對相關(guān)申請的交叉引用
本發(fā)明涉及用于在有需要的受試者中誘導(dǎo)飽食和延長飽感的藥物和食物組合物。
發(fā)明背景
腸道菌群的組成與宿主代謝表型相關(guān)(ley等人，2006)并且‘肥胖’微生物群的轉(zhuǎn)移可以誘發(fā)肥胖癥(turnbaugh等人,2006)和食欲過盛(vijay-kumar等人,2010),提示腸道菌群可以影響宿主攝食行為。盡管腸道菌群對宿主食欲的作用的根本機制還不明確，但有可能它們可以利用宿主的控制進食的分子途徑。
目前的進食控制模型涉及腸來源的饑餓和飽腹激素，所述激素將信號傳導(dǎo)至幾個調(diào)節(jié)攝食的穩(wěn)態(tài)和快感方面的腦回路(berthoud,2011；inui,1999；murphy和bloom,2006)。在這些中最突出的是起源自下丘腦弓狀核(arc)的厭食和促進食欲的途徑，下丘腦弓狀核包括分別在室旁核(pvn)中中繼傳遞的阿黑皮素原(pomc)和神經(jīng)肽y(npy)/刺鼠相關(guān)蛋白(agrp)神經(jīng)元(atasoy等人,2012；cowley等人,1999；garfield等人,2015；shi等人,2013)。arc和pvn途徑匯聚在外側(cè)臂旁核中，外側(cè)臂旁核將厭食投射發(fā)送至中央杏仁核(cea),表達降鈣素基因相關(guān)肽(cgrp)(carter等人,2013；garfield等人,2015)。
腸道菌群對宿主控制食欲的效應(yīng)的推定機制可能涉及其能量采集活性(turnbaugh等人,2006)和產(chǎn)生神經(jīng)活性遞質(zhì)和代謝物(dinan等人,2015；forsythe和kunze,2013；sharon等人,2014)。本發(fā)明人證明了直接作用于食欲控制途徑的細菌蛋白在腸道局部或全身的意義。事實上，幾種細菌蛋白已經(jīng)證明展示出與調(diào)節(jié)食欲的肽激素的序列同源性(fetissov等人,2008),并且最近由腸道共生大腸桿菌(e.coli)產(chǎn)生的clpb蛋白被鑒定為α-促黑素細胞激素(α-msh)的抗原-模擬物(tennoune等人,2014)。α-msh是pomc-衍生的神經(jīng)肽，其通過激活黑素皮質(zhì)素受體4(mc4r)在飽食信號傳導(dǎo)中具有關(guān)鍵作用(cone,2005)。盡管mc4r-介導(dǎo)的α-msh厭食效應(yīng)已經(jīng)主要被歸因于其作用的中心位點(mul等人,2013),但最近的一項研究表明腸道腸內(nèi)分泌細胞中mc4r的激活刺激飽腹激素胰高血糖素樣肽-1(glp-1)和肽yy(pyy)的釋放(panaro等人,2014)。因此腸道細菌衍生的α-msh-樣分子可以直接作用于合成飽腹激素的腸內(nèi)分泌細胞。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及用于在有需要的受試者中誘導(dǎo)飽食和延長飽感的藥物和食物組合物。具體地，本發(fā)明由權(quán)利要求限定。
具體實施方式
本發(fā)明人已經(jīng)證明clpb蛋白或表達clpb蛋白的細菌能夠在有需要的受試者中誘導(dǎo)飽食，延長飽感，減少進食，控制體重增加，和/或促進體重減輕。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種在有需要的受試者中誘導(dǎo)飽食的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表達clpb蛋白的細菌。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種在有需要的受試者中延長飽感的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表達clpb蛋白的細菌。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種在有需要的受試者中減少餐量的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表達clpb蛋白的細菌。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種在有需要的受試者中減少進食的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表達clpb蛋白的細菌。
本發(fā)明的另一個方面還涉及一種在有需要的受試者中控制體重增加的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表達clpb蛋白的細菌。
本發(fā)明的另一個方面還涉及一種在有需要的受試者中刺激體重減輕的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的clpb蛋白或有效量的表達clpb蛋白的細菌。
本發(fā)明的方法意圖用于人、寵物或牲畜,而寵物或牲畜可以選自由下列組成的組：犬、貓、豚鼠、兔、豬、牛、綿羊、山羊、馬和/或家禽。在一些實施方案中，所述受試者是雄性或雌性受試者。
在一些實施方案中，所述受試者是不肥胖的。在一些實施方案中，所述受試者是肥胖的。“肥胖癥”在本文中是指其中受試者優(yōu)選bmi>30的醫(yī)療狀況?！癰mi”或“身體質(zhì)量指數(shù)”被定義為受試者的體重除以他身高的平方。在醫(yī)學(xué)中普遍使用的該公式產(chǎn)生了kg/m2的量度單位。通常，不肥胖的受試者具有正常的體重?！罢！焙汀皢渭冃猿?uncomplicatedoverweight)”在本文中是指產(chǎn)18.5-30的bmi的體重。
當在本文中使用時，術(shù)語“飽感”意指其中個體感覺他們的渴望被滿足或最小化的基本上穩(wěn)態(tài)的狀態(tài)。許多生理因素據(jù)信對個體的飽感有影響。例如，味覺或味道，嗅覺或氣味，以及胃的脹滿感均可以對個體是否感覺“吃飽”有貢獻。更具體地，“飽感”是其中抑制進一步的進食并且決定餐間時間以及下一餐時消耗的食物量的狀態(tài)?！霸鰪姷娘柺掣小被蝾愃朴谜Z具有與對照情形相比飽食感更突出和/或更延長的含義。術(shù)語“飽食”當在本文中使用時是指在餐內(nèi)終止進食的狀態(tài)，通常在進餐開始后的一段時間(例如，20-30min)內(nèi)發(fā)生/被觀察到。因此，當在本文中提到“誘導(dǎo)飽食”或類似用語時，其具有激發(fā)受試者在進餐過程中停止進食的傾向的含義。對飽食的效應(yīng)可以通過對進餐終止的時間點評分來確定。如果在進餐終止時消耗的卡路里的量顯著比對照小，諸如例如，少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％或更多，則觀察到飽食效應(yīng)。在較長的時期(諸如1、2、3、4、5周或更多)內(nèi)，還可以與對照飲食相比對體重減輕或體重變化進行評分。與對照受試者相比，給予常規(guī)量的測試組合物(例如，一天一次，一天兩次或更多次)的受試者的體重優(yōu)選地顯著被控制(減小或增加較少)。當在本文中使用時，“對照受試者”是指不施用本發(fā)明的益生菌菌株的受試者。
當在本文中使用時，術(shù)語“clpb”具有其在本領(lǐng)域中的通常含義，并且還已知為熱休克蛋白f84.1，其是六聚體aaa+-atp酶的hsp100/clpb家族成員。clpb已經(jīng)被描述為獲得性耐熱性以及幾種革蘭氏陰性和革蘭氏陽性致病菌(諸如金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、土拉弗朗西斯菌(francisellaturalensis)、單核細胞增多性李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica)、和鼠傷寒沙門氏菌(salmonellathyphimurium))的毒力和感染性的關(guān)鍵因素。在大腸桿菌k12中，分子伴侶蛋白clpb也已知為熱休克蛋白f84.1或htpm并且是857個氨基酸的蛋白。通常，分子伴侶蛋白clpb包含來自大腸桿菌k12的分子伴侶蛋白clpb的具有seqidno:1的氨基酸序列(ncbi參考編號:np_417083.1,在2013年11月6日可獲得和/或uniprotkb/swiss-prot編號:p63284,在2013年11月6日可獲得)或由來自大腸桿菌k12的分子伴侶蛋白clpb的具有seqidno:1的氨基酸序列組成。通常，分子伴侶蛋白clpb的氨基酸序列包含與seqidno:1的氨基酸序列96-100％相同的氨基酸序列或由與seqidno:1的氨基酸序列96-100％相同的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，clpb的氨基酸序列與seqidno:1的氨基酸序列540-550(arwtgipvsr)96、97、98、99或100％相同。在本申請的上下文中，使用全局比對(即，兩條序列全長比較)計算同一性百分比。比較兩條或更多條序列的同一性的方法在本領(lǐng)域中是公知的。例如可以使用《needle》程序，當考慮兩條序列的全長時該程序使用needleman-wunsch全局比對算法(needleman和wunsch,1970j.mol.biol.48:443-453)來找到兩條序列的最佳比對(包括空位)。例如needle程序在ebi.ac.uk萬維網(wǎng)站點上可獲得。根據(jù)本發(fā)明的同一性百分比優(yōu)選地使用emboss:needle(全局)程序計算，所述程序使用的“空位開放”參數(shù)等于10.0,使用的“空位延伸”參數(shù)等于0.5,并使用blosum62矩陣。根據(jù)本發(fā)明，clpb蛋白模擬α-msh蛋白用于誘導(dǎo)飽食。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的clpb蛋白被抗-α-msh抗體識別。通常，所述抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，所述抗體是多克隆抗體諸如多克隆兔抗-α-mshigg(1:1000,peninsulalaboratories,sancarlos,ca,usa)。α-msh的氨基酸序列優(yōu)選地包含氨基酸序列sysmehfrwgkpv(seqidno:2)(genpept序列id,prf:223274,在2013年12月2日可獲得)或由氨基酸序列sysmehfrwgkpv(seqidno:2)組成。
seqidno:1:
mrldrltnkfqlaladaqslalghdnqfieplhlmsallnqeggsvsplltsaginagqlrtdinqalnrlpqvegtggdvqpsqdlvrvlnlcdklaqkrgdnfisselfvlaalesrgtladilkaagattanitqaieqmrggesvndqgaedqrqalkkytidlteraeqgkldpvigrdeeirrtiqvlqrrtknnpvligepgvgktaiveglaqriingevpeglkgrrvlaldmgalvagakyrgefeerlkgvlndlakqegnvilfidelhtmvgagkadgamdagnmlkpalargelhcvgattldeyrqyiekdaalerrfqkvfvaepsvedtiailrglkeryelhhhvqitdpaivaaatlshryiadrqlpdkaidlideaassirmqidskpeeldrldrriiqlkleqqalmkesdeaskkrldmlneelsdkerqyseleeewkaekaslsgtqtikaeleqakiaieqarrvgdlarmselqygkipelekqleaatqlegktmrllrnkvtdaeiaevlarwtgipvsrmmeserekllrmeqelhhrvigqneavdavsnairrsragladpnrpigsflflgptgvgktelckalanfmfdsdeamvridmsefmekhsvsrlvgappgyvgyeeggylteavrrrpysvilldevekahpdvfnillqvlddgrltdgqgrtvdfrntvvimtsnlgsdliqerfgeldyahmkelvlgvvshnfrpefinridevvvfhplgeqhiasiaqiqlkrlykrleergyeihisdealkllsengydpvygarplkraiqqqienplaqqilsgelvpgkvirlevnedrivavq
