本發(fā)明尤其涉及用于預(yù)測治療劑的個性化治療效能和活性的組合物和測定。

背景技術(shù)：

病人對藥療法響應(yīng)不同；治療的成功極大地依賴于為每個病人選擇正確的藥物?！畟€性化藥物’的目標(biāo)是解決每個病人獨特的疾病表現(xiàn)。需要個性化藥物的疾病和障礙包括惡性病、炎性疾病和神經(jīng)變性疾病。

作為非限制性實例，癌癥在臨床中對藥物具有低的實際響應(yīng)速率。例如，小于60％的乳腺癌、食道癌、結(jié)腸癌或胃癌病人對治療起反應(yīng)；在患有肺癌、黑素瘤、胰腺癌、肝癌或再發(fā)性卵巢癌的病人中，統(tǒng)計數(shù)字降低至小于30％。因此，選擇將解決每個病人的獨特疾病表現(xiàn)的合適的治療可以顯著提高治療效果。

為他們的病人-特異性抗癌活性預(yù)篩藥物是具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。在嘗試預(yù)測癌癥治療是否將成功的現(xiàn)有方法下，在短的化療周期之后從病人的腫瘤取活組織檢查，并組織學(xué)檢查腫瘤響應(yīng)。顯像技術(shù)能夠?qū)崟r追蹤對腫瘤退化/進行、脈管增殖和代謝活性的治療效果。為了預(yù)篩針對它們的抗癌活性的多種藥物以及藥物組合，發(fā)展了離體和體外測定。這些測定基于腫瘤組織，這些腫瘤組織是來自病人的活組織檢查并且然后被體外擴展或植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)。

由于缺乏不均勻的多細胞微環(huán)境，還沒有證明細胞培養(yǎng)方法在預(yù)測治療結(jié)果中有效。已經(jīng)證明第二方法稍微有效；然而，其花費7-12個月來產(chǎn)生足夠數(shù)目的小鼠用于篩選。因此，只有患有輕度和非進行性腫瘤的病人可以被選擇用于該測定。

遺傳信息和病人-特異性生物標(biāo)記已經(jīng)幫助推進個性化藥物。然而，幾乎50％的病人仍然與非有效治療錯配，然后被歸類為‘非響應(yīng)者’。

納米技術(shù)具有治療癌癥的很大希望，包括腫瘤-特異性生物分布、增加的細胞內(nèi)攝取和攜帶水溶和水不溶藥物的能力。納米顆粒還具有同時攜帶治療物(therapeutic cargo)連同原位顯像抗腫瘤活性的造影劑的能力(即，治療診斷學(xué)(theranostics))(Zhang,R.等人2011,J Nucl Med 52,958-964)。

對研究化學(xué)和生物試劑的個性化治療效能和活性的組合物和方法存在未滿足的需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供用于預(yù)測和確定患有疾病的對象對治療劑或治療劑的組合的響應(yīng)。

本發(fā)明首次提出了能夠針?biāo)麄兊牟∪颂禺愋孕芡瑫r地篩選多種治療劑的個性化方法，其具有單細胞分辨率。由此，本文中公開的組合物和方法賦予醫(yī)師為單個病人選擇特制的藥物的新操作(handle)。

在一個方面，本發(fā)明提供包括至少一種載體的組合物，所述至少一種載體包括：

(a)單細胞治療有效量的至少一種治療劑；和

(b)獨特地識別(a)的至少一種治療劑的一個或多個條碼。

在一些實施方式中，組合物包括多種類型的載體，其中每種類型的載體獨立地包括：

(a)單細胞治療有效量的至少一種治療劑；和

(b)獨特地識別(a)的至少一種治療劑的一個或多個條碼。

在一些實施方式中，所述多種類型的載體是1-5000種類型的載體。在一些實施方式中，所述多種類型的載體是1-4000種類型的載體。在一些實施方式中，所述多種類型的載體是1-2000種類型的載體。在一些實施方式中，所述多種類型的載體是1-500種類型的載體。在其他實施方式中，所述多種類型的載體是1-200種類型的載體。在其他實施方式中，所述多種類型的載體是1-10種類型的載體。在其他實施方式中，所述多種類型的載體是1-5種類型的載體。在其他實施方式中，所述多種類型的載體是1-4種類型的載體。

在另一實施方式中，組合物進一步包括至少一種對照載體，所述對照載體不含治療劑并且包括獨特地識別所述對照載體的一個或多個條碼(如，核酸分子)。

在一些實施方式中，所述治療有效量基本上是單細胞治療有效量。在另一實施方式中，所述治療有效量足以調(diào)節(jié)單細胞的狀態(tài)。在另一實施方式中，所述調(diào)節(jié)單細胞的狀態(tài)選自：調(diào)節(jié)細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞死亡、調(diào)節(jié)細胞耐藥性和調(diào)節(jié)細胞功能、活性或生理機能。在所述至少一種治療劑不能跨越細胞膜的實施方式中，可以使用所述治療有效量的更高濃度。

在另一實施方式中，所述條碼是獨特地識別所述對照載體的一個或多個核酸分子。在另一實施方式中，所述核酸分子的長度為5-1000個核苷酸。在另一實施方式中，所述核酸分子的長度為5-500個核苷酸。在另一實施方式中，所述核酸分子的長度為5-400個核苷酸。在另一實施方式中，所述核酸分子的長度為5-300個核苷酸。在另一實施方式中，所述核酸分子的長度為5-250個核苷酸。在另一實施方式中，所述核酸分子的長度為15-200個核苷酸。

在另一實施方式中，所述核酸分子包括基本上不與所述細胞的核酸一致或互補的序列。在另一實施方式中，所述核酸分子不進入細胞核。在另一實施方式中，所述核酸分子不含能夠進入細胞核的成分(諸如核定位信號(NLS)或核運載體)。

在另一實施方式中，所述條碼選自：稀土元素、熒光團、發(fā)色團、化學(xué)發(fā)光分子、磁性顆粒、染料和放射性同位素。在另一實施方式中，所述條碼是稀土元素。在另一實施方式中，所述稀土元素鑭系元素。

在另一實施方式中，所述至少一種載體具有至多250nm(納米)的直徑。在另一實施方式中，所述至少一種載體具有至少50nm的直徑。在另一實施方式中，所述至少一種載體是脂質(zhì)基顆粒。在另一實施方式中，所述至少一種載體選自脂質(zhì)體和膠粒。在另一實施方式中，所述至少一種載體配合有治療劑，諸如聚合物納米顆粒、納米凝膠、金屬納米顆粒(包括但不限于金或鐵氧化物納米顆粒)、碳納米管、疊層(layer by layer)顆粒和溶膠凝膠陶瓷顆粒。在另一實施方式中，所述至少一種載體包括聚乙二醇(PEG)。

在另一實施方式中，提供了包括多個載體的組合物，該多個載體獨立地包括至少一種治療劑和獨特地識別所述至少一種治療劑的核酸分子。在另一實施方式中，配制所述組合物用于全身施用。在另一實施方式中，配制所述組合物用于瘤內(nèi)施用。

在另一實施方式中，所述至少一種載體進一步包括標(biāo)記(如，示蹤物)。在另一實施方式中，所述標(biāo)記選自熒光團、發(fā)色團、化學(xué)發(fā)光分子、磁性顆?；蛉玖?、金屬、稀土和放射性同位素。在一些實施方式中，所述標(biāo)記用于篩選和/或檢測成功由所述載體靶向的細胞。在一些實施方式中，所述標(biāo)記進一步用于檢測所述治療劑的活性。

根據(jù)另一方面，提供了用于預(yù)測患有疾病的對象對治療劑的響應(yīng)的方法，該方法包括以下步驟：

(a)向?qū)ο笫┯冒ǘ喾N類型的載體的組合物，每種類型的載體獨立地包括單細胞治療有效量的至少一種治療劑和獨特地識別所述至少一種治療劑的一個或多個條碼(核酸分子)；

(b)獲得包括來自所述對象的細胞的樣品；和

(c)通過獨特的條碼識別包括1-5種類型的載體的細胞中所述至少一種治療劑的效果；

由此預(yù)測患有疾病的對象對治療劑的響應(yīng)。

在一些實施方式中，所述對象患有癌癥。在一些實施方式中，所述施用為靜脈注射并且所述組合物包括每個所述對象的腫瘤的單細胞1-200個載體。在一些實施方式中，所述施用為瘤內(nèi)注射，并且所述組合物包括每個所述對象的腫瘤的單細胞1-20個載體。

在一些實施方式中，在施用所述組合物之后24-72小時的時間范圍內(nèi)進行所述獲得。在一些實施方式中，在施用所述組合物之后24-48小時的時間范圍內(nèi)進行所述獲得。

在另一實施方式中，所述方法進一步包括測序所述核酸分子的步驟。在另一實施方式中，所述方法進一步包括擴增所述核酸分子的步驟。

在另一實施方式中，在步驟(c)之前將所述樣品分解為單細胞懸浮液。

在另一實施方式中，所述組合物的所述至少一種載體進一步包括至少一種標(biāo)記。在另一實施方式中，使用選自下列的方法分選所述樣品的所述細胞：FACS、磁珠分選、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、基于微流體的分選、基于細胞張力的分選等。

通過下文中給出的詳細描述，本發(fā)明的適用性的進一步實施方式和全部范圍將變得顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解，雖然詳細描述和具體實例指示本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是其僅通過說明的方式給出，因為根據(jù)詳細描述，本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得顯而易見。

附圖說明

圖1A-E.用于預(yù)測病人腫瘤內(nèi)部抗癌治療法的效能的非限制性實例的示意性說明。(A)包含藥物、DNA條碼和熒光染料的納米顆粒的構(gòu)造。(B)以極低劑量向?qū)ο笫┯冒煌幬锏募{米顆粒的混合物。(C)48小時之后，從腫瘤取核心活組織檢查，并解離為單細胞懸浮液。(D)使用納米顆粒內(nèi)部的熒光染料，基于納米顆粒攝取分選懸浮液(如，通過FACS)。然后，(E)使用生存力染色(viability stain)，根據(jù)藥物效能分選細胞(活性/失活，I/0)，并且通過測量細胞內(nèi)部DNA條碼使活性與內(nèi)部藥物或藥物組合相關(guān)聯(lián)。作為對照，類似地分析未處理的細胞(e`)的結(jié)局。

