本發(fā)明屬于獸藥領(lǐng)域，具體涉及一種含有犬副流感病毒抗原及犬支氣管敗血波氏桿菌抗原的疫苗組合物，試劑盒，以及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

犬傳染性支氣管炎(canineinfectioustracheobronchitis,itb)又稱犬窩咳(kennelcough)，是犬的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病，具有高傳染性、危害嚴(yán)重、影響范圍廣、易引發(fā)其他高致死性病原體感染等特點(diǎn)，僅在甘肅省2004-2009年的調(diào)查中該病的整體發(fā)病率高達(dá)34.26％(盧旺銀.甘肅省犬窩咳的流行病學(xué)調(diào)查與防治.畜牧獸醫(yī)雜志,2010,29(3):49-52)。該病主要引起幼犬突發(fā)性陣發(fā)性咳嗽并伴有不定量的鼻腔分泌物，常于春秋季節(jié)多發(fā)，由于犬群中一旦發(fā)病，很快引起整窩幼犬發(fā)病、咳嗽，故被稱為“犬窩咳”。目前，普遍認(rèn)為該病主要是由犬副流感病毒(canineparainfluenzavirus，cpiv)、犬支氣管敗血波氏桿菌(caninebordetellabronchiseptica，或bordetellabronchisepticaindogs,bb)病原定殖在鼻腔、喉、氣管、支氣管等部位而引起(ettinger,stephenj.,feldman,edwardc.texkbookofveterinaryinternalmedicine(4^thedition).1995,wbsaunderscompany)。

cpiv屬于副粘液病毒亞科副粘病毒屬，是單股負(fù)鏈rna病毒，可感染各種年齡、性別的犬科動(dòng)物，特別是幼齡犬，主要通過(guò)病犬的眼分泌物、唾液、呼吸道分泌物等散播，經(jīng)呼吸道途徑感染，通過(guò)損壞犬的上呼吸道組織，引起干咳、尖咳、鼻塞等癥狀，嚴(yán)重者會(huì)引起犬的支氣管炎和支氣管肺炎，并給其它病原體的感染創(chuàng)造條件。

bb為波氏桿菌屬成員之一，為一種革蘭氏陰性、需氧球桿菌，是在 患有支氣管炎的犬中最常分離出的細(xì)菌，易感染不同品種、年齡、性別的犬科動(dòng)物，尤其易感4-12周齡犬，并且已有文獻(xiàn)報(bào)道該細(xì)菌可由犬傳染給其他種類動(dòng)物如貓(dwightch,nigeljm,richardlw,etal.veterinarymicrobiology(2^ndedition).2004,blackwellpublishing)。該菌潛伏期有2-14日，如不與其他病原體共同感染作用，此菌的臨床癥狀通常會(huì)持續(xù)10日，然而即使感染癥狀已消失，但此細(xì)菌可繼續(xù)在自然環(huán)境中生存6-14周，期間可再傳染至易感動(dòng)物。此菌通過(guò)鼻液、唾液、呼吸道分泌物等傳播，可通過(guò)直接或間接接觸感染。此菌感染的臨床癥狀包括黏液鼻塞、深咳、尖咳、干咳、不適，在運(yùn)動(dòng)或情緒激動(dòng)時(shí)會(huì)加重。若感染第二病毒原體，經(jīng)常會(huì)引起嚴(yán)重支氣管肺炎。

國(guó)內(nèi)家庭飼養(yǎng)寵物的數(shù)量與日俱增，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)我國(guó)目前僅寵物犬的數(shù)量已超過(guò)1.5億只，在許多經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)城市的寵物數(shù)量與居民比例為1:10。因此，對(duì)寵物的健康要求越來(lái)越高。由于現(xiàn)有疫苗保護(hù)率不高，免疫效果不理想，究其原因是因?yàn)閭€(gè)別疫苗毒種的免疫原性不強(qiáng)，有的甚至存在毒性恢復(fù)、毒力返強(qiáng)、副反應(yīng)等現(xiàn)象(見(jiàn)中國(guó)專利cn103153337a、cn1876181a)。因此，急需研制更為安全有效的抗犬窩咳的疫苗制品。

專利申請(qǐng)cn102343088a公開(kāi)了一種犬傳染性氣管支氣管炎二聯(lián)活疫苗及其制備方法，利用分離得到的有較好免疫原性的犬副流感病毒及犬支氣管敗血波氏菌，純化后進(jìn)行傳代致弱，獲得弱毒株cpiv-cy-c株與菌株bb-sd25d，作為生產(chǎn)用毒株，制備出二聯(lián)活疫苗。然而其存在毒性恢復(fù)、毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。

專利申請(qǐng)cn101035558a公開(kāi)了對(duì)抗布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體和其他病原體的多聯(lián)犬疫苗，含犬支氣管敗血波氏桿菌p68蛋白與其他多種犬病毒的聯(lián)苗。然而該發(fā)明針對(duì)犬多種疾病，不能針對(duì)犬窩咳(2種疾病)進(jìn)行針對(duì)性治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種疫苗組合物及其制 備方法和應(yīng)用，該疫苗組合物可以預(yù)防和/或治療犬窩咳。

本發(fā)明涉及一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫有效量的犬副流感病毒抗原及免疫有效量的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原以及獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體；其中，所述犬副流感病毒抗原選自滅活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一種，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原選自滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原或p68蛋白。

本發(fā)明另一方面涉及一種試劑盒，所述試劑盒含有犬副流感病毒抗原及犬支氣管敗血波氏桿菌抗原以及佐劑；其中，所述犬副流感病毒抗原為滅活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一種，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為減毒的活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原；或所述犬副流感病毒抗原為減毒的活的犬副流感病毒抗原，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原或p68蛋白。

本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明的疫苗組合物的制備方法。

本發(fā)明另一方面涉及本發(fā)明的試劑盒的制備方法。

本發(fā)明還涉及所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療犬傳染性支氣管炎的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還涉及所述的試劑盒在制備預(yù)防和/或治療犬傳染性支氣管炎的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述疫苗組合物免疫后無(wú)副反應(yīng)發(fā)生，且免疫效果優(yōu)于現(xiàn)有二聯(lián)活疫苗；且本發(fā)明疫苗組合物免疫后無(wú)發(fā)噴嚏、咳嗽、流鼻涕等臨床癥狀，從而避免了將病原暴露給獸醫(yī)工作者或接觸者的可能，并降低了犬傳染性支氣管炎的發(fā)病率。

