADC和安慰劑緩沖液對(duì)照(媒介物)治療受試者一次并且在兩周或更多的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以便測(cè)量腫瘤倍增時(shí)間、對(duì)數(shù)細(xì)胞殺傷和腫瘤萎縮。

抗HER2 7C2抗體-藥物綴合物138和抗HER2 7C2抗體-藥物綴合物109示出對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的劑量依賴性作用。非特異性抗CD33抗體-藥物綴合物139和抗CD33抗體-藥物綴合物110示出較小或沒(méi)有腫瘤生長(zhǎng)抑制。

比較物ADC曲妥珠單抗emtansine(曲妥珠單抗-MCC-DM1(T-DM1)141位抗體-藥物綴合物(CAS登記號(hào)139504-50-0；Phillips G.等(2008)Cancer Res.68:9280-90)，并且具有以下結(jié)構(gòu)：

抗HER2 7C2抗體-藥物綴合物109示出對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的劑量依賴性作用。非特異性抗CD33抗體-藥物綴合物110在1mg/kg下示出較小的腫瘤生長(zhǎng)抑制并且在3mg/kg下示出中等的腫瘤生長(zhǎng)抑制?？笻ER2 7C2抗體-藥物綴合物109示出在等效劑量(3mg/kg)或在較高的10mg/kg劑量下比抗HER2 4D5曲妥珠單抗emtansine 141更高的功效(Phillips G.等(2008)Cancer Res.68:9280-90)。

藥物制劑

本發(fā)明的治療性抗體-藥物綴合物(ADC)的藥物制劑通常被制備用于使用藥學(xué)上可接受的腸胃外媒介物并且以單位可注射劑型進(jìn)行腸胃外施用，即快速推注、靜脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)注射。具有所需純度的抗體-藥物綴合物(ADC)任選與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.編著)，以凍干制劑或水溶液的形式。

抗體-藥物綴合物治療方法

想到本發(fā)明的抗體-藥物綴合物(ADC)可用于治療例如其特征在于腫瘤抗原的過(guò)表達(dá)的各種疾病或病癥。示例性病狀或過(guò)度增殖性病癥包括良性或惡性實(shí)體瘤和造血病癥諸如白血病和淋巴惡性腫瘤。其他病癥包括神經(jīng)元的、神經(jīng)膠質(zhì)的、星形膠質(zhì)的、下丘腦的、腺的、巨噬細(xì)胞的、上皮的、基質(zhì)的、囊胚的、炎癥性的、血管生成的和免疫學(xué)的包括自身免疫的病癥。

可以通過(guò)任何適合于待治療的病狀的途徑來(lái)施用本發(fā)明的抗體-藥物綴合物(ADC)。ADC將通常腸胃外地施用，即輸注、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、鞘內(nèi)和硬膜外。

通常，待治療的疾病或病癥為過(guò)度增殖性疾病諸如癌癥。本文中待治療的癌癥的實(shí)例包括，但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。此類癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌(例如，上皮鱗狀細(xì)胞癌)、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺部腺癌和肺部鱗癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、包括胃腸癌的胃癌(gastric cancer)或胃部癌(stomach cancer)、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer)或腎臟癌(renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛口癌、陰莖癌以及頭頸癌。

可以使用ADC化合物治療的自身免疫疾病包括風(fēng)濕性病癥(諸如例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、斯耶格倫氏綜合征(syndrome)、硬皮病、狼瘡諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和狼瘡腎炎、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血癥、抗磷脂抗體綜合征和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎)、骨關(guān)節(jié)炎、自身免疫腸胃和肝臟病癥(諸如例如炎癥性腸病(例如，潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)、自身免疫胃炎和惡性貧血、自身免疫肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎和乳糜瀉)、脈管炎(諸如例如ANCA相關(guān)的脈管炎，包括丘-施二氏血管炎(Churg-Strauss vasculitis)、韋格納肉芽腫(Wegener's granulomatosis)和多動(dòng)脈炎)、自身免疫神經(jīng)病癥(諸如例如多發(fā)性硬化、眼陣攣-肌陣攣綜合征、重癥肌無(wú)力、視神經(jīng)脊髓炎、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病和自身免疫多發(fā)性神經(jīng)病)、腎病癥(諸如例如腎小球腎炎、古德帕斯丘綜合征和貝格爾氏病)、自身免疫皮膚病癥(諸如例如，牛皮癬、蕁麻疹、麻疹、尋常性天皰瘡、大皰性類天皰瘡和皮膚紅斑狼瘡)、血液學(xué)病癥(諸如例如血小板減少性紫癜、血栓形成性血小板減少性紫癜、輸血后紫癜和自身免疫溶血性貧血)、動(dòng)脈粥樣硬化、葡萄膜炎、自身免疫聽(tīng)力疾病(諸如例如內(nèi)耳疾病和聽(tīng)力損失)、貝切特氏病、雷諾氏綜合征、器官移植和自身免疫內(nèi)分泌病癥(諸如例如，糖尿病相關(guān)的自身免疫疾病諸如胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、阿狄森病和自身免疫甲狀腺疾病(例如，格雷夫斯病和甲狀腺炎))。更優(yōu)選的此類疾病包括，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、ANCA相關(guān)的脈管炎、狼瘡、多發(fā)性硬化、斯耶格倫氏綜合征、格雷夫斯病、IDDM、惡性貧血、甲狀腺炎和腎小球腎炎。