圖2.可以采用用于合成并條碼化納米顆粒的高通量(throughput)方法的非限制性實例的示意性說明。微流體裝置(左)。水相(底部灰色通道)——將DNA和親水性治療物裝載入顆粒。水性搏動流動被用于調(diào)節(jié)微流體裝置中的剪切速率。有機相(頂部白色通道)——使用控制泵使各種脂質(zhì)結(jié)構(gòu)單元和疏水性藥物結(jié)合以改變顆粒的結(jié)構(gòu)參數(shù)。每個顆粒僅包含對應(yīng)條碼的一種藥物。

圖3A-F.惡性細胞中條碼化納米顆粒。檢測1,000個(A)、500個(B)、5個(C)細胞的群(cluster)內(nèi)和甚至單細胞(D)內(nèi)的DNA條碼。條碼可以具有各種長度——50、85和120bp(E)或使用另外的手段標(biāo)記。(F)4T1乳腺癌細胞內(nèi)部的DNA條碼化納米顆粒的共焦顯微鏡檢測。細胞膜被染紅(描繪的灰色)，細胞核藍色(由箭頭所描繪)，和顆粒被描繪為白色斑點。

圖4.原發(fā)性腫瘤和實驗轉(zhuǎn)移。通過局部(大腿內(nèi)原發(fā)性腫瘤，下圖像)或靜脈(肺轉(zhuǎn)移，上圖像)注射4T1細胞在BALB/c小鼠中建立三陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型。向帶有原發(fā)性腫瘤的動物靜脈注射條碼化納米顆粒。評估顆粒至原發(fā)性部位和轉(zhuǎn)移性部位的生物分布并篩選各種藥物的治療效能。

圖5.說明腫瘤組織內(nèi)部條碼分布的柱狀圖表。圖表描繪了施用游離條碼的動物和施用封裝條碼的動物之間的條碼濃度。對照不含條碼。

圖6.說明具有不同大小的脂質(zhì)體的DNA細胞攝取的柱狀圖表。

圖7A-B.說明在DOX治療之后活腫瘤細胞和死腫瘤細胞內(nèi)部的條碼分布的柱狀圖表。腫瘤細胞內(nèi)部安慰劑NP(A)和包含DOX的條碼化NP(B)之間條碼分布的比較。

圖8A-F.說明治療診斷的條碼化納米顆粒的柱狀圖表。同時將包含對照化合物或不同的藥物——安慰劑(A)、咖啡因(B)、順鉑(C)、亞德里亞霉素(D)和吉西他濱(Gemcitabine)(E)——的條碼化納米顆粒靜脈注射至帶有原發(fā)性腫瘤的BALB/c小鼠后大腿中。48小時之后，使顆粒能夠在腫瘤中積累并執(zhí)行治療活性，從腫瘤取活組織檢查。然后將活組織檢查組織解離為單細胞懸浮液，并根據(jù)它們的生存力(活/死)篩選細胞。與活細胞相比，在死細胞中發(fā)現(xiàn)升高水平的藥物(吉西他濱、順鉑)條碼。中性化合物——咖啡因——在活細胞和死細胞中具有類似的條碼水平。y軸指示在細胞內(nèi)部發(fā)現(xiàn)的條碼的數(shù)目。(F)對于每種藥物，通過由死細胞提取的條碼數(shù)除以由活細胞提取的條碼數(shù)計算藥物的效能。在對數(shù)尺度內(nèi)呈現(xiàn)值。

圖9A-D.基于條碼分析的治療效果。圖9A-B和D為比較不同治療組之間腫瘤體積變化的柱狀圖表。每組得到每周劑量的化療藥物：亞德里亞霉素、順鉑、或吉西他濱。對照組得到鹽水。每組的代表腫瘤尺寸。在開始治療后23天提取腫瘤。每組的腫瘤/身體重量。在處死(9C)當(dāng)天測量腫瘤和身體二者。數(shù)據(jù)計算為(n＝6/組)的平均值+/-SDE；*P<0.01；****P<0.0001。

具體實施方式

本發(fā)明提供用于預(yù)測和確定治療劑或治療劑的組合針對損傷的治療效能的組合物和方法。本文中公開的組合物和方法能夠定制治療以解決每個病人獨特的疾病表現(xiàn)。

如本文中下面所說明，在開始治療周期之前，載體(如，納米顆粒)充當(dāng)用于檢驗損傷內(nèi)部藥物或藥物組合的治療效能(如，癌性損傷)的治療診斷計量。

在一些實施方式中，載體包括治療劑和對應(yīng)的條碼，以及任選地標(biāo)記。每個載體包含極低劑量的藥物，其足以僅治療一個細胞且遠在全身治療閾值以下。

在一些實施方式中，提供了包括至少一種載體的組合物，所述至少一種載體包括：治療有效量的至少一種治療劑；獨特地識別至少一種治療劑的核酸分子；以及任選地標(biāo)記(即，示蹤物)。

在一些實施方式中，至少一種治療劑和核酸分子被封裝在至少一種載體內(nèi)。在其中載體進一步包括標(biāo)記的實施方式中，至少一種治療劑、核酸分子和標(biāo)記被封裝在至少一種載體內(nèi)。

在另一實施方式中，提供了包括多種載體的組合物，每種載體獨立地包括至少一種治療劑和獨特地識別所述至少一種治療劑的核酸分子。在一些實施方式中，組合物包括獨立地包括治療劑或其組合的1-5種類型的載體。在一些實施方式中，組合物包括獨立地包括治療劑或其組合的1-10種類型的載體。在一些實施方式中，組合物包括獨立地包括治療劑或其組合的1-200種載體。在一些實施方式中，組合物包括獨立地包括治療劑或其組合的1-2000種載體。在一些實施方式中，組合物包括獨立地包括治療劑或其組合的2-500種類型的載體。如此，本發(fā)明的組合物和方法提供單細胞分辨率下多種治療劑或其組合的同時篩選。在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物和方法提供單細胞分辨率下腫瘤-治療劑或其組合的同時篩選。

如本文中所使用，“類型的載體”指以相繼類似計量包括相同組成的一種或多種治療劑的載體。

治療劑

在一些實施方式中，所述治療有效量是基本上單細胞治療有效量。

如本文中所使用，“治療有效量”或“有效量”指在劑量下有效并且持續(xù)所需時間周期以實現(xiàn)期望的治療結(jié)果的量。治療劑的治療有效量將取決于障礙或癥狀的性質(zhì)并取決于特定的試劑，且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。

如本文中所使用，“單細胞治療有效量”指足以在單細胞內(nèi)實現(xiàn)期望的治療結(jié)果的有效量。在具體實施方式中，與治療劑的最小有效劑量(MED)相比，所述治療劑的所述單細胞治療有效量是試劑的相當(dāng)?shù)偷膭┝俊Ｔ谝恍嵤┓绞街?，與所述治療劑的最小有效劑量(MED)相比，所述單細胞治療有效量為至多0.1％、0.01％、0.001％或0.0001％的試劑。在一些實施方式中，“單細胞治療有效量”指足以在單細胞內(nèi)實現(xiàn)期望的治療結(jié)果的最小有效量。該量可以不同，取決于細胞類型、藥物類型和/或治療的持續(xù)時間。

在另一實施方式中，其中期望的藥物可以與組合物的其他成分反應(yīng)，為了提供每單細胞治療有效量的藥物，使用過量的藥物。對于非限制性實例，順鉑可以與條碼DNA反應(yīng)，因此為了提供具有治療有效量的順鉑的細胞，封裝過多的量。

在一些實施方式中，可以使用限制量的治療劑。作為非限制性實例，單拷貝的假單細胞菌毒素足以殺死靶細胞。

在另一實施方式中，所述單細胞治療有效量基本上足以調(diào)節(jié)單細胞的狀態(tài)或在單細胞內(nèi)實現(xiàn)期望的治療結(jié)果。在另一實施方式中，所述治療有效量不大于足以調(diào)節(jié)單細胞的狀態(tài)或在單細胞內(nèi)實現(xiàn)期望的治療結(jié)果的量的50％、40％、30％、20％或10％。

治療結(jié)果可以是，如，減輕癥狀、延長存活、提高移動性等。治療結(jié)果不需要是“治愈”。治療結(jié)果也可以是預(yù)防性的。

在另一實施方式中，所述調(diào)節(jié)單細胞的狀態(tài)選自：調(diào)節(jié)細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞死亡、調(diào)節(jié)細胞耐藥性、調(diào)節(jié)細胞功能、活性或生理機能。在一些實施方式中，調(diào)節(jié)細胞功能或活性包括但不限于RNA轉(zhuǎn)錄、一種或多種蛋白的翻譯，蛋白包括例如細胞內(nèi)或跨膜蛋白或脂質(zhì)。在另一實施方式中，所述調(diào)節(jié)單細胞的狀態(tài)包括調(diào)節(jié)細胞成分或生物標(biāo)記的存在、缺乏、水平(如，增加或降低)、活化或抑制。細胞成分或生物標(biāo)記包括但不限于基因、基因產(chǎn)物(如，RNA、mRNA、miRNA)和氨基酸分子(如，蛋白)。在一些實施方式中，細胞活性是代謝活性。

在一些實施方式中，所述至少一種治療劑不能跨越所述細胞的膜。在所述實施方式中，如與治療單細胞的濃度相比，所述治療有效量可以處于較高濃度。不能跨越細胞膜的治療劑的實例包括但不限于RNA和親水性藥物。

條碼

在一個實施方式中，所述條碼是一種或多種核酸分子。核酸分子——諸如DNA鏈——呈現(xiàn)未限制數(shù)目的條碼化選擇。如貫穿本發(fā)明所使用，“條碼”、“DNA條碼”彼此均是可互換的并且具有相同的含義。作為DNA條碼的本發(fā)明的核酸分子是脫氧核酸或核糖核酸或兩者的聚合物，并且可以是單鏈或雙鏈的，任選地包含合成的、非天然或修飾的核苷酸堿基。在一些實施方式中，比如，利用生物素、放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記對核酸分子進行標(biāo)記。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員所應(yīng)當(dāng)理解的，將獨特的DNA條碼并入治療劑載體(封裝)允許使用測定識別單個治療劑，識別包括但不限于微陣列系統(tǒng)、PCR，核酸雜交(包括“印跡”)或高通量測序。