具體實(shí)施方式

以下說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。

本發(fā)明主要涉及一種疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫有效量的犬副流感病毒抗原及免疫有效量的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原 以及獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體；其中，所述犬副流感病毒抗原選自滅活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一種，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原選自滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原或p68蛋白。

術(shù)語(yǔ)“疫苗組合物”又稱免疫原性組合物，是指一種含免疫原的制劑，包括如蛋白質(zhì)、肽、全細(xì)胞、滅活的、亞單位或減毒的活的病毒或細(xì)菌，或者多糖，或其組合，其被施用來(lái)刺激受體對(duì)存在于免疫原性組合物中一種或多種抗原的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。免疫接種是施用疫苗組合物并在宿主中刺激對(duì)抗原的免疫或免疫原性反應(yīng)的過(guò)程。優(yōu)選的宿主為哺乳動(dòng)物諸如犬。

術(shù)語(yǔ)“免疫有效量”又稱免疫保護(hù)量或產(chǎn)生免疫應(yīng)答的有效量，為可在接受者體內(nèi)有效誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的抗原量，該量足以預(yù)防或改善疾病的體征或癥狀，包括不利的健康影響或其并發(fā)癥。所述免疫應(yīng)答可能足以用于診斷目的或其它試驗(yàn)，或可能適合用于預(yù)防疾病的征兆或癥狀，包括由病原體引起的感染所造成的不利的健康結(jié)果或其并發(fā)癥。體液免疫力或由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力或此二者均可被誘導(dǎo)。動(dòng)物對(duì)免疫原性組合物的免疫應(yīng)答可通過(guò)例如測(cè)量抗體效價(jià)、淋巴細(xì)胞增殖分析而間接評(píng)估，或在以野生型毒株攻擊后通過(guò)監(jiān)測(cè)征兆或癥狀來(lái)直接評(píng)估，而該由疫苗提供的保護(hù)性免疫力可通過(guò)測(cè)量例如受試者的臨床征兆如死亡率、發(fā)病率的減少、溫度數(shù)值、受試者總體生理狀況及總體健康和表現(xiàn)來(lái)評(píng)估。所述免疫應(yīng)答可包括但不限于誘導(dǎo)細(xì)胞性和/或體液免疫力。

術(shù)語(yǔ)“犬副流感病毒抗原”是指至少含有一種犬副流感病毒(canineparainfluenzavirus，cpiv)抗原形式的任何組合物，所述犬副流感病毒抗原可誘導(dǎo)、刺激或能抵抗犬副流感病毒感染的免疫應(yīng)答，所述抗原形式包括但不限于滅活的、活的或亞單位的抗原。所述犬副流感病毒抗原包括活的抗原如cy-c株(保藏號(hào)為cgmccno.5268，參見(jiàn)中國(guó)專利cn102343088a)，a-20/8株(參見(jiàn)中國(guó)專利cn1876181a)，xn-4株(金昌德，李六金，李秦等.犬副流感病 毒弱毒株的分離與鑒定.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000,21(6):722-724)，solvary株(金昌德，李六金，婁慶林等.犬副流感流行毒株的分離鑒定.中國(guó)畜禽傳染病,1997(1):24-27)，以kc-plus呈現(xiàn)的活減毒犬副流感病毒d008株、以canixindhppi/l呈現(xiàn)的活減毒犬副流感病毒manhattan株、以duramunedappi呈現(xiàn)的活減毒犬副流感病毒fdl株、以vanguard7呈現(xiàn)的活減毒犬副流感病毒nl-cpi-5株、以和/或kc呈現(xiàn)的活減毒犬副流感病毒cornell株，以吉林省五星動(dòng)物保健藥廠生產(chǎn)的犬五聯(lián)活疫苗的犬副流感病毒a-20/8株，和/或來(lái)自naramune^tm、univac2、univac5、kennel-jec^tm、plus5的活減毒的犬副流感病毒毒株；滅活的抗原如犬副流感病毒d008株(美國(guó)atcc保存，保藏號(hào)為vr-399)，xn931株(金昌德，李六金，施新猷等.犬副流感病毒流行毒株的分離與鑒定.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000,21(6):719-721)，xn934株(金昌德，李六金，李秦等.犬副流感病毒弱毒株的分離與鑒定.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000,21(6):722-724)，78238株(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所主編.獸醫(yī)微生物學(xué).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1998:414-415)、yz0506株(岑皓.犬副流感病毒的分離及單克隆抗體的制備.揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007)；亞單位抗原如含犬副流感病毒免疫原性蛋白f(fusionprotein，即融合蛋白)、hn(hemagglutinin-neuraminidase，即血凝素神經(jīng)氨酸酶)、m(matrixprotein，即基質(zhì)蛋白)、np(nucleocapsidprotein，即核衣殼蛋白)、p(phosphopritein，即磷蛋白)和/或l(largeprotein，即大蛋白)蛋白或其結(jié)構(gòu)域的抗原；以及這些抗原形式組分的混合。

術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)域”是指蛋白質(zhì)生物大分子中具有特異結(jié)構(gòu)和獨(dú)立功能的區(qū)域，常見(jiàn)結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基數(shù)在100-400個(gè)之間，最小的結(jié)構(gòu)域只有40-50個(gè)氨基酸殘基，大的結(jié)構(gòu)域可超過(guò)400個(gè)氨基酸殘基。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述犬副流感病毒抗原選自滅活的犬副流感病毒抗原d008株抗原、以及f蛋 白、hn蛋白、np蛋白中的至少一種；所述犬支氣管敗血波氏菌抗原選自滅活的犬支氣管敗血波氏菌d-2株抗原、以及p68蛋白。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述犬副流感病毒抗原為滅活的犬副流感病毒抗原d008株抗原，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌d-2株抗原。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述犬副流感病毒抗原為犬副流感病毒f蛋白、hn蛋白、np蛋白中的至少一種，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活的支氣管敗血波氏菌d-2株抗原。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述犬副流感病毒抗原為滅活的犬副流感病毒抗原d008株抗原，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為p68蛋白。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述犬副流感病毒抗原為犬副流感病毒f蛋白、hn蛋白、np蛋白中的至少一種，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為p68蛋白。