為了預(yù)防或治療疾病，ADC的適當(dāng)劑量將取決于如上所定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重性和病程、分子是否出于預(yù)防或治療的目的施用、先前療法、患者的臨床史和對(duì)抗體的反應(yīng)以及主治醫(yī)師的判斷。一次性或經(jīng)過(guò)一系列治療將分子合適地施用至患者。取決于疾病的類型和嚴(yán)重性，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的分子為用于施用至患者的初始候選劑量，無(wú)論例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的施用或通過(guò)連續(xù)輸注。通常的日劑量范圍可以為約1μg/kg至100mg/kg或更多，這取決于上面提到的因素。待施用至患者的ADC的示例性劑量在約0.1至約10毫克/患者重量千克數(shù)的范圍內(nèi)。

制品

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供含有用于治療以上所述的病癥的材料的制品或“試劑盒”。制品包括容器和在容器上或與容器相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁(yè)。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包裝等。容器可以由諸如玻璃或塑料的各種材料形成。容器裝有有效于治療病狀的抗體-藥物綴合物(ADC)組合物，并且可以具有無(wú)菌入口(例如，容器可為具有皮下注射針頭可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶)。組合物中的至少一種活性劑為ADC。標(biāo)簽或包裝插頁(yè)指示組合物用于治療所選的病狀，諸如癌癥?；蛘呋蛄硗?，制品還可以包括第二(或第三)容器，所述容器包含藥學(xué)上可接受的緩沖液，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer's)溶液和葡萄糖溶液。它還可以包括在商業(yè)和使用者看來(lái)所需的其他材料，包括其他緩沖液、稀釋劑、過(guò)濾器、針頭和注射器。

實(shí)施例

實(shí)施例1蒽環(huán)類二硫化物、接頭-藥物(LD)中間體(表1)的合成。

LD-51：(2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-6,11-二氧代-N-[2-(2-吡啶基二硫烷基)乙基]-3,4-二氫-1H-并四苯-2-甲酰胺

根據(jù)US 8389697的實(shí)施例3，向WO 1998/02446和US 8470984的實(shí)施例1中報(bào)道所制備的PNU-159682(15.3mg，0.02038mmol)在3ml的甲醇和2ml的H₂O中的溶液中添加NaIO₄(5.1mg，0.0238mmol)在1ml的H₂O中的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，直到不可檢查到起始材料(TLC和HPLC分析)。_在減壓下去除溶劑，并且粗紅色固體(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-吡喃并[4',3':4,5][1,3]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基]氧基}-6,11-二氧代-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-羧酸51a無(wú)需進(jìn)一步純化用于下一步驟。MS(ESI)：628[M+H]⁺。

在氬氣氣氛下，向粗中間體51a在無(wú)水二氯甲烷中的溶液中添加無(wú)水三乙胺、TBTU(O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸鹽，又稱為：N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲四氟硼酸鹽，CAS號(hào)125700-67-6，Sigma-Aldrich B-2903)和N-羥基琥珀酰亞胺，以便形成51a的中間體NHS酯?；蛘?，可以使用其他偶聯(lián)試劑諸如DCC或EDC。在一小時(shí)之后，添加2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙胺鹽酸鹽(CAS號(hào)106139-15-5)。將反應(yīng)混合物在室溫?cái)嚢?0min，直到起始材料消失(HPLC-MS分析)。在真空下蒸發(fā)溶劑并且然后通過(guò)在硅膠上進(jìn)行快速柱色譜法來(lái)純化，得到51。MS(ESI)：796.88[M+H]⁺。

LD-52：N-[2-[[2-[(2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-基]-2-氧代-乙氧基]羰基-甲基-氨基]乙基]-N-甲基-氨基甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)乙酯的合成

2-[(2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-基]-2-氧代-乙基]N-甲基-N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸酯52a根據(jù)PNU-159682，使用三光氣(Cl₃CO)₂C＝O和N1,N2-二甲基乙-1,2-二胺來(lái)制備。

在室溫下，將1,2-二(吡啶-2-基)二硫烷和2-巰基乙醇在吡啶和甲醇中反應(yīng)，得到2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙醇。用4-硝基苯基羰氯化物在三乙胺和乙腈中進(jìn)行酰化得到4-硝基苯基2-(吡啶-2-基二硫烷基)乙基碳酸酯52b。將中間體52a與52b反應(yīng)以便形成LD-52。

LD-53：[2-甲基-2-(2-吡啶基二硫烷基)丙基]N-[2-[[2-[(2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-基]-2-氧代-乙氧基]羰基-甲基-氨基]乙基]-N-甲基-氨基甲酸酯的合成

根據(jù)用于LD-52的程序，將中間體52a與2-甲基-2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙基4-硝基苯基碳酸酯進(jìn)行酰化，得到LD-53。

LD-54：(2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-N-[2-甲基-2-(2-吡啶基二硫烷基)丙基]-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-甲酰胺的合成

根據(jù)用于LD-51的程序，在氬氣氣氛下將無(wú)水二氯甲烷中的粗中間體51a與無(wú)水三乙胺、TBTU和2-甲基-2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙-1-胺反應(yīng)，得到LD-54。

LD-55：(2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-N-[2-甲基-2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]丙基]-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-甲酰胺的合成

