發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及由膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病患者的生物樣品中存在的自身抗體特異性識(shí)別的生物標(biāo)志物自身抗原。

本發(fā)明提供了用于診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)和治療患者的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的方法和試劑盒。

發(fā)明背景

膜性腎病是腎病綜合征的常見(jiàn)原因。約15％的膜性腎病病例是由藥物、感染、腫瘤、免疫性疾病等引起的繼發(fā)性膜性腎病。其余85％的膜性腎病病例是特發(fā)性的，也稱為自身免疫性原發(fā)性膜性腎病。它的起源仍然未知。沒(méi)有接受治療的特發(fā)性膜性腎病患者中的大約一半將發(fā)展需要透析或腎移植的終末期腎病。在腎移植者中，他們中的約40％將復(fù)發(fā)。

pla2r1已被描述為特發(fā)性膜性腎病中的主要自身抗原，并且可用于診斷和監(jiān)測(cè)腎移植術(shù)之前和之后特發(fā)性膜性腎病的治療?；谶@種自身抗原的可能的治療策略也已經(jīng)被報(bào)道。

然而，僅有約70％的患有特發(fā)性膜性腎病的患者具有抗pla2r1自身抗體，表明其他自身抗原和相應(yīng)的自身抗體可能參與剩余的30％病例。因此，對(duì)于基于pla2r1自身抗原不能被跟蹤的30％的患者，存在相應(yīng)的診斷、預(yù)后和診療的需要。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及鑒定含有i型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域的7a(thsd7a)作為膜性腎病中的新的自身抗原和相應(yīng)的診斷和/或預(yù)后患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的體外方法，所述方法包括在從所述患者獲得的生物樣品中檢測(cè)識(shí)別thsd7a蛋白的一種或多種自身抗體的步驟。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述體外方法包括以下步驟：

(i)使從所述患者獲得的生物樣品與thsd7a多肽或其抗體結(jié)合片段接觸，和

(ii)檢測(cè)形成的任何抗原抗體復(fù)合物，

其中抗原抗體復(fù)合物的存在指示膜性腎病。

優(yōu)選地，生物樣品是血液樣品。

本發(fā)明涉及用于評(píng)估對(duì)患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的治療的有效性的體外方法，包括：

(i)在第一時(shí)間點(diǎn)確定在所述第一時(shí)間點(diǎn)從所述患者獲得的所述樣品中的抗thsd7a自身抗體的水平，

(ii)在第二時(shí)間點(diǎn)測(cè)定在所述第二時(shí)間點(diǎn)從所述患者獲得的所述樣品中的抗thsd7a自身抗體的水平，以及

(iii)比較兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的自身抗體的水平，

其中：

·與第一時(shí)間點(diǎn)相比，第二時(shí)間點(diǎn)中抗thsd7a自身抗體水平的降低表明治療有效，和/或

·與第一時(shí)間點(diǎn)相比，第二時(shí)間點(diǎn)中抗thsd7a自身抗體水平的增加表明治療無(wú)效。

本發(fā)明還提供了用于診斷和/或預(yù)后患者中的膜性腎病的試劑盒，所述試劑盒包括：

·thsd7a多肽或其抗體結(jié)合片段，和

·用于檢測(cè)在自身抗原和存在于生物樣品中的自身抗體之間形成的抗原抗體復(fù)合物的試劑。

本發(fā)明還涉及用于診斷和/或預(yù)后患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的體外方法，包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中的thsd7a水平的步驟。

在一個(gè)實(shí)施例方案中，所述方法包括以下步驟：

(i)測(cè)量從所述患者獲得的生物樣品中thsd7a蛋白的水平，

(ii)將所述水平與參考水平進(jìn)行比較，

其中與所述參考水平相比增加的thsd7a蛋白水平指示膜性腎病。

優(yōu)選地，生物樣品是腎活檢或血液樣品。

最后，本發(fā)明涉及治療方法、藥物組合物和用于治療膜性腎病的用途。

實(shí)際上，本發(fā)明涉及用于治療患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的方法，所述方法包括從所述患者體內(nèi)的樣品中離體去除抗thsd7a自身抗體。

本發(fā)明還涉及治療患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的方法，所述方法包括給予治療有效量的thsd7a多肽或其片段，表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的載體或表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的宿主細(xì)胞。

此外，本發(fā)明涉及用于治療膜性腎病的thsd7a多肽或其片段(表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的載體或表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的宿主細(xì)胞)和藥物組合物，藥物組合物包含所述thsd7a多肽或其片段(表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的載體或表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的宿主細(xì)胞)，特別是用于治療膜性腎病，更特別是特發(fā)性膜性腎病。

優(yōu)選地，對(duì)于本發(fā)明的治療方法、藥物組合物和用途，患者是thsd7a陽(yáng)性患者。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：在膜性腎病患者中檢測(cè)針對(duì)未知抗原的自身抗體。用來(lái)自膜性腎病(mn)患者和對(duì)照患者的血清探測(cè)的人腎小球提取物(hge)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。這些測(cè)試的患者中的大多數(shù)(88％)血清取自來(lái)自漢堡的預(yù)先存在的血清庫(kù)，而剩余的血清來(lái)自尼斯的患者隊(duì)列。該圖顯示不同反應(yīng)性模式的代表性圖像：所描繪的三種mn血清(mn2至mn4)與大小約250kda的腎小球蛋白反應(yīng)，但不與重組磷脂酶a2受體(rpla2r1)反應(yīng)。一個(gè)mn血清識(shí)別約180kda的腎小球蛋白以及重組pla2r1(mn36)。對(duì)于一個(gè)mn血清(mn6)、來(lái)自蛋白尿?qū)φ盏膬蓚€(gè)血清、一個(gè)患有最小變化疾病(mcd)和一個(gè)患有局灶性節(jié)段性腎小球硬化(fsgs)和一個(gè)健康供體的血清沒(méi)有觀察到反應(yīng)性。b.在針對(duì)抗pla2r1抗體陰性的膜性腎病(mn)的69個(gè)患者中，6個(gè)與250kda抗原反應(yīng)。這6個(gè)中的5個(gè)患有特發(fā)性mn，而1個(gè)患有具有陽(yáng)性抗核抗體(ana)的繼發(fā)性mn。在抗pla2r1陽(yáng)性患者(n＝60)、其他腎小球疾病患者(n＝76)或健康對(duì)照(n＝44)中沒(méi)有觀察到反應(yīng)性。

圖2：靶抗原的鑒定。a.人腎小球提取物(hge)和過(guò)表達(dá)的含有1型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域的7a(rthsd7a)的轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞與反應(yīng)性和非反應(yīng)性血清的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。該圖顯示了三個(gè)膜性腎病(mn)患者(其血清與hge和rthsd7a(mn1至mn3)二者均反應(yīng))、一個(gè)非反應(yīng)性mn患者(mn36)，一個(gè)患有最小變化疾病(mcd)的非反應(yīng)性患者和一名非反應(yīng)性健康對(duì)照患者的代表性圖像。rthsd7a遷移至比包含在腎小球裂解物中的天然蛋白質(zhì)略低的位置，最有可能是由于翻譯后修飾的差異。b.來(lái)自人腎小球提取物(hge)的裂解物的thsd7a的免疫沉淀結(jié)果。hge與來(lái)自mn患者和對(duì)照的反應(yīng)性和非反應(yīng)性血清樣品孵育，隨后加入人igg4親和基質(zhì)。離心樣品，將免疫沉淀物在還原條件下電泳，印跡在pvdf膜上，并用多克隆兔抗thsd7a抗體檢測(cè)。來(lái)自mn患者的所有5個(gè)反應(yīng)性血清免疫沉淀來(lái)自hge的靶抗原(mn1至mn5)，而一個(gè)非反應(yīng)性mn血清(mn9)以及來(lái)自健康對(duì)照患者的一個(gè)血清則沒(méi)有。在實(shí)驗(yàn)中當(dāng)用水替換血清時(shí)不發(fā)生免疫沉淀。

圖3：抗thsd7a抗體與mn患者的臨床病程之間的關(guān)系。來(lái)自一個(gè)膜性腎病患者的連續(xù)血清樣品的等體積人腎小球提取物(hge)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。在蛋白尿初始減少后，患者在2012年9月出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫和重的蛋白尿。開(kāi)始用環(huán)孢素a和類固醇的免疫抑制治療，并且蛋白尿減少，直到患者在2014年1月達(dá)到部分緩解。疾病活動(dòng)的這種發(fā)展反映在免疫抑制治療開(kāi)始后的蛋白質(zhì)印跡信號(hào)的減少。

圖4：大thsd7a蛋白(1657個(gè)氨基酸)的分子結(jié)構(gòu)。tshd7a蛋白由含有信號(hào)肽的大胞外部分、至少10個(gè)1型血小板應(yīng)答蛋白重復(fù)(其中幾個(gè)含有富含色氨酸的序列)和一個(gè)rgd基序、起始于氨基酸殘基1608的跨膜結(jié)構(gòu)域和短的細(xì)胞內(nèi)尾巴組成。

發(fā)明詳述

本發(fā)明人強(qiáng)調(diào)了在患有特發(fā)性膜性腎病的患者中存在自身抗體，所述自身抗體對(duì)新的自身抗原，即含有i型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域的7a(thsd7a)蛋白具有反應(yīng)性。

這些自身抗體存在于約15％的患有特發(fā)性膜性腎病的患者的血清中，其不存在抗pla2r1自身抗體。這代表了患有膜性腎病的患者總?cè)丝诘募s5-10％。

本發(fā)明人顯示，在患者中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)抗thsd7a自身抗體是igg4亞類；也發(fā)現(xiàn)了亞類igg3、igg2和igg1。

定義

術(shù)語(yǔ)“膜性腎病”具有其在本領(lǐng)域中的一般含義，并且是指腎病，其是成人腎病綜合征的常見(jiàn)病因。它包括由繼發(fā)性因素諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型肝炎或梅毒等引起的繼發(fā)性膜性腎病和原發(fā)性自身免疫性膜性腎病(也稱為“特發(fā)性膜性腎病”)?！疤匕l(fā)性膜性腎病”被認(rèn)為是靶向腎小球的自身免疫性疾病，主要已知的靶抗原是自身抗原pla2r1。

本文公開(kāi)的所有疾病、病癥和癥狀在提交本申請(qǐng)時(shí)具有本領(lǐng)域接受的如教科書(shū)所證實(shí)的一般含義。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“指示膜性腎病”在應(yīng)用于過(guò)程或事件時(shí)是指對(duì)膜性腎病進(jìn)行診斷的過(guò)程或事件，使得該過(guò)程或事件在患有膜性腎病比健康受試者和/或患有除膜性腎病以外的疾病的患者中明顯更頻繁地被發(fā)現(xiàn)。

術(shù)語(yǔ)“生物標(biāo)志物”和“標(biāo)志物”在本文中可互換使用。它們是指作為生物過(guò)程、生物事件和/或病理狀況的獨(dú)特指示物的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，thsd7a蛋白(或thsd7a多肽)及其任何抗體結(jié)合片段和抗thsd7a自身抗體是膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的生物標(biāo)志物。

術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”在本文中可互換使用，是指多種長(zhǎng)度的氨基酸序列，以其中性(不帶電)形式或鹽形式，并且未修飾或通過(guò)糖基化、側(cè)鏈氧化、磷酸化、瓜氨酸化或轉(zhuǎn)谷氨酰胺修飾。在某些實(shí)施方案中，氨基酸序列是全長(zhǎng)天然蛋白。在其他實(shí)施方案中，氨基酸序列是全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的較小片段。在其它實(shí)施方案中，氨基酸序列通過(guò)附接于氨基酸側(cè)鏈的附加取代基修飾，諸如添加n-或c-末端的蛋白質(zhì)標(biāo)簽、糖基單位、脂質(zhì)或無(wú)機(jī)離子諸如磷酸鹽，以及涉及鏈的化學(xué)轉(zhuǎn)化修飾，諸如巰基的氧化。因此，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”(或其等同術(shù)語(yǔ))旨在包括經(jīng)歷不顯著改變其特定性質(zhì)的那些修飾的全長(zhǎng)天然蛋白質(zhì)或其片段的氨基酸序列。特別地，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括蛋白質(zhì)同種型，即由相同基因編碼但在pi或mw或兩者上不同的變體。此類同種型在其氨基酸序列(例如，作為選擇性剪接或有限的蛋白水解的結(jié)果)方面可以不同，或者可以由差異翻譯后修飾(例如糖基化、?；?、磷酸化)引起。

術(shù)語(yǔ)thsd7a(thrombospondintype1domaincontaining7a，含有i型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域的7a)具有其在本領(lǐng)域中的一般含義，并且指在足細(xì)胞上高表達(dá)的1657個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，并且在血管發(fā)生期間通過(guò)fak依賴性機(jī)制參與內(nèi)皮細(xì)胞遷移和絲狀偽足形成。該術(shù)語(yǔ)可以包括天然存在的thsd7a及其變體和修飾形式。thsd7a可以來(lái)自任何來(lái)源，但通常是哺乳動(dòng)物(例如，人和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物或其他哺乳動(dòng)物物種)thsd7a，特別是人thsd7a。在q9upz6(uniprot數(shù)據(jù)庫(kù))和np_056019(genpept數(shù)據(jù)庫(kù)，前體序列)中提供示例性人天然thsd7a氨基酸序列，并且在nm_015204(genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，前體序列)中提供示例性人天然thsd7amrna序列。thsd7a蛋白的結(jié)構(gòu)如圖4所示。