術(shù)語(yǔ)“f蛋白”(fusionprotein)為犬副流感病毒的融合蛋白，其分子量為51kd，所述f蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公開(kāi)的登錄號(hào)為ay491509.1、ef546392.1、ef487542.1、ax586947.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1的f蛋白基因序列。

術(shù)語(yǔ)“hn蛋白”(hemagglutinin-neuraminidase)為犬副流感病毒的血凝素神經(jīng)氨酸酶，其分子量為68kd，所述hn蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公開(kāi)的登錄號(hào)為ef543647.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1、ef546393.1的hn蛋白基因序列。

術(shù)語(yǔ)“np蛋白”(nucleocapsidprotein)又稱n蛋白，為犬副流感病毒的核衣殼蛋白，分子量為60kd，所述np蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公開(kāi)的登錄號(hào)為ef543648.1、ef546391.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1、 ay581307.1的np蛋白基因序列。

術(shù)語(yǔ)“犬支氣管敗血波氏桿菌抗原”又稱犬支氣管敗血波氏菌抗原、犬波氏桿菌抗原或犬支氣管炎博德特氏菌(caninebordetellabronchiseptica，canineb.bronchiseptica，或bordetellabronchisepticaindogs，bb)抗原，是指至少含有一種犬支氣管敗血波氏桿菌抗原形式的任何組合物，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原可誘導(dǎo)、刺激或抵抗犬支氣管敗血波氏桿菌感染的免疫應(yīng)答，所述抗原形式包括但不限于滅活的、活的或亞單位的抗原、或其細(xì)菌提取物。所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原包括活的抗原如sd25d株(保藏號(hào)為cgmccno.5292，參見(jiàn)中國(guó)專利cn102343088a)、以kc-plus呈現(xiàn)的活減毒犬支氣管敗血波氏桿菌菌株s-55、以bronchi-shield呈現(xiàn)的活減毒犬支氣管敗血波氏桿菌菌株92b、以和/或kc呈現(xiàn)的活減毒犬支氣管敗血波氏桿菌菌株b-c2，和/或來(lái)自naramune^tm、univac2和/或kennel-jec^tm的活犬支氣管敗血波氏桿菌菌株；滅活的抗原如d-2株、bb7株、bi33irp274株(jacobsaac,theelenrph,jaspersr,etal.protectionofdogsfor13monthsagainstbordetellabronchisepticaandcanineparainfluenzaviruswithamodifiedlivevaccine.theveterinaryrecord,2005,157:19-23)、31123株(參見(jiàn)專利au516010)、kr001-a01株(保藏編號(hào)為fermp-21984，參見(jiàn)中國(guó)專利cn103153337a)；亞單位抗原如分離的犬支氣管敗血波氏桿菌p68蛋白或其結(jié)構(gòu)域的抗原，特別是重組的犬支氣管敗血波氏桿菌p68蛋白，其被抗p68蛋白的特異性單克隆抗體bord2-7(描述于us7736658中，通過(guò)參考并入本文)識(shí)別，且在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，其具有如us7736658中所述的氨基酸序列或與其具有同源性；細(xì)菌提取物如brochicine^tmcae(pfizer)其從提取自支氣管炎博德特氏菌細(xì)胞的抗原物制備，優(yōu)選通過(guò)柱色譜法純化的全細(xì)胞聲處理物(wholecellsonicate)制備，見(jiàn)1984年10月12日提交的專利申請(qǐng)?zhí)杅r2571618中所提供的；以及這些抗原形式組分的混合。

術(shù)語(yǔ)“p68蛋白”為犬支氣管敗血波氏桿菌中經(jīng)sds聚丙烯酰胺凝膠電泳所確定的分子量為68kd的蛋白質(zhì)，其被抗p68蛋白的特異性單克隆抗體bord2-7(atcc#)所識(shí)別，所述p68蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公開(kāi)的登錄號(hào)為he965806.1、hv491393.1、dl465896.1、di128761.1、dj055043.1、cq853559.1、cs417771.1、jq824384.1的p68蛋白基因序列。

術(shù)語(yǔ)“犬”通常被稱為狗者，但也包括犬科家族的其他成員如狼、豺、貂、狐貍。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述犬副流感病毒抗原含量為滅活的犬副流感病毒抗原10^2.0-10^8.0tcid50/頭份或亞單位抗原9-260μg/頭份；以及所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活的支氣管敗血波氏菌抗原10^7.0-10^11.0cfu/頭份或亞單位抗原8-300μg/頭份。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述犬副流感病毒抗原含量為滅活的犬副流感病毒抗原10^5.0-10^7.0tcid50/頭份或亞單位抗原12-100μg/頭份；以及所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原10^8.0-10^10.0cfu/頭份或亞單位抗原10-120μg/頭份。

術(shù)語(yǔ)“tcid50”是指組織培養(yǎng)感染劑量，并且其被定義為感染50％的給定批次的已接種細(xì)胞培養(yǎng)所需的病毒稀釋。各種方法可用于計(jì)算tcid50，包括sperman-karber方法，其用在通篇說(shuō)明書(shū)中。關(guān)于spearman-karber方法的描述，參見(jiàn)bwmahy,hokangro.virologymethodsmanual,1996:25-46。在本發(fā)明中當(dāng)抗原含量為滅活抗原含量時(shí)，表示滅活前的抗原含量。

術(shù)語(yǔ)“cfu”是菌落形成單位(colonyformingunits)的縮寫(xiě)，其表示：能產(chǎn)生微生物菌落的微生物、微生物芽孢/孢子(spore)、微生物的部分發(fā)育的芽孢或營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目。在本發(fā)明中當(dāng)抗原含量為滅活抗原含量時(shí)，表示滅活前的抗原含量。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述獸 醫(yī)學(xué)上可接受的載體為佐劑；其中，所述佐劑包括明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣，非離子嵌段聚合物表明活性劑、病毒顆粒、皂苷、蛋白體、免疫刺激復(fù)合物、蝸形體、季胺、阿夫立定avridine、維生素a、維生素e，ribi佐劑系統(tǒng)、草分枝桿菌的細(xì)胞壁骨架、胞壁?；念恗dp、三肽類mtp、單磷酰脂質(zhì)a、卡介苗、熱不穩(wěn)定的大腸桿菌腸毒素、霍亂毒素、海藻糖二霉菌酸酯、cpg寡脫氧核苷酸，白介素il-1、il-2、il-6、il-12、il-15、il-18、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、脫氫表雄甾酮、1,25-二羥基微生物d3，葡聚糖，聚甲基丙烯酸甲酯、卡波普carbopol，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，及水包油包水乳劑。