根據(jù)用于LD-60的程序，將5-硝基吡啶-2-硫醇60a添加至LD-54在DMF中的溶液中，得到LD-55。

LD-56：N-甲基-N-[2-[甲基-[2-氧代-2-[2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-[(9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基)氧基]-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-基]乙氧基]羰基-氨基]乙基]氨基甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)丙酯的合成

根據(jù)用于LD-52的程序，將中間體52a與4-硝基苯基2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙基碳酸酯進(jìn)行?；?，得到LD-56。

LD-57：(2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-N-[2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]乙基]-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-甲酰胺的合成

向1,2-二(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷57a(1.0g，3.22mmol)在無(wú)水DMF/MeOH(25mL/25mL)中的混合物中添加HOAc(0.1mL)，接著添加2-氨基乙硫醇鹽酸鹽57b(183mg，1.61mmol)。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜之后，在真空下對(duì)其進(jìn)行濃縮以去除溶劑，并且用DCM(30mL×4)洗滌殘余物，得到呈淡黃色固體的2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基)乙胺鹽酸鹽57c(300mg，69.6％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.28(d,J＝2.4Hz,1H),8.56(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.24(s,4H),8.03(d,J＝8.8Hz,1H),3.15-3.13(m,2H),3.08-3.06(m,2H)

如上制備中間體51a?；蛘撸騊NU-159682(50mg，0.078mmol)在MeOH/H₂O(5mL/5mL)中的懸浮液中添加NaIO₄(17mg，0.078mmol)在H₂O(2mL)中的溶液。在室溫下，在黑暗中將非均質(zhì)的反應(yīng)混合物劇烈攪拌4h。然后在真空下濃縮混合物，并且通過(guò)在硅膠上進(jìn)行柱色譜法來(lái)純化殘余物(DCM/MeOH＝100/1至10/1)，得到呈紫色固體的中間體51a(40mg，80％)。

向中間體51a(40mg，0.064mmol)在無(wú)水DCM(5mL)中的溶液中添加DIEA(41mg，0.32mmol)和HATU(為O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽，73mg，0.19mmol)。在室溫下將混合物攪拌0.5h之后，添加中間體57c(51mg，0.19mmol)。在室溫下將所得到的混合物再攪拌4h。通過(guò)制備型TLC(DCM/MeOH＝20/1)來(lái)純化混合物，得到呈紫色固體的LD-57(18mg，33.3％)。LCMS(ESI)：RT＝0.890min，M+H⁺＝841.2.，方法＝5-95AB/1.5min。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ13.94(s,1H),13.30(s,1H),9.33(d,J＝2.0Hz,1H),8.40(dd,J＝9.2,2.4Hz,1H),8.22(t,J＝6.0Hz,1H),8.04(J＝7.6Hz,1H),7.80-7.76(m,2H),7.40(d,J＝8.8Hz,1H),5.52(d,J＝5.6Hz,1H),5.34(s,1H),5.30(s,1H),5.22(s,1H),4.69(d,J＝1.6Hz,1H),4.47(d,J＝0.8Hz,1H),4.10(s,3H),4.07-4.01(m,2H),3.91(t,J＝9.6Hz,1H),3.74(s,2H),3.70-3.55(m,4H),3.45(s,3H),3.41-3.38(m,1H),3.25(d,J＝2.4Hz,2H),3.05(t,J＝6.0Hz,2H),2.83-2.80(m,1H),2.73-2.68(m,1H),2.52-2.48(m,1H),2.41-2.36(m,1H),2.05-1.98(s,1H),1.81-1.75(m,1H),1.36(d,J＝6.0Hz,3H)

LD-58：N-[2-[[2-[(2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-基]-2-氧代-乙氧基]羰基-甲基-氨基]乙基]-N-甲基-氨基甲酸2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]乙酯的合成

在室溫下，將1,2-二(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷57a(9.6g，30.97mmol)和2-巰基乙醇(1.21g，15.49mmol)在無(wú)水DCM/CH₃OH(250mL/250mL)中的溶液在N₂下攪拌24h。在真空下濃縮混合物之后，接著用DCM(300mL)稀釋殘余物。添加MnO₂(10g)并且在室溫下將混合物再攪拌0.5h。通過(guò)在硅膠上進(jìn)行柱色譜法來(lái)純化混合物(DCM/MeOH＝100/1至100/1)，得到呈棕色油狀物的2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基)乙醇58a(2.2g，61.1％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.33(d,J＝2.8Hz,1H),8.38-8.35(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),7.67(d,J＝9.2Hz,1H),4.10(t,J＝7.2Hz,1H),3.81-3.76(q,2H),3.01(t,J＝5.2Hz,2H)。

向58a(500mg，2.15mmol)在無(wú)水DMF(10mL)中的溶液中添加DIEA(834mg，6.45mmol)，接著添加PNP碳酸酯(二(4-硝基苯基)碳酸酯，1.31g，4.31mmol)。在室溫下將反應(yīng)溶液攪拌4h，并且通過(guò)制備型HPLC(FA)來(lái)純化混合物，得到呈淺棕色油狀物的4-硝基苯基2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基)乙基碳酸酯58b(270mg，33.1％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.30(d,J＝2.4Hz,1H),8.43-8.40(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),8.30-8.28(m,2H),7.87(d,J＝8.8Hz,1H),7.39-7.37(m,2H),4.56(t,J＝6.4Hz,2H),3.21(t,J＝6.4Hz,2H)。

