本發(fā)明涉及高良姜素新的藥理作用及其作用機(jī)制，尤其是高良姜素對(duì)糖尿病腦病的防治作用。

背景技術(shù)：

糖尿病腦?。╠iabetic encephalopathy，DE）是指糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）久病患者漸進(jìn)發(fā)生的以智能減退和大腦神經(jīng)生理及結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹饕卣鞯木窆δ芪蓙y性疾病，是糖尿病在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的并發(fā)癥。在糖尿病狀態(tài)下，腦的結(jié)構(gòu)改變主要是海馬及皮質(zhì)萎縮，功能改變主要是認(rèn)知功能損害，大量的研究報(bào)道肯定了糖尿病引起認(rèn)知功能障礙的事實(shí)。在2006 年，專門術(shù)語糖尿病認(rèn)知功能障礙（diabetes-associated cognitive decline,DACD）的提出進(jìn)一步增強(qiáng)了人們對(duì)這種功能紊亂的認(rèn)識(shí)，并成為糖尿病腦病研究的焦點(diǎn)。據(jù)估計(jì)全世界現(xiàn)有約3.47 億成年人罹患糖尿病，其中40% 生活在中國和印度。廣泛的流行病學(xué)調(diào)查研究以及基于流行病學(xué)調(diào)查的前瞻性研究表明：糖尿病是與年齡相關(guān)的認(rèn)知功能下降和癡呆的一個(gè)危險(xiǎn)因素，相對(duì)于非糖尿病患者，認(rèn)知功能下降的速度在糖尿病患者中增加了1.5-2.0 倍；同樣地，對(duì)于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD) 的發(fā)病率，DM 患者是非DM 患者的2 倍。多數(shù)研究結(jié)果表明，糖尿病腦病是一種大腦加速老化的過程，因而國外學(xué)者de la Monte SM 研究組提出AD 是Ⅲ型DM 的觀點(diǎn)。因此，糖尿病腦病正在成為本世紀(jì)全世界醫(yī)藥界重要的研究課題之一。

高良姜素 ，別名：高良姜黃素；3,5,7-三羥基黃酮，英文名稱Galangin，主要存在于姜科植物及蜂膠中，已知的其具有抗病毒抗腫瘤作用。結(jié)構(gòu)是如下：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1. 發(fā)明目的

本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)了高良姜素新的藥理作用，即高良姜素對(duì)糖尿病腦病的防治作用。實(shí)際上，本發(fā)明涉及高良姜素對(duì)糖尿病認(rèn)知功能損害的防治作用及其可能的作用機(jī)制。

2. 技術(shù)方案

高良姜素對(duì)糖尿病腦病等糖尿病并發(fā)癥具有防治作用，尤其是高良姜素對(duì)糖尿病引起的學(xué)習(xí)、記憶能力損害具有明顯的改善作用；高良姜素是通過降低貝塔淀粉樣肽前體蛋白β-位裂解酶1（BACE1） 的功能、抑制晚期糖基化終末化產(chǎn)物（AGEs/RAGE）軸、抗炎、抗氧化應(yīng)激等實(shí)現(xiàn)上述作用。

3. 有益效果

以上藥理試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明對(duì)高良姜素發(fā)現(xiàn)了新的藥理作用以及新的醫(yī)藥用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。

（2）本發(fā)明表明高良姜素防治糖尿病腦病藥理效果好，作用強(qiáng)，預(yù)示著有良好的藥用前景。

（3）在Morris 水迷宮試驗(yàn)中，高良姜素可明顯降低DM 大鼠的逃避潛伏期、增加平臺(tái)穿越次數(shù)以及在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間的百分比，說明高良姜素具有明顯改善DM 大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。

（4）本發(fā)明表明高良姜素具有明顯降低DM 大鼠海馬中AGEs 水平的作用，說明高良姜素可明顯抑制AGEs/RAGE 軸介導(dǎo)蛋白糖化作用。

（5）本發(fā)明表明高良姜素具有顯著降低 DM 大鼠大腦皮質(zhì)中 BACE1 活性、表達(dá)的作用，提示出高良姜素可明顯降低腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞毒劑 Aβ 的生成及其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