術(shù)語(yǔ)“獸醫(yī)學(xué)上可接受的”是指在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合用于與獸醫(yī)對(duì)象組織接觸但沒(méi)有過(guò)分毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)等的物質(zhì)，其與合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比相當(dāng)并有效用于其預(yù)期用途。本發(fā)明中“獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體”是指不干擾有效成分的生物活性的效力并且對(duì)其所施用的獸醫(yī)對(duì)象無(wú)毒的載體介質(zhì)，包括任何溶劑、分散介質(zhì)、涂料、佐劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌劑、抗真菌劑、等滲劑、吸附延遲劑等。其中，佐劑包括但不限于無(wú)機(jī)鹽類如明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣，表面活性劑和微粒如非離子嵌段聚合物表面活性劑(如膽固醇)、病毒顆粒、皂苷(如quila、qs-21、gpi-0100)、蛋白體、免疫刺激復(fù)合物、蝸形體(cochleate)、季胺(溴化二甲基雙十八烷基銨dda)、阿夫立定avridine、維生素a、維生素e，細(xì)菌產(chǎn)物如ribi佐劑系統(tǒng)(ribiinc.)、草分枝桿菌(mycobacterumphlei)的細(xì)胞壁骨架()、胞壁?；念恗dp、三肽類mtp、單磷酰脂質(zhì)a、卡介苗(bacilluscalmete-guerin)、熱不穩(wěn)定的大腸桿菌腸毒素、霍亂毒素、海藻糖二霉菌酸酯、cpg寡脫氧核苷酸(oligodeoxnucleotide)，細(xì)胞因子及激素類如白介素(il-1、il-2、il-6、il-12、il-15、il-18)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、脫氫表雄甾酮、1,25-二羥基微生物d3，多聚陰離子類如葡聚糖，聚丙烯酸類如聚甲基丙烯酸甲酯、卡波普carbopol，水包油乳液如 (hydronics，美國(guó))，油包水乳液如弗氏完全、不完全佐劑，及水包油包水乳劑；稀釋劑可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油等；等滲劑包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖，及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他等滲劑；穩(wěn)定劑包括白蛋白及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他穩(wěn)定劑；防腐劑包括硫柳汞及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他防腐劑。優(yōu)選地，所述獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體為佐劑；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述佐劑包括氫氧化鋁，以及皂苷與膽固醇的混合液。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述疫苗組合物包括犬副流感病毒f、hn、np蛋白抗原中的任意兩種蛋白抗原，每種蛋白抗原含量為6μg/頭份；10μg/頭份的犬支氣管敗血波氏桿菌p68蛋白抗原以及10％v/v鋁膠佐劑。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述f蛋白的基因序列包括在ncbi中公開(kāi)的登錄號(hào)為ay491509.1、ef546392.1、ef487542.1、ax586947.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1的f蛋白基因序列；

所述hn蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi中公開(kāi)的登錄號(hào)為ef543647.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1、ef546393.1的hn蛋白基因序列；

所述np蛋白的基因序列包括但不限于已在ncbi中公開(kāi)的登錄號(hào)為ef543648.1、ef546391.1、kc237065.1、kc237064.1、kc237063.1、ay581307.1的np蛋白基因序列。

作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述犬副流感病毒f、hn、np蛋白抗原序列為ncbi登錄號(hào)為kc237063.1的f、hn、np蛋白序列；所述犬支氣管敗血波氏桿菌p68蛋白抗原序列為ncbi登陸號(hào)為he965806.1的蛋白序列。

作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述疫苗組合物包括4μg/頭份的犬副流感病毒f、hn、np蛋白抗原；10μg/頭份的犬支氣管敗血波氏桿菌p68蛋白抗原以及10％v/v鋁膠佐劑。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的疫苗組合物中，所述疫苗組合物還包括狂犬病病毒抗原、犬細(xì)小病毒抗原、犬瘟病毒抗原、犬皰疹病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬鉤端螺旋體抗原中的至少一種抗原。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述疫苗組合物還包括其他抗原，其他抗原可以是微生物的滅活完整或部分制劑，或是通過(guò)遺傳過(guò)程技術(shù)或化學(xué)合成獲得的抗原分子。按照本發(fā)明適合應(yīng)用的其他抗原包括但不限于：病毒抗原如犬細(xì)小病毒(canineparvovirus)、犬瘟病毒(caninedistempervirus)、犬皰疹病毒(canineherpesvirus)、犬流感病毒(canineinfluenzavirus)、狂犬病病毒(rabiesvirus)，病原菌如布拉迪斯拉發(fā)鉤端螺旋體(leptospirabratislava)、犬鉤端螺旋體(leptospiracanicola)、感冒傷寒型鉤端螺旋體(leptospiragrippotyphosa)、黃疸出血鉤端螺旋體(leptospiraicterohaemorrhagiae)、波摩那鉤端螺旋體(leptospirapomona)、哈德焦鉤端螺旋體(leptospirahardjobovis)、卟啉單胞菌屬(porphyromonasspp.)、類桿菌屬(bacteriodesspp.)、疏螺旋體屬(borreliaspp.)、鏈球菌屬(streptococcusspp.，包括馬鏈球菌亞種獸疫streptococcusequisubspecieszooepidemicus)、埃里希氏體屬(ehrlichiaspp.)、支原菌屬(mycoplasmaspp.，包括全支原體mycoplasmacynos)、小孢子菌(microsporumcanis)，致病真菌如念球菌屬，原生動(dòng)物如隱孢子蟲(chóng)、新孢子蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)、艾美球蟲(chóng)屬、巴貝蟲(chóng)屬、賈第蟲(chóng)屬、利什曼原蟲(chóng)屬，或寄生蟲(chóng)如絳蟲(chóng)屬、黃蠅屬、棘球絳蟲(chóng)屬、并殖吸蟲(chóng)屬。