[2-[(2S,4S)-4-[[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基]氧基]-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-基]-2-氧代-乙基]N-甲基-N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸酯52a根據(jù)PNU通過(guò)對(duì)Bpoc保護(hù)的58c進(jìn)行去保護(hù)來(lái)制備，其中Bpoc為2-(對(duì)聯(lián)苯基)-2-丙基氧基羰基。向58c(25mg，0.025mmol)(其中胺被2-(4-聯(lián)苯基)-丙-2-基4′-甲氧基羰基苯基碳酸酯(BPOC試劑，Sigma-Aldrich，CAS登記號(hào)31140-37-1)保護(hù))在無(wú)水DCM(4mL)中的溶液中添加二氯乙酸(Cl₂CHCOOH，65mg，0.50mmol)在無(wú)水DCM(1mL)中的溶液。在室溫下將反應(yīng)溶液攪拌2h。在真空下濃縮溶液，并且用甲基叔丁基醚(MTBE，10mL×2)洗滌殘余物，得到呈紅色固體的52a(25mg，100％)。

向52a(25mg，0.025mmol)和4-硝基苯基2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基)乙基碳酸酯58b(30mg，0.075mmol)在無(wú)水DMF(3mL)中的溶液中添加TEA(三乙胺，25mg，0.25mmol)。在室溫下將溶液攪拌過(guò)夜之后，在真空下對(duì)其進(jìn)行濃縮并且通過(guò)制備型TLC(DCM/MeOH＝20/1)來(lái)純化殘余物，得到呈紅色固體的LD-58(12mg，48.0％)。LCMS(ESI)：RT＝0.921min，M+Na⁺＝1036.2。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ13.88(s,1H),13.24(d,J＝4.0Hz,1H),9.26-9.25(m,1H),8.40(d,J＝6.0Hz,1H),8.01(d,J＝7.6Hz,1H),7.89(d,J＝8.8Hz,1H),7.77(t,J＝8.0Hz,1H),7.38(d,J＝8.4Hz,1H),5.47(s,1H),5.30-5.23(m,2H),5.15-5.11(m,1H),4.92-4.87(m,1H),4.70(s,1H),4.47(s,1H),4.35(s,2H),4.10-4.03(m,4H),3.92-3.87(m,1H),3.59-3.40(m,8H),3.25-3.22(m,1H),3.12-3.10(m,2H),3.04(s,2H),3.98(t,J＝8.8Hz,4H),2.84-2.82(m,2H),2.60(d,J＝14.8Hz,1H),2.07-1.98(m,1H),1.76-1.72(m,1H),1.41(d,J＝5.6Hz,3H)。

LD-59：2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-[(9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基)氧基]-N-[2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]丙基]-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-甲酰胺的合成

向1-氨基丙-2-醇59a(10g，133mmol)在MeOH(360mL)和H₂O(40mL)中的攪拌溶液中添加Boc₂O(37g，169mmol)。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌5h之后，對(duì)其進(jìn)行濃縮并且通過(guò)色譜法來(lái)純化(EtOAc/PE＝10％-50％)，得到呈無(wú)色油狀物的2-羥基丙基氨基甲酸叔丁酯59b(19.8g，產(chǎn)率：85％)。

向59b(10g，57mmol)和Et₃N(17g，171mmol)在DCM(130mL)中的攪拌溶液中添加MsCl(甲磺酰氯，13g，114mmol)的溶液。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌4h之后，用冰水(200mL x 3)和鹽水(200mL)對(duì)其進(jìn)行洗滌。濃縮有機(jī)層，得到呈紅色油狀物的1-(叔丁氧基羰基氨基)丙烷-2-基甲磺酸酯59c(12g，產(chǎn)率：83％)。

向59c(6g，23.7mmol)在丙酮(70mL)中的攪拌溶液中添加硫代乙酸鉀(硫代乙酸鉀，5.4g，47.3mmol)在H₂O(100mL)中的溶液。在60℃下將反應(yīng)混合物攪拌12h。濃縮混合物并且用DCM(200ml x 2)萃取。濃縮合并有機(jī)層并且通過(guò)色譜法來(lái)純化，得到呈紅色固體的S-1-(叔丁氧基羰基氨基)丙烷-2-基硫代乙酸酯59d(1.1g，產(chǎn)率：20％)。¹H NMR(400MHz,CDCl3-d)δ1.30(d,J＝7.09Hz,3H)1.44(s,9H)2.33(s,3H)3.16-3.42(m,2H)3.58-3.71(m,1H)

向59d(500mg，2.15mmol)在MeOH(5mL)中的攪拌溶液中逐滴添加HCl/MeOH(10mL)。在室溫下將反應(yīng)混合物攪拌3h之后，對(duì)其進(jìn)行濃縮，得到直接用于下一步的1-氨基丙-2-硫醇鹽酸鹽59e。

向57a(1.33g，4.3mmol)在DCM(35mL)中的溶液中添加59e(273mg，2.15mmol)的溶液。在15℃下將混合物攪拌12h。將MnO₂(374.1mg，4.3mmol)添加至混合物并且在15℃下攪拌10min。用DCM(100mL)和MeOH(30mL x 3)洗滌固體。濃縮溶液，得到呈黃色固體的2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基)丙-1-胺59f(300mg，57％)。LCMS(ESI)：RT＝0.546min，M+H⁺＝245.7。