如本文所用，表述“thsd7a的片段”是指thsd7a的連續(xù)元件。通常，所述片段是生物活性片段，即它包含thsd7a的一種或多種功能性質(zhì)。

在本發(fā)明的上下文中，thsd7a的“片段”包含、優(yōu)選由thsd7a的整個(gè)氨基酸序列的至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少94％，至少96％，至少98％，至少99％組成。

優(yōu)選地，所述片段包含thsd7a的整個(gè)氨基酸序列中至少100個(gè)，至少200個(gè)，至少300個(gè)，至少400個(gè)，至少500個(gè)，至少600個(gè)，至少700個(gè)，至少800個(gè)，至少900個(gè)，至少1000個(gè)，至少1100個(gè)，至少1120個(gè)，至少1250個(gè)，至少1300個(gè)，至少1400個(gè)，至少1500個(gè)，至少1600個(gè)，至少1620個(gè)，至少1640個(gè)氨基酸。

優(yōu)選地，所述片段被針對(duì)thsd7a的自身抗體識(shí)別。測(cè)定片段與所述自身抗體相互作用的能力可以通過(guò)上述或本領(lǐng)域已知的用于測(cè)定直接結(jié)合的方法之一完成。

術(shù)語(yǔ)pla2r1(分泌性磷脂酶a2受體，也稱為pla2r1)具有其在本領(lǐng)域中的一般含義，并且本文中指m型磷脂酶a2受體，其是通過(guò)pla2r1基因在人類中編碼的受體，特別地已知為特發(fā)性膜性腎病的主要抗原腎病。在np_001007268(genpept數(shù)據(jù)庫(kù))中提供示例性人天然pla2r1氨基酸序列，并且在nm_001007267(genbank數(shù)據(jù)庫(kù))中提供示例性人天然thsd7amrna序列。值得注意的是，本文公開(kāi)的所有對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的引用諸如代碼或登錄號(hào)均指可在2014年7月24日在線獲得的版本。

術(shù)語(yǔ)“pla2r1陰性患者”或“thsd7a陰性患者”是指其血清不含分別針對(duì)pla2r1或thsd7a的自身抗體(或至少不含可檢測(cè)的自身抗體)的患者。相反，“pla2r1陽(yáng)性患者”或“thsd7a陽(yáng)性患者”是指其血清含有分別針對(duì)pla2r1或thsd7a的自身抗體的患者。

術(shù)語(yǔ)“自身抗體”具有其在本領(lǐng)域中的一般含義，并且是指由受試者(或患者)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的并針對(duì)受試者(或患者)自身蛋白質(zhì)(例如thsd7a)的抗體。自身抗體可攻擊身體自身的細(xì)胞、組織和/或器官，引起炎癥和細(xì)胞損傷。術(shù)語(yǔ)“識(shí)別thsd7a的自身抗體”可以與“抗thsd7a自身抗體”互換使用。

當(dāng)在本文中與抗原(例如thsd7a)結(jié)合使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“抗體結(jié)合片段”是指保留抗原結(jié)合抗體以形成抗體抗原復(fù)合物的能力的抗原片段。特別地，本發(fā)明的抗原的抗體結(jié)合片段保留了結(jié)合對(duì)膜性腎病特異性的自身抗體的能力?？乖暮线m的抗體結(jié)合片段可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)簡(jiǎn)單試驗(yàn)來(lái)鑒定，以確定其結(jié)合膜性腎病的特異性自身抗體的能力。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“患者”是指人類受試者或另一哺乳動(dòng)物受試者(例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物、狗、貓、山羊、馬、豬、小鼠、大鼠、兔等)，它們可患有膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病。優(yōu)選地，患者是人類患者。更優(yōu)選地，所述患者被懷疑患有膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病。

術(shù)語(yǔ)“生物樣品”在本文中以其最廣泛的含義使用。生物樣品通常被獲得用于受試者。所述受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。通常，生物樣品通常從患者獲得。通常，所述樣品包含一組代表性的自身抗體。

樣品可以是可以測(cè)定本發(fā)明的生物標(biāo)志物的任何生物組織或流體。這樣的樣品包括但不限于可以含有或不含有細(xì)胞，例如血液(例如全血、血清或血漿)的體液。這樣的樣品還包括活檢(例如腎活檢)。術(shù)語(yǔ)生物樣品還包括通過(guò)處理生物樣品衍生的任何材料。衍生材料包括但不限于從樣品中分離的細(xì)胞(或其后代)或從樣品提取的蛋白質(zhì)。生物樣品的處理可以涉及以下一種或多種：過(guò)濾、蒸餾、提取、濃縮、干擾組分的滅活、試劑的添加等。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“對(duì)照”，當(dāng)用于表征受試者時(shí)，是指健康的受試者或已被診斷患有除腎病以外的特定疾病的患者。術(shù)語(yǔ)“對(duì)照樣品”是指從健康受試者或診斷患有除腎病癥之外的疾病的患者獲得的一個(gè)或多于一個(gè)樣品。

術(shù)語(yǔ)“正常”和“健康”在本文中可互換使用。他們是指沒(méi)有顯示與腎臟疾病相關(guān)的任何癥狀，并且沒(méi)有診斷出患有膜性腎病或其他腎病的受試者。優(yōu)選地，正常受試者沒(méi)有使用影響腎系統(tǒng)的藥物上，并且沒(méi)有被診斷為患有任何其他疾病。在某些實(shí)施方案中，與獲得待測(cè)試的生物樣品的受試者相比，正常受試者具有相似的性別、年齡和/或體重指數(shù)。術(shù)語(yǔ)“正?！痹诒疚闹幸灿糜谙薅◤慕】凳茉囌攉@得的樣品。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“參考水平”是指在從對(duì)照獲得的生物樣品中測(cè)量的水平，或優(yōu)選至從幾個(gè)對(duì)照獲得的生物樣品中測(cè)量的幾個(gè)水平的平均值。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“診斷”(“diagnosis”、“diagnosing”或“diagnostic”)以其最廣泛的含義使用，并且包括膜性腎病的診斷、預(yù)后、診療和監(jiān)測(cè)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療”(“treat”或“treatment”)是指減輕或緩解與膜性腎病(特別是特發(fā)性膜性腎病)相關(guān)的醫(yī)學(xué)病況相關(guān)的至少一種不良作用或癥狀。這些包括減少抗thsd7a自身抗體的量，減少、抑制或終止抗thsd7a自身抗體的產(chǎn)生，抑制免疫系統(tǒng)，并且當(dāng)它們結(jié)合腎小球時(shí)減少與自身抗體的活性相關(guān)的炎癥和降解/損傷。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“診療”是指例如通過(guò)診斷方法鑒定可能受益于特定治療的患者的鑒定。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指可以減少可溶性抗thsd7a自身抗體的量的活性劑的量。與在治療開(kāi)始之前存在于血清中的自身抗體的量相比，減少的量為自身抗體減少至少10％，特別是至少20％，更特別地至少40％，優(yōu)選地至少60％，更優(yōu)選地至少80％，甚至更優(yōu)選地至少95％。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”是指本發(fā)明的活性劑(例如thsd7a多肽或其片段，表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的載體或表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的宿主細(xì)胞，如下所述)與藥學(xué)工業(yè)中通常使用的化學(xué)品和化合物的藥學(xué)上可接受的載體組合。

基于抗thsd7a自身抗體的檢測(cè)的診斷和預(yù)后方法和試劑盒

診斷方法

因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的涉及用于診斷和/或預(yù)后患者中膜性腎病、更特別是特發(fā)性膜性腎病的體外方法，所述方法包括在從所述患者獲得的生物樣品中檢測(cè)一種或更多種識(shí)別thsd7a蛋白的自身抗體。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物樣品是血液樣品(包括全血、血清或血漿)。優(yōu)選地，生物樣品是血清或血漿。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于診斷和/或預(yù)后患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的體外方法包括以下步驟：

(i)使從所述患者獲得的生物樣品與thsd7a多肽或其抗體結(jié)合片段接觸，和

(ii)檢測(cè)形成的任何抗原抗體復(fù)合物，

其中抗原抗體復(fù)合物的存在指示膜性腎病。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，thsd7a多肽或其抗體結(jié)合片段可以來(lái)自不同的哺乳動(dòng)物物種，特別是人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、兔或小鼠。

在一個(gè)實(shí)施方案中，thsd7a多肽可以是完全thsd7a蛋白。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體結(jié)合片段可以包含thsd7a的完整細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或由其組成或由thsd7a的一個(gè)或幾個(gè)獨(dú)特的i型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域和/或接頭莖構(gòu)成的其片段。

本發(fā)明的thsd7a多肽和更一般地所有生物標(biāo)志物可以通過(guò)任何合適的方法制備，包括重組方法。例如在“theproteins”(第ii卷，第3版，h.neurath等人(編輯)，1976，academicpress：newyork，ny，第105-237頁(yè))如所描述的此類方法也可以用于合成本發(fā)明的生物標(biāo)志物。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽/蛋白質(zhì)生物標(biāo)志(例如thsd7a多肽)固定在固體載體或支持物(例如珠或陣列)上。因此，在該實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使用涂覆有thsd7a多肽或其片段的裝置。通常，所述裝置是醫(yī)療裝置或診斷裝置，優(yōu)選診斷裝置。

通常，在本發(fā)明的上下文中，thsd7a多肽或其片段固定到所述裝置上。

本發(fā)明的診斷方法包括檢測(cè)在本發(fā)明的生物標(biāo)志物(例如thsd7a多肽)和存在于測(cè)試的生物樣品中的自身抗體之間形成的抗原抗體復(fù)合物。該檢測(cè)指示所述樣品中存在自身抗體(即抗thsd7a自身抗體)。

在本發(fā)明的實(shí)踐中，可以通過(guò)任何合適的方法進(jìn)行此類復(fù)合物的檢測(cè)(參見(jiàn)例如e.harlow和a.lane,"antibodies:alaboratoriesmanual",1988,coldspringharborlaboratory:coldspringharbor,ny)。

例如，可以使用免疫測(cè)定法進(jìn)行抗原抗體復(fù)合物的檢測(cè)。大量免疫測(cè)定技術(shù)是可用的，包括放射免疫測(cè)定、酶免疫測(cè)定(eia)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、免疫熒光、免疫沉淀和線印跡。免疫測(cè)定是本領(lǐng)域眾所周知的，并且落入本領(lǐng)域技術(shù)人員的一般知識(shí)內(nèi)。用于進(jìn)行此類測(cè)定的方法以及實(shí)際應(yīng)用和程序概述在教科書(shū)中。此類教科書(shū)的實(shí)例包括p.tijssen于practiceandtheoryofenzymeimmunoassays,編輯r.h.burdon和v.p.h.knippenberg,elsevier,amsterdam(1990),pp.221-278中以及methodsinenzymology,編輯s.p.colowick等人,academicpress涉及免疫學(xué)檢測(cè)方法的各卷，特別是第70、73、74、84、92和121卷。免疫測(cè)定可以是競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性的。例如，夾心測(cè)定的許多變化中的任何一種技術(shù)可用于進(jìn)行免疫測(cè)定。簡(jiǎn)言之，在應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的抗thsd7a自身抗體的檢測(cè)的典型夾心測(cè)定中，將未標(biāo)記的thsd7a多肽(生物標(biāo)志物)固定在固體表面上(如上所述)，并將待測(cè)試的生物樣品在允許形成抗原抗體復(fù)合物的條件下與結(jié)合的生物標(biāo)志物接觸一段時(shí)間。優(yōu)選地，抗原抗體復(fù)合物的形成在非還原條件下完成。

孵育后，加入用可檢測(cè)部分標(biāo)記并特異性識(shí)別來(lái)自所測(cè)試物種的抗體的抗體(例如，用于人受試者的抗人igg)，并在允許任何生物標(biāo)志物-結(jié)合的自身抗體和標(biāo)記的抗體之間的三元復(fù)合物形成的條件下孵育。洗去任何未結(jié)合的物質(zhì)，通過(guò)觀察/檢測(cè)由可檢測(cè)部分直接或間接產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)確定樣品中任何抗thsd7a自身抗體的存在。該測(cè)定中的變化包括其中將生物樣品和標(biāo)記的抗體同時(shí)加入到固定化的thsd7a蛋白/多肽生物標(biāo)志物中的測(cè)定。

二抗(即，如上所述在夾心測(cè)定中加入的抗體)可以用任何可檢測(cè)部分標(biāo)記，即任何實(shí)體，其通過(guò)其化學(xué)性質(zhì)提供分析上可識(shí)別的信號(hào)，從而允許檢測(cè)三元復(fù)合物，因此檢測(cè)生物標(biāo)志物-抗體復(fù)合物。