在一些實施方式中，通過在本發(fā)明的載體內(nèi)封裝DNA條碼實現(xiàn)使帶負電荷的DNA條碼滲透通過細胞的帶負電荷的脂質(zhì)雙層。

在一些實施方式中，核酸分子的序列不包括與天然存在于環(huán)境中或特定地天然存在于被本發(fā)明的方法和組合物靶向的所述細胞中的材料/物質(zhì)/顆粒相關(guān)的序列、模式、特征或任何其他核酸序列。在另外的實施方式中，核酸分子的序列不含超過10個堿基的核苷酸序列，這些堿基可以與天然存在的核苷酸序列，和特別是外顯子相關(guān)聯(lián)。在另一實施方式中，所述核酸分子包括與所述細胞的基因組材料基本上不一致或互補的序列(諸如預(yù)防核酸分子與細胞的基因組材料——特別是所述細胞的外顯子——的雜交，和/或預(yù)防假陽性擴增結(jié)果)。

在一些實施方式中，所述核酸序列可以進一步作為分子信標(biāo)。所述核酸序列通?？梢允菃捂湻肿?，諸如發(fā)夾形狀。所述核酸分子可以用于檢測細胞中的互補基因，諸如用于檢測細胞內(nèi)部的基因突變。在一些實施方式中，所述核酸具有與帶有突變的序列互補的序列。

在一些實施方式中，所述核酸分子包括預(yù)限定的獨特序列或由預(yù)限定的獨特序列組成。如本文中所使用，術(shù)語“獨特序列”或“獨特地識別”指保留區(qū)別的基于單射功能的序列(也稱為一對一功能)。

在實施本發(fā)明的預(yù)測方法之后，獨特條碼(如，具有獨特序列的核酸)適合用于識別載體內(nèi)對應(yīng)的至少一種治療劑。用于檢測核酸序列的存在和識別的方法對技術(shù)人員是已知的并且包括能夠增強多個條碼存在的測序和陣列(如，微陣列)系統(tǒng)(如，由Ilumina Inc.市售的)。

在一些實施方式中，諸如當(dāng)期望增加的準(zhǔn)確性時，核酸分子具有適合測序和/或擴增試驗(如PCR)的長度。在另一實施方式中，所述核酸分子具有適合裝載入本發(fā)明的載體的長度，優(yōu)選地在納米級。應(yīng)當(dāng)理解，所述核酸分子的長度取決于在本發(fā)明的組合物和方法中使用的載體的類型和大小(如，較短的序列適合用于納米顆粒，而較長的序列可以用于微粒)。

在另一實施方式中，所述核酸分子具有至多1000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多190、至多180、至多170、至多160、至多150、至多140、至多130或至多120個堿基的長度，其中每種可能性表示本發(fā)明的單獨的實施方式。在另一實施方式中，所述核酸分子具有至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20個堿基、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30個堿基、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100或至少200、至少300、至少400或至少500個堿基的長度，其中每種可能性表示本發(fā)明的單獨的實施方式。

核酸長度的非限制性實例包括但不限于5-50個堿基、5-40個堿基、5-30個堿基、5-25個堿基、5-24個堿基、5-23個堿基、5-22個堿基、5-21個堿基、5-20個堿基、5-19個堿基、5-18個堿基、5-17個堿基、5-16個堿基或5-15個堿基、15-50個堿基、15-60個堿基、15-70個堿基、15-80個堿基、15-90個堿基、15-100個堿基、15-200個堿基、15-250個堿基或15-500個堿基。

在另一實施方式中，每個載體內(nèi)所述核酸分子具有每載體或每靶細胞一個或多個鏈的濃度。很好地確定核酸分子的量在本領(lǐng)域技術(shù)人的能力范圍內(nèi)。在另一實施方式中，所述一個或多個核酸分子是1-10000個核酸分子。在另一實施方式中，所述一個或多個核酸分子是1-1000個核酸分子。在另一實施方式中，所述一個或多個核酸分子是1-5000個核酸分子。在另一實施方式中，所述一個或多個核酸分子是1-500個核酸分子。在另一實施方式中，所述一個或多個核酸分子是5-500個核酸分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以預(yù)先確定每個顆粒中核酸分子的量以便適合執(zhí)行的具體試驗，如測續(xù)和/或擴增試驗。

根據(jù)一些實施方式，每種顆粒包括獨特的條碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，利用獨特的條碼來條碼化每種顆粒(即，載體)可以指示進入單細胞的顆粒的量。在一些實施方式中，本發(fā)明提供確定用于治療疾病的治療劑量的方法，方法包括向?qū)ο笫┯冒ǘ喾N類型的載體的組合物，其中每種類型的載體包括一種或多種治療劑，其中在所述一種或多種治療劑的劑量中每種類型的載體不同。

根據(jù)一些實施方式，每種類型的顆粒(即，載體)包括識別所述載體類型的獨特的條碼(如，核酸序列)。根據(jù)一些實施方式，每種顆粒(即，載體)包括識別所述載體類型的獨特的條碼(如，核酸序列)。

在另一實施方式中，所述條碼選自：稀土元素、熒光團、發(fā)色團、化學(xué)發(fā)光分子、磁性顆粒、染料和放射性同位素。

在另一實施方式中，所述條碼是稀土元素。在另一實施方式中，所述稀土元素是鑭系元素。在一些實施方式中，所述鑭系元素選自：鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、钷(Pm)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、镥(Lu)、鈧(Sc)和釔(Y)。在另一實施方式中，所述稀土元素是鑭系元素。在一些實施方式中，所述鑭系元素選自La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu。

當(dāng)與熒光標(biāo)記配合時，稀土元素(如，鑭系元素)可以是有用的，并且一般通過使鑭系元素絡(luò)合物與感興趣的樣品在選擇的條件下結(jié)合以得到可檢測的光學(xué)響應(yīng)來使用?？梢栽谶x擇以引起光學(xué)響應(yīng)的波長下照射樣品。

在另一實施方式中，組合物內(nèi)的所述載體進一步包括用于可操作地使用所述核酸分子作為細胞內(nèi)的條碼的另外的試劑(如化學(xué)或生物試劑)。所述試劑的非限制性實例包括DNA酶或RNA酶，諸如防止分別被DNA或RNA條碼的內(nèi)源或外源酶降解。

在一些實施方式中，形成本發(fā)明的組合物的溶液中的條碼濃度可以在2至100微摩/升(μM)之間改變。在一些實施方式中，溶液中的條碼濃度可以在10至90微摩/升(μM)之間改變。在一些實施方式中，溶液中的條碼濃度可以在20至80微摩/升(μM)之間改變。在一些實施方式中，溶液中的條碼濃度可以在30至70微摩/升(μM)之間改變。

在一個實施方式中，相對于分析的細胞的數(shù)量，本文中描述的組合物包括少數(shù)的納米顆粒，以便確保數(shù)據(jù)的統(tǒng)計顯著性。通常，當(dāng)分析藥物(一種或多種)對腫瘤的治療作用時，1毫米³的癌癥組織中腫瘤細胞的平均數(shù)為10⁶個細胞。整個組織中細胞的總數(shù)為數(shù)千萬個細胞。即，每細胞的組合可能性的理論數(shù)為N！(階乘)，其中N為條碼的數(shù)目，假設(shè)有足夠的條碼進入每個細胞。為降低選擇的數(shù)目，分析的組織的每細胞的條碼化納米顆粒的數(shù)目優(yōu)選小于5。

在一個實施方式中，每細胞存在1-5種類型的載體(即，條碼化納米顆粒)/細胞。在另一實施方式中，每細胞存在1-5種類型的載體提供足夠的數(shù)據(jù)和高的信噪比(SNR)。在另一實施方式中，分析每細胞包括1-5種類型的載體的細胞。在另一實施方式中，分析每細胞包括1-4種類型的載體的細胞。

本發(fā)明部分基于下面的發(fā)現(xiàn)：為了達到每細胞存在至多5個條碼類型應(yīng)被注射的顆粒的量可以如下計算，考慮6-7％的靜脈注射的劑量在腫瘤部位積累并且實際到達腫瘤部位的5％的納米顆粒被細胞吸收，而其余被困在胞外基質(zhì)(ECM)中。

在一個實施方式中，每腫瘤細胞經(jīng)由靜脈注射施用1-200個顆粒。在另一實施方式中，每腫瘤細胞經(jīng)由靜脈注射施用1-300個顆粒。在另一實施方式中，每腫瘤細胞經(jīng)由靜脈注射施用1-400個顆粒。在另一實施方式中，每腫瘤細胞經(jīng)由靜脈注射施用1-500個顆粒。在另一實施方式中，每腫瘤細胞經(jīng)由靜脈注射施用1-1000個顆粒。

在另一實施方式中，每腫瘤細胞瘤內(nèi)施用1-20個顆粒。在另一實施方式中，每腫瘤細胞瘤內(nèi)施用1-10個顆粒。在另一實施方式中，每腫瘤細胞瘤內(nèi)施用1-50個顆粒。在另一實施方式中，每腫瘤細胞瘤內(nèi)施用1-100個顆粒。

在一些實施方式中，顆粒內(nèi)部條碼分子的量是至少1、或可選地至少5、或可選地至少10、或可選地至少20、或可選地至少30、或可選地至少40、或可選地至少50、或可選地至少60、或可選地至少70、或可選地至少80、或可選地至少90、或可選地至少100、或可選地至少500、或可選地至少1000、或可選地至少5000、或可選地至少10000個條碼分子/顆粒。在一些實施方式中，顆粒內(nèi)部條碼分子的量是是至多5、或可選地至多10、或可選地至多20、或可選地至多30、或可選地至多40、或可選地至多50、或可選地至多60、或可選地至多70、或可選地至多80、或可選地至多90、或可選地至多100、或可選地至多500、或可選地至多1000、或可選地至多5000個條碼分子/顆粒。在一些實施方式中，顆粒內(nèi)部條碼分子的量范圍在5-100個條碼分子/顆粒之間。在一些實施方式中，顆粒內(nèi)部條碼分子的量范圍在10-90個條碼分子/顆粒之間。在一些實施方式中，顆粒內(nèi)部條碼分子的量范圍在20-80個條碼分子/顆粒之間。每種可能性表示本發(fā)明的單獨的實施方式。在一些實施方式中，顆粒內(nèi)部條碼分子的量范圍在1-1000個條碼分子/顆粒之間。在一些實施方式中，顆粒內(nèi)部條碼分子的量范圍在1-10000個條碼分子/顆粒之間。