向中間體51a(25mg，0.040mmol)在無(wú)水DCM/DMF(5mL)中的溶液中添加DIEA(二異丙基乙胺，26mg，0.20mmol)和HATU(為O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸鹽，46mg，0.12mmol)。在室溫下將混合物攪拌0.5h之后，添加59f(34mg，0.12mmol)。在室溫下將所得到的混合物再攪拌4h。將混合物用DCM(30mL)稀釋并且用鹽水(15mL×3)洗滌。對(duì)DCM層進(jìn)行干燥(Na₂SO₄)，過(guò)濾并且濃縮。通過(guò)制備型TLC(DCM/MeOH＝20/1)來(lái)純化殘余物，得到呈紫色固體的LD-59(7mg，20.6％)。LCMS(ESI)：RT＝0.783min，M+H⁺＝855.2。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ13.94(d,J＝3.6Hz,1H),13.32(d,J＝4.8Hz,1H),9.33(s,1H),8.63-8.47(m,1H),8.39-8.35(m,1H),8.04(d,J＝7.6Hz,1H),7.78(J＝8.0Hz,1H),7.74-7.71(dd,J＝8.8,5.6Hz,1H),7.39(d,J＝8.8Hz,1H),5.52(d,J＝5.2Hz,1H),5.35(s,1H),5.27(d,J＝4.8Hz,1H),4.68(d,J＝4.4Hz,1H),4.46(d,J＝8.0Hz,1H),4.10(s,3H),4.06(d,J＝7.6Hz,1H),3.92(t,J＝7.8Hz,2H),3.71-3.67(m,1H),3.59-3.55(m,2H),3.45(d,J＝6.4Hz,3H),3.41-3.36(m,1H),3.28-3.22(m,3H),2.84-2.60(m,2H),2.53-2.37(m,2H),2.06-1.94(m,1H),1.81-1.77(m,1H),1.40-1.38(dd,J＝6.4,2.4Hz,3H),1.35(t,J＝6.0Hz,3H)

LD-60：[2-氧代-2-[2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-[(9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基)氧基]-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-基]乙基]N-甲基-N-[2-[甲基-[2-[(5-硝基-2-吡啶基)二硫烷基]丙氧基羰基]氨基]乙基]氨基甲酸酯的合成

向N-甲基-N-[2-[甲基-[2-氧代-2-[2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-[(9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基)氧基]-6,11-二氧代-3,4-二氫-1H-并四苯-2-基]乙氧基]羰基-氨基]乙基]氨基甲酸2-(2-吡啶基二硫烷基)丙酯LD-56(10mg，10.17umol)在DMF(1mL)中的溶液中添加5-硝基吡啶-2-硫醇60a(15.89mg，101.72umol)在20℃下的溶液。在20℃下將反應(yīng)混合物攪拌2h。用DCM(10mL)稀釋反應(yīng)混合物并且然后用水(5mL)、NaHCO₃水溶液(5mL)和鹽水(5mL)洗滌。對(duì)有機(jī)層進(jìn)行干燥并且濃縮。通過(guò)制備型TLC(DCM:MeOH＝25:1)來(lái)純化殘余物，得到呈紅色固體的純LD-60(7mg，66.94％)。LCMS：(10-80,CD,7.0min),3.782min，Ms＝1028.2(M+1)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ13.83(s,1H),13.19(s,1H),9.18(s,1H),8.31(d,1H,J＝7.6Hz),7.97(d,1H,J＝8.0Hz),7.86(d,1H,J＝8.4Hz),7.73(t,1H,J＝8.4Hz),7.33(d,1H,J＝8.4Hz),5.41(s,1H),5.29-5.05(m,3H),4.89-4.75(m,1H),4.64(s,1H),4.40(s,1H),4.13(s,2H),4.09–3.80(m,6H),3.58–3.12(m,12H),3.05–2.85(m,7H),2.78–2.42(m,3H),2.12–1.85(m,2H),1.72–1.55(m,1H),1.38-1.25(m,6H)

LD-61：2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-[(9-甲氧基-1-甲基-3,4,4a,6,7,9,9a,10a-八氫-1H-吡喃并[1,2]噁唑并[3,4-b][1,4]噁嗪-3-基)氧基]-6,11-二氧代-N-[2-(2-吡啶基二硫烷基)丙基]-3,4-二氫-1H-并四苯-2-甲酰胺的合成

根據(jù)用于LD-51的程序，在氬氣氣氛下將無(wú)水二氯甲烷中的粗中間體51a與無(wú)水三乙胺、TBTU和2-(吡啶-2-基二硫烷基)丙-1-胺反應(yīng)，得到LD-61。

LD-62：(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-吡喃并[4',3':4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-N-((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基)丙基)-6,11-二氧代-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲酰胺的合成

根據(jù)用于LD-59的程序，制備LD-62。

LD-63：(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-吡喃并[4',3':4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-N-((S)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基)丙基)-6,11-二氧代-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲酰胺的合成