在一些實施方案中，clpb蛋白以藥物組合物的形式施用于受試者。在一些實施方案中，clpb蛋白與藥學(xué)上可接受的賦形劑以及任選地緩釋基質(zhì)，諸如生物可降解的聚合物組合，以形成藥物組合物。術(shù)語“藥學(xué)上”或“藥學(xué)上可接受”是指當適當時施用于哺乳動物，特別是人時不產(chǎn)生不良反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)或其他不良反應(yīng)的分子實體和組合物。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑是指任何類型的無毒性的固體、半固體或液體填充劑，稀釋劑，包封材料或制劑助劑。在本發(fā)明的藥物組合物中，有效成分單獨地或與另一種有效成分組合可以以單位給藥形式作為與常規(guī)藥物支持物的混合物施用于動物和人。合適的單位給藥形式包含口服途徑形式諸如片劑、凝膠膠囊、粉末、顆粒和口服混懸劑或溶液劑、舌下和頰部給藥形式、氣霧劑、植入物、皮下給藥形式、透皮給藥形式、局部給藥形式、腹膜內(nèi)給藥形式、肌肉內(nèi)給藥形式、靜脈內(nèi)給藥形式、真皮下給藥形式、透皮給藥形式、鞘內(nèi)給藥形式和鼻內(nèi)給藥形式和直腸給藥形式。優(yōu)選地，所述藥物組合物包含對能夠注射的制劑是藥學(xué)上可接受的媒介物。這些可以具體地是等滲的、無菌的、鹽水溶液(磷酸一鈉或磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂等或這些鹽的混合物)，或干燥的、特別是凍干的組合物，根據(jù)情況，在添加無菌水或生理鹽水后，所述組合物允許配制注射溶液。適合用于注射用途的藥物形式包括無菌水溶液或分散體；包含麻油、花生油或含水丙二醇的制劑；和用于臨時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。在所有情況下，所述形式必須是無菌的并且必須是達到容易注射的流體。其在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的并且必須被保護免受微生物諸如細菌和真菌的污染作用。包含本發(fā)明的化合物作為游離堿或藥理學(xué)上可接受的鹽的溶液可以在水中適當?shù)嘏c表面活性劑諸如羥丙基纖維素混合來制備。分散體也可以在甘油、液體聚乙二醇、和它們的混合物中以及在油中制備。在儲存和使用的普通條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物的生長?；钚猿煞挚梢员慌渲瞥芍行曰螓}形式的組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白的游離氨基形成)，其與無機酸或有機酸形成，所述無機酸諸如，例如，鹽酸或磷酸，有機酸諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等。與游離羧基形成的鹽也可以源自無機堿諸如，例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵，以及源自有機堿諸如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等。所述載體也可以是溶劑或分散介質(zhì)，所述溶劑或分散介質(zhì)含有例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇，等)、其合適的混合物，和植物油。適宜的流動性例如可以通過使用涂層諸如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的粒度并且通過使用表面活性劑來保持。防止微生物的作用可以通過各種抗菌劑和抗真菌劑(例如，尼泊金、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)來實現(xiàn)。在許多情況下，其優(yōu)選地包含等滲劑，例如，糖類或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可以通過在組合物中使用延緩吸收的藥劑，例如，單硬脂酸鋁和明膠來實現(xiàn)。無菌注射溶液通過在適宜的溶劑中摻入所需量的活性多肽，接著過濾滅菌來制備，所述適宜的溶劑根據(jù)需要具有上面列舉的其他成分中的多種成分。通常，通過將多種經(jīng)滅菌的活性成分摻入至無菌媒介物中來制備分散體，所述無菌媒介物包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的來自上面列舉的那些的其他成分。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥技術(shù)和凍干技術(shù)，所述技術(shù)產(chǎn)生活性成分與來自其前面無菌過濾的溶液的任何附加的所需成分的粉末。在配制后，溶液將以與所述劑型可配伍的方式并且以治療上有效的量給藥。所述制劑容易地以多種劑型給藥，諸如上述的注射溶液類型，但也可以采用藥物釋放膠囊和類似物。例如，對于水溶液形式的腸胃外給藥，如果必要所述溶液應(yīng)當被適當?shù)鼐彌_并且首先利用足量的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑變成等滲。這些特殊的水溶液特別適合于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥。在這一點上，根據(jù)本公開，可以采用的無菌水性介質(zhì)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。例如，一個劑量可以溶解在1ml等滲nacl溶液中，并且加入至1000ml皮下灌注液中或在推薦的輸注部位處注射。根據(jù)被治療的受試者的狀況，劑量有必要進行一些改變。無論如何，負責給藥的人將決定用于個體受試者的適宜劑量。
當在本文中使用時，表述“表達clpb的細菌”是指表達或過度表達如上面所定義的分子伴侶蛋白clpb或包含與seqidno:1的氨基酸序列96-100％相同的氨基酸序列的多肽或由與seqidno:1的氨基酸序列96-100％相同的氨基酸序列組成的多肽，更優(yōu)選包含與seqidno:1的氨基酸序列96、97、98、99或100％相同的氨基酸序列的多肽或由與seqidno:1的氨基酸序列96、97、98、99或100％相同的氨基酸序列組成的多肽的細菌。
在一些實施方案中，表達clpb的細菌是益生菌菌株。
當在本文中使用時術(shù)語“益生物”意指命名這樣的活微生物，它們以充足的量整合在一起，對健康發(fā)揮積極效果，在傳統(tǒng)營養(yǎng)作用以外還提供舒適和健康。益生微生物已經(jīng)被定義為“當以足量施用時對宿主賦予健康益處的活微生物”(fao/who2001)。當在本文中使用時表述“益生菌菌株”表示對宿主的健康和福祉具有有益效應(yīng)的細菌菌株。
在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌菌株是有活力的益生菌菌株。表述“有活力的益生菌菌株”意指有代謝活性并且能夠定植在受試者的胃腸道的微生物。
在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌菌株是由細菌碎片混合物組成的無活力的益生菌菌株。在一些實施方案中，本發(fā)明的細菌碎片混合物由來自所述細菌菌株的蛋白組成。
在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌菌株選自食品級細菌。“食品級細菌”意指被使用且通常被認為在食品中使用是安全的細菌。
所述細菌菌株可以是天然存在的菌株或其可以是基因工程化的細菌菌株。
在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌菌株是組成性表達clpb蛋白的細菌。
在一些實施方案中，clpb蛋白在細菌中過表達。通常當?shù)鞍滓愿哂谧匀唤缰性跇藴蕳l件下存在的給定基線產(chǎn)量的量或產(chǎn)量表達或產(chǎn)生時蛋白表達是“上調(diào)的”或該蛋白是“過表達的”。蛋白的過表達可以例如通過改變下述中的任一種或多種來實現(xiàn)：(a)宿主細胞的生長或生活條件；(b)編碼所述蛋白的多核苷酸；(c)用來控制所述多核苷酸的表達以及其在細胞中的拷貝數(shù)的啟動子；和(d)宿主細胞本身。
在一些實施方案中，所述細菌承受應(yīng)激條件使得在所述細菌中clpb蛋白的表達被上調(diào)。應(yīng)激可以選自由下列各項組成的組：暴露于熱量，溫度改變，機械應(yīng)力，或長時間保存，低濕度保存和/或凍干或噴霧干燥。
在一些實施方案中，所述細菌接受營養(yǎng)物供應(yīng)至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。通常營養(yǎng)物借助于便于細菌生長的培養(yǎng)基(例如，如實施例中所述的muller-hinton)供應(yīng)。在一些實施方案中，細菌在緊接所述重復(fù)的營養(yǎng)物供應(yīng)的靜止期階段時分離，因為在此期期間clpb蛋白的濃度最大。
在一些實施方案中，所述細菌包含至少一個點突變使得clpb蛋白的表達被上調(diào)。術(shù)語“點突變”當在本文中使用時意指核酸置換和/或缺失。可選地或同時地，所述至少一個突變位于clpb基因的調(diào)控dna序列內(nèi)，例如，在轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列中，優(yōu)選此突變調(diào)節(jié)所述蛋白的表達。調(diào)控dna序列內(nèi)的突變可以起上調(diào)所述蛋白的表達的作用。
在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌菌株是已經(jīng)被遺傳工程化以表達clpb蛋白的細菌。通常，所述細菌菌株用編碼clpb蛋白的核酸轉(zhuǎn)化。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”意指將“外來”(即，外部的或細胞外的)基因、dna或rna序列引入至宿主細胞中，使得所述宿主細胞將表達引入的基因或序列以產(chǎn)生所需的物質(zhì)，通常被所引入的基因或序列編碼的蛋白或酶。接收和表達所引入的dna或rna的宿主細胞已經(jīng)被“轉(zhuǎn)化”。所述核酸可以在親代微生物的轉(zhuǎn)化后保留在染色體外或可以適于整合到微生物的基因組中。因此，所述核酸可以包括適于輔助整合的附加核苷酸序列(例如，允許同源重組并靶向整合到宿主基因組中的區(qū)域)或適于染色體外構(gòu)建體的穩(wěn)定表達和復(fù)制的附加核苷酸序列(例如，復(fù)制起始點，啟動子和其他調(diào)控序列)。在一些實施方案中，所述核酸是核酸構(gòu)建體或載體。在一些實施方案中，所述核酸構(gòu)建體或載體是表達構(gòu)建體或載體，然而，本發(fā)明涵蓋其他構(gòu)建體和載體，諸如用于克隆的那些。在一些實施方案中，表達構(gòu)建體或載體是質(zhì)粒。典型地，表達構(gòu)建體/載體進一步包括啟動子，如本文前面所述。在一些實施方案中，啟動子允許在它的控制下組成性表達基因。然而，也可以采用誘導(dǎo)型啟動子。要理解本發(fā)明的表達構(gòu)建體/載體除了啟動子以外可以含有任何數(shù)目的調(diào)控元件以及如果需要的話適合于表達clpb蛋白的額外基因。用于利用細胞外核酸轉(zhuǎn)化細菌細胞的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。
在一些實施方案中，益生菌菌株是革蘭氏陰性菌株。
在一些實施方案中，益生菌菌株是腸桿菌科成員。