標(biāo)記

在另一實施方式中，本發(fā)明的一種或多種載體進一步包括至少一種標(biāo)記或可檢測的部分。在一些實施方式中，對于所有載體使用同一標(biāo)記。在其他實施方式中，對于載體的子集使用獨特的標(biāo)記。

可用于本發(fā)明的組合物和方法的標(biāo)記包括但不限于熒光團、發(fā)色團、化學(xué)發(fā)光分子、放射性標(biāo)記物、金屬、稀土元素、磁性顆?；蛉玖?。

在一些實施方式中，標(biāo)記或可檢測的部分是在試驗中有用的標(biāo)記，其包括但不限于免疫測定，諸如ELISA，珠基、芯片基或平板基多重免疫測定、質(zhì)譜法、電泳、免疫比濁法(immunonephelometry)、免疫濁度測定法(immunoturbidimetry)、酶促測定、比色或熒光測定，如通過光度計可評估的，和基于熒光相關(guān)細胞分選(FACS)的分析或通過其他臨床建立的測定。所有這些方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，且在文獻中描述。

通常，標(biāo)記的量將取決于待執(zhí)行的測定，并且可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力確定，并且很好地在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力下。在一些實施方式中，載體包括所述標(biāo)記的一個分子或多個分子。

載體

在一些實施方式中，提供了用于治療劑(一種或多種)的載體、用于DNA條碼化所述治療劑(一種或多種)的核酸序列和任選地標(biāo)記。用于實踐本發(fā)明的方法的所述載體可以靶向具體的分子，包括生物分子，諸如多肽——包括細胞表面多肽，如異常生長細胞、癌細胞、免疫細胞和退化細胞上的多肽。

在可選的實施方式中，本發(fā)明提供了納米顆粒和脂質(zhì)體膜形式的載體，其包括(除了包括用于實踐本發(fā)明的方法的化合物以外)分子——如肽或抗體，該分子選擇性靶向異常生長、患病、感染、功能異常和/或細胞受體。

在一些實施方式中，所述至少一種載體是小泡的形式，諸如這樣的小泡：其攜帶的材料(治療劑、核酸分子和任選地標(biāo)記)在內(nèi)核內(nèi)。在一些實施方式中，所述至少一種載體是脂質(zhì)基顆粒。在另一實施方式中，所述脂質(zhì)基顆粒是脂質(zhì)體。在另一實施方式中，所述至少一種載體是膠粒。

在一些實施方式中，溶液對指定的細胞是惰性的并且不影響指定的細胞。在一些實施方式中，除了治療劑以外，組合物的所有成分是惰性的并且不影響指定的細胞。在一些實施方式中，溶液是水性溶液。在另一實施方式中，本發(fā)明的組合物不含陽離子表面活性劑(由于其可以影響細胞和/或影響治療劑的活性，和阻礙治療劑的作用的準(zhǔn)確分析)。

在一些實施方式中，所述至少一種載體是小泡的形式，諸如這樣的小泡：其攜帶的材料(治療劑、核酸分子和任選地標(biāo)記)形成絡(luò)合物/微粒，其中攜帶的材料具有或不具有另一試劑，諸如聚合物/蛋白/鹽。在一些實施方式中，所述至少一種載體形成樹狀聚體狀結(jié)構(gòu)，其中成分綴合至聚合物主鏈或經(jīng)由范德華力或疏水相互作用絡(luò)合。

在一些實施方式中，所述至少一種載體是聚合物納米顆粒。在一些實施方式中，所述至少一種載體是納米凝膠。在一些實施方式中，所述至少一種載體是金屬納米顆粒(如，金或鐵氧化物納米顆粒)。在一些實施方式中，所述至少一種載體是碳納米管。在一些實施方式中，所述至少一種載體是疊層顆粒。在一些實施方式中，所述至少一種載體是溶膠凝膠陶瓷顆粒。在一些實施方式中，所述至少一種載體是與藥物的蛋白絡(luò)合物。

在一些實施方式中，所述至少一種載體形成樹狀聚體狀結(jié)果，其中成分綴合至聚合物主鏈或經(jīng)由范德華力或疏水相互作用絡(luò)合。

在一個實施方式中，載體(如，脂質(zhì)體)的直徑小于500nm，以促進其通過胞外基質(zhì)進入細胞。在一個實施方式中，載體(如，脂質(zhì)體)的直徑小于400nm，以促進其通過胞外基質(zhì)進入細胞。

在一個實施方式中，載體(如，脂質(zhì)體)的直徑小于300nm、小于250nm、小于200nm、小于150nm、小于100nm、小于50nm、小于20nm、小于10nm或小于5nm。在另一實施方式中，載體(如，脂質(zhì)體)的直徑為至少1nm、至少5nm、至少10nm、至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少1500nm、至少200nm、至少250nm或至少300nm。每種可能性表示本發(fā)明的單獨的實施方式。

在另一實施方式中，載體的直徑為1-300nm。在另一實施方式中，載體的直徑為10-250nm。在另一實施方式中，載體的直徑為5-250nm。在另一實施方式中，脂質(zhì)體的直徑為20-150nm。在另一實施方式中，脂質(zhì)體的直徑為5-150nm。在另一實施方式中，脂質(zhì)體的直徑為20-150nm。

在一些實施方式中，用于靜脈施用的載體的直徑為5-250nm。在一些實施方式中，其中用于靜脈施用的載體是脂質(zhì)體，載體的直徑為40-250nm。在一些實施方式中，用于瘤內(nèi)施用的載體的直徑為5-300nm。在一些實施方式中，其中用于瘤內(nèi)施用的載體是脂質(zhì)體，載體的直徑為40-300nm。

在一些實施方式中，載體的形貌可以為球形或基本上球形、非球形(如，橢圓形、管形等)、不規(guī)則形等。

本發(fā)明構(gòu)想了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移載體促進治療劑和核酸至靶細胞的遞送的用途。脂質(zhì)體(如，脂質(zhì)體脂質(zhì)納米顆粒)一般用于研究、工業(yè)和醫(yī)療中多種應(yīng)用，特別對于它們作為體內(nèi)診斷或治療化合物的轉(zhuǎn)移載體的用途(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998；Drummond等人,Pharmacol.Rev.,51:691-743,1999)并且一般表征為具有內(nèi)部水空間的微泡，其通過一個或多個雙層的膜與外部介質(zhì)隔離。脂質(zhì)體的雙層膜通常由兩親性分子形成，諸如合成或天然起源的脂質(zhì)，其包括空間上分離的親水性域和疏水性域(Lasic，出處同上)。脂質(zhì)體的雙層膜還可以由兩親性聚合物和表面活性劑形成(如，聚合物囊泡(polymerosome)、囊泡(niosome)等)。

在一個實施方式中，可以選擇和/或制備載體以優(yōu)化治療劑和核酸分子(DNA條碼)至靶細胞的遞送。例如，如果靶細胞是肝細胞，可以優(yōu)化轉(zhuǎn)移載體的性質(zhì)(如，大小、電荷和/或pH)以向靶細胞有效遞送這樣的轉(zhuǎn)移載體。可選地，如果靶細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(如，用于神經(jīng)變性疾病的治療預(yù)測)，轉(zhuǎn)移載體的選擇和制備必須考慮血腦屏障的滲透以及在其內(nèi)的保留和/或向這樣的靶細胞直接遞送這樣的轉(zhuǎn)移載體的可選手段的使用。

將期望的實體并入脂質(zhì)體的過程常常被稱為“裝載”(Lasic等人，F(xiàn)EBS Lett.,312:255-258,1992)。脂質(zhì)體并入的治療劑、核酸和/或標(biāo)記可以完全地或部分地位于脂質(zhì)體的內(nèi)部空間，在脂質(zhì)體的雙層膜內(nèi)。將試劑并入脂質(zhì)體在本文中也稱為“封裝”，其中試劑被完全包含在脂質(zhì)體的內(nèi)部空間內(nèi)。通常，對于載體(如脂質(zhì)體)內(nèi)的試劑的封裝，化學(xué)鍵——諸如試劑和載體之間的共價鍵——是不需要的。將試劑并入轉(zhuǎn)移載體——諸如脂質(zhì)體——的目的常常是為了保護試劑不受環(huán)境損害，環(huán)境可能包含降解試劑(如，核酸)的酶或化學(xué)試劑和/或引起試劑的快速排泄的系統(tǒng)或受體。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，選擇的轉(zhuǎn)移載體能夠增強治療劑和核酸分子以及任選地包含在其中的標(biāo)記的穩(wěn)定性。脂質(zhì)體可以使封裝的試劑到達靶細胞和/或可以優(yōu)先使封裝的試劑到達靶細胞，或可選地限制試劑至其它不期望的靶部位或細胞的遞送。

在一些實施方式中，載體促進封裝的治療有效量的至少一種治療劑、獨特地識別至少一種治療劑的核酸分子和任選的標(biāo)記滲透至細胞。在一些實施方式中，通過封裝在載體內(nèi)，能夠使治療有效量的至少一種治療劑、獨特地識別至少一種治療劑的核酸分子和任選的標(biāo)記滲透至細胞。

在一些實施方式中，制備脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移載體以封裝一種或多種期望的試劑，使得組合物展示高的轉(zhuǎn)染效率和增強的穩(wěn)定性。雖然脂質(zhì)體可以促進向靶細胞引入核酸，但是加入聚陽離子(如，聚L-懶氨酸和魚精蛋白)，作為共聚物可以促進，和在一些例子，顯著地增強體內(nèi)外二者許多細胞系中若干種類型的陽離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率達2-28倍(參見N.J.Caplen,等人,Gene Ther.1995；2:603；S.Li,等人,Gene Ther.1997；4,891)。

在另一實施方式中，所述至少一種載體是納米脂質(zhì)體或脂質(zhì)納米顆粒。納米脂質(zhì)體能夠通過提高生物活性試劑的溶解度和生物利用率、體內(nèi)外穩(wěn)定性，以及避免他們與其他分子的不希望的相互作用來增強他們的性能。納米脂質(zhì)體的另一優(yōu)點是細胞特異性靶向，其是獲得靶細胞中最優(yōu)治療效果同時最小化對健康細胞和組織的副作用所需的藥物濃度的先決條件。