本發(fā)明所包括的病毒和細(xì)菌在用于疫苗組合物或免疫原性組合物中之前可以是減毒的活的、滅活的或亞單位的。減毒和滅活方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。減毒方法包括但不限于在細(xì)胞培養(yǎng)物中在核實(shí)的細(xì)胞系上連續(xù)傳代(病毒和一些細(xì)菌)、在肉湯培養(yǎng)物中連續(xù)傳代(細(xì)菌)、紫外線照射(病毒和細(xì)菌)和化學(xué)誘變(病毒和細(xì)菌)。病毒或細(xì)菌的滅活方法包括但不限于用福爾馬林、β-丙內(nèi)酯 (betapropriolactone,bpl)或二乙烯亞胺(binaryethylenimine,bei)處理或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。

本發(fā)明所包括的細(xì)菌可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)和繁殖，包括肉湯培養(yǎng)基(液體)金額瓊脂(固體、半固體)培養(yǎng)基。一些細(xì)菌還可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中培養(yǎng)并繁殖。

本發(fā)明的另一方面涉及一種試劑盒，所述試劑盒含有犬副流感病毒抗原及犬支氣管敗血波氏桿菌抗原以及佐劑；其中，所述犬副流感病毒抗原為滅活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一種，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為減毒的活的支氣管敗血波氏桿菌抗原；或所述犬副流感病毒抗原為減毒的活的犬副流感病毒抗原，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原或p68蛋白。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的試劑盒中，所述犬副流感病毒抗原為滅活的犬副流感病毒抗原d008株抗原，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為減毒的活的犬支氣管敗血波氏桿菌sd25d株抗原。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的試劑盒中，所述犬副流感病毒抗原為f蛋白、hn蛋白、np蛋白中的至少一種，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為減毒的活的支氣管敗血波氏桿菌sd25d株抗原。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的試劑盒中，所述犬副流感病毒抗原為減毒的活的犬副流感病毒cornell株抗原，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌d-2株抗原。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的試劑盒中，所述犬副流感病毒抗原為減毒的活的犬副流感病毒cornell株抗原，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原為p68蛋白。

本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明試劑盒的使用方法，所述方法包括使用所述滅活的犬副流感病毒抗原或f蛋白、hn蛋白、m蛋白、np蛋白、p蛋白、l蛋白中的至少一種亞單位抗原復(fù)原所述減毒的活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原；或使用所述滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原或 p68蛋白復(fù)原所述減毒的活的犬副流感病毒抗原。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法中，所述犬副流感病毒抗原含量為滅活的犬副流感病毒抗原10^2.0-10^8.0tcid50/頭份或亞單位抗原9-260μg/頭份，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原含量為減毒的活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原10^3.5-10^8.0cfu/頭份。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法中，所述犬副流感病毒抗原含量為所述減毒的活的犬副流感病毒抗原10^2.0-10^7.0tcid50/頭份，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原含量為滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原10^7.0-10^11.0cfu/頭份或p68蛋白亞單位抗原8-300μg/頭份。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法中，所述犬副流感病毒抗原含量為滅活的犬副流感病毒抗原10^5.0-10^7.0tcid50/頭份或亞單位抗原12-100μg/頭份；所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原含量為減毒的活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原10^4.0-10^7.0cfu/頭份。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明所述的試劑盒的使用方法中，所述犬副流感病毒抗原含量為所述減毒的活的犬副流感病毒抗原10^2.5-10^4.5tcid50/頭份，所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原含量為滅活的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原10^8.0-10^10.0cfu/頭份或亞單位抗原10-120μg/頭份。

本發(fā)明的另一方面涉及一種制備本發(fā)明所述的疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括：(1)分別制備所述犬副流感病毒抗原、所述犬支氣管敗血波氏桿菌抗原；以及(2)按比例將所述步驟(1)中所述制備的犬副流感病毒抗原和支氣管敗血波氏菌抗原，混合，添加佐劑。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述犬副流感病毒亞單位抗原中f、hn、np蛋白中的至少兩種可以串聯(lián)表達(dá)。

本發(fā)明的另一方面涉及一種制備本發(fā)明所述的試劑盒的方法，其中，所述方法包括：(1)分別制備所述犬副流感病毒抗原、所述犬支氣管敗 血波氏桿菌抗原；(2)將所述步驟(1)中制備的滅活抗原或亞單位抗原添加佐劑，并與制備的活的減毒的抗原分別包裝、放置。

作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，所述犬副流感病毒亞單位抗原中f、hn、np蛋白中的至少兩種可以串聯(lián)表達(dá)。

本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和/或治療犬傳染性支氣管炎的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明所述的試劑盒在制備預(yù)防和/或治療犬傳染性支氣管炎的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的疫苗組合物可直接施用于肌內(nèi)、鼻腔中或皮下，用于腸胃外施用的合適的方法包括肌內(nèi)、滴鼻和皮下注射。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述藥物經(jīng)肌肉注射給藥。

術(shù)語(yǔ)“預(yù)防和/或治療”在涉及犬窩咳時(shí)是指抑制犬副流感病毒、犬支氣管敗血波氏桿菌的復(fù)制、抑制犬副流感病毒、犬支氣管敗血波氏桿菌的傳播或防止犬副流感病毒、犬支氣管敗血波氏桿菌在其宿主體內(nèi)定居，以及減輕犬副流感病毒、犬支氣管敗血波氏桿菌感染的疾病或病癥的癥狀。若病毒或細(xì)菌荷載量減少、病癥減輕和/或攝食量和/或生長(zhǎng)增加，那么就可以認(rèn)為所述治療達(dá)到了治療效果。

術(shù)語(yǔ)“犬窩咳”(kennelcough)又稱犬傳染性支氣管炎(canineinfectioustracheobronchitis,itb)，是犬的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病，具有高傳染性、危害嚴(yán)重、影響范圍廣、易引發(fā)其他高致死性病原體感染等特點(diǎn)，主要引起幼犬突發(fā)性陣發(fā)性咳嗽并伴有不定量的鼻腔分泌物，常于春秋季節(jié)多發(fā)，由于犬群中一旦發(fā)病，很快引起正窩幼犬發(fā)病、咳嗽，故被稱為“犬窩咳”。