在一些實施方案中，益生菌菌株是大腸桿菌菌株。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)使用的益生大腸桿菌菌株包括非致病性大腸桿菌菌株，其發(fā)揮益生活性。益生大腸桿菌菌株的實例是益生大腸桿菌菌株bu-230-98,atcc保藏號202226(dsm12799),其是已知的市售的益生大腸桿菌菌株m-17的分離物。非致病性菌的實例是大腸桿菌nissle1917。尚未知曉是益生菌的大腸桿菌菌株的實例是實驗室大腸桿菌菌株k12。
通常，本發(fā)明的益生菌菌株利用本領(lǐng)域中熟知的任何適宜的培養(yǎng)基制備。根據(jù)本發(fā)明各種發(fā)酵培養(yǎng)基均是合適的，諸如(但不限于)例如首先工業(yè)培養(yǎng)基，一種或多種菌株在所述工業(yè)培養(yǎng)基中生長，并且所述培養(yǎng)基原樣使用或在濃縮后(例如，干燥)使用或在添加到另一食物基或產(chǎn)品中后使用。可選地，可以使用細菌細胞，或帶有培養(yǎng)基的細菌細胞(例如，發(fā)酵液)，或包含部分這樣細胞的培養(yǎng)基(即，具有所述一種或多種細菌菌株的培養(yǎng)基)。細胞或含有所述細胞的培養(yǎng)基包含一種或多種菌株的活的或有活力的細菌細胞和/或死的或無活力的細菌細胞。因此所述培養(yǎng)基可以通過，但不限于，加熱或超聲作用進行處理。凍干的、或冷凍的細菌和/或無細胞培養(yǎng)基(其可以被濃縮)也涵蓋在用于制備本發(fā)明的益生菌菌株的方法中。
通常，本發(fā)明的益生菌菌株通過攝入(即，經(jīng)口途徑)施用于所述受試者。
在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌菌株被包封以便被保護免受胃的影響。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌菌株被配制在包封形式的組合物中以便顯著地提高它們的生存時間。在這樣的情況下，膠囊的存在可以特別地延緩或防止微生物在胃腸道中的降解。要理解的是本發(fā)明的組合物可以被包封在腸包衣的、定時釋放(time-released)的膠囊或片劑中。腸包衣允許當膠囊/片劑通過胃腸道時其保持完整(即，未溶解的)，直至它到達小腸的時候為止。包封活細菌細胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的(參見，例如，generalmillsinc.的美國專利，諸如美國專利號6,723,358)。例如，利用海藻酸鹽和hi-maizetm淀粉微包封接著凍干已經(jīng)證明成功地延長乳制品中細菌細胞的保質(zhì)期[參見，例如，kailasapathy等人currissuesintestmicrobiol.2002september；3(2):39-48]?？蛇x地，可以利用葡甘露聚糖纖維諸如從魔芋(amorphophalluskonjac)提取的那些來完成包封?？蛇x地，也可以使用將有活力的益生菌包封在麻油乳液中[參見，例如，hou等人j.dairysci.86:424-428]。在一些實施方案中，用于腸包衣的藥劑優(yōu)選是甲基丙烯酸-丙烯酸烷基酯共聚物，諸如
-聚(甲基)丙烯酸酯,在消化液中是可溶的(通過形成鹽)：
-聚(甲基)丙烯酸酯,在消化液中是不可溶的：具有堿性基團的
腸
通常，本發(fā)明的益生菌菌株以食物組合物的形式施用于受試者。因此本發(fā)明的另一個方面涉及包含一定量的本發(fā)明的益生菌菌株的食物組合物。
在一些實施方案中，包含本發(fā)明的益生菌菌株的食物組合物選自完全食品組合物、食品補充劑、營養(yǎng)組合物，等。本發(fā)明的組合物可以用作食物成分和/或飼料成分。
所述食物成分可以是溶液的形式或作為固體—取決于應(yīng)用的用途和/或模式和/或給藥方式。
本發(fā)明的益生菌菌株通常在所述組合物的制備過程期間的任何時間加入，例如，它們可以在制備過程開始時加入至食物基或它們可以加入至最終的食物產(chǎn)品中。
“食物”是指液體(即，飲料)、固體或半固體飲食組合物，特別是不需要額外的營養(yǎng)素攝取的完全食品組合物(食物替代品)或食品補充劑組合物。食品補充劑組合物不能完全代替通過其他方式的營養(yǎng)素攝取。食物組合物和食品補充劑組合物例如是發(fā)酵乳制品或基于乳制品的產(chǎn)品，它們優(yōu)選地經(jīng)口一天一次或多次地施用或攝入。發(fā)酵乳制品可以直接使用根據(jù)本發(fā)明的細菌在制備過程中使用本身已知的方法制成，例如通過添加到食物基。在這樣的方法中，除了通常使用的微生物以外可以使用本發(fā)明的一種或多種菌株，和/或本發(fā)明的一種或多種菌株可以代替一種或多種通常使用的微生物或部分的通常使用的微生物。例如，在發(fā)酵乳制品諸如酸奶或基于酸奶的飲料的制備中，本發(fā)明的細菌可以添加到起子培養(yǎng)或用作起子培養(yǎng)的一部分，或可以在這樣的發(fā)酵過程中適當?shù)丶尤?。任選地，在制備過程后期所述細菌可以被失活或殺死。發(fā)酵乳制品包括奶基產(chǎn)品，諸如(但不限于)甜點、酸奶、酸乳飲料、夸克、開菲爾、發(fā)酵奶基飲料、酪乳、奶酪、調(diào)味汁、低脂醬、新鮮干酪、基于大豆的飲料、冰淇淋等?？蛇x地，食物和/或食品補充劑組合物可以是非乳制的或乳制的非發(fā)酵性產(chǎn)品(例如，非發(fā)酵奶或另一食物媒介中的菌株或無細胞媒介)。在一些實施方案中，本發(fā)明的益生菌菌株被包封并分散在食物(例如，在奶中)或非食物媒介中。非發(fā)酵性乳制品可以包括冰淇淋、營養(yǎng)棒和調(diào)味汁，等。非-乳制品可以包括飲料粉沖泡飲料和營養(yǎng)棒，等。所述產(chǎn)品可以使用已知的方法制備，諸如向食品基質(zhì)諸如脫脂奶或奶或奶基組合物和發(fā)酵物添加有效量的一種或多種菌株和/或無細胞培養(yǎng)基，如已知的那樣?？梢蕴砑蛹毦毎?包含所述細菌細胞的組合物)和/或無細胞培養(yǎng)基(包含所述無細胞培養(yǎng)基的組合物)的其他食品基質(zhì)是肉、肉代用品或植物基質(zhì)。
包含本發(fā)明的益生菌菌株的組合物可以是固體、半固體或液體。其可以是食品或食品補充劑的形式，例如，片劑、凝膠、粉劑、膠囊、飲料、棒等的形式。例如，所述組合物可以是包裝在小囊中的粉末的形式，其可以溶解在水、果汁、奶或另一種飲料中。
當在本文中使用時術(shù)語“食物成分”或“飼料成分”包括被添加到或可以被添加到功能食品或食料中作為營養(yǎng)補充劑的制劑。
“營養(yǎng)食物”或“營養(yǎng)食品”或“功能”食品意指含有對健康具有有益效果或能夠改善生理功能的成分的食料。
“食品補充劑”意指具有完善正常食物飲食的目的的食料。食品補充劑是營養(yǎng)素的濃縮來源或當被單獨攝入或作為小量的組合攝入時具有營養(yǎng)或生理效應(yīng)的其他物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，“功能食品”概括了食料以及以后被開發(fā)的相應(yīng)產(chǎn)品，它們的重要性不僅歸因于就營養(yǎng)和味道而言它們是有價值的，而且歸因于特定的成分物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，健康的中期或長期維持和促進是很重要的。就此而言，優(yōu)選非治療性用途。術(shù)語“營養(yǎng)食品”、“食物營養(yǎng)素(foodsceuticals)”、“特制食品”也代表本發(fā)明的實施方案，它們部分地用作同義詞，然而，還是處于不同的方式。然而，術(shù)語功能食品最清晰地表達了產(chǎn)品的預(yù)防方面和促進健康以及食物特性。在許多情況下，這些涉及通過分類和選擇(在本發(fā)明中也是如此)、純化、濃縮、還通過漸增添加所積聚而成的產(chǎn)品。不包括有效分離的物質(zhì)，特別是以片劑或丸劑的形式。盡管功能食品并不存在法定的含義，但大多數(shù)在此領(lǐng)域中感興趣的主體同意它們是在市場上銷售的除了基本的營養(yǎng)效應(yīng)以外還具有特定的健康效應(yīng)的食品。因此，功能食品是其中摻入了對食物施加了特定的功能益處(例如，醫(yī)學(xué)或生理益處)而不是純營養(yǎng)效應(yīng)的組分或成分(諸如本文所述的那些)。
在一些實施方案中，飲料是功能飲料或治療性飲料、止渴劑或普通飲料。借助于實施例，本發(fā)明的組合物可以用作軟飲料、果汁或包含乳清蛋白的飲品、保健茶、可可飲料、牛奶飲料和乳酸菌飲料、酸奶和酸奶飲品、干酪、冰淇淋、冰糕和甜點、糕點糖果、餅干蛋糕和蛋糕粉、休閑食品、均衡食品和飲料、水果餡、保健釉、巧克力焙烤食品餡、乳酪蛋糕調(diào)味餡(cheesecakeflavouredfilling)、水果味蛋糕餡(fruitflavouredcakefilling)、蛋糕和甜甜圈酥皮、即食烘焙用填充餡、曲奇餡、即用型焙烤食品餡、減少卡路里的食品餡(reducedcaloriefilling)、成人營養(yǎng)性飲料、酸性大豆/果汁飲料、無菌/殺菌袋裝巧克力飲料、雞尾酒(barmixes)、飲料粉、鈣強化大豆/原味和巧克力奶、鈣強化咖啡飲料的成分。
所述組合物可以進一步用作食品諸如下列中的成分：美國芝士醬、用于搓碎和碎干酪的抗結(jié)塊劑、點心盤、奶油干酪、干混植脂奶油脫脂酸奶油、冷凍/融化的動物性鮮奶油、對冷凍/融化穩(wěn)定的植物鮮奶油、低脂和清淡天然切達干酪(lowfatandlightnaturalcheddarcheese)、低脂瑞士風味酸奶、充氣冷凍甜點、硬盒包裝冰淇淋、帶環(huán)保標簽的經(jīng)濟性和嗜好性提高的硬盒冰淇淋、低脂冰淇淋：軟質(zhì)冰淇淋、烤肉調(diào)味醬、干酪蘸醬、農(nóng)家干酪調(diào)味汁(cottagechessedressing)、干混阿爾弗雷德醬、混合干酪醬、干混番茄醬和其他食品。
在一些實施方案中，包含本發(fā)明的益生菌菌株的組合物用于酸奶生產(chǎn)，諸如發(fā)酵型酸奶飲料、酸奶、飲用型酸奶、干酪、發(fā)酵奶油、奶基甜點等。合適地，所述組合物可以進一步用作干酪應(yīng)用、肉制品應(yīng)用或包括保護性培養(yǎng)物的應(yīng)用中的一種或多種應(yīng)用中的成分。
在一些實施方案中，包含本發(fā)明的益生菌菌株的食物組合物適合用于制備代餐產(chǎn)品。當在本文中使用時，術(shù)語“代餐產(chǎn)品”當在本文中使用時，除非另外指定，否則包括包含蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)的任何營養(yǎng)產(chǎn)品，然后所述營養(yǎng)產(chǎn)品的組合適合作為一餐的單一或基本營養(yǎng)源。通常，所述代餐產(chǎn)品包含至少一種碳水化合物源、至少一種脂質(zhì)源和/或至少一種蛋白源。作為蛋白源，可以使用任何合適的膳食蛋白質(zhì)，例如動物蛋白(諸如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)；植物蛋白(諸如大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白、和豌豆蛋白)；游離氨基酸的混合物；或其組合。乳蛋白諸如酪蛋白和小麥蛋白，以及大豆蛋白是特別優(yōu)選的。所述蛋白可以是完整蛋白或水解蛋白或完整蛋白和水解蛋白的混合物。例如對據(jù)信處于發(fā)生牛乳過敏風險的動物供應(yīng)部分水解的蛋白可以是合乎需要的(水解度為2-20％)。如果需要水解蛋白，水解過程可以根據(jù)需要以及如本領(lǐng)域中已知的那樣進行。例如，乳清蛋白水解物可以通過以一步或多步酶促水解乳清級分來制備。如果用作起始物料的乳清級分基本上不含乳糖，則發(fā)現(xiàn)在水解過程期間蛋白發(fā)生少得多的賴氨酸阻塞。這使得能夠?qū)①嚢彼嶙枞某潭葟募s15重量％的總賴氨酸減少到小于約10重量％的賴氨酸；例如約7重量％，這極大地改善了蛋白源的營養(yǎng)質(zhì)量。如果所述組合物包括脂肪源，則所述脂肪源優(yōu)選地提供所述組合物的5％-40％能量；例如，20％-30％的能量。使用芥花油、玉米油和高油酸向日葵油的共混物可以獲得合適的脂肪譜。碳水化合物的來源優(yōu)選地提供所述組合物的40％-80％能量。可以使用任何合適的碳水化合物，例如，蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固形物、麥芽糊精、和它們的混合物。通常，利用替餐用低能量膳食代替一日中的一餐促進體重減輕后的體重維持。