如本文中所使用，短語“脂質(zhì)納米顆?！敝赴ㄒ环N或多種脂質(zhì)(如，陽離子脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)和PEG-改性脂質(zhì))的轉(zhuǎn)移載體。優(yōu)選地，配制脂質(zhì)納米顆粒以向一個或多個靶細胞遞送一種或多種試劑。適合的脂質(zhì)的實例包括，例如，磷脂?；衔?如，磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂)。還構(gòu)想的是使用聚合物作為轉(zhuǎn)移載體，無論單獨或與其他轉(zhuǎn)移載體結(jié)合。適合的聚合物可以包括，例如，聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯，聚丙交酯，聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己內(nèi)酯、葡聚糖、白蛋白、明膠、藻酸鹽、膠原、殼聚糖、環(huán)糊精、樹狀聚體和聚乙烯亞胺。在一個實施方式中，基于其促進核酸向靶細胞的轉(zhuǎn)染的能力選擇轉(zhuǎn)移載體。

本發(fā)明構(gòu)想了使用脂質(zhì)納米顆粒作為包括陽離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)移載體以封裝和/或增強遞送核酸進入靶細胞。如本文中所使用，短語“陽離子脂質(zhì)”指在選擇的pH——諸如生理pH——下攜帶凈正電荷的任意多種脂質(zhì)種類。構(gòu)想的脂質(zhì)納米顆?？梢酝ㄟ^包括采用一種或多種陽離子脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)和PEG改性脂質(zhì)的不同比例的多成分脂質(zhì)混合物來制備。文獻中已經(jīng)描述了若干陽離子脂質(zhì)，其中許多是市售的。

用于本發(fā)明的組合物和方法的適合的陽離子脂質(zhì)包括國際專利公開WO2010/053572中描述的那些，其通過引用并入本文。在某些實施方式中，本發(fā)明的組合物和方法采用包括可電離的陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米顆粒。在一些實施方式中，使用陽離子脂質(zhì)N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨或“DOTMA”(美國專利號4,897,355)。DOTMA可被單獨配制或可與中性脂質(zhì)——二油?；字Ｒ掖及坊颉癉OPE”或其他陽離子或非陽離子脂質(zhì)——結(jié)合為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移載體或脂質(zhì)納米顆粒，并且這樣的脂質(zhì)體可被用于增強遞送核酸進入靶細胞。其他適合的陽離子脂質(zhì)包括，例如，5-羧基鯨蠟醇基甘氨酸雙十八烷基酰胺(5-carboxyspermylglycinedioctadecylamide)或“DOGS”、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺內(nèi)鹽(2,3-dioleyloxy-N-[2(spermine-carboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-pr-opanaminium)或“DOSPA”(美國專利號5,171,678；美國專利號5,334,761)，1,2-二油酰基-3-二甲基銨-丙烷或“DODAP”、1,2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷或“DOTAP”?？紤]的陽離子脂質(zhì)還包括1,2-雙十八酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”、1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”、1,2-二亞油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”、N-二油基-N,N-二甲基氯化銨或“DODAC”、N,N-雙十八烷基-N,N-二甲基溴化銨或“DDAB”、N-(1,2-雙肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨或“DMRIE”、3-二甲基氨基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順,順-9,12-十八二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”、2-[5'-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基1-1-(順,順-9',1-2'-十八二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基芐基胺或“DMOBA”、1,2-N,N'-二油基氨基甲?；?3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”、2,3-二亞油?；趸?N,N-二甲基丙基胺或“DLinDAP”、1,2-N,N'-二亞油基氨基甲?；?3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”、1,2-二亞油?；被柞；?3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”、2,2-二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊環(huán)或“DLin-K-DMA”、2,2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊環(huán)或“DLin-K-XTC2-DMA”和2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)-N,N-二-甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(參見WO 2010/042877；Semple等人,Nature Biotech.28:172-176(2010))，或其混合物。(Heyes，J.等人,J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,D V.等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公開WO2005/121348A1)。

本發(fā)明還構(gòu)想了使用膽固醇基陽離子脂質(zhì)。這樣的膽固醇基陽離子脂質(zhì)可以單獨或與其他陽離子或非陽離子脂質(zhì)組合使用。適合的膽固醇基陽離子脂質(zhì)包括，例如，DC-膽(N,N-二甲基-N-乙基酰胺基膽固醇)、1,4-二(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao,等人Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美國專利號5,744,335)或ICE。

另外，商業(yè)購買若干試劑以增強轉(zhuǎn)染效果。適合的實例包括LIPOFECTIN(DOTMA:DOPE)(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)、LIPOFECTAMINE(DOSPA:DOPE)(Invitrogen)、LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen)、FUGENE、TRANSFECTAM(DOGS)和EFFECTENE。

還構(gòu)想的是這樣的陽離子脂質(zhì)，諸如基于二烷基氨基、基于咪唑和基于胍鹽的脂質(zhì)。例如，某些實施方式涉及包括一種或多種基于咪唑的陽離子脂質(zhì)的組合物。

本發(fā)明還構(gòu)想了單獨或優(yōu)選地與其他脂質(zhì)一起使用聚乙二醇(PEG)改性磷脂和衍生化脂質(zhì)，諸如衍生化神經(jīng)酰胺(PEG-CER)，包括N-辛?；?鞘氨醇-1-[丁二酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神經(jīng)酰胺)，其他脂質(zhì)包括轉(zhuǎn)移載體(如，脂質(zhì)納米顆粒)。添加這樣的成分可以阻止絡(luò)合物聚集并且還可以提供增加循環(huán)壽命和增加向靶細胞遞送脂質(zhì)-核酸組合物的手段(Klibanov等人(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或可以選擇他們以在體內(nèi)快速地交換出制劑(參見美國專利號5,885,613)。特別有用的可交換脂質(zhì)是具有較短?；?如，C14或C18)的PEG-神經(jīng)酰胺。本發(fā)明的PEG改性磷脂和衍生化脂質(zhì)可以占脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移載體中存在的總脂質(zhì)的從大約0％至大約20％、大約0.5％至大約20％、大約1％至大約15％、大約4％至大約10％或大約2％的摩爾比。

本發(fā)明還構(gòu)想了使用非陽離子脂質(zhì)。如本文中所使用，短語“非陽離子脂質(zhì)”指任何中性、兩性離子或陰離子脂質(zhì)。如本文中所使用，短語“陰離子脂質(zhì)”指在選擇的pH——諸如生理pH——下攜帶凈負電荷的任意多種脂質(zhì)種類。非陽離子脂質(zhì)包括但不限于二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)、二油?；字８视?DOPG)、二棕櫚酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油?；字Ｒ掖及?DOPE)、棕櫚酰油?；字Ｄ憠A(POPC)、棕櫚酰油?；?磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油?；?磷脂酰乙醇胺4-(N-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚?；字Ｒ掖及?DPPE)、雙肉豆蔻?；姿嵋掖及?DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂?；?2-油?；?磷脂酰乙醇胺(SOPE)、膽固醇或其混合物。這樣的非陽離子脂質(zhì)可以單獨使用，但優(yōu)選地與其他賦形劑結(jié)合使用，例如，陽離子脂質(zhì)。當(dāng)與陽離子脂質(zhì)結(jié)合使用時，非陽離子脂質(zhì)可以占轉(zhuǎn)移載體中存在的總脂質(zhì)的5％至大約90％或優(yōu)選地大約10％至大約70％的摩爾比。

在一些實施方式中，轉(zhuǎn)移載體(如，脂質(zhì)納米顆粒)通過結(jié)合多種脂質(zhì)和/或聚合物成分來制備。包括脂質(zhì)納米顆粒的陽離子脂質(zhì)、非陽離子脂質(zhì)和/或PEG改性脂質(zhì)的選擇，以及這樣的脂質(zhì)彼此間的相對摩爾比是基于選擇的脂質(zhì)(一種或多種)的特性、預(yù)期靶細胞的性質(zhì)和待遞送的試劑的特性。另外的考慮包括，例如，烷基鏈的飽和以及選擇的脂質(zhì)(一種或多種)的大小、電荷、pH、pKa、融合性(fusogenicity)和毒性。

本發(fā)明的組合物中使用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移載體可以通過目前在本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種技術(shù)來制備。多層小泡(MLV)可以通過常規(guī)技術(shù)來制備，例如，通過在合適的溶劑中溶解脂質(zhì)然后蒸發(fā)溶劑以在器皿的內(nèi)部上留下薄膜或通過噴霧干燥而在適合的容器或器皿的內(nèi)壁上沉積選擇的脂質(zhì)。然后可以利用渦流運動將水相添加至器皿，其可以導(dǎo)致MLV的形成。然后可以通過均化、超聲或擠出多層小泡來形成單層小泡(ULV)。另外，可以通過洗滌劑去除技術(shù)來形成單層小泡。

在某些實施方式中，本發(fā)明的組合物可以裝載有診斷放射性核素、熒光材料或體外和體內(nèi)應(yīng)用二者中可檢測的其他材料。

在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒載體由脂質(zhì)制造，其使用適于容納顆粒的高通量合成和標(biāo)記的在線微流體裝備。這樣的制造方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，如，Jahn等人,2007,Langmuir 23,6289-6293。通常，制造容納治療有效負載的合適的大小的顆粒。

化學(xué)試劑可以被裝載至穩(wěn)定的HSPC顆粒內(nèi)，例如由Schroeder等人,2007,Langmuir 23,4019-402所示?？梢栽凇鞍咨a(chǎn)納米顆?！瘍?nèi)合成生物治療劑(蛋白/RNA)。在一些實施方式中，合成納米顆粒被可控地觸發(fā)以在靶部位合成蛋白和RNA，如在Schroeder,A等人Nano Lett 12,2685–2689,(2012)中所顯示。這些納米顆粒由脂質(zhì)小泡組成，脂質(zhì)小泡填充有負責(zé)轉(zhuǎn)錄和翻譯的分子機器，包括以光不穩(wěn)定保護基團籠蔽的氨基酸、核糖體和DNA。顆粒作為能夠生產(chǎn)RNA/蛋白的納米工廠。在體外和體內(nèi)，蛋白/RNA合成可以在空間上和時間上可控，并且可以通過在毫秒的時間級上照射微米級組織區(qū)域來引發(fā)。如此，該平臺可以用于針對它們的活性——如，抗癌活性——來篩選RNA(Png等人,2012Nature 481,190-194)和蛋白。