根據(jù)用于LD-59的程序，制備LD-63。

實(shí)施例2通過(guò)還原和再氧化制備用于綴合的半胱氨酸工程化的抗體

在特定條件下，半胱氨酸工程化的抗體可被制成對(duì)與本發(fā)明的接頭-藥物中間體(諸如表1中的那些)綴合有反應(yīng)性的，這通過(guò)用還原劑諸如DTT(Cleland試劑，二硫蘇糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽；Getz等(1999)Anal.Biochem.第273卷:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)在具有2mM EDTA的50mM Tris pH 7.5中，在37℃下處理3小時(shí)或在室溫下處理過(guò)夜來(lái)實(shí)現(xiàn)。還原表達(dá)在CHO細(xì)胞中的全長(zhǎng)、半胱氨酸工程化的單克隆抗體(THIOMAB^TM)(Gomez等(2010)Biotechnology and Bioeng.105(4):748-760；Gomez等(2010)Biotechnol.Prog.26:1438-1445)，例如使用約50倍過(guò)量的DTT在室溫下過(guò)夜來(lái)還原二硫化物鍵，所述二硫鍵可在新引入的半胱氨酸殘基與存在于培養(yǎng)基中的半胱氨酸之間形成。稀釋還原的THIOMAB^TM并且用10mM乙酸鈉(pH 5)負(fù)載到HiTrap S柱上，并且用含有0.3M的氯化鈉的PBS洗脫?；蛘?，通過(guò)添加1/20體積的10％乙酸來(lái)酸化抗體，用10mM琥珀酸鹽pH 5稀釋，負(fù)載到柱上并且然后用10個(gè)柱體積的琥珀酸鹽緩沖液洗滌。用50mM Tris pH7.5、2mM EDTA洗脫柱。

根據(jù)Kabat編號(hào)輕鏈氨基酸(Kabat等,Sequences of proteins of immunological interest,(1991)第5版,US Dept of Health and Human Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD)。根據(jù)EU編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)重鏈氨基酸(Edelman等(1969)Proc.Natl.Acad.of Sci.63(1):78-85)，除了在標(biāo)注為Kabat系統(tǒng)的地方。使用單字母氨基酸縮寫。

表達(dá)在CHO細(xì)胞中的全長(zhǎng)、半胱氨酸工程化的單克隆抗體(THIOMAB^TM)由于細(xì)胞培養(yǎng)條件而在工程化的半胱氨酸上具有半胱氨酸加合物(胱氨酸)或在工程化的半胱氨酸上進(jìn)行谷胱甘肽化。為了釋放工程化的半胱氨酸的反應(yīng)性巰基基團(tuán)，將THIOMAB^TM溶解于約pH 8.0下的500mM硼酸鈉和500mM氯化鈉中，并且用約50-100倍過(guò)量的1mM TCEP(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(Getz等(1999)Anal.Biochem.第273卷:73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)在37℃下還原約1-2小時(shí)?；蛘?，可以使用DTT作為還原劑。通過(guò)非還原性SDS-PAGE或通過(guò)變性反相HPLC PLRP柱色譜法來(lái)監(jiān)測(cè)鏈間二硫鍵的形成。稀釋還原的THIOMAB^TM并且用10mM乙酸鈉(pH 5)負(fù)載到HiTrap SP FF柱上，并且用含有0.3M氯化鈉的PBS或含有150mM氯化鈉的50mM Tris-Cl(pH 7.5)洗脫。

通過(guò)進(jìn)行再氧化，在存在于親本Mab中的半胱氨酸殘基之間重新建立二硫鍵。洗脫的還原的THIOMAB^TM用pH 7下的15X或2mM脫氫抗壞血酸(dhAA)處理約3小時(shí)，或在50mM Tris-Cl(pH 7.5)中處理約3小時(shí)，或在室溫下用200nM至2mM硫酸銅水溶液(CuSO₄)處理過(guò)夜?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的其他氧化劑(oxidant)，即氧化劑(oxidizing agent)和氧化條件。周圍空氣氧化也可為有效的。此溫和的、部分的再氧化步驟可高保真地高效形成鍵內(nèi)二硫化物。緩沖液通過(guò)由Sephadex G25樹(shù)脂洗脫來(lái)進(jìn)行交換并且用含有1mM DTPA的PBS洗脫。通過(guò)確定來(lái)自溶液的280nm處的吸光度的還原抗體濃度和通過(guò)與DTNB(Aldrich,Milwaukee,WI)反應(yīng)和確定412nm處的吸光度確定硫醇濃度來(lái)檢驗(yàn)硫醇/Ab值。

在具有延長(zhǎng)質(zhì)量范圍的TSQ Quantum Triple quadrupole^TM質(zhì)譜儀(Thermo Electron,San Jose California)上進(jìn)行液相色譜法/質(zhì)譜分析。在加熱至75℃的1000A微內(nèi)徑柱(50mm×2.1mm，Polymer Laboratories，Shropshire，UK)上對(duì)樣品進(jìn)行色譜分離。使用30％-40％B(溶劑A：0.05％水中的TFA，溶劑B：0.04％乙腈中的TFA)的線性梯度，并且使用電噴霧源對(duì)洗脫物進(jìn)行直接離子化。通過(guò)數(shù)據(jù)系統(tǒng)收集數(shù)據(jù)，并且使用(Novatia,LLC,New Jersey)進(jìn)行去卷積。在LC/MS分析之前，用肽N-糖苷酶F(2個(gè)單位/毫升；PROzyme,San Leandro,CA)在37℃下處理抗體或藥物綴合物(50微克)持續(xù)2小時(shí)，以便去除N-連接的碳水化合物。