包含本發(fā)明的益生菌菌株的食物組合物通常包含載體或媒介物?！拜d體”或“媒介物”意指適合用于給藥的材料并且包括本領(lǐng)域中已知的任何此類材料，諸如，例如，任何液體、凝膠、溶劑、液體稀釋劑、增溶劑或類似物，它們是無毒的并且不以有害的方式干擾所述組合物的任何組分。營養(yǎng)上可接受的載體的實例包括，例如，水、鹽溶液、醇、硅酮、蠟、凡士林油、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂質(zhì)體、糖類、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、滑石、表面活性劑、硅酸、粘性石蠟、香精油、脂肪酸單甘油酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮，和類似物。
在一些實施方案中，包含本發(fā)明的益生菌菌株的食物組合物包含一定量的膳食纖維。膳食纖維通過小腸，卻不被酶消化，并且作為天然增容劑和緩瀉藥發(fā)揮作用。膳食纖維可以是可溶的或不溶的并且通常優(yōu)選是兩種類型的共混物。膳食纖維的合適來源包括大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜兒豆膠、阿拉伯樹膠、低聚果糖、低聚半乳糖、唾液基-乳糖和來源于動物奶的寡糖。在一些實施方案中，所述膳食纖維在甘露聚糖中選擇。甘露聚糖(諸如葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖)，諸如瓜兒豆膠、刺槐豆膠、蒟蒻、和黃原膠，存在于一些植物細胞壁中。葡甘露聚糖通常由(1-4)-β-連接的葡萄糖和甘露糖單元組成，而半乳甘露聚糖通常由被單一單元的(1-6)-α-半乳糖取代的(1-4)-β-甘露聚糖主鏈組成。許多胚乳豆科植物，諸如瓜爾豆和槐豆，在種子發(fā)育期間在胚乳中包含半乳甘露聚糖。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)葡甘露聚糖是糧食的微量組分。
在一些實施方案中，包含本發(fā)明的益生菌菌株的食物組合物含有根據(jù)政府機構(gòu)諸如usrda推薦的礦物質(zhì)和微量營養(yǎng)素諸如痕量元素和維生素。例如，所述組合物可以包含每天一次劑量的下面的給定范圍的微量營養(yǎng)素中的一種或多種：-300-500mg鈣、50-100mg鎂、150-250mg磷、5-20mg鐵、1-7mg鋅、0.1-0.3mg銅、50-200μg碘、5-15μg硒、1000-3000μgβ-胡蘿卜素、10-80mg維生素c、1-2mg維生素b1、0.5-1.5mg維生素b6、0.5-2mg維生素b2、5-18mg煙酸、0.5-2.0μg維生素b12、100-800μg葉酸、30-70μg生物素、1-5μg維生素d、3-10μg維生素e。
在一些實施方案中，包含本發(fā)明的益生菌菌株的組合物含有乳化劑。食品級乳化劑的實例通常包括甘油一酯和甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、卵磷脂和甘油一酯和甘油二酯。類似地可以包括合適的鹽和穩(wěn)定劑。
在一些實施方案中，包含本發(fā)明的益生菌菌株的食物組合物含有至少一種益生物質(zhì)?！耙嫔镔|(zhì)”意指意欲促進本發(fā)明的益生菌菌株在腸中生長的食物物質(zhì)。所述益生物質(zhì)可以選自由下列各項組成的組：寡糖和可選地含有果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；和/或膳食纖維。
在一些實施方案中，包含本發(fā)明的益生菌菌株的組合物含有保護性水狀膠質(zhì)(諸如樹膠、蛋白、改性淀粉)、粘合劑、成膜劑、包囊劑/材料、壁/殼材料、基質(zhì)化合物、包衣、乳化劑、表面活性劑、增溶劑(油、脂肪、蠟、卵磷脂等)、吸附劑、載體、填充劑、輔助化合物(co-compound)、分散劑、潤濕劑、加工助劑(溶劑)、助流劑、掩味劑、增重劑、凝膠化劑(jellifyingagent)、膠凝劑、抗氧化劑和抗微生物劑。所述組合物還可以包含常規(guī)藥物添加劑和輔料、賦形劑和稀釋劑，包括，但不限于，水、任何來源的白明膠、植物膠、木質(zhì)素磺酸鈉、滑石、糖類、淀粉、阿拉伯樹膠、植物油、聚亞烷基二醇、調(diào)味劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖液、潤滑劑、著色劑、潤濕劑、填充劑，等等。在所有情況下，這些更多的組分將關(guān)于它們對預(yù)期受者的適合性來選擇。
在一些實施方案中，clpb蛋白(或表達所述蛋白的益生菌菌株)的給藥重復(fù)例如一天2-3次，持續(xù)一天或多天并且通常持續(xù)至少4天，或甚至4-15周的周期，在適當時中斷一個或多個周期。在一些實施方案中，clpb蛋白與受試者的一餐同時地或相繼地給予。在一些實施方案中，clpb蛋白在受試者的餐前給予。
當在本文中使用時，術(shù)語“有效量”是指足以實現(xiàn)有益效果(例如，激發(fā)飽感，延長飽食，減少進食，控制體重增加,和/或促進體重減輕)的clpb蛋白的量。在本發(fā)明的上下文中，施用于受試者的clpb蛋白的量將取決于個體的特征，諸如一般健康、年齡、性別、體重...本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠根據(jù)這些和其他因素確定適宜的劑量。例如，當clpb蛋白以益生物質(zhì)的形式施用于受試者時，本發(fā)明的菌株應(yīng)當能夠生成足以在受試者上產(chǎn)生有益效果的集落。如果益生菌菌株以食品的形式施用，則其通?？梢园?03-1012cfu的本發(fā)明的益生菌菌株每g干重的所述食物組合物。
本發(fā)明將進一步通過下面的附圖和實施例來舉例說明。然而，這些實施例和附圖不應(yīng)當以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。
附圖說明
圖1：在3周管飼開始和結(jié)束時分析的在正常c57bl6成年小鼠中每天一次胃內(nèi)遞送大腸桿菌k12野生型(wt)或刪除clpb基因的大腸桿菌(δclpb)對體重、24h進食和進餐模式的效應(yīng)。對照小鼠(ctr)不接受任何管飼。進餐模式測量為餐量，對應(yīng)于在單餐期間吃掉的食物的平均量，并且作為進餐頻率，對應(yīng)于每24h間隔至少5min的進餐數(shù)。減少的攝食量反映了較快的飽食并且減少的進餐頻率反映了較長的飽感。a.雙因素重復(fù)測量anova,邦弗朗尼事后檢驗*p<0.05。b、d、g、h,anova,tukey事后檢驗，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。e.學(xué)生t檢驗，*p<0.05。
具體實施方式
實施例1:
材料和方法
在定期營養(yǎng)素供應(yīng)后體外大腸桿菌生長
在50mlfalcon瓶中在處于25℃、ph為7.3的含有30％牛肉浸液、1.75％干酪素水解物和0.15％淀粉的40mlmh培養(yǎng)基(becton,dickinson,md)中在37℃培養(yǎng)大腸桿菌k12菌。為了建模人中的兩種預(yù)定的每日用餐，在連續(xù)5天期間細菌每12h接受新的mh培養(yǎng)基。細菌生長在第一次提供mh培養(yǎng)基后每2h、第三次提供后每1h以及在第五次提供后每10min通過分光光度計測量為在λ＝600nm的od。在每12h循環(huán)結(jié)束時，將細菌在室溫(rt)以6,000rpm離心5min。棄去上清液并且更換相等體積(～40ml)的新mh培養(yǎng)基。在最后一次補充mh培養(yǎng)基后，在指數(shù)期和接下來的靜止期中對細菌采樣以進行蛋白提取。
蛋白提取
大腸桿菌k12菌在4℃以4,000g離心30min。細菌殘余物溶解在2ml三羥基甲基氨基甲烷(tris)緩沖液(ph7.4)中并通過在rt超聲作用3min進行勻漿。為了從未溶解的細胞碎片中分離蛋白，將細菌勻漿在4℃以10,000g離心30min?；厥丈锨逡?，然后在4℃以60,000g超離心45min從而將蛋白進一步分離成細胞質(zhì)(上清液)和膜(殘余物)級分。膜蛋白溶解在tris緩沖液(ph7.4)中。蛋白濃度使用2-dquant試劑盒(gehealthcare,piscataway,nj)測量。
二維聚丙烯酰胺凝膠電泳
對于2d-page，300μg大腸桿菌蛋白提取物用來再水化固定的ph梯度(ipg)條(ph4–7；18cm；bio-rad,hercules,ca)。然后通過使用ipgphor等電聚焦系統(tǒng)(gehealthcare)進行等點聚焦總計85,000v-h以第一維解析蛋白。在聚焦后，將ipg條在平衡緩沖液[尿素6mol/l、30％(vol:vol)甘油、2％(wt:vol)十二烷基硫酸鈉(sds)、tris-hcl50mmol/lph8.8、和含有2％(wt:vol)二硫蘇糖醇的0.25％(wt:vol)溴酚藍]中孵育15min，然后在含有4％(wt:vol)碘乙酰胺的平衡緩沖液中烷基化15min。ipg條隨后固定到10％聚丙烯酰胺梯度凝膠(20cm·18cm·1mm)上進行sds-page。在ettandaltsix垂直電泳系統(tǒng)(gehealthcare)中利用12ma/凝膠在25℃進行第二維過夜。在sds-page后，將2d凝膠在2％(vol:vol)正磷酸和在50％(vol:vol)甲醇中在rt固定2h。然后將凝膠用水漂洗，并且通過cbbg-250(bio-rad)染料[34％(vol:vol)甲醇、17％(wt:vol)硫酸銨、2％(vol:vol)正磷酸和0.66gcbbg-250/l]可視化蛋白斑點。
對差異蛋白表達的分析
將染色的2d凝膠的圖像通過用灰色標度標志物(kodak,rochester,ny)校準并用labscan6.0軟件(gehealthcare)數(shù)字化的imagescannerii(gehealthcare)掃描。使用imagemaster2dplatinum5.0軟件(gehealthcare)進行對差異蛋白表達的分析，包括斑點檢測、定量、匹配和對比分析。每個蛋白樣品接受2d-page至少3次(膜蛋白)和4次(細胞質(zhì)蛋白)以使連續(xù)運行變化最小化，并且使用imagemaster比較每組3個(或4個)凝膠以確認所述組凝膠內(nèi)沒有出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)有差異的斑點。每組的最有代表性的凝膠(凝膠移位、斑點清晰度和斑點數(shù))用來比較指數(shù)期和靜止期的大腸桿菌蛋白。表達水平由凝膠中每個斑點的相對體積來確定并且表示為％體積，計算為斑點體積/凝膠中解析的所有斑點的σ體積。這種經(jīng)歸一化的斑點體積通過對凝膠中存在的所有斑點均考慮總體積而考慮到了由于蛋白上樣和染色引起的變異。豐度變異計算為2期之間斑點組％體積的平均值比率。僅體積變異比率>1.5的斑點被考慮為相關(guān)。凝膠內(nèi)缺失的斑點表明對于該蛋白在所選的試驗條件下沒有可檢測到的表達。在斑點體積對數(shù)變換后，相應(yīng)的p值通過學(xué)生t檢驗(顯著性水平p<0.05)確定。
通過液相色譜-電噴射離子化ms/ms進行的蛋白鑒定
使用ettan斑點切取儀(gehealthcare)將感興趣蛋白斑點從cbbg-250-染色的2d凝膠切下，并且如前所述(goichon等人,2011)在ettan消化器(gehealthcare)上進行蛋白的自動凝膠內(nèi)消化。然后將蛋白提取物重新懸浮在10μl5％(vol:vol)乙腈/0.1％(vol:vol)甲酸中，然后利用連接到裝有nanospray源和hplc-chipcubeinterface(agilenttechnologies,courtaboeuf,法國)的6340離子阱質(zhì)譜儀的nano-lc1200系統(tǒng)進行分析。簡言之，在40nlrp-c18捕獲柱上將肽富集并脫鹽，并在zorbax(30-nm孔徑,5-μm粒徑)c18柱(43mm長x75μm內(nèi)徑；agilenttechnologies)上分離。使用9-min線性梯度(在0.1％甲酸中的3％-80％乙腈)以400nl/min的流速，并且利用離子阱質(zhì)譜儀分析洗脫液。