在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒(如，載體)是這樣的納米顆粒：其中形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)組成納米顆粒的40-100％。在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包括0-50％mol的膽固醇。在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包括1-8％mol的PEG-脂質(zhì)。在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包括0-10％mol的功能脂質(zhì)(如，陽離子脂質(zhì)或具有靶向部分的脂質(zhì))。

如本文中和本領(lǐng)域內(nèi)所使用，mol百分比(“％mol”)指基于組成納米顆粒的成分或化合物的總mol的具體成分或化合物的百分比。例如，如果納米顆粒包含3mol的化合物A和1mol的化合物B，那么化合物A占混合物的75mol％并且化合物B占25mol％。

在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒(如，載體)包括40-70％mol的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)。在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包括20-50％mol的膽固醇。在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包括4-8％mol的PEG-脂質(zhì)。在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包括0-3％mol的功能脂質(zhì)(如，陽離子脂質(zhì)或具有靶向部分的脂質(zhì))。根據(jù)具體實施方式，包括40-70％mol的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)、20-50％mol的膽固醇、4-8％mol的PEG-脂質(zhì)和0-3％mol的功能脂質(zhì)的納米顆粒適合用于靜脈施用。

在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒(如，載體)包括50-80％mol的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)。在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包括0-50％mol的膽固醇。在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包括0-3％mol的PEG-脂質(zhì)。在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包括4-8％mol的功能脂質(zhì)(如，陽離子脂質(zhì)或具有靶向部分的脂質(zhì))。根據(jù)具體實施方式，包括50-80％mol的形成脂質(zhì)體的脂質(zhì)、0-50％mol的膽固醇、0-3％mol的PEG-脂質(zhì)和4-8％mol的功能脂質(zhì)的納米顆粒適合用于瘤內(nèi)施用。

治療診斷用途

根據(jù)一些實施方式，提供了用于預(yù)測患有疾病的對象對治療劑的響應(yīng)的包括多種載體的組合物，多種載體獨立地包括治療有效量的至少一種治療劑和獨特地識別所述至少一種治療劑的核酸分子。

根據(jù)一些實施方式，提供了預(yù)測患有疾病的對象對治療劑的響應(yīng)的方法，方法包括步驟：

(a)向?qū)ο笫┯冒ǘ喾N載體的組合物，多種載體獨立地包括治療有效量的至少一種治療劑和獨特地識別所述至少一種治療劑的核酸分子；和

(b)通過獨特的核酸分子識別從所述對象獲得的樣品中所述至少一種治療劑的效果；

由此預(yù)測患有疾病的對象對治療劑的響應(yīng)。

在另一實施方式中，所述方法進一步包括測序所述核酸分子的步驟。在另一實施方式中，所述方法進一步包括擴增所述核酸分子的步驟。用于擴增和測序核酸的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。

在另一實施方式中，所述方法進一步包括在利用靶細胞培育試劑之后清洗和DNA酶處理步驟。在另一實施方式中，在確定治療效果之前所述樣品被分解為單細胞懸浮液。將細胞樣品分解為單細胞懸浮液的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且可以包括例如gentleMACS^TM組織處理器(Dissociator)。

在另一實施方式中，所述方法進一步包括細胞分選步驟。細胞分選的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的并且包括但不限于FACS、磁珠分選、ELISA、基于微流體的分選、基于細胞張力的分選等。根據(jù)優(yōu)勢實施方式，通過分選靶細胞和使細胞狀態(tài)(如活/死細胞)與DNA條碼相關(guān)聯(lián)來分析每種治療劑的活性。在另外的實施方式中，該方法能夠針對它們的病人特異性和細胞特異性活性篩選多種藥物。

在實施方式中，本文中公開的方法包括提供持續(xù)的時間量的治療劑以執(zhí)行其治療活性。在取樣靶細胞之前的持續(xù)的時間量將取決于障礙或癥狀的性質(zhì)，和取決于特定試劑，并且可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。作為非限制性實例，持續(xù)的時間量包括在施用組合物后大約24、大約30、大約48小時，或超過24小時。每種可能性表示本發(fā)明的單獨的實施方式。在一些實施方式中，為了避免細胞內(nèi)部條碼的DNA酶降解，持續(xù)的時間量小于72小時。

在一些實施方式中，在取樣靶細胞之前的持續(xù)的時間量范圍為從24至72小時。在一些實施方式中，在取樣靶細胞之前的持續(xù)的時間量范圍為從24至48小時。在其他實施方式中，在取樣靶細胞之前的持續(xù)的時間量范圍為從30-48小時。在其他實施方式中，在施用組合物之后至少24小時獲得樣品。在其他實施方式中，在施用組合物之后至少30小時獲得樣品。在其他實施方式中，在施用組合物之后至少48小時獲得樣品。在其他實施方式中，在施用組合物之后至多48小時獲得樣品。在其他實施方式中，在施用組合物之后至多60小時獲得樣品。在其他實施方式中，在施用組合物之后至多72小時獲得樣品。在其他實施方式中，在施用組合物之后24-48小時之間獲得樣品。在其他實施方式中，在施用組合物之后30-48小時之間獲得樣品?？梢愿鶕?jù)若干因素確定取樣靶細胞的準(zhǔn)確時間范圍，包括使用的條碼以及被檢查的治療劑的類型和量。作為非限制性實例，核酸分子通常易于在施用之后48小時降解(特別是全身施用)，而稀土元素可以在較長的時間周期被檢測。在其他實施方式中，治療劑由它們對靶細胞的作用的時間而異。

在一些實施方式中，治療劑(如，順鉑)包括獨特的條碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在這樣的實施方式中，所述載體可以包括治療劑(如，順鉑)并且不需要添加另外的條碼。

在另一實施方式中，所述組合物被配制用于全身施用。在另一實施方式中，所述全身施用為靜脈注射。在另一實施方式中，所述施用為注射入組織，諸如瘤內(nèi)注射。

在一些方面，提供了包括至少一種細胞的組合物，該至少一種細胞包括本發(fā)明的1-4種類型的載體。在一些實施方式中，提供了包括至少一種細胞的組合物，該至少一種細胞包括1-4種類型的載體，每種類型的載體獨立地包括單細胞治療有效量的至少一種治療劑；和獨特地識別至少一種治療劑的1-10,000個核酸分子。在一些實施方式中，提供了包括多種細胞的組合物，每種細胞包括1-4種類型的載體，并且每種類型的載體獨立地包括單細胞治療有效量的至少一種治療劑；和獨特地識別至少一種治療劑的1-10,000個核酸分子。

本發(fā)明的方法和組合物可被用于優(yōu)先靶向大量的靶細胞。例如，構(gòu)想的靶細胞包括但不限于肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、肺細胞、骨細胞、干細胞、間充質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、心臟細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、β細胞、垂體細胞、滑膜細胞、卵巢細胞、睪丸細胞、成纖維細胞、B細胞、T細胞、網(wǎng)織紅細胞、白細胞、粒細胞和腫瘤細胞。如本文中所使用，“腫瘤細胞”包括原發(fā)性癌細胞以及轉(zhuǎn)移性細胞。

如本文中所使用，術(shù)語“對象”指本發(fā)明的組合物和方法被施用至其的任何動物(如，哺乳動物)，包括但不限于人類、非人類靈長類、嚙齒類等。在一些實施方式中，關(guān)于人類對象，術(shù)語“對象”和“病人”在本文中可交換地使用。在其他實施方式中，關(guān)于非人類對象，術(shù)語“對象”和“病人”在本文中可交換地使用。

在一些實施方式中，本發(fā)明的方法用于確定或預(yù)測患有惡性疾病的對象對治療劑的響應(yīng)。在一些實施方式中，所述惡性疾病是癌癥、癌癥轉(zhuǎn)移和惡化前的損傷。

癌癥治療劑的實例包括，例如但不限于阿比特龍、阿維A、阿地白介素、阿侖珠單抗、氨磷汀、安吖啶、阿那格雷、阿那羅唑、砷、天冬酰胺酶、天冬酰胺酶歐文菌屬、阿西替尼、阿扎胞苷、BCG、苯達莫司汀、貝伐珠單抗、貝沙羅汀、比卡魯胺、博來霉素、硼替佐米、本妥昔單抗(Brentuximab)、溴隱亭、布舍瑞林、白消安、卡巴它賽、卡麥角林、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉立濱、氯膦酸鹽、克里唑蒂尼、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、阿糖胞苷、氮烯唑胺、放線菌素D、達沙替尼、道諾霉素、地加瑞克、迪諾蘇單抗、地塞米松、右雷佐生、多西他賽、亞德里亞霉素、亞德里亞霉素聚乙二醇化脂質(zhì)體、恩扎魯胺、表阿霉素、艾日布林、埃羅替尼、雌莫司汀、依托泊苷、依維莫司、依西美坦、非格司亭、氟達拉濱、5-氟脲嘧啶、氟他胺、氟維司群、吉非替尼、吉西他濱、戈舍瑞林、羥基脲、依達比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、3-硝基-4-碘苯甲酰胺(Iniparib)、干擾素α-2b、易普利姆瑪、伊立替康、伊沙匹隆、Lambrolizumab、蘭瑞肽、拉帕替尼、來那度胺、來曲唑、亞葉酸、亮丙瑞林、洛莫司汀、氮芥、甲孕酮、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美司那、甲氨蝶呤、絲裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、尼羅替尼、尼魯米特、奧曲肽、奧法木單抗、奧沙利鉑、紫杉醇、紫杉醇納米顆粒、白蛋白結(jié)合(nab)、帕米膦酸鈉、帕尼單抗、帕唑帕尼培美曲塞、帕妥珠單抗、卟菲爾鈉、甲芐肼、喹高利特、雷替曲塞、呼腸孤病毒血清3型菌株-迪爾林、利妥昔單抗、羅咪酯肽、魯索利替尼、索拉非尼、鏈脲菌素、蘇尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、西羅莫司脂化物(Temsirolimus)、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、噻替派、促甲狀腺素α、托珠單抗、拓撲替康、曲妥單抗曲妥單抗、曲妥珠單抗曲奧舒凡、維生素A酸、維羅非尼、長春堿、長春新堿和長春瑞濱。