將疏水性相互作用色譜法(HIC)樣品注射到丁基HIC NPR柱(2.5微米粒徑，4.6mm×3.5cm)(Tosoh Bioscience)上并且以0.8ml/min用0至70％B的線性梯度洗脫(A：50mM磷酸鉀中的1.5M硫酸銨，pH 7，B：50mM磷酸鉀pH 7，20％異丙醇)。裝備有多波長(zhǎng)檢測(cè)器和化學(xué)工作站軟件的Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)用于分辨和定量具有每種抗體的不同藥物比的抗體種類。

實(shí)施例3接頭-藥物中間體至抗體的綴合

在實(shí)施例2的還原和再氧化程序之后，將半胱氨酸工程化的抗體(THIOMAB^TM)溶解于PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)緩沖液中并且在冰上冷淬。將過(guò)量的約1.5摩爾至20當(dāng)量的接頭-藥物中間體(包括但不限于表1中的LD-51至LD-61，具有巰基反應(yīng)性的吡啶基二硫化物基團(tuán))溶解于DMSO中，用乙腈和水稀釋，并且添加至PBS中的冷淬的還原的、再氧化的抗體。通常接頭-藥物以50mM Tris(pH 8)中的約20mM濃度從DMSO儲(chǔ)備液中添加至抗體，并且如通過(guò)LC-MS分析反應(yīng)混合物所確定的監(jiān)測(cè)直到約1至約24小時(shí)反應(yīng)完全。當(dāng)反應(yīng)完全時(shí)，添加過(guò)量的馬來(lái)酰亞胺來(lái)猝滅反應(yīng)并且對(duì)任何未反應(yīng)的抗體巰基基團(tuán)進(jìn)行加帽(cap)。可以負(fù)載綴合混合物并且穿過(guò)HiTrap SP FF柱洗脫以便去除過(guò)量的藥物-接頭中間體和其他雜質(zhì)。通過(guò)離心超濾來(lái)濃縮反應(yīng)混合物，并且純化半胱氨酸工程化的抗體藥物綴合物并且通過(guò)用PBS穿過(guò)G25樹(shù)脂洗脫來(lái)脫鹽，在無(wú)菌條件下過(guò)濾穿過(guò)0.2μm過(guò)濾器并且冷凍用于儲(chǔ)存。

例如，在用20mM琥珀酸鈉(pH 5)稀釋之后，將粗抗體-藥物綴合物(ADC)施加至陽(yáng)離子交換柱。用至少10個(gè)柱體積的20mM琥珀酸鈉(pH 5)洗滌柱，并且用PBS洗脫抗體。使用凝膠過(guò)濾柱，將抗體藥物綴合物配制到具有240mM蔗糖的20mM His/乙酸鹽(pH 5)中。通過(guò)UV光譜法以確定蛋白質(zhì)濃度、通過(guò)分析性SEC(大小排阻色譜法)用于聚集分析并且通過(guò)在用賴氨酸C肽鏈內(nèi)切酶處理之前和之后進(jìn)行LC-MS來(lái)對(duì)抗體-藥物綴合物進(jìn)行表征。

使用Shodex KW802.5柱，用具有0.25mM氯化鉀和15％IPA的0.2M磷酸鉀pH 6.2，以0.75ml/min的流速下進(jìn)行大小排阻色譜法。通過(guò)對(duì)280nm處的吸光度的洗脫峰面積進(jìn)行積分來(lái)確定綴合物的聚集狀態(tài)。

可以使用Agilent QTOF 6520ESI儀器進(jìn)行LC-MS分析。作為舉例，在37℃下，用Tris(pH 7.5)中的1:500w/w胞內(nèi)蛋白酶Lys C(Promega)處理抗體-藥物綴合物，持續(xù)30min。將所得到的裂解片段負(fù)載到加熱至80℃的(埃)、8μm(微米)PLRP-S(高度交聯(lián)的聚苯乙烯)柱上，并且用30％B至40％B的梯度用5分鐘進(jìn)行洗脫。流動(dòng)相A為具有0.05％TFA的H₂O并且流動(dòng)相B為具有0.04％TFA的乙腈。流速為0.5ml/min。在電噴霧離子化和MS分析之前，通過(guò)在280nm處的UV吸光度檢測(cè)來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)洗脫。通常實(shí)現(xiàn)未綴合的Fc片段、殘余未綴合的Fab和摻藥物的Fab的色譜分辨。使用Mass Hunter^TM軟件(Agilent Technologies)對(duì)獲得的m/z譜進(jìn)行去卷積，以便計(jì)算抗體片段的質(zhì)量。

通過(guò)這些程序，制備表2的半胱氨酸工程化的抗體藥物綴合物101-117。

實(shí)施例4體外細(xì)胞增殖測(cè)定

通過(guò)細(xì)胞增殖測(cè)定來(lái)測(cè)量ADC的功效，所述細(xì)胞增殖測(cè)定采用以下方案(CELLTITER GLO^TM發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定，Promega公司Technical Bulletin TB288；Mendoza等(2002)Cancer Res.62:5485-5488)：

1.將在培養(yǎng)基中含有約10⁴個(gè)細(xì)胞(SKBR-3、BT474、MCF7或MDA-MB-468)的100μl細(xì)胞培養(yǎng)物等分試樣沉積在96孔不透明壁的板中的每個(gè)孔中。