檢測(cè)可以是定性的或定量的。用于標(biāo)記生物分子諸如抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)例如"affinitytechniques.enzymepurification:partb",methodsinenzymol,1974,vol.34,w.b.jakoby和m.wilneck(eds.),academicpress:newyork,ny；以及m.wilchek和e.a.bayer,anal.biochem.,1988,171:1-32)。免疫測(cè)定中最常用的可檢測(cè)部分是酶和熒光團(tuán)。在酶免疫測(cè)定(eia或elisa)的情況下，通常通過(guò)戊二醛或高碘酸鹽將諸如辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶等的酶與二抗綴合。與特定酶一起使用的底物通常被選擇用于在相應(yīng)的酶水解時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)的顏色變化。在免疫熒光的情況下，二抗與熒光部分化學(xué)偶聯(lián)，而不改變其結(jié)合能力。在熒光標(biāo)記的抗體與生物標(biāo)志物-抗體復(fù)合物結(jié)合并去除任何未結(jié)合的材料后，檢測(cè)熒光部分產(chǎn)生的熒光信號(hào)，并任選地定量?；蛘?，二抗可以用放射性同位素、化學(xué)發(fā)光部分或生物發(fā)光部分標(biāo)記。

通常，在本發(fā)明的上下文中，thsd7a多肽是分離的多肽或重組多肽。

如上所述，本發(fā)明的生物標(biāo)志物被患有膜性腎病、更特別是特發(fā)性膜性腎病的患者群體的血清特異性識(shí)別，并且特別是被沒(méi)有抗性-pla2r1自身抗體的膜性腎病患者的血清特異性識(shí)別。

因此，在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述患者是pla2r陰性患者。

該患者對(duì)于膜性腎病的所有常見(jiàn)原因(例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型肝炎和梅毒)也被檢測(cè)為陰性。

目前，對(duì)于pla2r1陰性患者，沒(méi)有可用于診斷膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的非侵入性方法。因此，所述患者必須經(jīng)歷腎活檢。

相反，本發(fā)明的方法是非常有希望的，因?yàn)樗梢悦獬趖hsd7a陰性患者中以及在thsd7a陽(yáng)性患者中執(zhí)行侵入性技術(shù)的需要。

在具體實(shí)施方案中，所述患者沒(méi)有和/或不會(huì)經(jīng)歷腎活檢。

所述方法還可以基于檢測(cè)抗pla2r1自身抗體(在專利申請(qǐng)wo2010/009457中描述)并行地應(yīng)用于膜性腎病的診斷方法，和評(píng)估膜性腎病的另外的生物標(biāo)志物(例如繼發(fā)性膜性腎病的生物標(biāo)志物)。此類生物標(biāo)志物的實(shí)例包括但不限于抗核抗體(ana)、抗乙型肝炎抗原和快速血漿反應(yīng)素(rpr)。

使用所述診斷方法獲得的結(jié)果可以與臨床數(shù)據(jù)、來(lái)自其他測(cè)試的結(jié)果、對(duì)膜性腎病的診斷進(jìn)行的測(cè)定或程序進(jìn)行比較和/或組合。這樣的比較和/或組合可以幫助提供更精細(xì)的診斷。

膜性腎病的預(yù)后方法和治療監(jiān)測(cè)

本發(fā)明人還顯示抗ths7a自身抗體的存在和水平與膜性腎病患者、更特別是特發(fā)性膜性腎病患者的治療有效性、緩解或復(fù)發(fā)之間的相關(guān)性。

目前用于膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的治療是免疫抑制治療，例如環(huán)孢素，他克莫司，硫唑嘌呤，英夫利昔單抗，奧馬珠單抗，達(dá)利珠單抗，阿達(dá)木單抗，依庫(kù)珠單抗，依法珠單抗，那他珠單抗，奧馬珠單抗和雷帕霉素。它還包括環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥和利妥昔單抗。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于評(píng)估對(duì)患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的治療有效性的體外方法，包括：

(i)在第一時(shí)間點(diǎn)確定在所述第一時(shí)間點(diǎn)從所述患者獲得的所述樣品中的抗thsd7a自身抗體的水平，

(ii)在第二時(shí)間點(diǎn)測(cè)定在所述第二時(shí)間點(diǎn)從所述患者獲得的所述樣品中的抗thsd7a自身抗體的水平，以及

(iii)比較兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的自身抗體的水平，

其中：

·與第一時(shí)間點(diǎn)相比，第二時(shí)間點(diǎn)中抗thsd7a自身抗體水平的降低表明治療有效，和/或

·與第一時(shí)間點(diǎn)相比，第二時(shí)間點(diǎn)中抗thsd7a自身抗體水平的增加表明治療無(wú)效。

本發(fā)明的方法優(yōu)選對(duì)已診斷為膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病并且是thsd7a陽(yáng)性患者的患者進(jìn)行。

在本發(fā)明的實(shí)踐中，抗thsd7a自身抗體的水平的測(cè)定可以通過(guò)任何合適的定量方法進(jìn)行，例如如上所述(參見(jiàn)例如e.harlow和a.lane,"antibodies:alaboratoriesmanual",1988,coldspringharborlaboratory:coldspringharbor,ny)。特別地，抗thsd7a自身抗體的水平可以通過(guò)其中形成抗原抗體復(fù)合物的免疫測(cè)定法來(lái)檢測(cè)。

如上所述，患者通常最初被診斷患有膜性腎病，并且具有可檢測(cè)量的抗thsd7a自身抗體。在例如用免疫抑制治療治療時(shí)，隨著時(shí)間的推移，在有效治療的情況下觀察到可檢測(cè)的抗thsd7a自身抗體的量的減少。

當(dāng)減少至少10％，特別是至少20％，更特別地至少30％，甚至更特別地至少40％，優(yōu)選地至少50％，更優(yōu)選地至少60％，甚至更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選至少80％的抗thsd7a自身抗體水平時(shí)，治療被認(rèn)為是有效的。這通常表明良好的預(yù)后。

在理想情況下，自身抗體的量應(yīng)當(dāng)?shù)陀诒疚乃龅臋z測(cè)方法的可檢測(cè)水平，并且患者被認(rèn)為處于病癥的緩解中。

相反，當(dāng)?shù)谝缓偷诙r(shí)間點(diǎn)之間的水平穩(wěn)定或增加至少5％，特別是至少10％，更特別地至少20％，甚至更特別地至少30％時(shí)，甚至更特別地至少40％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，甚至更優(yōu)選至少70％，甚至更優(yōu)選至少80％或更多的初始水平的抗thsd7a自身抗體，治療被認(rèn)為是無(wú)效的。

可以觀察到幾種情況。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在第二時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有檢測(cè)到抗thsd7a自身抗體。這表明患者被認(rèn)為處于緩解。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，觀察到抗thsd7a自身抗體的穩(wěn)定水平：在第一和第二時(shí)間點(diǎn)獲得的水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方差內(nèi)相當(dāng)?shù)叵嗨?，偏差在約1-5％偏差之間，優(yōu)選3％偏差。這表示穩(wěn)定的疾病，其中治療持續(xù)時(shí)間不足(因此如果臨床指示，則應(yīng)繼續(xù)治療)或無(wú)效。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，與第一時(shí)間點(diǎn)相比，在第二時(shí)間點(diǎn)觀察到增加水平的抗thsd7a自身抗體，并且第一時(shí)間點(diǎn)具有可檢測(cè)的抗thsd7a自身抗體。這表明疾病的惡化和/或缺乏有效的治療。增加至少30％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少100％，甚至更優(yōu)選至少200％被認(rèn)為表示情況惡化和不良預(yù)后。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，與第一時(shí)間點(diǎn)相比，在第二時(shí)間點(diǎn)觀察到增加水平的抗thsd7a自身抗體，并且第一時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有可檢測(cè)的抗thsd7a自身抗體。這表明患者已復(fù)發(fā)并且膜性腎病已復(fù)發(fā)。

根據(jù)本發(fā)明，第二時(shí)間點(diǎn)被選擇為晚于第一時(shí)間點(diǎn)?？梢圆呗孕缘乩缇椭委煵呗院陀糜趯?duì)有發(fā)展膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病風(fēng)險(xiǎn)的患者或已經(jīng)患有膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的患者和具有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)的患者選擇第一和第二時(shí)間點(diǎn)。

例如，第一時(shí)間點(diǎn)可以在對(duì)患者施用任何治療之前，第二時(shí)間點(diǎn)可以置于治療應(yīng)當(dāng)顯示效果的時(shí)刻或在治療結(jié)束時(shí)，并且可以稍后重復(fù)該測(cè)定。

因此，該測(cè)定可以重復(fù)幾次；可以在多于兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)估抗thsd7a自身抗體水平。步驟(iii)的比較必須與第一時(shí)間點(diǎn)或與先前的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較。當(dāng)在該時(shí)間期間觀察到抗thsd7a自身抗體水平的全面降低時(shí)，指示患者健康的改善和治療的有效性。相反，當(dāng)在該時(shí)間期間沒(méi)有觀察到抗thsd7a自身抗體水平的降低時(shí)，特別是當(dāng)觀察到總體增加時(shí)，指示患者健康的降低和治療的無(wú)效性。在一段時(shí)間的沒(méi)有可檢測(cè)的抗thsd7a自身抗體之后可檢測(cè)的抗thsd7a自身抗體的再現(xiàn)指示復(fù)發(fā)。

對(duì)于在不同時(shí)間點(diǎn)從患者收集的所有樣品，所使用的測(cè)定是相同的。

在無(wú)效治療的情況下，必須調(diào)整治療策略。

考慮到上述內(nèi)容，用于評(píng)估對(duì)患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的治療的有效性的體外方法也構(gòu)成了在患者中預(yù)后膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的方法。

試劑盒

在另一方面，本發(fā)明提供了包含可用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法的材料的試劑盒。本文提供的診斷程序可以由診斷實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室或從業(yè)者來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明提供了可用于這些不同設(shè)置的試劑盒。

用于檢測(cè)生物樣品中的thsd7a自身抗體和/或用于診斷根據(jù)本發(fā)明的患者中的膜性腎病的材料和試劑可以在試劑盒中組裝在一起。本發(fā)明的每種試劑盒包含至少一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)/多肽生物標(biāo)志物，優(yōu)選其量適合于檢測(cè)生物樣品中的自身抗體。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于檢測(cè)從患者獲得的生物樣品中識(shí)別thsd7a的自身抗體的試劑盒，所述試劑盒包括：

·thsd7a多肽或其抗體結(jié)合片段，和

·用于檢測(cè)在自身抗原、優(yōu)選thsd7a多肽或其抗體結(jié)合片段與自身抗體、優(yōu)選針對(duì)存在于生物樣品中的thsd7a的自身抗體之間形成的抗原抗體復(fù)合物的試劑。

根據(jù)本發(fā)明，所述試劑允許檢測(cè)存在于所述生物樣品中的自身抗體，其中所述自身抗體是指示膜性腎病的抗thsd7a自身抗體。

在本發(fā)明的上下文中，所述thsd7a多肽是哺乳動(dòng)物thsd7a多肽/蛋白或其抗體結(jié)合片段，優(yōu)選人thsd7a多肽/蛋白或其抗體結(jié)合片段，特別是包含thsd7a的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或由其組成或由其一個(gè)或幾個(gè)獨(dú)特的i型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域和/或接頭莖構(gòu)成的其片段。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，thsd7a多肽或其抗體結(jié)合片段可來(lái)自不同的哺乳動(dòng)物物種，特別是來(lái)自人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、兔或小鼠。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的本發(fā)明的試劑盒，其用于診斷患者中的膜性腎病。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含pla2r1多肽或其抗體結(jié)合片段。

在本發(fā)明的上下文中，所述pla2r1多肽是哺乳動(dòng)物pla2r1多肽/蛋白及其抗體結(jié)合片段，優(yōu)選人pla2r1多肽/蛋白及其抗體結(jié)合片段。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，pla2r1多肽或其抗體結(jié)合片段可以來(lái)自不同的哺乳動(dòng)物物種，特別是來(lái)自人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、豬、兔或小鼠。

用于檢測(cè)在自身抗原標(biāo)志物和存在于生物樣品中的自身抗體之間形成的抗原抗體復(fù)合物的試劑還允許檢測(cè)指示膜性腎病(還指抗thsd7a自身抗體)的抗pla2r1自身抗體。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒可以進(jìn)一步包含至少一種額外的膜性腎病的生物標(biāo)志物，例如繼發(fā)性膜性腎病的生物標(biāo)志物(諸如ana、抗乙型肝炎抗原、快速血漿反應(yīng)素等)。

包括在本發(fā)明的試劑盒中的多肽生物標(biāo)志物可以或可以不固定在基材表面上(例如珠、陣列等)。

因此，一方面，本發(fā)明還涉涂覆有thsd7a多肽或其片段的裝置。通常，所述裝置是醫(yī)療裝置或診斷裝置，優(yōu)選診斷裝置。

優(yōu)選地，所述裝置用于診斷和/或預(yù)后膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的方法中。通常，在本發(fā)明的上下文中，thsd7a多肽或其片段固定在所述裝置上。

將多肽分子固定在固體表面上的方法是本領(lǐng)域已知的。多肽/蛋白質(zhì)可以通過(guò)共價(jià)或被動(dòng)結(jié)合到固體載體或支持物的表面而被固定化。合適的載體或支持物材料的實(shí)例包括但不限于瓊脂糖、纖維素、硝化纖維素、葡聚糖、sephadex、sepharose、羧甲基纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、濾紙、磁鐵礦、離子交換樹(shù)脂、玻璃、聚胺-甲基-乙烯基-醚-馬來(lái)酸共聚物、氨基酸共聚物、乙烯-馬來(lái)酸共聚物、尼龍、絲綢等。多肽/蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物在固體載體或支持物的表面上的固定可以包括使用本領(lǐng)域公知的方法交聯(lián)，共價(jià)結(jié)合或物理吸附。固體載體或支持物可以是珠、顆粒、微孔板、陣列、比色皿、管、膜或適于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的診斷方法的任何其它形狀(例如，使用免疫測(cè)定)。