用作治療劑的化學(xué)治療劑的實例包括，例如但不限于如，烷基化試劑(如，環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、氮雜環(huán)丙烷、環(huán)氧化物、烷基硫酸酯)、順鉑和其類似物(如，卡鉑、奧沙利鉑)、抗代謝物(如，甲氨蝶呤、5-氟脲嘧啶、卡培他濱、阿糖胞苷、吉西他濱、氟達拉濱)、拓撲異構(gòu)酶干擾試劑(如、喜樹堿、依立替康、托泊替康、依托泊苷、替尼泊苷、亞德里亞霉素、柔紅霉素)、抗微管試劑(如，長春花生物堿、諸如長春新堿、長春堿和長春瑞濱；紫杉烷，諸如紫杉醇和多西他賽)、干擾素、白介素-2、組蛋白脫乙?；敢种苿慰寺】贵w、雌激素調(diào)質(zhì)(如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬)、甲地孕酮、芳香化酶抑制劑(如，來曲唑、阿那曲唑、依西美坦、奧曲肽)、奧曲肽、抗雄激素(如，氟他胺、卡索地司(casodex))、激酶和酪氨酸抑制劑(如，伊馬替尼(STI571或格列衛(wèi)(Gleevac))；吉非替尼(易瑞沙)；和厄洛替尼(特羅凱)等。參見如Cancer:Principles and Practice of Oncology,第7版,Devita等人,Lippincott Williams&Wilkins,2005,第15、16、17和63章)。

在一些實施方式中，本發(fā)明的方法用于確定或預(yù)測患有炎性疾病或障礙的對象對治療劑的響應(yīng)。

在一些實施方式中，本發(fā)明的方法用于確定或預(yù)測患有變性疾病或障礙的對象對治療劑的響應(yīng)。在一個實施方式中，所述變性疾病是骨性關(guān)節(jié)炎。

在一些實施方式中，本發(fā)明的方法用于確定或預(yù)測患有神經(jīng)性疾病或障礙的對象對治療劑的響應(yīng)。

如本文中所使用，當(dāng)與值組合時，術(shù)語“大約”指參考值的正負10％。例如，大約1000納米(nm)的長度指1000nm+-100nm的長度。

在查閱了下面的實施例之后，本發(fā)明的另外的目的、優(yōu)勢和新特征對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得顯而易見，其不旨在限制性的。另外，如本文此前所敘述和下面權(quán)利要求部分中所要求保護的本發(fā)明的各種實施方式和方面中的每個在下面的實施例中發(fā)現(xiàn)實驗支持。

實施例

一般地，本文中使用的命名法和本發(fā)明中利用的實驗室過程包括分子、生物化學(xué)、微生物和重組DNA技術(shù)。在文獻中全面地解釋這樣的技術(shù)。參見，例如，“Molecular Cloning:A laboratory Manual”Sambrook等人,(1989)；”Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I-III Ausubel,R.M.,編(1994)；Ausubel等人,“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons,New York(1988)；Watson等人,“Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York；Birren等人(編)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,Vol.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；美國專利號4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所闡述的方法學(xué)；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,Volumes I-III Cellis,J.E.編(1994)；Freshney,Wiley-Liss,N.Y.的“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”(1994),第三版；“Current Protocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.編(1994)；Stites等人(編)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(編),“Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；其全部通過引用并入。貫穿該文件提供其他一般參考。

脂質(zhì)體合成/制備

使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備脂質(zhì)體。將HSPC、PEG-DSPE和膽固醇58％、2％、40％溶解在純的乙醇中并在65℃下加熱直到完全溶解。

合成脂質(zhì)體：脂質(zhì)體包含下列的脂質(zhì)組合物：58％mol的氫化大豆磷脂酰膽堿(HSPC)、Mw 762.1；2mol％的聚乙二醇二硬脂酰-磷酸乙醇胺(m2000PEG DSPE)——其作用是降低脂質(zhì)體由于空間效應(yīng)的聚集/融合，Mw 2805.54；和40mol％的膽固醇Mw 386.65。溶液中總脂質(zhì)的工作濃度為50mM。培養(yǎng)基為去離子水中10％PBS/5％葡萄糖。首先，將脂質(zhì)溶解在純乙醇中，升溫至65℃并加入至1ml的培養(yǎng)基(也升溫至相同的溫度)。在直接注入和移液之后，加入更多培養(yǎng)基以達到最終的脂質(zhì)濃度。氫化大豆磷脂酰膽堿由Lipoid貢獻(Ludwigshafen,Germany)；m2000PEG-DSPE從Avanti(Alabaster,Alabama,USA)購買和膽固醇(分類號：C8667-500MG)來自Sigma(Rehovot，Israel)。

DNA封裝：25毫微摩且脫鹽的ssDNA寡聚物(oligos)從Sigma&IDT(Leuven Belgium)購買，其具有50-120個堿基對的長度范圍。在兩個ssDNA的退火之后，將原液稀釋至100μM并分為100微升(μl)的等分試樣。對于5ml的脂質(zhì)溶液，在添加溶解的脂質(zhì)(對于3ml-150μl的dsDNA)之前，將300μl的dsDNA加入至1ml的培養(yǎng)基溶液。在封裝之后，使用擠出機生產(chǎn)200nm的脂質(zhì)體。

擠出過程：通過400nm和200nm的膜擠出脂質(zhì)溶液3次。擠出機溫度被設(shè)置為65攝氏度(℃)。

經(jīng)由DLS的粒徑確定粒徑(動態(tài)光散射)——在擠出之后，通過DLS(ZetaSizer–ZSP)進行大小確定。PDI范圍在0.003-0.08之間。

體外轉(zhuǎn)染：在8/3.5cm組織培養(yǎng)板中在B-16(黑素瘤)和4T1(乳腺癌)小鼠癌細胞二者上進行體外實驗。在RPMI(biological industries)中培養(yǎng)細胞，經(jīng)過24小時，將具有新鮮培養(yǎng)基的10％(v/v)的脂質(zhì)體溶液加入細胞培養(yǎng)。在37℃下培育細胞24小時，并且然后分析。

DNA提取：具有剩余脂質(zhì)體的培養(yǎng)基被丟棄并利用PBSX1(Biological Industries)清洗細胞3次。利用胰蛋白酶使細胞與板分離并轉(zhuǎn)移入1.5ml的Eppendorf管。在1200rpm下離心細胞7min，并且丟棄胰蛋白酶。使用Bligh和Dyer試驗進行DNA提取；添加167μl的1:2氯仿：甲醇(v/v)、55.5μl的氯仿、和100μl的去離子水。在1000rpm離心5min后，收集上部水相。

DNA擴增：在循環(huán)變溫器(“Daniel Biotech”)中使用50μl的反應(yīng)中預(yù)混合物(ready mix)(“Ornat”)來擴增dsDNA。經(jīng)過PCR，將溶液裝載至3％(w/w)的瓊脂糖凝膠(“Hy-Labs”)并進行25min。

RT-PCR：在DNA提取之后，在RT-PCR循環(huán)變溫器(“Bio Rad”)使用TaqMan探針擴增和分析鏈。

細胞分選：取具有10⁶/ml的濃度的15ml的細胞懸浮液至流動活化細胞分選儀(FACS–ARIA)。對細胞設(shè)門(gating)后，它們被分選為1,000個細胞、100個細胞、10個細胞和單個細胞。所有細胞被分選入聚丙烯的圓錐透明96井。在分選之后，進行B&D和PCR。

細胞稀釋：將細胞懸浮在1ml的培養(yǎng)基中并計數(shù)。下一步是在900μl的PBSX1中一系列稀釋，至多10³細胞–100μl。每個稀釋為再稀釋10倍，從而得到10³、10²和10個細胞：10μl至90μl的去離子水。最終，為了在理論上得到單細胞，從100個細胞稀釋取1μl放入99μl的PBSX1。

共焦/細胞觀測儀：DNA封裝——使用上面描述的方法制備包含F(xiàn)AM綴合DNA的脂質(zhì)體。在10％PBS(膜類型)上透析脂質(zhì)體持續(xù)24小時。分別地利用DLS(制造)激發(fā)和發(fā)射566-345nm測量透析之前和之后的樣品(三份)的熒光。再分透析之后和之前的熒光值以給出封裝百分比。

體內(nèi)轉(zhuǎn)染：100μl的10⁶細胞/ml的4T1(乳腺癌)皮下注射至10周齡的balb/c雌性小鼠。大約14周之后(當(dāng)原發(fā)性腫瘤足夠大)，靜脈注射100μl的脂質(zhì)體溶液。36小時之后，處死小鼠并在冰內(nèi)取其器官(+腫瘤)用于進一步步驟。

實施例1

納米顆粒制造和標(biāo)記

納米顆粒由脂質(zhì)制造，其使用適于容納(圖2)顆粒的高通量合成和標(biāo)記的在線微流體裝備(Jahn,A.等人2007,Langmuir 23,6289-6293)。制造適于容納治療有效負載的合適大小的顆粒?；瘜W(xué)試劑被裝載至穩(wěn)定的HSPC顆粒內(nèi)(Schroeder,A等人2007,Langmuir 23,4019-4025)和在～200nm的‘蛋白生產(chǎn)納米顆?！瘍?nèi)合成生物治療劑(如，蛋白/RNA)。最近，發(fā)展了可以被可控地觸發(fā)以在靶部位合成蛋白和RNA的合成納米顆粒(Schroeder,A.等人2012,Nano Lett 12,2685–2689)。這些納米顆粒由脂質(zhì)小泡組成，脂質(zhì)小泡填充有負責(zé)轉(zhuǎn)錄和翻譯的分子機器，包括以光不穩(wěn)定保護基團籠蔽的氨基酸、核糖體和DNA。顆粒作為能夠生產(chǎn)RNA/蛋白的納米工廠。在體外和體內(nèi)，蛋白/RNA合成在空間上和時間上可控，并且可以通過在毫秒的時間級上照射微米級組織區(qū)域來引發(fā)。我們將使用該平臺針對它們的抗癌活性篩分RNA和蛋白。

可以體外和體內(nèi)建模原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性治療活性。為了同時篩選多種藥物，利用DNA條碼標(biāo)記納米顆粒(圖3)。如圖3中所見，檢測1,000個(圖3A)、500個(圖3B)、5個(圖3C)細胞的群內(nèi)和甚至單細胞(圖3D)內(nèi)的DNA條碼。