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明實(shí)施例中cpiv抗原中的活的抗原以cpivcornell株(源自)、滅活的抗原以cpivd008株(源自美國(guó)菌毒種中心，保藏號(hào)為vr-399)、亞單位的抗原以cpivf、hn和np蛋白(ncbi登錄號(hào)均為kc237063.1)，及bb抗原中的活的抗原以bbsd25d株(保藏號(hào)為cgmccno.5292，參見(jiàn)中國(guó)專利cn102343088a)、滅活的抗原以bbd-2株(jacobsaac,theelenrph,jaspersr,etal.protectionofdogsfor13monthsagainstbordetellabronchisepticaandcanineparainfluenzaviruswithamodifiedlivevaccine.theveterinaryrecord,2005,157:19-23)、亞單位的抗原以bbp68蛋白(ncbi登錄號(hào)為he965806.1)為例進(jìn)行闡述，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何情況下均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。

本發(fā)明實(shí)例中所用的樣品保存液為pbs磷酸緩沖液，ph值為7.4，其1l體積配方為：nacl8.0g、kcl0.2g、na2hpo4·12h2o2.9g、kh2po40.24g，但該實(shí)施方式無(wú)論在任何情況下均不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。

本發(fā)明中所用的化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所述的實(shí)驗(yàn)方法，若無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1犬副流感病毒抗原的制備及含量測(cè)定

1.1cpiv活抗原的制備及含量測(cè)定

將cpivcornell株使用dmem培養(yǎng)液稀釋后，按培養(yǎng)液體積5％v/v接種生長(zhǎng)良好的vero細(xì)胞單層，37℃吸附30分鐘，加入dmem培養(yǎng)液，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待80％細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，置-20℃反復(fù)凍融2次，收獲病毒液。將收獲的cpivcornell株病毒液作10倍系列稀釋，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-64個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板5孔，每孔0.1ml，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，在37℃、5％co2的溫箱中培養(yǎng)7日，觀察細(xì)胞病變(cpe)，根據(jù)reed-muench法計(jì)算 得出cpiv病毒含量為10^7.5tcid50/ml。

將收獲的病毒液，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定方法進(jìn)行純凈性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果：無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。

將檢驗(yàn)合格的cpicornell株病毒液，經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分鐘離心或中空纖維過(guò)濾柱過(guò)濾以除去細(xì)胞碎片，加入等體積10％脫脂奶粉作為凍干保護(hù)劑，混勻、凍干后分裝，作為活的cpiv抗原，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2cpiv滅活抗原的制備、含量測(cè)定、滅活及其檢驗(yàn)

將cpivd008株強(qiáng)毒株按照實(shí)施例1.1所述方法進(jìn)行制備及含量測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明：cpiv病毒含量為10^7.5tcid50/ml。

將收獲的cpivd008株病毒液按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》規(guī)定進(jìn)行純凈性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果表明：病毒液無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。

將檢驗(yàn)合格的cpivd008株病毒液，經(jīng)3000轉(zhuǎn)/分鐘離心或經(jīng)中空纖維過(guò)濾柱過(guò)濾以除去細(xì)胞碎片，然后于收獲的cpiv病毒液中加入甲醛溶液使其終濃度為0.01％-0.1％v/v，置37℃滅活24-48小時(shí)，每4小時(shí)攪拌1次，每次10分鐘，即為滅活的cpiv病毒液。取滅活的病毒液10倍稀釋后接種已形成良好單層的vero細(xì)胞25cm²瓶?jī)?nèi)，每個(gè)滅活樣品接種4瓶，每瓶接種1ml，27℃吸附1小時(shí)后棄去接種液，加入新鮮培養(yǎng)基，10ml/瓶，27℃培養(yǎng)72小時(shí)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。盲傳1代，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，無(wú)細(xì)胞病變表明滅活檢驗(yàn)合格。

1.3cpiv亞單位抗原的制備及含量測(cè)定

分別將cpivhn和f蛋白的序列(ncbi登錄號(hào)均為kc237063.1)按照中國(guó)專利wo9929872a所述方法制備、純化并濃縮cpivhn和f蛋白以用于制備亞單位抗原；將cpivnp蛋白的序列(ncbi登錄號(hào)為kc237063.1)按照劉騰飛文獻(xiàn)(劉騰飛.犬副流感病毒的檢測(cè)和np基因的克隆、表達(dá)及其重組蛋白的免疫學(xué)活性的研究.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2010)里所提及的方法制備、純化并濃縮cpivnp蛋白以用于制備亞單位抗原。將制得的hn、f和np蛋白分別采用bca定量試劑盒(購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)檢測(cè)蛋白含量，hn、f和np蛋白濃度分別為1mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml。

實(shí)施例2犬支氣管敗血波氏桿菌抗原的制備及含量測(cè)定

2.1bb活抗原的制備及含量測(cè)定

將bbsd25d株凍干菌種用生理鹽水復(fù)融后，劃線接種于含5％新生牛血清的tsa平板，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察菌落形態(tài)，挑取5-10個(gè)典型菌落，劃線接種于含5％新生牛血清的tsa斜面，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，作為一級(jí)種子，于2-8℃保存，使用期不超過(guò)2周。取一級(jí)種子按1％接種含5％新生牛血清的tsb液體培養(yǎng)基，37℃、200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)16小時(shí)，取樣進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，合格后作為二級(jí)種子，使用期不超過(guò)2周。取二級(jí)種子，按培養(yǎng)基量1％接種，37℃發(fā)酵培養(yǎng)24小時(shí)收獲菌液，取樣分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和純粹檢驗(yàn)。培養(yǎng)收獲的菌液純粹檢驗(yàn)合格，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果為1×10¹²cfu/ml。將菌液離心，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，沉淀使用等體積含10％脫脂牛奶的耐熱保護(hù)劑懸浮，并進(jìn)行凍干，凍干后分裝，2-8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2bb滅活抗原的制備、含量測(cè)定、滅活及其檢驗(yàn)

按實(shí)施例2.1方法，培養(yǎng)bbd-2株，經(jīng)純粹檢驗(yàn)合格，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果為1×10¹⁰cfu/ml。

將檢驗(yàn)合格的bbd-2株菌液以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取沉淀，根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，將菌液使用生理鹽水懸浮至活菌數(shù)為9×10¹⁰cfu/ml菌液，根據(jù)菌液體積，加入終濃度為0.3％甲醛溶液，37℃滅活16-24小時(shí)，期間每隔4小時(shí)攪拌或振蕩一次。取滅活的菌液接種含5％新生牛血清的tsa平板，37℃培養(yǎng)48小時(shí)以進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格。