因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所提供的，本發(fā)明的試劑盒包括用于診斷膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的陣列?；蛘?，基材表面可以包括在本發(fā)明的試劑盒中，用于固定本發(fā)明的生物標(biāo)志物。

本發(fā)明的試劑盒還包含至少一種用于檢測(cè)試劑盒中包含的肽生物標(biāo)志物(例如thsd7a和/或pla2r)與存在于生物樣品中的自身抗體之間形成的生物標(biāo)志物-抗體復(fù)合物的試劑。這樣的試劑可以是例如如上所述特異性識(shí)別來(lái)自所測(cè)試物種的抗體(例如，針對(duì)人受試者的抗人igg，特別是igg4、igg3、igg2和igg1，優(yōu)選igg4)的標(biāo)記抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記的抗體識(shí)別所有形式的人igg。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述標(biāo)記的抗體特異性識(shí)別人igg4亞類。

取決于程序，試劑盒可以進(jìn)一步包括以下的一種或多種：提取緩沖液和/或試劑，封閉緩沖液和/或試劑，免疫檢測(cè)緩沖液和/或試劑，標(biāo)記緩沖液和/或試劑和檢測(cè)工具。使用這些緩沖液和試劑進(jìn)行該方法的不同步驟的方案可以包括在試劑盒中。包括在本發(fā)明的試劑盒中的不同試劑可以固體(例如凍干)或液體形式提供。本發(fā)明的試劑盒可任選地包含用于每種個(gè)體緩沖液和/或試劑的不同容器(例如，小瓶、安瓿、試管、燒瓶或瓶)。每種成分通常適合在其各自的容器中等分或以濃縮形式提供。還可以提供適于執(zhí)行所公開(kāi)的方法的某些步驟的其他容器。試劑盒的個(gè)體容器優(yōu)選保持在密閉限制中用于商業(yè)銷售。

在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明的方法在患者中使用其組分用于診斷膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的說(shuō)明書(shū)。使用根據(jù)本發(fā)明方法的試劑盒的說(shuō)明書(shū)可包括用于處理從患者獲得的生物樣品和/或用于進(jìn)行測(cè)試的說(shuō)明書(shū)，和/或用于解釋結(jié)果的說(shuō)明書(shū)。試劑盒還可以含有由管理藥品或生物制品的制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式的通知。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的陣列或蛋白質(zhì)陣列，其包含至少固定于其表面的本發(fā)明的thsd7a多肽生物標(biāo)記物。優(yōu)選地，陣列包含多于一種本發(fā)明的多肽/蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，因此還包含適合于檢測(cè)pla2r陽(yáng)性患者的pla2r1多肽生物標(biāo)志物。陣列還可以包含膜性腎病的至少一種另外的生物標(biāo)志物，例如繼發(fā)性膜性腎病的生物標(biāo)志物(諸如ana、抗乙型肝炎抗原、快速血漿反應(yīng)素等)。

在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了用于診斷膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的蛋白質(zhì)珠懸浮液陣列。這種珠懸浮陣列包括一種或多種可識(shí)別的獨(dú)特顆?；蛑榈膽腋∫海渲忻總€(gè)珠含有與其大小、顏色或熒光特征相關(guān)的編碼特征，并且其中每個(gè)珠涂覆有本發(fā)明的多肽/蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及本發(fā)明的試劑盒、陣列或珠在患者中診斷膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的用途。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述試劑盒、陣列或珠包含

·thsd7a多肽或其抗體結(jié)合片段，和

·用于檢測(cè)在自身抗原標(biāo)志物和存在于生物樣品中的自身抗體之間形成的抗原抗體復(fù)合物的試劑，

并且可以根據(jù)本發(fā)明的方法使用。

本發(fā)明的所述試劑盒、陣列或珠還可以用于評(píng)估患者中膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的治療的有效性，以及用于預(yù)后患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病。

在具體實(shí)施方案中，所述患者先前已經(jīng)評(píng)估了識(shí)別pla2r1的自身抗體的存在并且對(duì)于所述自身抗體是陰性的。該患者對(duì)于膜性腎病的所有常見(jiàn)原因(例如，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙型肝炎和梅毒)也被檢測(cè)為陰性。

在這種情況下，用于診斷所述患者的膜性腎病的本發(fā)明的試劑盒或陣列既不包含pla2r1多肽或其抗體結(jié)合片段，也不包含膜性腎病的任何其它生物標(biāo)志物。

基于thsd7a自身抗原檢測(cè)的診斷方法和試劑盒

本發(fā)明人顯示自身抗原thsd7a在患有膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病(特別是具有thsd7a自身抗體的患者)的患者的腎中過(guò)表達(dá)。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及thsd7a作為膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的生物標(biāo)志物的用途。

因此，本發(fā)明涉及用于診斷和/或預(yù)后患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的體外方法，包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中的thsd7a水平的步驟。

根據(jù)本發(fā)明，用于診斷和/或預(yù)后患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的所述體外方法還包括監(jiān)測(cè)患者的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病。

根據(jù)本發(fā)明，thsd7a水平包括thsd7a蛋白水平和mrna蛋白水平。

在具體實(shí)施方案中，所述患者是pla2r陰性患者。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還可以基于檢測(cè)抗pla2r1自身抗體和膜性腎病的其它生物標(biāo)志物，與膜性腎病的診斷方法并行應(yīng)用。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物樣品優(yōu)選是血液樣品或腎活檢。

基于檢測(cè)thsd7a蛋白水平的診斷方法

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于診斷和/或預(yù)后患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的體外方法，包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中thsd7a蛋白水平的步驟。

在特定實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：

(i)測(cè)量從所述患者獲得的生物樣品中的thsd7a蛋白水平，

(ii)將所述水平與參考水平相比較，

其中與所述參考水平相比增加的thsd7a蛋白水平指示膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病。

優(yōu)選地，所述生物樣品是血液樣品或腎活檢。

通常，thsd7a蛋白水平的增加對(duì)應(yīng)于在對(duì)照樣品中測(cè)量的蛋白質(zhì)水平的至少20％、優(yōu)選至少50％的增加。

thsd7a水平可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的不同方法測(cè)量。

在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括使生物樣品與能夠與存在于生物樣品中的生物標(biāo)志物(例如thsd7a)選擇性相互作用的結(jié)合伴侶接觸。

結(jié)合伴侶可以是可以是多克隆或單克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合伴侶可以是適體。

本發(fā)明的多克隆抗體或其片段可以根據(jù)已知方法通過(guò)向選自例如豬、牛、馬、兔、山羊、綿羊和小鼠等的宿主動(dòng)物施用適當(dāng)?shù)目乖虮砦粊?lái)產(chǎn)生。本領(lǐng)域已知的各種佐劑可用于增強(qiáng)抗體產(chǎn)生。盡管可用于實(shí)施本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，但優(yōu)選單克隆抗體。

本發(fā)明的單克隆抗體或其片段可以通過(guò)使用通過(guò)培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系提供抗體分子產(chǎn)生的任何技術(shù)來(lái)制備和分離。用于生產(chǎn)和分離的技術(shù)包括但不限于最初由kohler和milstein(1975)描述的雜交瘤技術(shù)；人類b細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(cote等人，1983)；和ebv雜交瘤技術(shù)(cole等人，1985)。

或者，描述的用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)4,946,778)可以適于產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明的生物標(biāo)志物的單鏈抗體?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的抗體還包括抗生物標(biāo)志物片段，包括但不限于可通過(guò)胃蛋白酶消化完整抗體分子產(chǎn)生的f(ab')2片段，和可通過(guò)將f(ab')2片段的二硫鍵還原產(chǎn)生的fab片段?；蛘?，可構(gòu)建fab和/或scfv表達(dá)文庫(kù)以允許快速鑒定對(duì)本發(fā)明的生物標(biāo)志物具有所需特異性的片段。例如，可以使用抗體的噬菌體展示。在這樣的方法中，單鏈fv(scfv)或fab片段在合適的噬菌體的表面上表達(dá)，例如，m13。簡(jiǎn)言之，取出合適宿主(例如已經(jīng)用蛋白質(zhì)免疫的小鼠)的脾細(xì)胞。vl和vh鏈的編碼區(qū)從產(chǎn)生針對(duì)蛋白質(zhì)的所需抗體的那些細(xì)胞獲得。然后將這些編碼區(qū)融合到噬菌體序列的末端。一旦噬菌體插入合適的載體中，例如細(xì)菌，噬菌體展示抗體片段?？贵w的噬菌體展示也可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的組合方法提供。然后可以將噬菌體展示的抗體片段用作免疫測(cè)定的一部分。也可以使用vhh。

識(shí)別thsd7a的市售單克隆抗體的實(shí)例包括獲自abcam(ab121122)、novusbiologicals(nbp1-93612)、abnovacorporation(pab20021)、atlasantibodies(hpa000923)和santacruz(sc-163453、sc-163455)的那些。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合伴侶可以是適體。適體是在分子識(shí)別方面代表抗體的替代物的一類分子。適體是具有以高親和力和特異性識(shí)別幾乎任何類別的靶分子的能力的寡核苷酸或寡肽序列。這樣的配體可以通過(guò)隨機(jī)序列文庫(kù)的systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment(selex)來(lái)分離，如tuerkc.1997所述。隨機(jī)序列文庫(kù)可通過(guò)dna的組合化學(xué)合成獲得。在該文庫(kù)中，每個(gè)成員是獨(dú)特序列的線性寡聚體(最終被化學(xué)修飾的)。在jayasenasd，1999中已經(jīng)綜述了這類分子的可能的修飾、用途和優(yōu)點(diǎn)。肽適體由通過(guò)平臺(tái)蛋白(例如大腸桿菌硫氧還蛋白a)展示的構(gòu)象約束的抗體可變區(qū)組成，其選自兩種雜交方法產(chǎn)生的組合文庫(kù)(colas等人，1996)。

本發(fā)明的結(jié)合伴侶(諸如抗體或適體)可以用可檢測(cè)的分子或物質(zhì)(諸如熒光分子、放射性分子或本領(lǐng)域已知的任何其它標(biāo)記)標(biāo)記。本領(lǐng)域中已知標(biāo)記通常(直接或間接地)提供信號(hào)。

如本文所用，關(guān)于抗體的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記的”旨在包括通過(guò)偶聯(lián)(即物理連接)可檢測(cè)物質(zhì)諸如放射性試劑或熒光團(tuán)(例如熒光素異硫氰酸酯(fitc)或藻紅蛋白(pe)或吲哚菁(cy5))至抗體或適體直接標(biāo)記抗體或適體，以及通過(guò)與可檢測(cè)物質(zhì)的反應(yīng)性間接標(biāo)記探針或抗體。本發(fā)明的抗體或適體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法用放射性分子標(biāo)記。例如，放射性分子包括但不限于用于閃爍照相研究的放射性原子，諸如i123、i124、ini11、re186、re188。

上述測(cè)定可以涉及結(jié)合伴侶(即抗體或適配體)與固體支持物的結(jié)合。可用于本發(fā)明實(shí)踐中的固體支持物包括基材，諸如硝酸纖維素(例如，以膜或微量滴定孔形式)；聚氯乙烯(例如，片或微量滴定孔)；聚苯乙烯膠乳(例如珠或微量滴定板)；聚偏氟乙烯；重氮紙；尼龍膜；活化珠，磁響應(yīng)珠等。

本發(fā)明的生物標(biāo)志物可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)免疫診斷技術(shù)檢測(cè)，包括免疫測(cè)定諸如競(jìng)爭(zhēng)、直接反應(yīng)或夾心型測(cè)定。這樣的測(cè)定包括但不限于凝集試驗(yàn)；酶標(biāo)記和介導(dǎo)的免疫測(cè)定，諸如如elisa；生物素/親和素型測(cè)定；放射免疫測(cè)定；免疫電泳；免疫沉淀。

更具體地，可以使用elisa方法，其中微量滴定板的孔用針對(duì)本發(fā)明的生物標(biāo)志物的一組抗體包被。然后將含有或懷疑含有所述生物標(biāo)志物的生物樣品加入包被的孔中。在足以允許形成抗體抗原復(fù)合物的孵育時(shí)間段后，可洗滌板以除去未結(jié)合的部分和添加可檢測(cè)標(biāo)記的二級(jí)結(jié)合分子。允許二級(jí)結(jié)合分子與任何捕獲的樣品標(biāo)志物蛋白反應(yīng)，洗滌板并使用本領(lǐng)域眾所周知的方法檢測(cè)二級(jí)結(jié)合分子的存在。

或者，可以使用免疫組織化學(xué)(ihc)方法。ihc具體提供了原位檢測(cè)樣品或組織樣品中靶標(biāo)的方法。在ihc中保持樣品的總體細(xì)胞完整性，從而允許檢測(cè)感興趣靶標(biāo)的存在和位置。通常，樣品用福爾馬林固定，包埋在石蠟中并切成切片用于染色和隨后通過(guò)光學(xué)顯微鏡檢查。ihc的當(dāng)前方法使用直接標(biāo)記或基于二抗或基于半抗原的標(biāo)記。已知的ihc系統(tǒng)的實(shí)例包括例如envision^tm(dakocytomation)、(immunovision,springdale,az)、nba^tm試劑盒(zymedlaboratoriesinc.,southsanfrancisco,ca)、(nichireicorp,tokyo,japan)。