對于蛋白鑒定，提取ms/ms峰列表并通過使用mascotdaemonversion2.2.2(matrixscience)搜索引擎將其與蛋白數(shù)據(jù)庫進行比較。利用下面的特定參數(shù)進行搜索：酶特異性，胰蛋白酶；允許一個未酶切位點；沒有固定修飾；可變化的修飾，蛋氨酸氧化，半胱氨酸脲基甲基化，絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸磷酸化；單同位素；肽電荷，2+和3+；前驅(qū)粒子的質(zhì)量公差，1.5da；碎片粒子的質(zhì)量公差，0.6da；esi-trap作為儀器；分類學(xué)，大腸桿菌；國立生物技術(shù)信息中心(ncbi)數(shù)據(jù)庫[ncbinr20120531(18280215條序列，6265275233個殘基)](bethesda,md)。如果蛋白命中滿足下列標準中之一則自動地驗證所述蛋白命中：利用至少兩個排名最高的肽(粗體的和紅色的)鑒定，每個肽的mascot評分大于54(p<0.01)，或利用至少兩個排名最高的肽(粗體的和紅色的)鑒定，每個的mascot評分大于47(p<0.05)。為了評價假陽性率，使用mascot的“誘餌”選項進行所有初始的數(shù)據(jù)庫搜索。如果假陽性率從來不超過1％則認為結(jié)果是相關(guān)的。
atp測定
使用atp比色/熒光測定試劑盒根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書(biovision,ca)測量體外atp產(chǎn)生。簡言之，將來自指數(shù)期或靜止期的細菌蛋白置于一系列孔中，對于每個濃度一式兩份(在atp測定緩沖液中的1、10和25μg/ml)并且利用atp測定緩沖液調(diào)整至50μl/孔。然后將10μl不同的營養(yǎng)素溶液、15％蔗糖或mh培養(yǎng)基添加至相應(yīng)的孔中并且利用atp測定緩沖液調(diào)整至50μl/孔；僅50μl/孔的atp緩沖液添加至對照孔中。所述板在37℃孵育2h。在孵育后，將50μlatp反應(yīng)混合物(含有atp測定緩沖液、atp探針、atp轉(zhuǎn)換劑和顯影劑混合物)添加到每個孔中。在rt孵育30min后在570nm測量od，避光。
clpb免疫測定的顯影和驗證
clpb檢測測定的設(shè)計基于幾個標準，諸如在線性濃度范圍內(nèi)的特異性和靈敏度檢測。特定狀況是沒有α-msh交叉反應(yīng)性的clpb檢測，其可能由于在clpb分子中存在一個或多個α-msh-樣表位而發(fā)生。為了程序和信號檢測的簡單性，我們使用了標準的96-孔elisa板以及通過分光光度計進行od讀數(shù)的選項。clpbelisa和westernblot(wb)的詳細規(guī)程在分開的章節(jié)中給出。
為了防止啟示抗體(ab)與捕獲ab的結(jié)合，我們分別在不同的物種，兔和小鼠中制備了clpb捕獲ab和clpb檢測ab。為了從復(fù)雜的生物樣品中最有效地捕獲clpb蛋白，我們用具有多個抗-clpb表位的兔多克隆ab包被elisa板。為了避免clpb和α-msh之間的交叉反應(yīng)性，我們使用小鼠單克隆抗-clpbab作為檢測ab，所述小鼠單克隆抗-clpbab的特征是高靈敏度和特異性地識別clpb而非通過對幾個ab克隆的elisa篩選來進行α-msh預(yù)選擇。堿性磷酸酶綴合的抗小鼠啟示ab用作獲得發(fā)色酶促反應(yīng)的常用elisa工具，所述發(fā)色酶促反應(yīng)可作為與分析物濃度成正比的od來讀取。在沒有到達穩(wěn)定期并且沒有od信號飽和的條件下從2pm-150pm的重組大腸桿菌clpb蛋白的7個連續(xù)稀釋液的檢測得到od線性變化。
為了確認開發(fā)的clpb測定的特異性，我們測量了從大腸桿菌k12wt的10個不同的培養(yǎng)物以及從δclpb突變大腸桿菌的培養(yǎng)物提取的蛋白樣品中的clpb濃度。clpb突變株和相應(yīng)的野生型(wt)菌株由dr.axelmogk(zmbh,海德堡大學(xué),德國)饋贈。此外，我們通過wb使用抗-clpb多克隆兔ab分析了存在于這些細菌蛋白樣品中的clpb并且比較了elisa中wb帶以及clpb濃度之間的信號強度值。在所有wt大腸桿菌培養(yǎng)物中檢測clpb，其中7個培養(yǎng)物的clpb濃度高于1000pm，而在從δclpb大腸桿菌中提取的蛋白樣品中clpb是無法檢測到的。wb揭示了在wt中存在具有期望的96kda大小的主要條帶，而在δclpb大腸桿菌中則沒有。這些條帶的od強度在各個樣品之間有所變化，并且與通過elisa在相同的大腸桿菌培養(yǎng)物樣品中測量的clpb濃度正相關(guān)。因此，在δclpb大腸桿菌的蛋白制劑中檢測不到clpb確認了測量的特異性，并且elisa和wb之間的良好一致性提供了對兩種clpb免疫檢測技術(shù)的交叉驗證。
為了驗證clpb血漿測定檢測來源于腸道細菌的clpb，我們使用了clpbelisa來測量小鼠血漿中的clpb，所述小鼠已經(jīng)經(jīng)由胃內(nèi)管飼每天一次補充wt大腸桿菌或補充δclpb大腸桿菌持續(xù)3周。血漿樣品可獲自我們之前發(fā)表的研究(tennoune等人,2014)。我們發(fā)現(xiàn)clpb正常存在于小鼠血漿中，包括對照以及用不含細菌的培養(yǎng)肉湯管飼的小鼠兩者。重要的是，clpb血漿水平在接受wt大腸桿菌的小鼠中增加而在補充以clpb-缺陷性大腸桿菌的小鼠中沒有改變，確認了血漿clpb的腸道細菌起源。
clpbelisa
使用100μl和在100mmnahco3緩沖液(ph9.6)中的2μg/ml的濃度，將兔多克隆抗-大腸桿菌clpb抗體(由delphigenetics,戈斯利,比利時定制)在4℃包被在96-孔maxisorp板(nunc,rochester,ny)上持續(xù)12h。在含有0.05％tween20的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，ph7.4中洗滌板(5minx3)。重組大腸桿菌clpb蛋白(由delphigenetics定制)在樣品緩沖液(pbs,疊氮化鈉0.02％,ph7.4)中連續(xù)地稀釋至5、10、25、50、70、100和150pm，并且一式二份地加入至孔中以制備標準品。分析物樣品包括：來自小鼠和大鼠的結(jié)腸粘膜和血漿樣品或從大腸桿菌k12培養(yǎng)物提取的蛋白。分析物樣品一式兩份地加入至剩余的孔中，并且在rt孵育2h。在含有0.05％tween20的pbs，ph7.4中洗滌板(5minx3)。將小鼠單克隆抗-大腸桿菌clpb抗體(在樣品緩沖液中1:500，由delphigenetics定制)加入至孔中，并且在rt孵育90min。在含有0.05％tween20的pbs，ph7.4中洗滌板(5minx3)。將來自jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.(westgrove,pa)的綴合有堿性磷酸酶的山羊抗小鼠igg(在樣品緩沖液中1:2000)加入至孔中并在rt孵育90min。在含有0.05％tween20的pbs，ph7.4中洗滌板(5minx3)，然后加入100μl磷酸對硝基苯酯溶液(sigma,st.louis,mo)作為堿性磷酸酶底物。在rt孵育40min后，通過添加50μl3nnaoh終止反應(yīng)。使用酶標儀metertech960(metertechinc.,臺北，臺灣)在405nm測定od。將從未添加血漿樣品或clpb蛋白標準稀釋液的板的讀數(shù)得到的空白od值從樣品od值中減去。
clpbwestern印跡
使用從大腸桿菌k12提取的蛋白進行western印跡。蛋白樣品(10μg)在處于tris-甘氨酸緩沖液中的20％丙烯酰胺sds凝膠上分離并轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜(gehealthcare,奧爾賽，法國)上，用tbs(10mmol/ltris,ph8；150mmol/lnacl)加0.05％(w/v)tween20中的5％(w/v)脫脂奶粉在rt將其封閉至少1h。然后，將所述膜在4℃與兔多克隆抗-大腸桿菌clpb抗體(1:2000,delphigenetics)孵育過夜。用在tbs/0.05％tween20中的5％(w/v)脫脂奶粉封閉溶液中洗滌3次后，將膜與過氧化物酶綴合的抗兔igg(1:3000,santacruzbiotechnology)孵育1h。3次洗滌后，使用ecl檢測試劑盒(gehealthcare)將過氧化物酶反應(yīng)顯色。將蛋白條帶與分子量標準(precisionplus,biorad)進行比較，并且使用imagescanneriii(gehealthcare)掃描薄膜，并使用imagequanttl軟件7.0(gehealthcare)分析條帶像素密度。
大腸桿菌蛋白在大鼠中的腸給藥
動物
動物看護和試驗依照由美國國立衛(wèi)生研究院所建立的指導(dǎo)方針并且遵守法國和歐洲共同體規(guī)章(officialjournaloftheeuropeancommunity(歐共體官方雜志)l358,18/12/1986)。將雌性sprague-dawley大鼠，體重200-250g(janvier,genest-saint-isle,法國)在規(guī)定的環(huán)境條件(22±1℃,12h光暗周期，在7:30a.m.開燈)下在裝備齊全的動物設(shè)施中的固定籠(3只大鼠/籠)中保持1周以便使它們適應(yīng)于居住條件。可隨意獲得標準顆粒嚙齒動物飼料(rm1膳食，sds,uk)和飲用水。
試驗#1
此實驗設(shè)計為評價我們的大腸桿菌生長體外模型與腸道內(nèi)細菌生長的體內(nèi)情況的相關(guān)性。大鼠通過氯胺酮(75mg/kg,virbac,carros,法國)/甲苯噻嗪(5mg/kg,bayer,leverkusen,法國)溶液，3:1vol.，0.1ml/100g體重腹腔注射進行麻醉。剖腹術(shù)后，通過做兩個結(jié)扎游離結(jié)腸：第一個在盲腸結(jié)腸連接處，第二個在下方4cm。使用插入到升結(jié)腸中并用第一個結(jié)扎固定的聚丙烯導(dǎo)管進行結(jié)腸灌注和腔內(nèi)容物采樣。2mlmh培養(yǎng)基或水輕輕地輸注到結(jié)腸中，之后立即取出用于測量od。在od測量后，將結(jié)腸內(nèi)容物的整個樣品返回至結(jié)腸中。在不添加新的mh培養(yǎng)基或水的條件下，在前20min期間每5分鐘并且然后在30min時和60min時重復(fù)結(jié)腸內(nèi)容物的這種采樣。細菌密度通過分光光度計測量為在λ＝600nm的od。在第一次灌注前以及灌注后30和60min從門靜脈取血樣。在試驗結(jié)束時從結(jié)腸取糞便樣品用于dna提取和clpb的pcr。
實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)
使用cfx96q-pcr儀(biorad,ca)進行定量pcr(qpcr)以分析表達clpbdna的細菌的細菌密度。使用qampdna糞便微型試劑盒(qiagenvenlo,荷蘭)從大鼠糞便提取總dna。qpcr混合物包含5μlsybrgreenmaster(qiagen,westsussex,uk)、0.5μm每種正向和反向引物、來自樣品的dna以及水，達到總體積10μl。引物購自invitrogen(cergy-pontoise,法國)。三步pcr進行40個循環(huán)。樣品在95℃變性10min，在60℃退火2min，并在95℃延伸15s。
試驗#2
本實驗?zāi)康氖窃u價大腸桿菌蛋白對體循環(huán)中的腸肽(glp-1和pyy)釋放的作用。如上所述將大鼠麻醉并游離結(jié)腸，在指數(shù)期(n＝6)或在靜止期(n＝6)中提取的大腸桿菌蛋白(在2mlpbs中的0,1μg/kg蛋白)的結(jié)腸灌注進行一次持續(xù)20min。在結(jié)腸灌注20min前后從門靜脈取血樣用于測定glp-1、pyy和clpb。在試驗結(jié)束時取結(jié)腸粘膜的樣品用于clpb測定。使用熒光酶免疫測定試劑盒(phoenixpharmaceuticalinc.,ca)根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書進行g(shù)lp-1和pyy測定。使用酶標儀變色龍(microplatereaderchameleon)(hidexinc.,圖爾庫,芬蘭)在325nm激發(fā)和在420nm發(fā)射測量熒光。