（6）高良姜素明顯降低DM 大鼠海馬中IL-1β 和TNF-α 水平，表明高良姜素具有強(qiáng)大的抗炎作用。

（7）高良姜素明顯增加血清中GSH 水平，增強(qiáng)血清中SOD 活性的作用，表明高良姜素具有很強(qiáng)的抗氧化作用。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1 高良姜素對(duì)訓(xùn)練1天和4天的DM 大鼠逃避潛伏期的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

圖 2 高良姜素對(duì) DM 大鼠平臺(tái)穿越次數(shù)的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖 3 高良姜素對(duì) DM 大鼠平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

圖 4 高良姜素對(duì) DM 大鼠空腹血糖的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；

圖 5 高良姜素對(duì) DM 大鼠海馬中 AGEs 含量的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較， **P<0.01。

圖 6 高良姜素對(duì) DM 大鼠大腦皮質(zhì)中 BACE1 活性的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

圖 7 高良姜素對(duì) DM 大鼠大腦皮質(zhì)中 BACE1 蛋白表達(dá)的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

圖 8 高良姜素對(duì) DM 大鼠海馬中IL-1β水平的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較， **P<0.01。

圖 9 高良姜素對(duì) DM 大鼠海馬中TNF-α 水平的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較， **P<0.01。

圖 10 高良姜素對(duì) DM 大鼠血清中SOD 活性的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖 11 高良姜素對(duì) DM 大鼠血清中GSH 水平的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但絕不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。下面參照實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例以及使用的制備方法。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的描述可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行等同替換、組合、改良或修飾，但這些都將包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1：高良姜素對(duì)DM 大鼠認(rèn)知功能的影響

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD 品系大鼠，8-9 周齡，190-220g，海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥品與試劑高良姜素購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司（HPLC純度>98%），STZ 購自sigma 公司，葡萄糖測(cè)試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 模型建立雄性SD 大鼠禁食不禁水12h 以上，按55mg/kg 一次性腹腔注射STZ（臨用前溶于0.1mol/L 檸檬酸鈉緩沖液，pH4.4）進(jìn)行造模，造模三天后，眶靜脈叢取血約0.2ml，25℃、3000rpm 離心10min，分離血清。用葡萄糖試劑盒檢測(cè)空腹血糖（FBG），取FBG值大于250mg/dl(13.9mmol/L) 和小于600mg/dl（33.3mmol/L）的大鼠作為成功的糖尿病大鼠。

1.3.2 分組及給藥將造模成功的糖尿病大鼠按照血糖值隨機(jī)分為3 組，分別為糖尿病模型組、高良姜素高、低劑量組，每組10 只大鼠。另設(shè)一組正常對(duì)照組，每組10 只大鼠。高良姜素高、低劑量組分別按15，30mg/kg 灌胃（按10ml/kg 體積）給予高良姜素（用水制成混懸液），每天一次，連續(xù)9 周。正常對(duì)照組和模型組給同體積生理鹽水。每周監(jiān)測(cè)一次體重，調(diào)整給藥體積，每月監(jiān)測(cè)一次空腹血糖。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定給藥8 周后，各組大鼠進(jìn)行Morris 水迷宮測(cè)試，觀察學(xué)習(xí)、記憶功能，記錄大鼠的逃避潛伏期、平臺(tái)穿越次數(shù)以及在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間的百分比。之后，各組大鼠股靜脈取血，分離血清，低溫保存，備用；即刻處死，取腦，分離海馬和皮質(zhì)，-80℃保存。

1.4多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高良姜素對(duì)DM 大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能的影響

在Morris 水迷宮測(cè)試中，與正常組大鼠比較，在5 天的訓(xùn)練中DM 大鼠的逃避潛伏期均顯著增加（P<0.01），平臺(tái)穿越次數(shù)（P<0.01）以及在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間的百分比顯著減少（P<0.01）。高良姜素低劑量在訓(xùn)練的第5 天顯著降低DM 大鼠的逃避潛伏期（P<0.05），高劑量在第1、4天均顯著降低DM 大鼠的逃避潛伏期（P<0.05）；高良姜素高、低劑量均可顯著增加在平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間的百分比（P<0.05 或P<0.01），而只有高劑量顯著增加平臺(tái)穿越次數(shù)（P<0.05）。結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