在具體實(shí)施方案中，在與識(shí)別本發(fā)明的生物標(biāo)志物的抗體(例如抗thsd7a抗體)孵育后，組織切片(即腎活檢樣品)可以安裝在載玻片或其它支持物上。然后，可以進(jìn)行安裝在合適的固體支持物上的樣品的顯微鏡檢查。為了產(chǎn)生顯微照片，包含樣品的切片可以安裝在載玻片或其它平面支持物上，以通過(guò)選擇性染色突出本發(fā)明的生物標(biāo)志物(例如thsd7a蛋白)的存在。

因此，ihc樣品可以包括例如：(a)包含從所述組織分離的新鮮組織或細(xì)胞的制備物，(b)固定和包埋所述組織或細(xì)胞樣品，和(c)在所述組織或細(xì)胞樣品中檢測(cè)本發(fā)明的生物標(biāo)志物(例如thsd7a蛋白)組織或細(xì)胞樣品。在一些實(shí)施方案中，ihc染色程序可包括如下步驟：切割和修整組織，固定，脫水，石蠟浸潤(rùn)，薄切片切割，安裝到載玻片上，烘烤，脫石蠟，再水合，抗原修復(fù)，封閉步驟，施加識(shí)別本發(fā)明的生物標(biāo)志物的一抗，洗滌，施加二抗(任選偶聯(lián)至合適的可檢測(cè)標(biāo)記)，洗滌，復(fù)染和顯微鏡檢查。

檢測(cè)生物標(biāo)志物(使用或不使用基于免疫測(cè)定的方法)還可以包括化合物的分離：基于化合物的分子量的離心；基于質(zhì)量和電荷的電泳；基于疏水性的hplc；基于尺寸的尺寸排阻層析；和基于化合物對(duì)所用的特定固相的親和力的固相親和力。一旦分離，可以基于已知的“分離譜”(例如，該化合物的保留時(shí)間)來(lái)鑒定本發(fā)明的生物標(biāo)志物，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)量。

或者，可以通過(guò)例如質(zhì)譜儀檢測(cè)和測(cè)量分離的化合物，特別是當(dāng)測(cè)量生物標(biāo)志物的片段或肽時(shí)。

在另一方面，如上所述，本發(fā)明提供了包含可用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法的材料的試劑盒。本文提供的診斷程序可以由診斷實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室或從業(yè)者來(lái)進(jìn)行。本發(fā)明提供了可用于這些不同設(shè)置的試劑盒。

用于檢測(cè)生物樣品中thsd7a水平(mrna或蛋白質(zhì)水平)和/或用于診斷根據(jù)本發(fā)明的患者的膜性腎病的材料和試劑可以在試劑盒中組裝在一起。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒至少包含識(shí)別thsd7a或thsd7a的其他結(jié)合伴侶的抗體。

在具體實(shí)施方案中，所述試劑盒可以進(jìn)一步包含至少一種識(shí)別pla2r1或pla2r1的其它結(jié)合伴侶的抗體。

在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述試劑盒還可以包含識(shí)別膜性腎病的另一種生物標(biāo)志物的至少一種另一種抗體(或另一種結(jié)合伴侶)，例如繼發(fā)性膜性腎病的生物標(biāo)志物(例如ana、抗乙型肝炎抗原、快速血漿反應(yīng)素等)。

可以將結(jié)合伴侶加標(biāo)簽以便于檢測(cè)。其可以或可以不固定在基材表面上(例如，珠、陣列等)。例如，本發(fā)明的試劑盒可以包括用于診斷本文提供的膜性腎病的陣列?；蛘?，可以在用于固定結(jié)合伴侶(例如，通過(guò)電泳和轉(zhuǎn)移至膜)的本發(fā)明試劑盒中包括基材表面(例如膜)。

此外，本發(fā)明的試劑盒通常還包含至少一種用于檢測(cè)試劑盒中包括的結(jié)合伴侶和本發(fā)明的生物標(biāo)志物之間的復(fù)合物的試劑。

根據(jù)程序，試劑盒可以進(jìn)一步包含以下一種或多種：提取緩沖液和/或試劑，免疫印跡緩沖液和/或試劑，以及檢測(cè)工具。使用這些緩沖液和進(jìn)行該方法的不同步驟的試劑的操作方案可以包括在試劑盒中。

包括在本發(fā)明試劑盒中的不同試劑可以固體(例如凍干)或液體形式提供。本發(fā)明的試劑盒可任選地包含用于每種個(gè)體緩沖液和/或試劑的不同容器(例如，小瓶、安瓿、試管、燒瓶或瓶)。每種組分通常適合在其各自的容器中等分或以濃縮形式提供。還可以提供適于執(zhí)行所公開(kāi)的方法的某些步驟的其他容器。試劑盒的個(gè)體容器優(yōu)選保持在密閉限制中用于商業(yè)銷售。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明的方法使用其組分用于診斷、預(yù)后或監(jiān)測(cè)患者中的膜性腎病的說(shuō)明書(shū)。使用根據(jù)本發(fā)明方法的試劑盒的說(shuō)明書(shū)可包括用于處理從受試者獲得的生物樣品和/或用于進(jìn)行測(cè)試的說(shuō)明書(shū)，或用于解釋結(jié)果的說(shuō)明書(shū)。試劑盒還可以包含由管理藥品或生物制品的制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式的通知。

基于檢測(cè)thsd7amrna水平的診斷方法

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于診斷和/或預(yù)后患者中的膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的體外方法，包括測(cè)定從所述患者獲得的生物樣品中thsd7a表達(dá)水平的步驟。

在特定實(shí)施例中，所述方法包括以下步驟：

(i)測(cè)量從所述患者獲得的生物樣品中的thsd7amrna水平，

(ii)將所述水平與參考水平相比較，

其中與所述參考水平相比增加的thsd7amrna水平指示膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病。

優(yōu)選地，所述生物樣品是血液樣品或腎活檢。

通常，thsd7amrna水平的增加對(duì)應(yīng)于在對(duì)照樣品中測(cè)量的mrna水平的至少20％、優(yōu)選至少50％的增加。

測(cè)定mrna量的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用裂解酶或化學(xué)溶液或通過(guò)核酸結(jié)合樹(shù)脂提取，首先提取樣品(例如，由患者制備的細(xì)胞或組織)中包含的核酸。然后通過(guò)雜交(例如northern印跡分析)和/或擴(kuò)增(例如，rt-pcr)檢測(cè)提取的mrna。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)rt-pcr，優(yōu)選定量或半定量rt-pcr，甚至更優(yōu)選實(shí)時(shí)定量或半定量rt-pcr測(cè)定thsd7a的mrna水平。

其他擴(kuò)增方法包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma)、鏈置換擴(kuò)增(sda)和基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba)。

具有至少10個(gè)核苷酸并且顯示與感興趣的mrna的序列互補(bǔ)性或同源性的核酸可用作雜交探針或擴(kuò)增引物。應(yīng)當(dāng)理解，這樣的核酸不需要是相同的，但通常與相當(dāng)大小的同源區(qū)域具有至少約80％同一性，更優(yōu)選85％同一性，甚至更優(yōu)選90-95％同一性。在某些實(shí)施方案中，有利的是使用核酸與用于檢測(cè)雜交的合適工具諸如可檢測(cè)標(biāo)記組合。本領(lǐng)域已知各種適當(dāng)?shù)闹甘緞?，包括熒光、放射性、酶或其它配體(例如親和素/生物素)。

探針通常包含長(zhǎng)度為10至1000個(gè)核苷酸之間，例如10至800個(gè)之間，更優(yōu)選15至700個(gè)之間，通常20至500個(gè)之間的單鏈核酸。引物通常是較短的單鏈核酸，長(zhǎng)度為10至25個(gè)核苷酸，被設(shè)計(jì)為完全或幾乎完全匹配待擴(kuò)增的感興趣的核酸。探針和引物對(duì)它們雜交的核酸是“特異性”的，即它們優(yōu)選在高嚴(yán)格雜交條件(對(duì)應(yīng)于最高解鏈溫度tm，例如50％甲酰胺，5x或6xscc。scc是0.15mnacl，0.015m檸檬酸鈉)下雜交。

在上述擴(kuò)增和檢測(cè)方法中使用的核酸引物或探針可以作為試劑盒組裝。此類試劑盒包括共有引物和分子探針。優(yōu)選的試劑盒還包括確定是否發(fā)生擴(kuò)增所必需的組分。試劑盒還可以包括例如pcr緩沖液和酶；陽(yáng)性對(duì)照序列，反應(yīng)對(duì)照引物；和用于擴(kuò)增和檢測(cè)特定序列的說(shuō)明書(shū)。

本發(fā)明的治療方法

發(fā)明人強(qiáng)調(diào)，在足細(xì)胞上表達(dá)的thsd7a蛋白在膜性腎病的某些情況下是自身抗原，這允許設(shè)想基于靶向該自身抗原的新的治療方法。

實(shí)際上，如現(xiàn)有技術(shù)中所描述的，特別是對(duì)于pla2r1，由自身抗體結(jié)合足細(xì)胞足上的靶抗原的免疫沉積可以激活導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的補(bǔ)體系統(tǒng)。

因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及在患者中治療膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的方法，所述方法包括從所述患者的樣品中離體去除抗thsd7a自身抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，膜性腎病是特發(fā)性膜性腎病。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者是thsd7a陽(yáng)性患者。

優(yōu)選地，患者是人類患者。

可以通過(guò)用thsd7a多肽或其片段作為抗原的免疫吸附從血液中去除抗體。在去除抗體后，將樣品返回到患者體內(nèi)。

自身抗體對(duì)thsd7a的免疫吸收有助于減少循環(huán)自身抗體的量，特別是循環(huán)thsd7a自身抗體，從而減少對(duì)腎的潛在損害。可以在免疫學(xué)確認(rèn)抗thsd7a自身抗體的存在之后并且在任何免疫抑制治療開(kāi)始之前初始應(yīng)用這種治療。這在免疫抑制治療可以對(duì)患者的免疫系統(tǒng)和自身抗體的產(chǎn)生具有影響之前的這個(gè)早期是特別有用的。也可以在治療期間和在將所述患者診斷為陽(yáng)性thsd7a患者之后的任何時(shí)間應(yīng)用該治療。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗thsd7a自身抗體的免疫吸收可以通過(guò)將血液、血清或血漿通過(guò)固定化的thsd7a多肽而發(fā)生。重組thsd7a、優(yōu)選重組人thsd7a或片段可以固定在本領(lǐng)域已知的惰性和無(wú)菌基質(zhì)上，諸如sepharose珠?？箃hsd7a自身抗體將結(jié)合固定化的thsd7a多肽或片段，并提醒(remind)與基質(zhì)間接結(jié)合。然后收集血液、血清或血漿。所得的血液、血清或血漿應(yīng)該具有減少的或沒(méi)有可檢測(cè)的抗thsd7a自身抗體。免疫吸附程序應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。然后可以將收集的耗盡了抗thsd7a自身抗體的血液、血清或血漿輸送回患者體內(nèi)。

如在本發(fā)明的治療方法中所使用的，thsd7a多肽的片段通常是抗體結(jié)合片段。

本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于在患者中治療膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的方法，所述方法包括給予治療有效量的thsd7a多肽或其片段、表達(dá)所述thsd7a多肽的載體或其片段或表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的宿主細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，膜性腎病是特發(fā)性膜性腎病。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者是thsd7a陽(yáng)性患者。

優(yōu)選地，患者是人類患者。

根據(jù)本發(fā)明，thsd7a多肽或其片段以可溶形式施用。

通過(guò)提供可溶性thsd7a多肽或其片段，可溶性多肽可以作為誘餌抗原，并隔離遠(yuǎn)離腎小球中的thsd7a的自身抗體，從而減少對(duì)腎的潛在損害。thsd7a多肽優(yōu)選是人來(lái)源的thsd7a多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，適于治療或從血清吸附thsd7a的自身抗體的片段是包含thsd7a的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或由其組成的片段或其由一個(gè)或幾個(gè)其不同的i型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域和/或接頭莖構(gòu)成的其片段。

如上所述，thsd7a多肽和片段可以通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的任何方法合成，諸如例如在細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、酵母或植物細(xì)胞中的重組蛋白質(zhì)合成。

常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)克隆技術(shù)可用于克隆編碼thsd7a的核酸，使用thsd7a的mrna作為pcr克隆的模板。如上所述，在nm_015204(genebank)中提供了示例性人天然thsd7amrna序列。