2.3bb亞單位抗原的制備及含量測(cè)定

將bbp68蛋白的序列(ncbi登陸號(hào)為he965806.1)，按美國(guó)專利us7736658提供的方法制備、純化并濃縮犬支氣管敗血波氏桿菌p68蛋白以制備亞單位抗原。將制備的p68蛋白液，采用bca蛋白定量試劑盒(購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，測(cè)得bbp68蛋白的含量為1mg/ml。

實(shí)施例3疫苗組合物的制備

用pbs溶液將實(shí)施例1、2制備的各抗原、鋁膠佐劑(購(gòu)自美國(guó)通用公司)按照表1所示組分進(jìn)行配制。其中，滅活的或亞單位的抗原、活的抗原組成疫苗組合物(包括疫苗1、2、3、6)時(shí)，將滅活的或亞單位的抗原、鋁膠佐劑用pbs溶液按表1中所示終濃度進(jìn)行混合配制得混合液，并對(duì)各混合液分別進(jìn)行性狀檢驗(yàn)(久置后上層為無(wú)色澄明液體，下層為灰白色沉淀，振搖后呈均勻混懸液)、無(wú)菌檢驗(yàn)(按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，均無(wú)菌生長(zhǎng))；并對(duì)活抗原進(jìn)行性狀檢驗(yàn)(為乳白色海綿狀樹(shù)洞團(tuán)塊，易于瓶壁脫離)、無(wú)菌檢驗(yàn)(按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，均無(wú)菌生長(zhǎng))。免疫使用時(shí)，使用含滅活的或亞單位的抗原、佐劑的混合液稀釋活的抗原，使活的抗原的終濃度如表1所示。

表1疫苗組合物所含組分

實(shí)施例4疫苗組合物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

4.1疫苗組合物中的犬副流感病毒抗原的動(dòng)物試驗(yàn)

先對(duì)含犬副流感病毒活抗原疫苗組合物的安全性進(jìn)行研究，按表1中疫苗1和疫苗2中的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原、鋁膠佐劑所示含量分別制備兩者的混合物，用于稀釋犬副流感病毒活抗原cornell株，稀釋后得疫苗1#、2#，其中每1ml均含犬副流感病毒10倍免疫劑量的抗原即10^4.0tcid50，用于疫苗1和疫苗2的安全性試驗(yàn)，肌肉注射5只14-21日齡易感(犬副流感病毒中和抗體效價(jià)低于1:2，抗原陰性和犬支氣管敗血波氏桿菌的抗原、抗體均為陰性)犬，間隔14日，以相同劑量和途徑重復(fù)接種，觀察21日，觀察結(jié)果注射犬全部健活，無(wú)任何不良反應(yīng)，表明疫苗1和疫苗2的安全性檢驗(yàn)合格。

再進(jìn)行免疫、攻毒試驗(yàn)，將實(shí)施例3制得的疫苗1-14經(jīng)肌肉注射2-3月齡健康易感(犬副流感病毒中和抗體效價(jià)低于1:2，抗原陰性，犬支氣管敗血波氏桿菌抗原、抗體均為陰性)犬，1ml/只，于14日后，以相同途徑和劑量加強(qiáng)免疫1次，同時(shí)設(shè)置5只免疫現(xiàn)有二聯(lián)活疫苗(購(gòu)自pfizeranimalhealth的cpi/b)作為現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照、5 只未免疫犬作為空白對(duì)照。二免后觀察14天，每天觀察犬注射部位局部反應(yīng)，同時(shí)觀察犬精神、食欲及飲水狀況。二免后28日，各試驗(yàn)組犬采血，elisa測(cè)定抗體效價(jià)，其中elisa抗體效價(jià)測(cè)定方法：將抗原分別使用碳酸鹽緩沖液(ph值9.6)稀釋為10μg/ml，包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，100μl/孔，2～8℃包被過(guò)夜，使用pbst洗滌后，加入10％脫脂奶粉封閉，37℃封閉2h，棄去封閉液，洗滌后，2～8℃保存。將待檢血清使用pbs系列稀釋后，加入96孔板，37℃反應(yīng)1小時(shí)，加入1:5000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗犬二抗，37℃作用1小時(shí)，洗滌，加入tmb底物顯色15分鐘，然后加入2m硫酸終止，測(cè)定od450nm值，以p/n≥2.1判為陽(yáng)性，以判為陽(yáng)性的最高稀釋度作為待檢血清的抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表2。

二免后28日，各試驗(yàn)組犬均使用犬副流感病毒d008株病毒液(10^7.3tcid50/ml)經(jīng)鼻腔途徑進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為1ml/只，攻毒后每天測(cè)定犬直腸溫度，并觀察犬臨床癥狀，包括咳嗽、流鼻涕，攻毒后觀察14天，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2疫苗免疫后抗犬副流感病毒elisa抗體及攻毒保護(hù)效果

注：發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)：連續(xù)咳嗽2日或出現(xiàn)體溫升高后不降(＞2日)或流鼻涕中一項(xiàng)臨床癥狀判為發(fā)?。唤】等何闯霈F(xiàn)咳嗽和體溫升高、流鼻涕癥狀，其中體溫“未升高”表示為直腸溫度不高于39.5℃；“升高”表示直腸溫度高于39.5℃。

免疫后，觀察犬精神、食欲、局部癥狀，并觀察犬注射后行動(dòng)狀況；并結(jié)合表2，結(jié)果顯示：(1)免疫疫苗1-14的犬均未出現(xiàn)由注射疫苗引起的腿部暫時(shí)性麻痹，觀察14天，免疫犬精神、食欲正常，且局部未發(fā)現(xiàn)由注射疫苗引起的腫脹等副反應(yīng)。(2)血清學(xué)檢測(cè)表明，免疫疫苗1-14的各免疫犬注射疫苗后，均產(chǎn)生體液免疫，但不同組分疫苗elisa抗體效價(jià)不同，而含亞單位抗原的疫苗elisa抗體效價(jià)最高，并與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照組的相當(dāng)甚至更高；特別地，elisa抗體效價(jià)隨亞單位疫苗中抗原含量的升高而增大(見(jiàn)疫苗8-10)。(3)攻毒試驗(yàn)表明，除疫苗4、疫苗7攻毒后出現(xiàn)1/5體溫升高后又降低，并出現(xiàn)咳嗽1天癥狀外，其余組在觀察期均未出現(xiàn)體溫升高、流鼻涕等癥狀，且無(wú)咳嗽犬，均未發(fā)病；而現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照組的免疫犬攻毒后，5/5犬攻毒后第2天出現(xiàn)體溫升高，2/5犬出現(xiàn)咳嗽癥狀且超過(guò)2日，3/5犬流鼻涕，其中3只犬發(fā)?。豢瞻讓?duì)照組犬中4/5犬攻毒后第2天出現(xiàn)體溫升高，5/5犬出現(xiàn)咳嗽癥狀且超過(guò)2日，5/5犬流鼻涕，5只對(duì)照犬均發(fā)病?？傊?，疫苗1-14的免疫效果相當(dāng)甚至優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照組的。