2.2 高良姜素對(duì) DM 大鼠血糖和體重的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，DM 大鼠的 FBG 一直處于高水平狀態(tài)，顯著高于正常大鼠（P<0.01）。DM 大鼠給予高良姜素高、低劑量 4 及 9 周后，F(xiàn)BG 仍然處于高水平狀態(tài)，與未給藥 DM大鼠比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見圖4）。在開始給藥后，DM 大鼠的體重顯著低于正常大鼠的體重（P<0.01），高良姜素高劑量在給藥5和9周后，顯著增加DM大鼠的體重（P<0.05），其他兩個(gè)劑量在給藥期間均對(duì) DM 大鼠的體重?zé)o顯著影響（見表 4）。

表 1 高良姜素對(duì) DM 大鼠體重的影響

注 ：與正常對(duì)照組比較，P<0.01；與模型組比較，*P<0.05。

實(shí)施例 2 ：高良姜素對(duì) DM 大鼠海馬中 AGEs 水平的影響

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同實(shí)施例 1。

1.2 藥品與試劑兔抗 RAGE 抗體購自美國 Santa Cruz 公司，兔抗 GAPDH 抗體購自美國Bioworld公司，Ⅰ型膠原酶購自美國sigma公司，堿性磷酸酶二抗、苯甲基磺酰氟化物（PMSF）和 BCA 蛋白質(zhì)測(cè)試盒購自江蘇碧云天生物公司，Na₃VO₄和 NaF 購自國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

熒光分光光度法檢測(cè) AGEs 水平。將保存的海馬標(biāo)本，稱重后按 10 倍量（w/v）加入 100mM 的 PBS（pH7.4）緩沖液，4℃下超聲勻漿。勻漿液于 4℃下 10000rpm 離心 15min后，上清液用于總蛋白質(zhì)含量及其他相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。取沉淀，以雙蒸水洗滌 3 次，在沉淀中加入氯仿 / 甲醇 (1:1)1.0ml，振蕩過夜。再加入甲醇 / 水 (4:1)0.5ml，4℃下 4000rpm 離心5min。沉淀以甲醇 1.0ml 洗滌 2 次，雙蒸水洗滌 2 次，再用 pH7.5,0.02mol/LHepes 緩沖液（含 0.1mol/L CaCl₂）洗 2 次。沉淀于 1.0ml Hepes 緩沖液中 4℃下過夜。離心去除緩沖液，將顆粒懸浮于 1.0ml 含Ⅰ型膠原酶（290U）的 Hepes 緩沖液中，加入甲苯和氯仿各 2.0μl。以只含 Hepes 緩沖液和膠原酶的空白管為標(biāo)準(zhǔn)，37℃振蕩 24h，將消化液離心，留取上清液。用熒光分光光度法檢測(cè)上清液中的熒光強(qiáng)度（反映 AGEs 的含量），激發(fā)波長為 370nm, 吸收波長為 440nm。AGEs 的含量以 U/mg 海馬蛋白表示。

2 結(jié)果

DM 大鼠海馬中 AGEs 含量顯著增加，與正常大鼠海馬中的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。高良姜素高劑量可顯著降低DM大鼠海馬中的AGEs含量（P<0.01），結(jié)果見圖5。

實(shí)施例 3 ：高良姜素對(duì) DM 大鼠大腦皮質(zhì)中 BACE1 活性、蛋白表達(dá)及 mRNA 水平的影響

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 同實(shí)施例 1。

1.2 藥品與試劑

兔抗 BACE1 抗體購自英國 abcam 公司，兔抗 GAPDH 抗體購自美國Bioworld 公司，BACE1 的人工合成的熒光底物（貨號(hào) ES004）購自美國 R&D System 公司。大鼠 Bace1 和 β-actin 引物由上海生工生物工程公司合成，TRIzol 購自 Invitrogen 中國公司。