理想地，應(yīng)當(dāng)在pcr引物的有義鏈和反義鏈的末端設(shè)計(jì)限制性酶消化識(shí)別位點(diǎn)，以促進(jìn)擴(kuò)增的核酸連接到克隆載體或其他載體中?；蛘?，為了本領(lǐng)域眾所周知的ta-克隆的目的，可以包括3'-a單鏈突出端。此類具有3'-a單鏈突出端的編碼核酸可容易地連接到invitrogen拓?fù)洚悩?gòu)酶輔助的ta載體中，諸如ii-topo、和編碼核酸可以克隆到通用克隆載體諸如puc19、pbr322、pbluescript載體(stratageneinc.)或來(lái)自invitrogeninc的pcr中。然后將所得的攜帶編碼thsd7a的核酸的重組載體亞克隆入蛋白質(zhì)表達(dá)載體或病毒載體用于在多種蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中使用選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、昆蟲(chóng)細(xì)胞系、酵母、細(xì)菌和植物細(xì)胞的宿主細(xì)胞合成thsd7a融合蛋白。還可以設(shè)計(jì)并且包括在核酸內(nèi)的蛋白酶切割位點(diǎn)以促進(jìn)thsd7a從更大的融合蛋白中釋放，例如his-thsd7a或硫氧還蛋白-thsd7a。蛋白酶切割位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于腸激酶、胰凝乳蛋白酶和凝血酶的那些。

可以使用在invitrogen拓?fù)洚悩?gòu)酶輔助的ta載體中的克隆方法將pcr擴(kuò)增的編碼核酸克隆到載體中，所述ta載體諸如ii-topo、和和二者都是定向topo進(jìn)入載體，其允許將5'→3'方向的dna序列克隆到表達(dá)載體中。在5'→3'方向的定向克隆促進(jìn)dna序列單向插入蛋白質(zhì)表達(dá)載體中，使得啟動(dòng)子位于核酸的5'atg起始密碼子的上游，從而啟動(dòng)由啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的蛋白質(zhì)表達(dá)。攜帶thsd7a編碼核酸的重組載體可以轉(zhuǎn)染并在通用克隆大腸桿菌細(xì)胞諸如xliblue、sure(stratagene)和top-10細(xì)胞(invitrogen)中繁殖。

不同的表達(dá)載體可用于表達(dá)和純化從異源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)。使用選自以下的宿主細(xì)胞的異源蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)：例如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、酵母、細(xì)菌或植物細(xì)胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。表達(dá)載體應(yīng)具有必需的5'上游和3'下游調(diào)控元件，諸如啟動(dòng)子序列、核糖體識(shí)別和結(jié)合tata盒和3'utraauaaa轉(zhuǎn)錄終止序列，用于在其各自的宿主細(xì)胞中有效的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。表達(dá)載體可以具有另外的序列，諸如6x-組氨酸，v5，硫氧還蛋白，谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶，c-myc，vsv-g，hsv，flag，麥芽糖結(jié)合肽，金屬結(jié)合肽，ha和“分泌”信號(hào)(蜜蜂蜂毒肽，α因子，pho，bip)，其被摻入表達(dá)的重組蛋白中。此外，可以在這些序列之后摻入酶消化位點(diǎn)，以在不需要時(shí)促進(jìn)額外的序列的酶促去除。這些額外的序列可用于檢測(cè)重組蛋白表達(dá)，用于通過(guò)親和層析進(jìn)行蛋白純化，增強(qiáng)重組蛋白在宿主細(xì)胞質(zhì)中的溶解性，用于更好的蛋白表達(dá)，特別是用于小蛋白片段和/或用于分泌表達(dá)的重組蛋白進(jìn)入培養(yǎng)基，進(jìn)入原核細(xì)菌的周質(zhì)或酵母細(xì)胞的原生質(zhì)球。重組蛋白的表達(dá)可以在宿主細(xì)胞中是組成型的，或者其可以例如用硫酸銅，糖例諸如半乳糖，甲醇，甲胺，硫胺素，四環(huán)素，桿狀病毒感染和(異丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷)iptg(一種乳糖的穩(wěn)定合成類似物)進(jìn)行誘導(dǎo)。

在一些實(shí)施方案中，重組thsd7a可在各種表達(dá)宿主細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)菌例如大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)和植物細(xì)胞諸如衣藻(chlamydomonas)，或甚至來(lái)自無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。從克隆載體，可以將核酸亞克隆到適于蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、酵母、細(xì)菌或植物細(xì)胞中表達(dá)的重組表達(dá)載體或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，諸如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。亞克隆可以通過(guò)pcr克隆，限制性消化然后連接或重組反應(yīng)，諸如使用和bpclonase^tm酶混合物的基于λ噬菌體的位點(diǎn)特異性重組的那些來(lái)實(shí)現(xiàn)。亞克隆應(yīng)當(dāng)是單向的，使得核酸的5'atg起始密碼子在表達(dá)載體中的啟動(dòng)子的下游?；蛘撸?dāng)將編碼核酸克隆到(定向進(jìn)入載體)或任何invitrogen的pentr(進(jìn)入)載體時(shí)，編碼核酸可以在一個(gè)單重組反應(yīng)中分別轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞、大腸桿菌、昆蟲(chóng)和酵母中的蛋白質(zhì)表達(dá)的各種表達(dá)載體(目的)中。一些目的載體設(shè)計(jì)用于桿狀病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒(aav)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的構(gòu)建，其在感染其各自的宿主細(xì)胞時(shí)允許重組蛋白在宿主細(xì)胞中異源表達(dá)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，將基因轉(zhuǎn)移到目的載體中僅在兩個(gè)步驟中完成。存在用于在大腸桿菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母中蛋白表達(dá)的表達(dá)載體。在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化和選擇后，表達(dá)載體準(zhǔn)備用于在合適的宿主中表達(dá)。

其它表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的實(shí)例是用于大腸桿菌宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)的pet載體(novagen)，pgex載體(amershampharmacia)和pmal載體(newenglandlabs.inc.)，諸如bl21，bl21(de3)和ad494(de3)plyss，rosetta(de3)和origami(de3)(novagen)；用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系諸如cho，cos，hek-293，jurkat和mcf-7中表達(dá)的基于強(qiáng)cmv啟動(dòng)子的pcdna3.1(invitrogen)和pcineo載體(promega)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的復(fù)制無(wú)能力腺病毒載體載體padenox,pad5f35,plp-adeno-x-cmv(clontech),pad/cmv/v5-dest,pad-dest載體(invitrogen)；plncx2，plxsn和plapsn逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與來(lái)自clontech的retro-x^tm系統(tǒng)一起用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)；plenti4/v5-dest^tm,plenti6/v5-dest^tm和plenti6.2/v5-gw/lacz(invitrogen)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)；腺病毒相關(guān)病毒表達(dá)載體，例如用于腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的paav-mcs，paav-ires-hrgfp和paav-rc載體(stratagene)；bacpak6桿狀病毒(clontech)和pfastbac^tmht(invitrogen)在spodoperafrugiperda9(sf9)和sf11昆蟲(chóng)細(xì)胞系中的表達(dá)；pmt/bip/v5-his(invitrogen)用于在果蠅schneiders2細(xì)胞中表達(dá)；用于在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的畢赤酵母表達(dá)載體ppiczα,ppicz,pfldα和pfld(invitrogen)和用于在甲醇畢赤酵母中表達(dá)的載體pmetα和pmet；用于在酵母釀酒酵母中表達(dá)的pyes2/gs和pyd1(invitrogen)載體。在chlamydomonasreinhardtii中大規(guī)模表達(dá)異源蛋白質(zhì)的最新進(jìn)展由griesbeckc.等人，2006moi.biotechnol.34:213-33和fuhrmannm.2004,methodsmoimed.94:191-5描述。外源異源編碼序列通過(guò)同源重組插入核、葉綠體和線粒體的基因組中。攜帶多樣性葉綠體選擇標(biāo)記氨基糖苷腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(aada)的葉綠體表達(dá)載體p64(其賦予對(duì)大觀霉素或鏈霉素的抗性)可用于在葉綠體中表達(dá)外源蛋白。生物彈槍基因槍方法可用于將載體引入藻類中。在其進(jìn)入葉綠體時(shí)，外源dna從基因槍顆粒釋放并通過(guò)同源重組整合到葉綠體基因組中。

在不同宿主細(xì)胞中的重組蛋白表達(dá)可以是組成型或采用誘導(dǎo)物諸如硫酸銅，糖諸如半乳糖，甲醇，甲胺，硫胺素，四環(huán)素或iptg的誘導(dǎo)型。在宿主細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)后，裂解宿主細(xì)胞以釋放表達(dá)的蛋白質(zhì)用于純化。裂解各種宿主細(xì)胞的方法在"samplepreparation-toolsforproteinresearch"emdbioscience和在thecurrentprotocolsinproteinsciences(cpps)中有所介紹。優(yōu)選的純化方法是親和層析，諸如使用鎳、鈷或鋅親和樹(shù)脂用于組氨酸標(biāo)記的重組蛋白的離子金屬親和層析。純化加組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白的方法由clontech使用他們的鈷樹(shù)脂和novagen在他們的pet系統(tǒng)手冊(cè)第10版中描述。另一種優(yōu)選的純化策略是通過(guò)免疫親和層析，例如，抗myc抗體綴合的樹(shù)脂可以用于親和純化加myc標(biāo)簽的重組肽。用絲氨酸蛋白酶諸如凝血酶和腸激酶的酶消化從組氨酸或myc標(biāo)簽切割和釋放重組蛋白，從親和樹(shù)脂釋放重組蛋白，而組氨酸標(biāo)簽和myc標(biāo)簽保留附接于親和樹(shù)脂。

也設(shè)想了無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)提供了優(yōu)于傳統(tǒng)的基于細(xì)胞的表達(dá)方法的若干優(yōu)點(diǎn)，包括容易修飾反應(yīng)條件以有利于蛋白質(zhì)折疊，降低對(duì)產(chǎn)物毒性的敏感性和適用于高通量策略諸如快速表達(dá)篩選或因?yàn)闇p少反應(yīng)體積和處理時(shí)間的大量蛋白質(zhì)生產(chǎn)。無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可以使用質(zhì)粒或線性dna。此外，翻譯效率的提高導(dǎo)致每毫升反應(yīng)混合物超過(guò)一毫克蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。能夠以高產(chǎn)量產(chǎn)生蛋白質(zhì)的無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)的實(shí)例由spirinas等人，science242:1162(1988)描述。該方法使用在整個(gè)反應(yīng)混合物中含有氨基酸、三磷酸腺苷(atp)和三磷酸鳥(niǎo)苷(gtp)的進(jìn)料緩沖液的連續(xù)流設(shè)計(jì)和連續(xù)去除翻譯的多肽產(chǎn)物。該系統(tǒng)使用大腸桿菌裂解物提供無(wú)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)料緩沖液。這種連續(xù)流動(dòng)系統(tǒng)與原核和真核表達(dá)載體都是相容的。作為實(shí)例，changg.等人,science310:1950-3(2005)描述了大規(guī)模無(wú)細(xì)胞生產(chǎn)的內(nèi)在膜蛋白emre多藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

其它市售的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括expressway^tm無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(invitrogen)，其利用基于大腸桿菌的體外系統(tǒng)進(jìn)行有效的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄和翻譯反應(yīng)，以管反應(yīng)形式產(chǎn)生高達(dá)毫克量的活性重組蛋白；快速翻譯系統(tǒng)(rts)(rocheappliedscience)，其也使用基于大腸桿菌的體外系統(tǒng)；和tnt偶聯(lián)網(wǎng)狀細(xì)胞裂解物系統(tǒng)(promega)，其使用基于兔網(wǎng)織紅細(xì)胞的體外系統(tǒng)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，使用幾種thsd7a多肽的混合物用于治療。預(yù)想的肽可以與其他蛋白融合以獲得更長(zhǎng)的血清半衰期，串聯(lián)連接的肽或環(huán)狀肽。

本文所述的方法包括哺乳動(dòng)物thsd7a，其從哺乳動(dòng)物(例如豬或兔)中純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，從腎臟中離體純化天然(非重組)哺乳動(dòng)物thsd7a。天然蛋白質(zhì)純化的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及用于治療膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的thsd7a多肽或其片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，膜性腎病是特發(fā)性膜性腎病。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者是thsd7a陽(yáng)性患者。

優(yōu)選地，患者是人類患者。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述thsd7a多肽片段是抗體結(jié)合片段(根據(jù)本發(fā)明意味著患有特發(fā)性膜性腎病的患者的自身抗體識(shí)別所述片段)。

優(yōu)選地，所述thsd7a的片段包含thsd7a的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或由其組成，或其由其一個(gè)或幾個(gè)不同的i型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域和/或接頭莖構(gòu)成的其片段。

根據(jù)本發(fā)明，所述thsd7a多肽或其片段以治療有效量使用。

在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的載體或表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的宿主細(xì)胞。

本發(fā)明的另一目的涉及包含thsd7a多肽或其片段和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明涉及用于治療膜性腎病的所述藥物組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，膜性腎病是特發(fā)性膜性腎病。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，患者是thsd7a陽(yáng)性患者。

優(yōu)選地，患者是人類患者。

在具體實(shí)施方案中，所述藥物組合物可包含表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的載體或表達(dá)所述thsd7a多肽或其片段的宿主細(xì)胞。