大腸桿菌蛋白在大鼠中的給藥、進食和腦c-fos研究
動物
雄性wistar大鼠，體重200-250g(janvier,genest-saint-isle,法國)如上所述適應(yīng)居住條件和飼養(yǎng)。試驗前三天，將大鼠轉(zhuǎn)移至單個代謝籠(tecniplast,里昂，法國)，在代謝籠里它們隨意進食相同的但是為粉末形式(sds)的rm1飲食。飲用水隨時可用。在適應(yīng)期期間每天輕輕地觸摸大鼠幾分鐘以便使它們習慣于操作。在適應(yīng)結(jié)束時，將大鼠分成三個組以達到相似的平均體重并且在試驗1-3中使用。在相同的大鼠中以4天的間隔進行包括限制進食的兩個試驗。在自由攝食的大鼠中進行的第三個試驗涉及它們的新的系列。
試驗#1
第一個試驗?zāi)康氖潜容^在指數(shù)期和靜止期中提取的大腸桿菌膜蛋白的作用。大鼠禁食過夜(18.00h-10.00h)，而水可隨意飲用。在禁食后的第二天，大腸桿菌蛋白在10.00h腹腔注射并立即將大鼠返回至它們的代謝籠，代謝籠包含預(yù)先稱重的量的食物。在1、2和4h時測量進食。第一組大鼠(n＝6)接受處于300μlpbs中的0.1mg/kg從指數(shù)期大腸桿菌提取的膜蛋白；第二組大鼠(n＝6)接受0.1mg/kg從靜止期大腸桿菌提取的膜蛋白并且對照組(n＝6)接受300μlpbs。
試驗#2
第二個試驗?zāi)康氖潜容^在指數(shù)期和靜止期提取的大腸桿菌細胞質(zhì)蛋白的作用。使用與試驗#1相似的試驗規(guī)程。
試驗#3
本試驗被設(shè)計用來評價總大腸桿菌蛋白對自由攝食大鼠的進食的作用。在指數(shù)期(n＝6)或在靜止期(n＝6)提取的大腸桿菌蛋白(處于300μlpbs中的0.1mg/kg蛋白，i.p.)或作為對照的僅pbs(n＝6)的注射在19.30h進行，并且使動物返回至它們的代謝籠，代謝籠包含預(yù)先稱重的量的食物。在2h后測量累積進食。之后立即，通過戊巴比妥鈉(0.2mg/kg,i.p.)麻醉大鼠并灌注用于腦中c-fos表達的免疫組化研究。
組織準備和免疫組化
通過在4％多聚甲醛中灌注/浸泡固定腦、冷凍并在低溫恒溫器(leicamicrosystems,南泰爾,法國)上切割(14μm)，然后使用酪胺信號放大(tsa)加上熒光素試劑盒(nen,boston,ma)處理用于免疫組化。對于單一染色，使用針對c-fos的兔多克隆抗血清(1:4,000,ab-5,calbiochem,merckkgaa,達姆施塔特,德國)。對于雙重染色，在tsa后，使用兔抗β-內(nèi)啡肽(β-end)單克隆抗體1:1,000(lifetechnologies,frederick,md)或鼠抗降鈣素基因相關(guān)肽(cgrp)單克隆igg1:1,000(santacruzbiotechnology,inc.,tx)應(yīng)用直接免疫熒光技術(shù)，兔抗β-內(nèi)啡肽(β-end)單克隆抗體由抗兔花菁-3抗體1:200(jacksonimmunoresearch,westgrove,pa)顯影，鼠抗降鈣素基因相關(guān)肽(cgrp)單克隆igg由抗鼠玫瑰紅綴合的抗體1:200(jacksonimmunoresearch)顯影。在下丘腦弓狀核和腹內(nèi)側(cè)核中以及在杏仁核的中央核中，陽性細胞在x20放大倍數(shù)下從6個連續(xù)切片計數(shù)。每只大鼠陽性細胞的平均數(shù)目用來計算組平均值。在adobephotoshop6.0軟件(adobesystems,sanjose,ca)中優(yōu)化數(shù)字圖像的亮度和對比度。
大腸桿菌蛋白在小鼠中的長期給藥
2月齡雄性c57bl6小鼠(n＝32)購自janvierlabs并且利用12h光暗周期，在8:00開燈來適應(yīng)動物設(shè)施持續(xù)1周。然后，將小鼠單個地置于biodaq鼠籠(researchdiets,inc.,newbrunswick,nj)中，每個鼠籠裝有自動取食監(jiān)測器。適應(yīng)biodaq籠3天后，將小鼠分成三個組(n＝8),每個組接受不同的治療，所述不同的治療由采用下列任一項在9:00和在18:30每天兩次腹膜注射：(i)pbs,(ii)在指數(shù)期提取的細菌蛋白(0,1mg/kg體重),(iii)在靜止期提取的細菌蛋白(0,1mg/kg體重)。食物(serlab,蒙塔泰爾,法國)和飲用水隨意攝取并且每天測量體重。連續(xù)監(jiān)測進食數(shù)據(jù)一周，并且使用biodaqdataviewer2.3.07(researchdiets)分析。對于進餐模式分析，餐間間隔設(shè)定為300s。飽感比率計算為餐后間隔時間除以在前一餐中消耗的食物量(g)。試驗后，通過斷頭術(shù)處死小鼠；移除腦，并且切下下丘腦用于神經(jīng)肽mrna微陣列。
下丘腦神經(jīng)肽mrna微陣列
使用
電生理記錄
如前所述(fioramonti等人,2007)從成年pomc-egfp小鼠(5-7周齡；ref:c57bl/6j-tg(pomc-egfp)1low/j,thejacksonlaboratory)制備腦切片(250μm)。切片在rt在含有(以mm計):118nacl、3kcl、1mgcl2、25nahco3、1.2nah2po4、1.5cacl2、5hepes、2.5d-葡萄糖(用蔗糖將克分子滲透壓濃度調(diào)整至310mosm，ph7.4)的含氧胞外培養(yǎng)基中孵育至少60min的恢復(fù)期。一旦處于記錄室中，用相同的胞外培養(yǎng)基以2-3ml/min灌注切片。用配備用于熒光(熒光素濾光片)和ir-dic視頻顯微鏡的nikon顯微鏡ef600(nikonfrance,champignysurmarne)觀察切片。使用x40水浸物鏡(nikon)與熒光攝像機(nikon)可視化有活力的arcpomc神經(jīng)元。硼硅酸鹽移液管(4-6mω；1.5mmod,sutterinstruments,novato,ca)充滿經(jīng)過濾的胞外培養(yǎng)基。細胞貼附記錄使用multiclamp700b放大器獲得，使用digidata1440a接口數(shù)字化并且使用pclamp10.3軟件(axoninstruments,moleculardevices,sunnyvale,ca)以3khz采集。移液管和電池電容被全補償。在建立穩(wěn)定的基線后，1nmclpb(delphigenetics)灌注5-10分鐘。在clpb灌注的最后3min內(nèi)、灌注后7-10min測量pomc神經(jīng)元的觸發(fā)速率并且與灌注前3min測量的觸發(fā)速率相比較。
統(tǒng)計分析
分析數(shù)據(jù)并使用graphpadprism5.02(graphpadsoftwareinc.,sandiego,ca)進行繪圖。通過科爾莫格羅夫-斯米爾諾夫(kolmogorov-smirnov)檢驗評價正態(tài)性。根據(jù)正態(tài)性結(jié)果，組間差異通過方差分析(anova)或非參數(shù)克魯斯卡爾-沃利斯(k-w)檢驗與tukey或dunn事后檢驗進行分析。在適當?shù)臅r候，根據(jù)正態(tài)性結(jié)果，使用學(xué)生t檢驗和皮爾遜相關(guān)性檢驗或曼-惠特尼(m-w)檢驗比較單個組。使用重復(fù)測量(rm)anova和邦弗朗尼(bonferroni)事后檢驗分析連續(xù)試驗的作用。數(shù)據(jù)表示為均值±均值的標準誤(s.e.m),并且對于所有檢驗，p<0.05被認為是統(tǒng)計學(xué)顯著的。
結(jié)果
定期營養(yǎng)素提供后的大腸桿菌生長
在第一次向大腸桿菌培養(yǎng)物提供müeller-hinton(mh)營養(yǎng)培養(yǎng)基后，觀察到細菌生長的三個期：1)2h的停滯期；2)4h的指數(shù)生長期和3)0.35光密度(od)保持穩(wěn)定6h的靜止期。在第3次和第5次mh培養(yǎng)基供應(yīng)后，僅發(fā)現(xiàn)兩個生長期：指數(shù)期和靜止期，第一期在提供營養(yǎng)素后立即開始。每個新的進食周期表位為較短持續(xù)時間的指數(shù)生長期：第3次提供后2h，和第5次提供后20min。第5次提供營養(yǎng)素后，提取細菌蛋白并將其分離成膜級分和細胞質(zhì)級分，用于蛋白質(zhì)組分析和禁食大鼠中的體內(nèi)試驗。在新的試驗中，為了驗證繼續(xù)定期提供營養(yǎng)素是否可以進一步加速細菌生長的動力學(xué)，向大腸桿菌k12供應(yīng)營養(yǎng)素9次。我們發(fā)現(xiàn)，在第7次和第9次提供營養(yǎng)素后，指數(shù)生長期不進一步改變，持續(xù)20min，od有相同的(δ0.3)相對增加，反映了在每次供應(yīng)營養(yǎng)素后相同的細菌生長。根據(jù)mcfarland標準，0.3od的增加對應(yīng)于108-109的細菌增量。在第9次提供營養(yǎng)素后，在指數(shù)期和靜止期提取細菌蛋白，顯示總蛋白濃度分別為0.088mg/ml和0.15mg/ml。對提取的蛋白測試clpb水平，并且已經(jīng)用于atp生成測定中以及用于體內(nèi)試驗包括在自由攝食的小鼠和大鼠中結(jié)腸內(nèi)灌注和體內(nèi)注射，接著腦中的c-fos檢測。
蛋白質(zhì)組分析
為了分析蛋白表達譜是否根據(jù)營養(yǎng)素誘導(dǎo)的細菌生長期而變化，分別對在第5次添加mh培養(yǎng)基后10min和2.3h(分別對應(yīng)于指數(shù)期和靜止期)提取的大腸桿菌k12蛋白的膜級分和細胞質(zhì)級分進行二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2d-page)。檢測到的蛋白斑點的總數(shù)目為2895個(1367個膜和1528個細胞質(zhì))。
指數(shù)期和靜止期之間膜蛋白的2d-page的比較揭示了20種差異表達(相差至少1.5倍)的蛋白。在它們中，17種蛋白顯示在指數(shù)期中表達增加，且15種通過質(zhì)譜法鑒定。細胞質(zhì)蛋白的2d-page的比較顯示了20種差異表達(相差至少1.5倍)的蛋白。與膜蛋白相反，大多數(shù)細胞質(zhì)蛋白(19種)表明在靜止期期間表達增加。僅一個蛋白斑點(對應(yīng)于鞭毛蛋白)在指數(shù)期中具有較高的表達。大多數(shù)鑒定到的蛋白涉及合成代謝或分解代謝過程，顯示了在兩個生長期中的總體上混合的代謝譜。
體外通過大腸桿菌蛋白產(chǎn)生atp
為了研究細菌蛋白質(zhì)組是否在生長期期間改變可能影響它們的能量提取容量，在體外測試由指數(shù)期和靜止期的大腸桿菌k12蛋白從營養(yǎng)素產(chǎn)生atp。我們發(fā)現(xiàn)來自兩個生長期的蛋白能夠從不同的能量來源增加atp產(chǎn)生。與蔗糖溶液相比，當使用含蛋白的混合能量源諸如mh培養(yǎng)基時atp濃度較高。atp產(chǎn)生隨著細菌蛋白濃度增加劑量依賴性地增加，然而在來自指數(shù)期或靜止期的蛋白的atp產(chǎn)生效應(yīng)之間沒有發(fā)現(xiàn)顯著的差異。
體外大腸桿菌產(chǎn)生clpb
我們開發(fā)并驗證了用于檢測大腸桿菌clpb的酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)，該測定已經(jīng)用于本研究中。在4個單獨的大腸桿菌k12培養(yǎng)物中研究在細菌生長期之間clpb蛋白產(chǎn)生是否不同。western印跡檢測到所有在靜止期期間具有增加水平的蛋白制劑中都有對應(yīng)clpb的96kda條帶。這些改變進一步在相同的細菌蛋白制劑中使用clpbelisa證實，表明在靜止期中clpb濃度幾乎加倍。
營養(yǎng)素和大腸桿菌蛋白的腸灌注