實施例2

分析原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性模型

在BALB/c小鼠中使用4T1乳腺癌模型進行原始體內(nèi)研究(圖4)，由Weinberg及其合作者報道。為了確認這些模型的臨床準(zhǔn)確性，在人胚胎干細胞(hESC)畸胎瘤中建立的人衍生的腫瘤中也試驗了治療診斷納米顆粒的生物分布和活性。這些腫瘤被認為以準(zhǔn)確方式反映臨床情景，包括微環(huán)境、瘤內(nèi)形態(tài)不均一性、癌細胞亞群和細胞表現(xiàn)型(Burgos-Ojeda,D.等人2013,Cancer Res 73,3555-3565,2845)。

首先，為了檢查使用脂質(zhì)體的條碼的遞送的效率，向小鼠施用包含條碼的脂質(zhì)體或裸露的條碼。在注射48小時后，收獲、均化腫瘤和提取和擴增條碼?；A(chǔ)擴增識別RT-PCR中條碼的非特異性擴增。使用載體(脂質(zhì)體)在腫瘤組織中檢測的條碼的量顯著地較大(圖5)。因為DNA鏈(條碼)和細胞膜二者是帶負電荷的，所以DNA不進入沒有傳遞質(zhì)的細胞。因此，腫瘤中游離條碼的存在可以由到達腫瘤的細胞外基質(zhì)而不是細胞的DNA鏈解釋。

將具有100納米的直徑的條碼化納米顆粒和具有微米的直徑的條碼化納米顆粒靜脈注射至帶有乳腺癌腫瘤的BALB/C小鼠。注射48小時之后，腫瘤被解離為單細胞懸浮液并使用FAC收集細胞。通過RT-PCR提取和擴增DNA條碼。結(jié)果說明納米的納米顆粒的攝取顯著地高于微米級納米顆粒的攝取(圖6)。這些結(jié)果暗示脂質(zhì)體的攝取是依賴大小的，并偏好較小顆粒。

體內(nèi)技術(shù)的初次嘗試通過使用亞德里亞霉素(DOX)作為針對乳腺癌的藥物模型。為了確定在包含DOX的條碼化納米顆粒(BNP)和僅包含條碼而沒有藥物的安慰劑BNP之間的條碼分布中是否存在任何差異，步驟包括在兩批中合成條碼化脂質(zhì)體：1.脂質(zhì)體僅包含條碼，2.脂質(zhì)體包含條碼和DOX。以被動方式封裝條碼同時以主動方式封裝DOX。將安慰劑BNP單獨地注入一組小鼠(n＝3)中，和將DOX BNP注入另一組。在注射48小時之后，提取腫瘤并解離為單細胞懸浮液。利用生存力染料(7AAD)染色細胞并在FACS中分選為活/死細胞。從每一組提取條碼。提取后，通過RT-PCR擴增DNA條碼。將每一組(活/死)的條碼濃度轉(zhuǎn)化為條碼的量并以細胞的量歸一化以得到每細胞的DNA條碼分子。圖7(A)顯示了在安慰劑條碼化NP中，主要積累在活細胞中。該結(jié)果匹配在死細胞中幾乎沒有攝取出現(xiàn)的假設(shè)。第二組DOX處理顯示了死細胞中優(yōu)先的分布(圖7(B))。

卵巢癌是社會上是普遍存在的，其具有很少有效治療方式。該疾病在轉(zhuǎn)移至肝臟或腹部空間后多次被檢測到。

在目前的研究中，如先前所描述(Burgos-Ojeda，出處同上)，卵巢腫瘤在SCID/米色小鼠中的hESC畸胎瘤中擴大。靜脈施用裝載有抗癌藥物的條碼化納米顆粒。經(jīng)過48小時評價納米顆粒的治療任務(wù)的評估，其能夠在腫瘤中積累并進行治療任務(wù)。通過使用4T1細胞已經(jīng)證實了48小時的時間線(參見圖8)。組織的死后組織學(xué)評估被用于研究腫瘤生物分布。然后將活組織檢查樣品解離為單細胞懸浮液，并使用抗體，根據(jù)細胞亞群(包括CD45、CD11B、F4/80、CD13、REST)和生存力(活/死)分選細胞。

將包含五種不同藥物或?qū)φ栈衔?圖8描繪了安慰劑、咖啡因、順鉑、亞德里亞霉素和吉西他濱)的條碼化納米顆粒同時靜脈注射至在后腿中帶有原發(fā)性腫瘤的BALB/c小鼠。48小時后，從腫瘤取活組織檢查。然后將活組織檢查組織解離為單細胞懸浮液，并根據(jù)它們的生存力(活/死)篩選細胞。與活細胞相比，在死細胞中發(fā)現(xiàn)升高水平的藥物(吉西他濱、順鉑)條碼。中性化合物、咖啡因在活細胞和死細胞中具有相似的條碼水平。如圖8A-E所指示，對于治療該腫瘤，吉西他濱比順鉑更有效。

結(jié)果顯示了每種條碼的獨特分布。DOX和順鉑顯示了如所預(yù)期的清楚的治療作用?？Х纫蝻@示了幾乎沒有作用并且其分布在死細胞和活細胞之間幾乎相等地分配(圖8A-E)。最驚人的結(jié)果來自于兩側(cè)的治療程度：安慰劑和吉西他濱?；诩魉麨I的分布，發(fā)現(xiàn)其是最有效的藥物。與活細胞相比，幾乎全部吉西他濱條碼積累在死細胞中，超過6,000(圖8(E))。在治療效果的其它程度中，與死細胞相比，安慰劑BNP幾乎僅積累在活細胞中，超過10,000，圖8(A)。該數(shù)據(jù)暗示，只要細胞是活的，安慰劑BNP將繼續(xù)積累在細胞中。這使分布強烈地移動向活細胞移動。

該實施例圖解了在開始治療周期之前，用于確定藥物的細胞特異性效能的治療診斷平臺(圖8F)，以及研究了腫瘤微環(huán)境內(nèi)不同藥物的治療曲線。

為了驗證三種化療藥物——亞德里亞霉素、順鉑和吉西他濱——的條碼化分析，進行治療處理。實驗包括4組，每組包含6只小鼠。每組用單種藥物處理持續(xù)24天，開始10天后腫瘤誘導(dǎo)。一周一次靜脈給予每個劑量。每組用5mg/kg的亞德里亞霉素、6mg/kg的順鉑、125mg/kg的吉西他濱或作為對照的100μl的鹽水處理。利用卡尺測量腫瘤體積并計算為長度/2*(寬度)²。通過看圖9(A)，基于腫瘤體積變化百分比，可以直接對藥物效能分級。這些結(jié)果增強了分級的(rated)吉西他濱為三種藥物中最有效的藥物的診斷分析。相對于亞德里亞霉素和對照處理，吉西他濱顯著地弱化腫瘤的生長。在實驗周期期間沒有觀察到臨床毒性。開始處理24天后，提取每個小鼠的腫瘤用于進行進一步分析。圖9(B)顯示了來自每組的典型的腫瘤。該腫瘤的視覺化也增強了診斷結(jié)果并說明每個處理之間的差異。增強結(jié)果的另一個指示是腫瘤/身體重量比。腫瘤重量越小并且身體重量越大，藥物越有效。在圖9(C)中，吉西他濱中存在導(dǎo)致最小化腫瘤/身體重量比的趨勢。趨勢與腫瘤尺寸和腫瘤體積的變化相關(guān)聯(lián)。腫瘤重量參數(shù)反映了藥物抑制和損壞腫瘤生長的效果。身體重量參數(shù)反映了藥物對身體的影響或藥物的副作用多么嚴重。組合這些參數(shù)可有利于確定哪種藥物對治療腫瘤最有效和哪種藥物對身體顯示較小毒性。為檢查不同組之間組織水平中的差異，在組織學(xué)上研究所有腫瘤。利用蘇木精和伊紅染色來自腫瘤的組織切片。切片的顯微鏡檢查高度說明細胞實體腫瘤。有趣地，顯示對治療臨床響應(yīng)的腫瘤是的細胞較少且具有較低的有絲分裂計數(shù)。另地，利用兔單克隆抗-Ki67抗體(SP6；Thermo Scientific，F(xiàn)remont，CA)免疫組織學(xué)染色組織切片以確定擴增指數(shù)(未顯示)。切片的分析說明了在接受更有效治療的腫瘤中較低的擴增指數(shù)，其中擴增指數(shù)在對照、亞德里亞霉素、順鉑和吉西他濱治療的腫瘤中分別為85％、90％、65％和40％。

實施例3

方法的可行性

體內(nèi)實驗顯示了使用低于2μM的條碼濃度導(dǎo)致阻止檢測(在系統(tǒng)的LOD下)。用于體外研究的顆粒的濃度為用于體內(nèi)研究的顆粒的濃度的百分之一，以阻止在單層的細胞內(nèi)部顆粒的溢出。這允許好的統(tǒng)計和魯棒性分析。封裝的條碼的分析顯示了在顆粒內(nèi)條碼分子的充分的范圍應(yīng)當(dāng)在5-100個條碼分子/顆粒(基于DNA與脂質(zhì)摩爾比計算該范圍)的范圍內(nèi)。對于結(jié)果的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)，有效的顆粒濃度具有2-20μM的范圍。當(dāng)使用低于2μM的濃度時，存在不是所有細胞將包含至少一個顆粒的高可能性。在該濃度之上，系統(tǒng)中的SNR(信噪比)將太低。

為了確定顆粒施用后收獲細胞的最優(yōu)時間點，顆粒在組織中積累的時間、藥物殺死細胞花費的時間和在細胞中條碼降解花費的時間均應(yīng)被考慮?？紤]這些參數(shù)，在通過進行活組織檢查收獲顆粒之前，顆粒的時間循環(huán)周期被優(yōu)化為48小時。

生物分布中體內(nèi)工作顯示了花費24小時使顆粒在腫瘤組織中達到最大濃度。另外，體外工作顯示了達到若干藥物的最大治療效果的平均時間在24小時至48小時之間變化?？紤]使顆粒到達組織和使藥物在細胞中致死的時間周期——最優(yōu)的時間周期應(yīng)當(dāng)為30-48小時。由于條碼被存在于細胞內(nèi)部的DNA酶降解，延長該時間周期將承受條碼分解的風(fēng)險。

實施例4

靜脈和瘤內(nèi)施用的顆粒組合物

制備由獨特脂質(zhì)組分構(gòu)成的優(yōu)選的顆粒以適合于施用模式，具體而言，靜脈對瘤內(nèi)施用。在表1中總結(jié)了靜脈施用的顆粒和瘤內(nèi)施用的顆粒的示例性組合物。

表1：