藥物組合物可以是全長(zhǎng)thsd7a和各種大小的片段、特別是抗體結(jié)合片段和藥學(xué)上可接受的媒介物的組合。此類片段的實(shí)例包括但不限于包含thsd7a的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或由其組成的片段或由其一個(gè)或幾個(gè)不同的i型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域和/或接頭莖構(gòu)成的其片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以包含幾種thsd7a多肽或其片段的混合物。預(yù)想的肽可以與其他蛋白融合以獲得更長(zhǎng)的血清半衰期，串聯(lián)連接的肽或環(huán)狀肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指由美國(guó)聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國(guó)藥典或其他公認(rèn)的藥典中列出的用于動(dòng)物、更特別是用于人的。術(shù)語(yǔ)“載體”是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。這樣的藥物載體可以是無(wú)菌液體，諸如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的那些，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)施用藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液體載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥物賦形劑包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，大米，面粉，白堊，硅膠，硬脂酸鈉，單硬脂酸甘油酯，滑石，氯化鈉，干燥脫脂乳品，甘油，丙二醇，水，乙醇等。如果需要，組合物還可以含有少量的潤(rùn)濕劑或乳化劑或ph緩沖劑。這些組合物可以采取溶液，懸浮液，乳液，片劑，丸劑，膠囊，粉末，緩釋制劑等形式。該組合物可以使用傳統(tǒng)的粘合劑和載體諸如甘油三酯配制成栓劑?？诜苿┛砂?biāo)準(zhǔn)載體，諸如藥物級(jí)的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。合適的藥物載體的實(shí)例描述于remington'spharmaceuticalsciences,第18版,gennaro,編輯(mackpublishingco.,1990)中。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將其它成分加入到藥物制劑中，包括抗氧化劑，例如抗壞血酸；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)，諸如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合劑諸如edta；和糖醇諸如甘露醇或山梨醇。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)常規(guī)方法將組合物配制為適于靜脈內(nèi)施用于人的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是在無(wú)菌等滲水性緩沖液中的溶液。如果需要，組合物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑諸如利諾卡因(lignocamne)以減輕注射部位的疼痛。通常，成分以單位劑型分開(kāi)或混合在一起供應(yīng)，例如作為干燥的凍干粉末或無(wú)水濃縮物在氣密密封的(hermeticallysealed)容器諸如指示活性劑的量的安瓿或小袋中供應(yīng)。當(dāng)組合物通過(guò)輸注施用時(shí)，其可以用含有無(wú)菌藥物級(jí)水或鹽水的輸注瓶分配。當(dāng)組合物通過(guò)注射施用時(shí)，可以提供安瓿的注射用無(wú)菌水或鹽水，使得可以在施用之前混合成分。

本發(fā)明的組合物可以配制成中性或鹽形式。

藥學(xué)上可接受的鹽包括與陰離子諸如衍生自鹽酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的陰離子形成的鹽，以及與陽(yáng)離子諸如衍生自舉例來(lái)說(shuō)的鈉，鉀，銨，鈣，氫氧化鐵，異丙胺，三乙胺，2-乙基氨基乙醇，組氨酸，普魯卡因等的陽(yáng)離子形成的鹽。

各種遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，并且可以用于施用thsd7a多肽或其片段，例如包封在脂質(zhì)體、微粒和微膠囊中(參見(jiàn)例如wu和wu,j.biol.chem.,262:4429-4432(1987))。組合物可以在囊泡、特別是脂質(zhì)體中遞送(參見(jiàn)langer,science,249:1527-1533(1990)；treat等人，在liposomesinthetherapyofinfectiousdiseaseandcancer,lopez-beresteinandfidler,eds.(liss,newyork1989),pp.353-365；lopez-berestein,同上,pp.317-327；一般參見(jiàn)同上)。引入方法包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口服途徑。組合物可以通過(guò)任何方便的途徑施用，例如通過(guò)輸注或團(tuán)注，通過(guò)上皮或被覆粘膜皮膚(mucocutaneouslinings)(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并且可以與其它生物活性劑一起施用。施用可以是全身或局部的。此外，可能需要通過(guò)任何合適的途徑將本發(fā)明的藥物組合物引入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括心室內(nèi)和鞘內(nèi)注射；可以通過(guò)例如附接到儲(chǔ)器(諸如omcana儲(chǔ)器)的心室內(nèi)導(dǎo)管來(lái)促進(jìn)心室內(nèi)注射。也可以使用肺給藥，例如通過(guò)使用吸入器或霧化器，以及具有霧化劑的制劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療性施用的藥物制劑必須是無(wú)菌的。通過(guò)經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾膜(例如，0.2微米膜)過(guò)濾容易實(shí)現(xiàn)無(wú)菌。藥物制劑的ph通常應(yīng)為約6至8。

在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可以在控釋系統(tǒng)中遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵(參見(jiàn)langer，同上；sefton,crccrit.ref.biomed.eng.,14:201(1987)；buchwald等人,surgery,88:507(1980)；saudek等人,n.engl.j.med.,321:574(1989))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用聚合物材料(參見(jiàn)medicalapplicationsofcontrolledrelease,langer和wise,編輯(crcpress,bocaraton,fia.1974)；controlleddrugbioavailability,drugproductdesignandperformance,smolen和ball,編輯(wiley,newyork1984)；ranger和peppas,macromol.sci.rev.macromol.chem.,23:61(1983)；也參見(jiàn)levy等人,science,228:190(1985)；during等人,ann.neurol.,25:351(1989)；howard等人,j.neurosurg.,71:105(1989))。其他控釋系統(tǒng)在langer的綜述(science,249:1527-1533(1990))中討論。關(guān)于緩釋組合物的實(shí)例，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)3,773,919，ep58,481a，美國(guó)專利號(hào)3,887,699，ep158,277a，加拿大專利號(hào)1176565，u.sidman等人,biopolymers22:547(1983)和r.langer等人,chem.tech.12:98(1982)。

在制劑中使用的精確劑量還將取決于施用途徑以及膜性腎病的嚴(yán)重性和血清中抗thsd7a自身抗體的滴度，并且應(yīng)當(dāng)根據(jù)從業(yè)者的判斷和每位患者的情況來(lái)決定。有效劑量可以從源自體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線外推。

給予患者的劑量通常為0.1mg/kg至100mg/kg患者體重。優(yōu)選地，給予患者的劑量為0.1mg/kg至20mg/kg患者體重，更優(yōu)選1mg/kg至10mg/kg患者體重。對(duì)于基因治療，病毒載體應(yīng)該在每個(gè)患者每次施用1×10⁶至10¹⁴個(gè)病毒載體顆粒的范圍內(nèi)。

此外，可以任選地使用體外或體內(nèi)測(cè)定來(lái)幫助鑒定最佳劑量范圍。所使用的精確劑量還取決于給藥途徑和所治療病癥的嚴(yán)重性，并且應(yīng)根據(jù)從業(yè)者的判斷和每個(gè)受試者的情況，例如根據(jù)公開(kāi)的臨床研究來(lái)決定。然而，合適的有效劑量范圍為約每4小時(shí)約10微克至約5克，盡管它們通常每4小時(shí)約500mg或更少。在一個(gè)實(shí)施方案中，有效劑量為每4小時(shí)約10μg，約20μg，約50μg，約100μg，約200μg，約300μg，約400μg，約500μg，約600μg，約700μg，約800μg，約900μg，約1mg，約1.2mg，約1.4mg，約1.6mg，約1.8mg，約2.0mg，約2.2mg，約2.4mg，約2.6mg，約2.8mg，約3.0mg，約3.2mg，約3.4mg，約3.6mg，約3.8mg，約4.0mg，約4.2mg，約4.4mg，約4.6mg，約4.8mg，或約5.0mg，10.0mg，15.0mg，20.0mg，25.0mg，50.0mg。等效劑量可以在各種時(shí)間段內(nèi)施用，包括但不限于約每2小時(shí)，約每6小時(shí)，約每8小時(shí)，約每12小時(shí)，約每24小時(shí)，約每36小時(shí)，約每48小時(shí)，約每72小時(shí)，約每周，約每?jī)芍?，約每三周，約每月和約每?jī)蓚€(gè)月。本文所述的有效劑量是指給藥的總量。包含thsd7a多肽、其片段的組合物或表達(dá)載體和/或包含其的宿主細(xì)胞一次或通過(guò)一系列治療合適地施用于患者。

在實(shí)施方案中，包含thsd7a多肽或其片段的組合物與免疫抑制治療組合施用，所述免疫抑制治療包括但不限于硫唑嘌呤，英夫利昔單抗，奧馬珠單抗，達(dá)利珠單抗，阿達(dá)木單抗，依庫(kù)珠單抗，依法珠單抗，那他珠單抗，奧馬珠單抗，環(huán)磷酰胺，苯丁酸氮芥和/利妥昔單抗。

特別地，包含thsd7a多肽或其片段的組合物與用于治療膜性腎病、特別是特發(fā)性膜性腎病的任何治療組合施用，并且可以對(duì)患者有效。

本發(fā)明將通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。但是，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例

材料和方法

患者。膜性腎病(mn)的診斷是通過(guò)腎活檢進(jìn)行的。血清取自膜性腎病患者、其他腎臟疾病患者和健康對(duì)照組。所有患者在取第一次血清時(shí)沒(méi)有事先進(jìn)行免疫抑制治療。通過(guò)elisa研究血清的抗pla2r1抗體。

人腎組織。來(lái)自接受腎切除術(shù)的患者的腎的健康部分用于制備人腎小球的制備物。通過(guò)分級(jí)篩分和杜恩斯(dounce)勻漿獲得腎小球。通過(guò)超速離心和增溶作用分開(kāi)可溶性級(jí)分和膜級(jí)分。為了除去存在的免疫球蛋白g，將樣品與蛋白g微珠(miltenyibiotech,bergischgladbach,germany)一起孵育，并通過(guò)磁性分離柱(同上)提取結(jié)合的免疫球蛋白。對(duì)于酶促去糖基化，本發(fā)明人根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用n-糖肽酶f和神經(jīng)氨酸酶(均來(lái)自rochediagnostics,mannheim,germany)。

蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白質(zhì)樣品在非還原或還原條件下在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并在半干條件(biorad,hercules,usa)下轉(zhuǎn)移到pvdf膜。將膜(millipore,billerica,usa)用在pbs-tween0.05％中的5％奶粉過(guò)夜封閉，隨后在室溫下與一抗和二抗孵育2小時(shí)。為了用作第一抗體，將血清在0.5％奶粉中以1:100工作稀釋度稀釋。對(duì)于thsd7a(含有i型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域的7a)的特異性檢測(cè)，本發(fā)明人使用市售的兔多克隆抗體(sigma,st.louis,usa)，工作稀釋度為1:1,000。二抗是辣根過(guò)氧化物酶綴合的小鼠抗人或山羊抗兔igg(均來(lái)自southernbiotech,birmingham,usa)。當(dāng)需要igg亞類檢測(cè)時(shí)，應(yīng)用小鼠抗人igg1-igg4(同上)。

免疫沉淀。將人腎小球裂解物與來(lái)自膜性腎病或其他腎小球疾病患者的血清以及健康對(duì)照一起孵育。加入igg4親和基質(zhì)(lifetechnologies,leiden,netherlands)，將樣品在4℃孵育過(guò)夜。通過(guò)低速離心收集免疫沉淀物，將樣品進(jìn)行電泳、印跡，并如上所述用抗thsd7a抗體檢測(cè)。

質(zhì)譜。切下對(duì)應(yīng)于在蛋白質(zhì)印跡分析中可見(jiàn)條帶的凝膠區(qū)，并進(jìn)行胰蛋白酶膠內(nèi)(in-gel)消化。消化的肽使用甲酸和乙腈分離，通過(guò)納米高效液相層析(nanohplc)分開(kāi)，并使用abi4700質(zhì)譜儀(absciex,framingham,usa)通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間(maldi-tof)串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定。通過(guò)proteinpilot軟件(absciex,framingham,usa)分析原始數(shù)據(jù)，并使用paragon算法進(jìn)一步處理。

候選蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過(guò)pcr克隆或從公司(genecoppoeia和origene)購(gòu)買(mǎi)編碼thsd7a和pla2r1的三個(gè)旁系同源物(即巨噬細(xì)胞甘露糖受體(mrc1)、內(nèi)吞受體180(mrc2)和樹(shù)突狀細(xì)胞受體205(ly75)的人cdna。在亞克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中并添加特異性ha或ddk標(biāo)簽(plpcx或pcmv6進(jìn)入)后，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證所有cdna序列。通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到hek293細(xì)胞中。72小時(shí)后，收集培養(yǎng)基，刮下細(xì)胞并裂解細(xì)胞。通過(guò)超速離心獲得表達(dá)的目標(biāo)蛋白的可溶性級(jí)分。將膜級(jí)分重懸于裂解緩沖液中，通過(guò)劇烈的手動(dòng)杜恩思攪拌進(jìn)行勻漿，并且在高速離心后獲得溶解的級(jí)分。通過(guò)使用特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡分析并與模擬轉(zhuǎn)染相比較來(lái)驗(yàn)證候選蛋白的表達(dá)。