2.制備含有培養(yǎng)基但不含細(xì)胞的對(duì)照孔。

3.將ADC添加至實(shí)驗(yàn)孔并且孵育3-5天。

4.將板平衡至室溫，持續(xù)大約30分鐘。

5.添加體積等于存在于每個(gè)孔中的細(xì)胞培養(yǎng)基的體積的CELLTITER GLO^TM試劑。

6.將內(nèi)容物在定軌振蕩器上混合2分鐘以便誘導(dǎo)細(xì)胞溶解。

7.在室溫下將板孵育10分鐘以便使發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定。

8.在圖表中記錄發(fā)光并報(bào)告為RLU＝相對(duì)發(fā)光單位。

對(duì)作為每組復(fù)制物的發(fā)光平均值的數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，其中具有標(biāo)準(zhǔn)偏差誤差線。方案為CELLTITER GLO^TM發(fā)光細(xì)胞的修正形式

培養(yǎng)基：SK-BR-3生長(zhǎng)于50/50/10％FBS/谷氨酰胺/250μg/mL中，G-418OVCAR-3生長(zhǎng)于RPMI/20％FBS/谷氨酰胺中

實(shí)施例5高表達(dá)HER2轉(zhuǎn)基因外植體小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)抑制體內(nèi)功效

在第0天進(jìn)行單一處理之前，確立腫瘤并且允許生長(zhǎng)至體積為150-200mm³(如使用卡尺所測(cè)量)。根據(jù)下式，使用卡尺測(cè)量腫瘤體積：V(mm³)＝0.5A X B²，其中A和B分別為長(zhǎng)直徑和短直徑。在腫瘤體積達(dá)到3000mm³之前或當(dāng)腫瘤示出即將發(fā)生潰瘍的跡象時(shí)處死小鼠。將從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組(每組10個(gè)小鼠)收集的數(shù)據(jù)表示為平均值±SE。

采用Fo5小鼠乳腺腫瘤模型來(lái)評(píng)估本發(fā)明的抗體-藥物綴合物在單一劑量靜脈內(nèi)注射之后的體內(nèi)功效，并且如先前所述(Phillips GDL、Li GM、Dugger DL等Targeting HER2-Positive Breast Cancer with Trastuzumab-DM1,an Antibody-Cytotoxic Drug Conjugate.(2008)Cancer Res.68:9280-90)，所述參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。用Fo5模型測(cè)試抗Her2 ADC，所示Fo5模型為其中如圖3和圖5所示的人HER2基因在鼠乳腺腫瘤病毒啟動(dòng)子(MMTV-HER2)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下在乳腺上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。HER2過(guò)表達(dá)引起自發(fā)的乳腺腫瘤發(fā)展。通過(guò)連續(xù)移植腫瘤片段(大小為大約2×2mm)，將這些創(chuàng)始動(dòng)物(founder animal)(創(chuàng)始#5[Fo5])之一的乳腺腫瘤在后代FVB小鼠中增殖。所有研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南來(lái)進(jìn)行。在研究開(kāi)始時(shí)和在移植后14天，在九個(gè)動(dòng)物中靜脈內(nèi)給藥每種抗體-藥物綴合物(單一劑量)。初始腫瘤大小的體積為約200mm³。由本發(fā)明的抗體-藥物綴合物得到的隨時(shí)間的腫瘤生長(zhǎng)抑制測(cè)量在圖3-5中示出。

可以如下所述的采用另一種乳腺脂肪墊移植物功效模型(Chen等(2007)Cancer Res 67:4924-4932)，評(píng)估單一靜脈內(nèi)劑量之后的腫瘤體積并且使用從具有腹腔內(nèi)腫瘤的小鼠切除的腫瘤，然后連續(xù)傳代到受體小鼠的乳腺脂肪墊中。

雖然出于清楚理解的目的已通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例相當(dāng)詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但描述和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。貫穿本說(shuō)明書中引用的所有專利、專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)明確地以引用的方式并入。

序列表

<110> GENENTECH公司等

<120> 蒽環(huán)類二硫化物中間體、抗體-藥物綴合物和方法

<130> P05813-WO

<140>

<141>

<150> 62/049,720

<151> 2014-09-12

<160> 30

<170> PatentIn 3.5 版

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 1

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Val Gly Asn Thr Phe Leu Glu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 2

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 3

Phe Gln Gly Ser Gln Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 4

Gly Tyr Glu Phe Ser Arg Ser Trp Met Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 5

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Gly Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 6

Asp Gly Ser Ser Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 7

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

1 5 10 15

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 8

Leu Gly Val Asn Ser Val Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 9

Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 10

Asn His Ala Ile Ser

1 5

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 11

Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 12

Glu Trp Ala Asp Val Phe Asp

1 5

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Val Asn Ser Val Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 14

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 14

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Asn His

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Trp Ala Asp Val Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 15

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 16

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 17

Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 18

Gly Asn Tyr Met Ser

1 5

<210> 19

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 19

Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成肽”

<400> 20

Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val

1 5 10

<210> 21

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Asn Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val Trp Gly Lys Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 24

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val Trp Gly Lys Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Ile Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

Arg Asp Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Met Val Val Trp Gly Lys Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

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<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來(lái)源

<223> /注釋=“人工序列的描述：合成多肽”

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Gly Asn

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

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65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val

85 90 95

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100 105 110

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1 5

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該技術(shù)已申請(qǐng)專利。僅供學(xué)習(xí)研究，如用于商業(yè)用途，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：J·弗呂加勒;T·皮洛
技術(shù)所有人：基因泰克公司
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