為了驗證我們的營養(yǎng)素誘導(dǎo)的大腸桿菌生長的體外模型是否與體內(nèi)腸道細菌生長動力學(xué)相關(guān)，將mh培養(yǎng)基或水輸注到被麻醉的大鼠的結(jié)腸中。我們發(fā)現(xiàn)mh培養(yǎng)基而非水的輸注誘導(dǎo)腸道中細菌增殖的指數(shù)生長期持續(xù)20min，與體外數(shù)據(jù)一致。門靜脈中測量的血漿clpb水平在mh輸注后30或60min沒有顯著差異。盡管如此，血漿clpb濃度與糞便中的clpbdna含量正相關(guān)。
下一步，為了確定大腸桿菌蛋白質(zhì)組的生長依賴性變化是否可以影響宿主腸道中局部食欲控制的機制，在單獨的試驗中，經(jīng)麻醉的大鼠接受20min來自指數(shù)期或靜止期(均以0.1mg/kg)的大腸桿菌蛋白的結(jié)腸輸注。在接受靜止期蛋白的大鼠中在輸注后20min測量的結(jié)腸粘膜中的clpb濃度較高，然而clpb的血漿水平不受來自指數(shù)期或靜止期的細菌蛋白影響。與我們的假設(shè)(大腸桿菌蛋白對宿主食欲信號傳導(dǎo)的作用可能取決于細菌生長期)一致，我們發(fā)現(xiàn)來自指數(shù)期而非靜止期的大腸桿菌蛋白的結(jié)腸灌注刺激glp-1的血漿水平，并且相反，在輸注來自靜止期而非指數(shù)期的蛋白后檢測到pyy的血漿水平升高。
在大鼠中急性大腸桿菌蛋白給藥后的進食和腦c-fos
因為clpb存在于所有測試的大鼠和小鼠的血漿中，因此有可能血漿大腸桿菌蛋白可以通過它們的全身作用來影響食欲并且這樣的效應(yīng)對于與細菌生長期相關(guān)的蛋白可以是不同的。通過在禁食過夜的大鼠中測試這種可能性，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，單一腹膜內(nèi)(i.p.)給藥(0.1mg/kg體重)在靜止期提取的大腸桿菌蛋白的膜級分減少了再喂食期間的1h-和2h-進食，相比，給予在指數(shù)期提取的大腸桿菌蛋白(0.1mg/kg體重,i.p.)的細胞質(zhì)級分增加了再喂食期間的4h進食。
為了進一步調(diào)查大腸桿菌總蛋白是否可以以生長期依賴性的方式影響自發(fā)進食，并且激活中樞部位諸如arc，用細菌蛋白(0.1mg/kg體重,i.p.)在暗期開始之前注射自由攝食的大鼠。在注射后2h測量進食，然后處死大鼠用于分析腦中的c-fos表達。我們發(fā)現(xiàn)用來自靜止期的細菌蛋白注射的大鼠吃的比對照少，而來自指數(shù)期的細菌蛋白的注射不顯著地影響進食。
在向自由攝食的大鼠腹腔注射大腸桿菌蛋白后2小時，免疫組化分析下丘腦的arc和腹內(nèi)側(cè)核(vmn)中以及cea中的c-fos表達。發(fā)現(xiàn)接受來自靜止期的細菌蛋白的小鼠的arc和vmn中c-fos-陽性細胞的數(shù)目增加。arc中大多數(shù)表達c-fos的細胞含有β-內(nèi)啡肽(對照，71.31±12.81％,大腸桿菌指數(shù)期，73.56±10.45％,大腸桿菌靜止期，80.50±9.68％,anovap＝0.36),即被鑒定為厭食pomc神經(jīng)元。因此，arc中剩余的c-fos神經(jīng)元的百分比在組間的差異不顯著(對照,28.69±12.81％,大腸桿菌指數(shù)期,26.44±10.45％,大腸桿菌靜止期,19.5±9.68％,anovap＝0.36)。盡管β-內(nèi)啡肽陽性細胞的總數(shù)目在組間的差異不顯著(對照，54.82±10.67個細胞，大腸桿菌指數(shù)期,66.03±11.43個細胞，大腸桿菌靜止期,66.03±5.06個細胞，anovap＝0.09),但與對照和接受指數(shù)期蛋白的大鼠相比，在接受靜止期蛋白的大鼠中激活的β-內(nèi)啡肽神經(jīng)元的相對數(shù)目增加。此外，激活的β-內(nèi)啡肽神經(jīng)元的數(shù)目與進食負相關(guān)(pearson’sr＝-0.57,p＝0.018)。
在cea中，與其他兩組相比，在用來自靜止期的蛋白注射的大鼠中c-fos-陽性細胞的數(shù)目增加。cea中幾乎所有c-fos-陽性細胞的表型被確定為表達cgrp的神經(jīng)元(對照,100±0.01％,大腸桿菌指數(shù)期,100±0.01％,大腸桿菌靜止期,100±0.01％,anovap＝0.92)。盡管cea中cgrp-陽性神經(jīng)元的總數(shù)目在組間是相似的(對照,123.8±13.15個細胞，大腸桿菌指數(shù)期,118.3±25.59個細胞，大腸桿菌靜止期,126.1±6.64個細胞，anovap＝0.85)，但c-fos激活的cgrp神經(jīng)元的百分比僅在接受靜止期蛋白的大鼠中增加。cgrp神經(jīng)元的激活與進食負相關(guān)(pearson’sr＝-0.89,p＝0.001)。
在小鼠中長期注射大腸桿菌蛋白后的進食模式和下丘腦神經(jīng)肽
為了確定細菌蛋白是否可以影響進食模式，向自由攝食的小鼠每天兩次注射大腸桿菌總蛋白(0.1mg/kg體重,i.p.)持續(xù)1周。注射后第一天的特點是與對照相比在接受來自靜止期而非指數(shù)期的細菌蛋白的小鼠中體重和進食顯著減少。盡管每天的攝食量在組間差異不顯著，但在接受靜止期蛋白的小鼠中1周后觀察到相對于注射前一天減少。盡管在接受來自靜止期的細菌蛋白的小鼠中觀察到有增加的趨勢，但進餐頻率在組間差異不顯著。盡管在注射6天期間在3組間總進食差異不顯著，但單獨地對光周期和暗周期進行分析表明用指數(shù)期蛋白注射的小鼠在光周期期間進食增加，而在暗周期期間進食減少。相反，接受靜止期蛋白的小鼠在暗周期中的進食表現(xiàn)出少于對照，而在光周期中沒有任何影響。在注射后第一天期間，在接受來自靜止期的蛋白的小鼠中飽感比率是增加的，并且1周后同一組顯示減少的趨勢。
為了了解在注射細菌蛋白6天后觀察到的改變的進食模式的分子改變基礎(chǔ)，我們分析了參與食欲控制的幾種神經(jīng)肽的下丘腦mrna表達水平。我們發(fā)現(xiàn)與對照相比，接受靜止期蛋白的小鼠顯示腦來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)和食欲肽的前體mrna水平升高，并且與用指數(shù)期蛋白注射的小鼠相比促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(crh)的前體mrna水平升高，用指數(shù)期蛋白注射的小鼠也顯示升高的bdnf水平而qrfp水平降低。
clpb電生理激活下丘腦pomc神經(jīng)元
為了確定作為在靜止生長期中上調(diào)的大腸桿菌蛋白的標志物和α-msh的模擬物的clpb是否激活arcpomc神經(jīng)元，在來自pomc-egfp小鼠的腦切片上使用細胞貼附的膜片鉗電生理檢驗clpb作用。施加clpb(1nm)浴將～50％的arcpomc神經(jīng)元(n＝7/13)的動作電位頻率增加229±109％(基礎(chǔ)：2.02±0.78hzvs.clpb:3.82±1.36hz)。通常，pomc神經(jīng)元直至clpb施用后至少10min才完全地恢復(fù)到其基礎(chǔ)觸發(fā)速率。
討論
我們的研究揭示了細菌蛋白可以地將腸道細菌與宿主的食欲控制生理性聯(lián)系起來，包括分別與營養(yǎng)素誘導(dǎo)的腸道中細菌生長和它們的全身效應(yīng)相關(guān)聯(lián)的其短期和長期機制兩者。下面的主要結(jié)果支持了這種結(jié)論：1)營養(yǎng)素的定期提供加速和穩(wěn)定大腸桿菌的指數(shù)生長持續(xù)20min,與體內(nèi)數(shù)據(jù)一致；2)大腸桿菌靜止生長期的特點是增加的總細菌蛋白含量和不同的蛋白質(zhì)組譜，包括增加的clpb；3)來自兩個生長期的大腸桿菌蛋白在體外劑量依賴性地刺激atp產(chǎn)生；4)clpb的血漿水平在營養(yǎng)素誘導(dǎo)的腸道中細菌生長后不改變，但與腸道菌群中的clpbdna相關(guān)聯(lián)；5)來自指數(shù)生長期和靜止生長期的大腸桿菌蛋白的腸灌注分別刺激血漿glp-1和pyy。6)大腸桿菌蛋白的體內(nèi)注射僅在注射來自靜止期的蛋白時顯著地減少進食，伴有厭食arc和cea神經(jīng)元中的c-fos激活，以及最后7)clpb刺激arcpomc神經(jīng)元的觸發(fā)速率。
定期提供營養(yǎng)素和細菌生長
在定植于人胃腸道的廣泛細菌中，大腸桿菌是豐度最高的兼性厭氧菌，證明了其作為共生腸道細菌的模式生物的合理性(foucault等人,2009)。在此，我們發(fā)現(xiàn)在定期供應(yīng)營養(yǎng)素期間大腸桿菌改變了其生長動力學(xué)，在第五個攝食周期后導(dǎo)致立即的指數(shù)生長持續(xù)20min，緊接著是靜止期。然后在下一次提供營養(yǎng)素后相同地重現(xiàn)了該生長周期，表明其可以扮演對細菌機制內(nèi)在設(shè)定的起搏器的角色。在大鼠結(jié)腸中觀察到相似的響應(yīng)于營養(yǎng)素輸注的細菌生長動力學(xué)，支持了我們的體外數(shù)據(jù)可以與體內(nèi)情形相關(guān)，例如，在規(guī)律進餐的人中。在每一次新的提供后108-109的細菌數(shù)目增量保持穩(wěn)定，表明細菌生物質(zhì)相應(yīng)穩(wěn)定的產(chǎn)生，包括腸道中蛋白含量增加，可以扮演宿主的進餐誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)因子的作用。鑒于人中的平均正餐階段類似于定期飼養(yǎng)的細菌的指數(shù)生長的持續(xù)時間，可推測宿主飽感可以被到達靜止期(接觸攝入的營養(yǎng)素后20min)的腸道細菌所觸發(fā)。然而，胃腸道中的細菌含量范圍為胃中的103至結(jié)腸中的1012。而且，攝入的營養(yǎng)素需要約2h前進通過胃和小腸，并且需要約10h通過大腸。因為至大多數(shù)腸道細菌的營養(yǎng)素遞送被這樣延遲，有可能除了與營養(yǎng)素團直接接觸以外，正餐階段期間的細菌生長可能也被釋放到腸腔中的營養(yǎng)素通過對攝食的巴甫洛夫腦反射來啟動。
在生長期期間的細菌蛋白表達和腸道傳感
因為定期飼養(yǎng)的大腸桿菌的生長動力學(xué)可以與宿主正餐階段和正餐后階段相關(guān)聯(lián)，我們研究了細菌蛋白的表達是否可以潛在地將腸道細菌與宿主的食欲控制聯(lián)系起來。首先，我們比較了處于指數(shù)生長期與靜止生長期的大腸桿菌的蛋白質(zhì)組。為了此分析，在指數(shù)期的中間，即提供營養(yǎng)素后10min，以及在2h后的靜止期(正常以感覺到飽感為特征的時間)提取大腸桿菌蛋白。在兩個生長期之間至少有40種差異表達的蛋白的發(fā)現(xiàn)證實了它們不僅通過蛋白含量定量上不同(在細菌增殖后幾乎加倍)，而且性質(zhì)上也不同。已經(jīng)研究了改變的蛋白表達譜與宿主的食欲控制的可能相關(guān)性：i)通過比較細菌蛋白生成能量底物的能力，和ii)通過確定細菌蛋白對食欲調(diào)節(jié)途徑的可能直接效應(yīng)。對大腸桿菌clpb的最新蛋白質(zhì)組鑒定支持了作為α-msh的構(gòu)象蛋白模擬物的最新可能性(tennoune等人,2014)；所述數(shù)據(jù)驗證我們的較早假設(shè)，即展現(xiàn)的表位與厭食肽或促進食欲的肽同源的腸道細菌蛋白可能負責產(chǎn)生交叉反應(yīng)性抗體(fetissov等人,2008)。因此，可想到這樣的細菌模擬蛋白的組合可能直接影響食欲，其取決于與細菌生長期相關(guān)的蛋白表達譜。通過分析大腸桿菌培養(yǎng)物和腸粘膜，我們發(fā)現(xiàn)clpb水平增加與靜止生長期相關(guān)。因此，增加的clpb可能促進營養(yǎng)素誘導(dǎo)的大腸桿菌增殖后的厭食途徑的激活，以及增加的細菌蛋白產(chǎn)生。重要的問題是細菌蛋白諸如clpb,可以作用于食欲調(diào)節(jié)途徑。