4.2疫苗組合物中的犬支氣管敗血波氏桿菌抗原的動(dòng)物試驗(yàn)

先含犬支氣管敗血波氏桿菌活抗原疫苗組合物的安全性試驗(yàn)進(jìn)行研究，按表1中疫苗3和疫苗6中的犬副流感病毒抗原、鋁膠佐劑所示含量分別制備兩者的混合物，用于稀釋犬支氣管敗血波氏桿菌活抗原sd25d株，稀釋后得疫苗3#、6#，且每1ml均含犬支氣管敗血波氏桿菌10^9.0cfu，用于疫苗3和疫苗6的安全性試驗(yàn)。將疫苗3#、6#分別肌肉注射5只14～21日齡易感(血清凝集效價(jià)低于1:16、氣管分泌物bb分離培養(yǎng)陰性、犬副流感病毒抗原與抗體均為陰性)犬，間隔14日，以相同劑量和途徑重復(fù)接種，觀察21日，觀察結(jié)果顯示：注射犬全部均健活，無(wú)任何副反應(yīng)，表明疫苗3和疫苗6安全性試驗(yàn)合格。

再進(jìn)行免疫、攻毒試驗(yàn)，將實(shí)施例3制得的疫苗1～14分別肌肉接種56日齡健康易感(血清凝集效價(jià)低于1:16、氣管分泌物bb分離培養(yǎng)陰性抗體陰性)犬5只，1ml/只，于14日后，以相同途徑和劑量加強(qiáng)免疫1次，同時(shí)設(shè)置5只免疫現(xiàn)有二聯(lián)活疫苗(購(gòu)自pfizeranimalhealth的cpi/b)作為現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照、5只未免疫犬作為空白對(duì)照。免后觀察14天，每天觀察犬注射部位局部反應(yīng)，同時(shí)觀察犬精神、食欲及飲水狀況。并于二免后28天采集免疫組及對(duì)照組犬血清，并進(jìn)行elisa抗體效價(jià)測(cè)定，其中elisa抗體效價(jià)測(cè)定方法：將p68抗原分別使用碳酸鹽緩沖額(ph值9.6)稀釋為5μg/ml，包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，100μl/孔，2～8℃包被過(guò)夜，使用pbst洗滌后，加入10％脫脂奶粉封閉，37℃封閉2h，棄去封閉液，洗滌后，2～8℃保存。將待檢血清使用pbs系列稀釋后，加入96孔板，37℃反應(yīng)1小時(shí)，加入1:4000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗犬二抗，37℃作用1小時(shí)，洗滌，加入tmb底物顯色15分鐘，然后加入2m硫酸終止，測(cè)定od450nm值，以p/n≥2.1判為陽(yáng)性，以判為陽(yáng)性的最高稀釋度作為待檢血清的抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3。

二免后28日使用犬支氣管敗血波氏桿菌強(qiáng)毒株bc株1.3×10¹⁰cfu/ml通過(guò)氣溶膠進(jìn)行攻毒。攻毒后，每天早晚觀察犬的臨床癥狀2次，觀察14天，連續(xù)2天觀察到咳嗽判為發(fā)病，同時(shí)，攻毒后每天測(cè)定犬直腸溫度，觀察結(jié)果見(jiàn)表3。

表3疫苗免疫后抗犬支氣管敗血波氏桿菌抗體效價(jià)及攻毒保護(hù)效果

*注：發(fā)?。哼B續(xù)咳嗽2日或出現(xiàn)體溫升高后(＞2日)判為發(fā)?。唤】等何闯霈F(xiàn)咳嗽和體溫升高癥狀。體溫“未升高”表示為直腸溫度不高于39.5℃；“升高”表示直腸溫度高于39.5℃。

結(jié)合免疫后的觀察情況及表3可知：(1)免疫疫苗1-14的犬均未出現(xiàn)由注射疫苗引起的腿部暫時(shí)性麻痹，觀察14天，免疫犬精神、食欲正常，且局部未發(fā)現(xiàn)由注射疫苗引起的腫脹等副反應(yīng)。(2)二免后28日，免疫疫苗1-14的犬均產(chǎn)生elisa抗體效價(jià)，與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照組的相當(dāng)甚至高于現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照，表明疫苗1-14均具有較好的免疫原性，特別地，含亞單位抗原的疫苗免疫效果最好。(3)攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示免疫 疫苗1、4、8犬，均有1/5犬出現(xiàn)輕微咳嗽且體溫升高后又降低，其余疫苗未出現(xiàn)咳嗽或體溫升高，均獲得保護(hù)。而現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照組即免疫cpi/b疫苗的犬2只連續(xù)3-5天出現(xiàn)嚴(yán)重的咳嗽、體溫升高癥狀，空白對(duì)照組自攻毒后第5天開(kāi)始至14天所有犬5/5均連續(xù)咳嗽超過(guò)8天、體溫升高均發(fā)病。總之，疫苗1-14相對(duì)于現(xiàn)有疫苗的免疫效果相當(dāng)甚至更好。

綜上所述：(1)所述疫苗組合物的免疫后不僅沒(méi)有麻痹、腫脹副反應(yīng)發(fā)生且未發(fā)生咳嗽、體溫升高的臨床癥狀，而且免疫效果與現(xiàn)有商品化疫苗的相當(dāng)甚至更高，特別地，含亞單位抗原的疫苗效果最好；(2)所述疫苗組合物免疫時(shí)操作簡(jiǎn)便，克服了現(xiàn)有商品化疫苗接種期間接種給動(dòng)物時(shí)發(fā)生打噴嚏從而暴露給獸醫(yī)工作者或接觸者。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。