組織學(xué)分析。對(duì)于免疫熒光分析，將人腫瘤腎切除術(shù)標(biāo)本的健康極的2μm石蠟切片脫石蠟并在水中再水合。通過(guò)在ph6.1的檸檬酸鹽緩沖液中煮沸(在恒定98℃下30分鐘)來(lái)獲得抗原修復(fù)。用在pbs中的0.05％tritonx-100(sigma,st.louis,usa)的5％馬血清(vector,burlingame,usa)在室溫下將非特異性結(jié)合封閉30分鐘，然后一抗在封閉緩沖液中4℃過(guò)夜。用熒光色素綴合的二抗(jacksonimmunoresearch,dianova,hamburg,germany；1：400，在5％馬血清中室溫下30分鐘)顯現(xiàn)染色。使用draq5(molecularprobes,lifetechnologies,grandisland,usa)顯現(xiàn)細(xì)胞核。省略一抗進(jìn)行陰性對(duì)照。使用激光掃描顯微鏡510和適當(dāng)?shù)能浖?allzeiss,oberkochen,germany)通過(guò)共聚焦顯微鏡評(píng)估染色切片。

對(duì)于免疫組織化學(xué)，將來(lái)自mn患者的腎活檢的1μm石蠟切片脫石蠟并再水合。通過(guò)在dako抗原修復(fù)緩沖液(ph9)中煮沸(98℃下15分鐘)并隨后在室溫下冷卻15分鐘來(lái)獲得抗原修復(fù)。在室溫下用含有0.05％tritonx-100(sigma)的pbs中的5％馬血清(vector)封閉非特異性結(jié)合30分鐘，然后用在封閉緩沖液中兔抗thsd7a(1:400，atlas)在4℃下孵育過(guò)夜。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，使用zytochemplusap聚合物試劑盒(zytomedsystems)顯現(xiàn)染色。將核用hemalaun復(fù)染色，切片用阿拉伯樹(shù)膠(sigma)固定。省略一抗進(jìn)行陰性對(duì)照。用axioskop使用axiovision軟件(allzeiss)評(píng)估染色。

用于組織學(xué)分析的一抗是：兔抗thsd7a和抗pla2r1(atlas，1:200)，豚鼠抗nephrin(acris，1:100)，山羊抗iv型膠原蛋白(southernbiotech，1:400)和綿羊抗纖連蛋白(dako，1:500)。所有二抗都是熒光色素綴合的親和純化的驢抗體(jacksonimmunoresearch,dianova,hamburg,germany，1:400)。

結(jié)果

用pla2r1的旁系同源物和人腎小球的蛋白裂解物篩查特發(fā)性膜性腎病血清。我們通過(guò)兩種平行方法篩查特發(fā)性膜性腎病(imn)血清和相關(guān)對(duì)照血清。第一個(gè)方法聚焦于pla2r1的旁系同源物作為候選抗原。第二個(gè)方法是更一般的，就來(lái)自人腎小球提取物(hge)中的總蛋白篩查血清。

pla2r1的三種旁系同源蛋白，即巨噬細(xì)胞甘露糖受體(mrc1)、內(nèi)吞受體180(mrc2)和樹(shù)突狀細(xì)胞受體205(ly75)在hek293細(xì)胞中作為重組蛋白瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)在非還原條件下的蛋白質(zhì)印跡分析，用來(lái)自65個(gè)膜性腎病(其中30個(gè)為抗-pla2r1抗體陰性)患者、57個(gè)其他蛋白尿性腎病患者和44個(gè)膜性腎病患者以及健康對(duì)照的血清，研究了針對(duì)這些旁系同源物以及hge的血清反應(yīng)性。如前面通過(guò)elisa所測(cè)試的，已知對(duì)抗-pla2r1抗體是陽(yáng)性的所有血清在蛋白質(zhì)印跡分析上與重組pla2r1反應(yīng)，但是這些血清和來(lái)自其他類別的血清都沒(méi)有與pla2r1的旁系同源蛋白反應(yīng)。來(lái)自4個(gè)患有imn的患者的血清(其對(duì)抗-pla2r1抗體都是陰性的)識(shí)別出大小約250kda的相同的腎小球蛋白(圖1a)。來(lái)自其他腎臟疾病患者或健康對(duì)照的血清在該區(qū)域中沒(méi)有顯示任何反應(yīng)性。然后將篩查擴(kuò)展至129個(gè)膜性腎病患者(95個(gè)imn，34個(gè)繼發(fā)性mn)。發(fā)現(xiàn)在elisa和蛋白質(zhì)印跡分析中對(duì)于抗-pla2r1抗體都是陰性的總共6個(gè)血清與250kda的相同蛋白質(zhì)反應(yīng)(圖1b)。在這些患者中，5個(gè)患有imn，1個(gè)患有抗核抗體(ana)陽(yáng)性滴度的mn，將該患者分類為繼發(fā)性mn的情況(圖1b)。

因此，上述篩查鑒定了新的存在于hge中的250kda的自身抗原，可能不同于在相同hge制劑中具有約180kda大小的pla2r1。為了更好地區(qū)分兩種抗原，我們?cè)诰哂械捅０钒俜直鹊膕ds-page凝膠上運(yùn)行hge蛋白以分開(kāi)這兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)，然后準(zhǔn)備蛋白質(zhì)印跡，并用與pla2r1或新的抗原反應(yīng)的血清連續(xù)孵育膜。如所預(yù)期的，顯示具有約60kda的大小差異的兩個(gè)不同的條帶，表明存在兩種不同的抗原。為了進(jìn)一步與pla2r1相比表征新的抗原，我們對(duì)含有兩種抗原的hge酶促去糖基化。n-糖肽酶f使新的抗原的大小減小至接近225kda，并且添加神經(jīng)氨酸酶(去除唾液酸的酶)引起進(jìn)一步遷移至200kda。另一方面，如前所述，pla2r1在加入n-糖肽酶f后遷移至約145kda，但在加入神經(jīng)氨酸酶后沒(méi)有觀察到更多的遷移。與完全糖基化的250kda蛋白質(zhì)反應(yīng)的所有血清也以相同的分子量識(shí)別去糖基化形式，這表明所有血清識(shí)別相同的蛋白質(zhì)。此外，新的抗原和pla2r1都存在于hge的膜級(jí)分中，但是僅pla2r1存在于可溶性級(jí)分中。

鑒定作為thsd7a的新型hge抗原。我們進(jìn)行了天然腎小球蛋白和用n-糖肽酶f處理以及n-糖肽酶f和神經(jīng)氨酸酶處理的腎小球蛋白的凝膠電泳。來(lái)自每個(gè)處理的絕大部分蛋白質(zhì)用考馬斯藍(lán)染料染色，另一部分轉(zhuǎn)移到pvdf并用患者針對(duì)新的抗原的抗體陽(yáng)性的血清進(jìn)行探測(cè)。然后，我們?cè)谌缟纤龅?50kda、225kda和200kda處切除對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)印跡信號(hào)的考馬斯染色的凝膠區(qū)域，假設(shè)靶蛋白將特異性存在于所有三種條件下。在所有凝膠切片中進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得最初的候選列表。根據(jù)新的抗原的預(yù)期生化特性，即通過(guò)參考它們的分子量、n-糖基化、膜定位和在人腎或腎小球中的表達(dá)，對(duì)候選蛋白質(zhì)進(jìn)行分級(jí)(rank)。有趣的是，所有以前測(cè)試的pla2r1旁系同源物在質(zhì)譜分析中出現(xiàn)在顯著位置，回顧性地證明了初始方法的合理性。我們使用商業(yè)上可獲得的抗體和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的hek293細(xì)胞來(lái)特異性地測(cè)試候選抗原，并最終鑒定含有1型血小板應(yīng)答蛋白結(jié)構(gòu)域的7a(thsd7a)作為目的蛋白。

事實(shí)上，先前與hge中的250kda蛋白質(zhì)反應(yīng)的所有6種血清也識(shí)別在hek293細(xì)胞中表達(dá)的重組thsd7a，而抗-pla2r1陽(yáng)性血清或?qū)φ罩袥](méi)有一個(gè)識(shí)別(圖2a)。值得注意的是，hge中存在的天然thsd7a蛋白和在hek293細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白顯示出相同的糖基化模式，然而重組蛋白遷移至稍低的位置，表明翻譯后修飾的微小差異(圖2a)。作為反應(yīng)性血清識(shí)別的腎小球自身抗原確實(shí)是thsd7a的最終證據(jù)，我們進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。所有反應(yīng)性血清，但不是對(duì)照，從hge免疫沉淀thsd7a，如通過(guò)沉淀物與針對(duì)thsd7a的特異性多克隆抗體的反應(yīng)性所證明的(圖2b)。

抗thsd7a自身抗體的表征。為了測(cè)定抗thsd7a自身抗體的igg亞型，我們使用針對(duì)不同igg(1至4)的二抗。發(fā)現(xiàn)抗thsd7a的igg4是所有6種反應(yīng)性血清的主要抗體。然而，其他igg亞型也存在于大多數(shù)血清中。這一發(fā)現(xiàn)與所有可用活檢中igg4的增強(qiáng)染色一致。此外，當(dāng)凝膠在還原條件下運(yùn)行時(shí)，所有陽(yáng)性血清都失去了它們對(duì)hge中的250kda蛋白質(zhì)和重組thsd7a的反應(yīng)性。因此，對(duì)于抗pla2r1自身抗體，抗thsd7a自身抗體大部分是igg4，并且識(shí)別thsd7a中存在于天然和重組thsd7a蛋白中的一個(gè)或多個(gè)構(gòu)象依賴性表位。

抗thsd7a自身抗體和疾病活動(dòng)。來(lái)自兩個(gè)imn患者和抗thsd7a抗體陽(yáng)性的系列血清樣品可通過(guò)半定量蛋白質(zhì)印跡分析用于抗thsd7a抗體水平的分析。在一個(gè)患者中，免疫抑制治療誘導(dǎo)抗thsd7a抗體水平的實(shí)質(zhì)性降低，隨后是蛋白尿的減少(圖3)。另一方面，在由于臨床癥狀輕微(minorclinicalcomplaint)未接受免疫抑制治療的一個(gè)患者中，抗體水平保持穩(wěn)定地高，具有持續(xù)的腎病范圍的蛋白尿?？傊?，這些結(jié)果表明抗體水平和臨床疾病活性之間的關(guān)聯(lián)。

thsd7a在健康對(duì)照和mn患者中的腎小球表達(dá)。為了研究thsd7a的腎小球表達(dá)，我們?cè)趤?lái)自健康受試者和來(lái)自imn患者的活檢樣品中進(jìn)行免疫熒光和免疫組織化學(xué)分析。當(dāng)用兩種不同的抗thsd7a特異性抗體探測(cè)時(shí)，我們?cè)趤?lái)自健康腎的活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了thsd7a的顯著的線性腎小球表達(dá)。省略一抗的陰性對(duì)照顯示根本沒(méi)有染色。當(dāng)對(duì)nephrin染色時(shí)，觀察到在足細(xì)胞足突的細(xì)胞間裂孔隔膜區(qū)域中表達(dá)的跨膜蛋白，與thsd7a非常相似的染色模式。此外，兩個(gè)分子顯示強(qiáng)共定位，表明thsd7a位于足細(xì)胞足突中或非常接近足細(xì)胞足突。另一方面，thsd7a不與腎小球基底膜的標(biāo)志物(諸如iv型膠原蛋白和纖連蛋白)共定位。確切地說(shuō)，thsd7a相對(duì)于iv型膠原蛋白和纖連蛋白位于上皮下，表明其在足細(xì)胞足突上而不是腎小球基底膜上表達(dá)。

從先前的研究已知pla2r1與在來(lái)自患有mn和具有可檢測(cè)的抗pla2r1抗體的患者的活檢的上皮下沉積物中的igg4共定位。為了研究抗thsd7a陽(yáng)性mn患者中的這種現(xiàn)象，我們使用特異性抗thsd7a以及抗igg4抗體進(jìn)行免疫熒光顯微鏡檢查。我們發(fā)現(xiàn)在來(lái)自抗thsd7a陽(yáng)性mn患者(n＝5)的所有可用活檢中igg4和thsd7a的強(qiáng)染色。因此，thsd7a以典型的mn的顆粒模式與igg4共定位。

thsd7a的免疫組織化學(xué)染色顯示在來(lái)自健康對(duì)照的活組織檢查樣品中沿著足細(xì)胞質(zhì)膜的線性陽(yáng)性。相比之下，pla2r1表達(dá)略少。在來(lái)自患有抗thsd7a陽(yáng)性mn的患者的所有五各可用活檢中，與正常對(duì)照相比，免疫組織化學(xué)顯示thsd7a的染色顯著增強(qiáng)。另一方面，pla2r1染色在這些患者中是正常的。相比之下，所有研究的具有抗pla2r1抗體的患者具有正常的thsd7a染色，但增強(qiáng)的pla2r1的顆粒染色，如前所述。來(lái)自患有繼發(fā)性mn的患者的所有研究的活檢都對(duì)thsd7a和pla2r1具有正常染色。

來(lái)自活檢組織的抗thsd7a的igg的洗脫。igg從來(lái)自一個(gè)其血清與thsd7a反應(yīng)的患者、來(lái)自兩個(gè)pla2r1相關(guān)imn的病例和來(lái)自一個(gè)v型狼瘡腎炎的病例的冷凍殘余活檢核心酸性洗脫出來(lái)。來(lái)自抗thsd7a血清陽(yáng)性病例的igg在蛋白質(zhì)印跡上特異性識(shí)別重組thsd7a，而從pla2r1相關(guān)的mn病例中洗脫的igg不識(shí)別thsd7a且特異性識(shí)別pla2r1。從v類狼瘡腎炎活檢中洗脫的igg不識(shí)別任一抗原。