盡管細菌蛋白存在于腸粘膜中(haange等人,2012),但它們跨越腸道屏障的通路還沒有被廣泛研究(lim和rowley,1985)。理論上，在腸道中自發(fā)的和誘導(dǎo)的細菌溶解(rice和bayles,2008)后，細菌成分可以通過腸神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)，通過在腸上皮細胞中吸收和通過旁細胞擴散跨越粘膜上皮屏障(neunlist等人,2012)。例如，在革蘭氏陰性細菌的溶解后釋放的脂多糖(lps)天然地存在于健康人和小鼠的血漿中，在進食高脂飲食后具有更高的基礎(chǔ)水平(cani等人,2007)。lps血漿水平在正餐后也升高(harte等人,2012),但關(guān)于細菌蛋白沒有這樣的數(shù)據(jù)。在此我們證明在腸道中細菌增殖后或在腸道輸注細菌蛋白后在大鼠中血漿clpb水平保持穩(wěn)定。這指示血漿clpb,以及更可能存在于血漿中的其他細菌蛋白并不劇烈地受營養(yǎng)素誘導(dǎo)的細菌增殖的影響，并且因此，它們可能不參與向大腦的短期飽感信號傳導(dǎo)。
盡管如此，血漿clpb濃度與腸道菌群中的clpbdna相關(guān)聯(lián)，提示產(chǎn)生clpb的細菌的數(shù)目(長期來看應(yīng)當相對地獨立于與營養(yǎng)素驅(qū)動的細菌生長相關(guān)的該細菌數(shù)目波動)，可以是負責長期保持血漿clpb水平的主要因素。這個結(jié)論進一步得到我們的數(shù)據(jù)支持，我們的數(shù)據(jù)為驗證clpbelisa而獲得，顯示在長期用大腸桿菌管飼的小鼠中血漿clpb濃度增加，而在接受clpb-突變的大腸桿菌的小鼠中不增加。因此，有可能存在于血漿中的腸道細菌蛋白，包括clpb，可以起作用系統(tǒng)性地將腸道菌群的組成與能量代謝的長期控制聯(lián)系起來。
大腸桿菌蛋白對體外atp產(chǎn)生的作用
通過食物鏈的能量交換代表了所有生物體之間的通用聯(lián)系(yun等人,2006)。來源于細菌和動物兩者中的營養(yǎng)素分解代謝的atp充當合成代謝過程的主要能量底物。當atp水平低時動物可以通過腺苷-5'-一磷酸-激活的蛋白激酶(ampk)的活性感測atp的變化，導(dǎo)致增加的進食，反之亦然(dzamko和steinberg,2009)。因此，在本工作中，我們比較了處于指數(shù)期和靜止期的大腸桿菌蛋白在體外生成atp的能力。實際上，許多鑒定的蛋白展示出合成代謝或分解代謝特性。我們發(fā)現(xiàn)大腸桿菌蛋白能夠刺激體外atp-產(chǎn)生，提示它們可以在腸道中細菌溶解后繼續(xù)催化atp產(chǎn)生。盡管在來自指數(shù)期和靜止期的蛋白之間沒有發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生atp的能力有差異，但細菌蛋白濃度依賴性atp產(chǎn)生表明在營養(yǎng)素誘導(dǎo)的細菌增殖后細菌蛋白含量增加應(yīng)當導(dǎo)致更高的atp合成。以前已經(jīng)通過比較肥胖的和瘦的人和小鼠建立了腸道菌群為宿主代謝采集能量的效率的相關(guān)性(turnbaugh等人,2006)。我們的數(shù)據(jù)通過證明大腸桿菌蛋白生成atp的能力進一步證實了這些結(jié)果。還提示進餐誘導(dǎo)的細菌增殖可以導(dǎo)致增加的腸atp，這應(yīng)當有助于對能量利用率的腔內(nèi)感測以及腸道松弛(glasgow等人,1998)。
大腸桿菌蛋白對飽腹激素的腸效應(yīng)
下一步，我們研究腸道中的大腸桿菌蛋白是否可以刺激腸道飽腹激素諸如glp-1和pyy的全身釋放(adrian等人,1985；batterham等人,2002；beglinger和degen,2006；flint等人,1998)。事實上，兩種激素都由在腸內(nèi)遍布存在并在結(jié)腸中富含的相同的或不同的腸內(nèi)分泌l-細胞產(chǎn)生(eissele等人,1992),并且因此，l-細胞直接暴露于細菌蛋白。我們發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌蛋白對glp-1和pyy釋放的差別效應(yīng)，證明來自指數(shù)生長期的蛋白對glp-1的刺激和來自靜止生長期的蛋白對pyy的刺激。這些結(jié)果表明了營養(yǎng)素誘導(dǎo)的細菌生長和已知的進餐誘導(dǎo)的glp-1和pyy釋放動力學(xué)之間的一些相似性。事實上，如在人中所示的那樣，血漿glp-1的銳峰在胃內(nèi)輸注液體餐后15min出現(xiàn)，而持續(xù)時間更長的升高的血漿pyy在餐后15-30min之間開始(edwards等人,1999；gerspach等人,2011)。glp-1的較長時間釋放與攝入脂肪有關(guān)(vanderklaauw等人,2013)。因此，定期飼養(yǎng)的腸道細菌的生長動力學(xué)在時間上符合glp-1和pyy釋放的動力學(xué)，提示腸道細菌，特別是大腸桿菌蛋白在進餐誘導(dǎo)的腸飽感信號傳導(dǎo)中的誘導(dǎo)性地位。來自指數(shù)期的大腸桿菌蛋白刺激glp-1的差別效應(yīng)有可能反映了glp-1在血糖控制中的腸降血糖素地位(edwards等人,1999；steinert等人,2014)。最近證明了由l-細胞表達的功能性mc4r(panaro等人,2014),為它們可能被α-msh-模擬細菌蛋白激活提供了背景知識。與增加的血漿pyy水平相關(guān)的大腸桿菌靜止期期間的clpb產(chǎn)生增加以及腸粘膜中升高的clpb水平，提示clpb在結(jié)腸中產(chǎn)生pyy的l-細胞的激活中具有直接作用。從另一方面，迄今為止在指數(shù)生長期期間可能上調(diào)的未鑒定的大腸桿菌蛋白可能優(yōu)先地刺激glp-1分泌。
大腸桿菌蛋白對進食和食欲調(diào)節(jié)大腦途徑的全身效應(yīng)
我們在此證明向饑餓的或自由攝食的大鼠以及自由攝食的小鼠外周注射大腸桿菌蛋白根據(jù)大腸桿菌的生長期而改變它們的進食?？紤]到血漿clpb不受腸輸注營養(yǎng)素影響而是在短時間內(nèi)穩(wěn)定，細菌蛋白的全身作用應(yīng)當被解釋為與它們對食欲的長期調(diào)節(jié)效應(yīng)相關(guān)。此外，因為指數(shù)期很短的持續(xù)時間，在持續(xù)時間長的靜止期期間上調(diào)的細菌蛋白應(yīng)當在血漿中占優(yōu)勢，并且因此，它們的全身給藥可以更好地代表生理情況。在這些試驗中使用的0.1mg/kg濃度的大腸桿菌蛋白與在人或嚙齒動物中外周給藥后肽激素諸如瘦素和pyy的有效飽感產(chǎn)生劑量相似(batterham等人,2002；halaas等人,1995；heymsfield等人,1999)。
在給予來自指數(shù)期的細胞質(zhì)蛋白后觀察到在光周期中再攝食期間在饑餓大鼠中進食增加以及給予來自靜止期的膜蛋白后進食減少。本試驗證實來自同一細菌的不同蛋白混合物能夠通過它們的全身作用增加或減少進食。然而，在更加生理性的環(huán)境下，通過在暗周期測試總大腸桿菌蛋白在自由攝食的大鼠中的效應(yīng)，僅觀察到由來自靜止期的蛋白所誘導(dǎo)的進食減少。
在自由攝食的小鼠中重復(fù)注射的結(jié)果進一步支持了大腸桿菌蛋白促進負能量平衡的地位。事實上，第一天的細菌蛋白注射伴隨著進食和體重的減少，在接受靜止期蛋白的小鼠很明顯，并且其特征還在于增加的飽感比率。盡管此后在這些小鼠中的進食被標準化，攝食量的進行性減少伴隨著進餐頻率的增加，最可能作為維持進食的代償機制(meguid等人,1998)。另外地，在光周期和暗周期期間觀察到大腸桿菌蛋白的差別效應(yīng)。因此，在下丘腦中調(diào)節(jié)食欲的神經(jīng)肽的mrna表達的模式顯示了激活厭食和促進食欲途徑兩者的混合反應(yīng)。值得注意的是，兩組接受大腸桿菌蛋白的小鼠顯示出相似的bdnfmrna增加，其為vmn中mc4r下游的厭食途徑(xu等人,2003)。此途徑可以成為在兩組中觀察到的暗周期期間的進食減少的基礎(chǔ)，并且進食減少在用指數(shù)期蛋白注射的小鼠中進一步加重，顯示了較低水平的促進食欲的qrfp(chartrel等人,2003)和npy(herzog,2003)。相反，接受來自靜止期的細菌蛋白的小鼠展示出增強的厭食曲線，具有升高水平的crhmrna，最可能涉及表達mc4r的pvn神經(jīng)元(lu等人,2003)。在注射6天后在這些小鼠中，這些改變結(jié)合刺激進餐頻率的食欲肽a的mrna前體表達增加(baird等人,2009)，可以分別有助于攝食量和飽感比率的減少。
與我們的假設(shè)(即，在靜止期期間產(chǎn)生的細菌蛋白可以激活一些關(guān)鍵的中樞厭食途徑)一致，我們發(fā)現(xiàn)在自由攝食的大鼠中，厭食arcpomc神經(jīng)元以及vmn中c-fos的表達增加，vmn長時間以來已知作為飽感中心并且與arcpomc神經(jīng)元互相聯(lián)系(sternson等人,2005)。獲得的c-fos模式類似于攝食期間產(chǎn)生飽感的反應(yīng)的模式(johnstone等人,2006)或被飽腹激素諸如pyy或胰多肽誘導(dǎo)產(chǎn)生飽感的反應(yīng)的模式(batterham等人,2002；challis等人,2004；lin等人,2009)。相對小數(shù)目(～10％)的c-fos-激活的pomc神經(jīng)元提示循環(huán)的大腸桿菌蛋白可以經(jīng)由此下丘腦途徑發(fā)揮作用對食欲和體重具有調(diào)節(jié)效應(yīng)。盡管確定通過npy/agrp神經(jīng)元激活c-fos是不可行的，但它們對由細菌蛋白引起的信號傳導(dǎo)的貢獻不能被排除；這些神經(jīng)元還表達mc3r和mc4r(mounien等人,2005)。此外，在ceacgrp神經(jīng)元中比arcpomc更強激活c-fos(～40％)可以表示來自arcpomc和npy/agrp神經(jīng)元以及可能來自其他調(diào)節(jié)食欲的腦區(qū)的會聚的下游作用，所述其他調(diào)節(jié)食欲的腦區(qū)在此沒有分析，諸如孤束的核。
最后，為了確定細菌蛋白激活調(diào)節(jié)食欲的腦部位諸如arcpomc神經(jīng)元是否可以通過它們的局部作用來引起，我們研究了對這些神經(jīng)元施用clpb是否可以激活它們的電活動。我們的結(jié)果顯示大約一半的所研究的神經(jīng)元的動作電位頻率增加，保持激活狀態(tài)持續(xù)至少10min。clpb的持續(xù)效應(yīng)與α-msh對表達功能性mc3r和mc4r的pomc神經(jīng)元的作用相符(smith等人,2007)，提示clpb可以是下丘腦pomc神經(jīng)元的生理激活物，有些類似于產(chǎn)生飽感的pyy和瘦素(batterham等人,2002；cowley等人,2001)。然而，我們不知曉clpb是否能夠直接激活或經(jīng)由局部網(wǎng)絡(luò)激活pomc神經(jīng)元。
總之，這些數(shù)據(jù)支持其表達在靜止生長期中增加的全身存在的大腸桿菌蛋白，諸如clpb，在經(jīng)由激活腦厭食途徑促進負能量平衡中的地位。也提示導(dǎo)致大腸桿菌以及可能來自腸桿菌科家族其他細菌的低或高豐度的微生物群組成的改變，可能分別以正向或負向的方式影響宿主能量平衡。
實施例2
1月齡雄性c57bl6小鼠(janvierlaboratories)如上所述適應(yīng)動物設(shè)施1周并維持飼養(yǎng)。小鼠如下分成3組：(i)用108大腸桿菌k12細菌管飼；(ii)用108clpb缺陷型大腸桿菌k12細菌管飼；(iii)和不接受任何治療的對照。在berndbukau’slaboratory(zmbh,海德堡大學(xué),海德堡，德國)中生成clpb突變菌株，并且該菌株以及相應(yīng)的野生型(wt)大腸桿菌5由draxelmogk饋贈。將小鼠單個地置于biodaq籠(researchdiets)并且每天在暗周期開始之前用0.5ml含有細菌的lb培養(yǎng)基經(jīng)胃內(nèi)管飼持續(xù)21天。與不表達clpb蛋白的細菌相反，在接受wt大腸桿菌的小鼠中第一天管飼伴有體重和進食的減少(圖1)。
參考文獻
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序列表
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