1.3 方法

1.3.1 BACE1 活性測(cè)定

熒光分光光度法測(cè)定 BACE1 活性。在測(cè)定 AGEs 水平時(shí)制備的大腦皮質(zhì)勻漿液，離心所得的上清作為 BACE1 活性測(cè)定的樣本。BCA 法測(cè)定總蛋白濃度后，在熒光底物終濃度為 10μM 的 100 μl 反應(yīng)體系中加入 50-70 μg 蛋白，在 37℃反應(yīng) 10 min，加入 20 μl 二甲基亞砜（DMSO）終止反應(yīng)，采用熒光儀器測(cè)定反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度（FSU），反映 BACE1 活性。BACE1 活性的大小表示為正常組產(chǎn)物生成量的百分比。

1.3.2 BACE1 蛋白表達(dá)測(cè)定

Western blotting 法測(cè)定 BACE1 蛋白表達(dá)。取分裝保存的大腦皮質(zhì)組織漿液，電泳分離樣品，轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素膜），洗膜，封閉，一抗反應(yīng)，二抗反應(yīng)，顯色，掃描或拍照，Image J 軟件分析 蛋白表達(dá)水平的變化。采用 GAPDH 作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 同實(shí)施例 1。

2 結(jié)果

2.1 高良姜素對(duì) DM 大鼠大腦皮質(zhì)中 BACE1 活性的影響

DM 大鼠大腦皮質(zhì)中 BACE1 活性顯著增加，為正常大鼠大腦皮質(zhì)的 129%，兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；高良姜素可顯著降低 DM 大鼠大腦皮質(zhì)中 BACE1 活性（P<0.05），結(jié)果見圖6。

2.2 高良姜素對(duì) DM 大鼠大腦皮質(zhì)中 BACE1 蛋白表達(dá)的影響

DM 大鼠大腦皮質(zhì)中 BACE1 蛋白的相對(duì)表達(dá)顯著增加，與正常大鼠大腦皮質(zhì)中的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；高良姜素可顯著降低 DM 大鼠大腦皮質(zhì)中的 BACE1 蛋白表達(dá)（P<0.01），結(jié)果見圖7。

實(shí)施例 4 ：高良姜素對(duì) DM 大鼠海馬中 IL-1β和 TNF-α水平的影響

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同實(shí)施例 1。

1.2 藥品與試劑 IL-1β 和 TNF-α 的 ELISA 試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司，BCA 蛋白質(zhì)測(cè)試盒購自江蘇碧云天生物公司。

1.3 方法

酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）法測(cè)定 IL-1β 和 TNF-α 水平。取 BACE1 活性測(cè)定的樣本，測(cè)定海馬中 IL-1β 和 TNF-α 水平。IL-1β 和 TNF-α 水平測(cè)定嚴(yán)格按照各自試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同實(shí)施例 1。

2 結(jié)果

DM 大鼠海馬中 IL-1β 和 TNF-α 水平顯著增加，比正常大鼠海馬中的分別增加了2.9 倍和 48.6%，兩組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P<0.01）。高良姜素低、中、高劑量均可顯著降低 DM 大鼠海馬中的 IL-1β 和 TNF-α 水平（均 P<0.01），結(jié)果見圖8、圖9。

實(shí)施例 5 ：高良姜素對(duì) DM 大鼠血清中 SOD 活性和 GSH 水平的影響

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同實(shí)施例 1。

1.2 藥品與試劑 SOD 和 GSH 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

分光光度法測(cè)定 SOD 活性和 GSH 水平。取保存的血清樣本，測(cè)定 SOD 活性和 GSH 水平，嚴(yán)格按照各自試劑盒的操作步驟進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理同實(shí)施例 1。

2 結(jié)果

DM 大鼠血清中 SOD 活性和 GSH 水平顯著降低，比正常大鼠血清中的分別降低了16.2% 和 38.4%，兩組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P<0.01）；高良姜素高、低劑量均可顯著增強(qiáng) DM 大鼠血清中的 SOD 活性（P<0.05 或 P<0.01）；高良姜素高劑量可顯著增加 DM 大鼠血清中的 GSH 水平（P<0.05），結(jié)果見圖10、圖11。

最后有必要在此說明的是：以上實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。