本發(fā)明生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及Tenascin-C的醫(yī)藥新用途，涉及Tenascin-C在制備診斷和治療腎臟損傷制劑中的應(yīng)用，具體涉及Tenascin-C在用于制備修復(fù)急性腎臟損傷和診斷，治療慢性腎間質(zhì)纖維化病癥制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：研究顯示，隨著人口的老齡化，慢性腎臟病(chronickidneydisease，CKD)的發(fā)病率和死亡率也逐年升高，這與CKD的傳統(tǒng)因素包括糖尿病、高血壓和心血管疾病的患病率逐年上升密切相關(guān)。據(jù)調(diào)查，在美國成人CKD患病率為11％，在年齡超過60歲的人群中則高達(dá)39.4％，統(tǒng)計(jì)表明CKD的患病率超過單純糖尿病(9.3％)和CVD(8.5％)，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。無論何種原因引起的CKD，慢性腎間質(zhì)纖維化為其最終共同通路，表現(xiàn)為腎間質(zhì)小管的萎縮及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。通常關(guān)于CKD的病因研究及腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度的診斷主要依賴于腎活檢，但腎活檢是臨床實(shí)踐中采用的有創(chuàng)傷性的診斷措施，且其無法監(jiān)測纖維化的動態(tài)變化速度及嚴(yán)重程度。雖然腎功能(如血清肌酐)與腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，但其診斷的敏感性較差，當(dāng)出現(xiàn)肌酐升高時(shí)，腎臟的纖維化通常已經(jīng)較嚴(yán)重了，達(dá)不到早期診斷的目的。與CKD相對應(yīng)的另一嚴(yán)重影響人類健康的腎臟疾病是急性腎損傷(acutekidneydisease，AKI)，近年來AKI的發(fā)病率也是逐年上升，這與人口的老齡化及手術(shù)量的增加密切相關(guān)。2013年cJASN發(fā)表了關(guān)于AKI發(fā)病率的系統(tǒng)綜述，結(jié)果表明：基于KDIGO指南提供的AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)，住院患者AKI的發(fā)病率為23.2％(95％CI21.0-25.7％)，全因死亡率為23.0％(21.3-24.8％)；如此高的發(fā)病率及死亡率不僅危害人類的健康，也給社會和政府帶來巨大負(fù)擔(dān)。雖然AKI能恢復(fù)甚至肌酐下降至基線水平，但其中仍有很大一部分患者無法完全恢復(fù)而轉(zhuǎn)變?yōu)镃KD，表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)行性進(jìn)展。目前尚缺乏有效的生物標(biāo)志物用于檢測AKI的恢復(fù)以及是否遺留腎間質(zhì)纖維化，以及缺乏有效的藥物促進(jìn)腎小管壞死后腎小管上皮細(xì)胞的再生。因此，本申請的發(fā)明人擬提供Tenascin-C作為腎臟損傷或腎臟纖維化的生物標(biāo)志物，通過監(jiān)測血、尿中的指標(biāo)反應(yīng)腎臟損傷的嚴(yán)重程度并預(yù)測腎臟恢復(fù)的機(jī)會；以及提供Tenascin-C在制備診斷和治療腎臟損傷制劑中的應(yīng)用，將有助于慢性腎臟纖維化的早期診斷及監(jiān)測、干預(yù)腎臟纖維化的進(jìn)展。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的提供Tenascin-C在制備診斷和治療腎臟損傷制劑中的應(yīng)用，具體涉及Tenascin-C在用于制備修復(fù)急性腎臟損傷和診斷，治療慢性腎間質(zhì)纖維化病癥制劑中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，本發(fā)明提供Tenascin-C作為腎臟損傷或腎臟纖維化的生物標(biāo)志物，尤其是作為腎臟損傷或腎臟纖維化的血液及尿液中的生物標(biāo)志物；更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供Tenascin-C在制備檢測，診斷和治療腎臟損傷或腎臟纖維化的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明中通過檢測腎組織、血清和尿液中的Tenascin-C，反應(yīng)腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度；本發(fā)明中通過抑制Tenascin-C的功能，減輕慢性腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展；本發(fā)明中通過檢測腎組織、血清和尿液中的Tenascin-C，反應(yīng)急性腎損傷的嚴(yán)重程度并預(yù)測遺留慢性腎間質(zhì)纖維化的風(fēng)險(xiǎn)；本發(fā)明中通過同在急性期上調(diào)Tenascin-C的功能，減輕急性腎損傷的嚴(yán)重程度。更具體的，本發(fā)明中，進(jìn)行了慢性腎間質(zhì)纖維化患者腎活檢標(biāo)本中的TNC檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性腎間質(zhì)纖維化過程中TNC的表達(dá)明顯增加；進(jìn)一步，通過構(gòu)建雙轉(zhuǎn)基因小鼠TNC-CreER-eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠與報(bào)告基因小鼠Rosa26-tdTomato小鼠交配獲得雙轉(zhuǎn)基因小鼠，利用該種轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻模型(UUO)，結(jié)果證實(shí)，在慢性腎間質(zhì)纖維化過程中腎組織TNC的表達(dá)明顯增加；而采用TNC基因缺失小鼠證實(shí)TNC基因缺失顯著減輕慢性腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度。本發(fā)明中，進(jìn)行了急性腎損傷患者腎活檢標(biāo)本的TNC檢測，發(fā)現(xiàn)急性腎小管壞死部位TNC的表達(dá)明顯增加；進(jìn)一步，通過構(gòu)建TNC-CreER-eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，該小鼠與報(bào)告基因小鼠Rosa26-tdTomato小鼠交配獲得雙轉(zhuǎn)基因小鼠，利用該種轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建急性缺血再灌注損傷模型，證實(shí)在急性腎損傷過程中腎組織TNC的表達(dá)變化趨勢；采用TNC基因缺陷小鼠證實(shí)TNC基因缺失顯著加重急性腎損傷的嚴(yán)重程度。本發(fā)明中，從患者腎活檢標(biāo)本及動物研究證實(shí)的在慢性腎間質(zhì)纖維化過程中的TNC表達(dá)上調(diào)可作為反應(yīng)慢性腎間質(zhì)纖維化的生物標(biāo)志物；經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)的在急性缺血再灌注損傷過程中證實(shí)的TNC表達(dá)上調(diào)可作為反應(yīng)急性腎損傷嚴(yán)重程度和預(yù)測遺留慢性腎間質(zhì)纖維化風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志物。本發(fā)明的試驗(yàn)檢測結(jié)果證實(shí)，TNC基因缺失顯著減輕慢性腎間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度，可用于制備通過抑制TNC的作用能減輕慢性腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度的檢測試劑及試劑盒；本發(fā)明試驗(yàn)檢測結(jié)果證實(shí)，TNC基因缺失顯著加重急性腎損傷的嚴(yán)重程度，可用于制備通過上調(diào)TNC的功能可減輕慢性腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度的檢測試劑及試劑盒。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：提供Tenascin-C作為腎臟損傷或腎臟纖維化的生物標(biāo)志物，尤其是作為腎臟損傷或腎臟纖維化的血液及尿液中的生物標(biāo)志物；以及提供Tenascin-C在制備檢測，診斷和治療腎臟損傷或腎臟纖維化的試劑盒中的應(yīng)用；本發(fā)明中通過監(jiān)測血、尿中的生物標(biāo)志物指標(biāo)能反應(yīng)腎臟損傷的嚴(yán)重程度并預(yù)測腎臟恢復(fù)的機(jī)會，并進(jìn)一步提供促進(jìn)急性腎損傷的修復(fù)減輕腎臟損傷的嚴(yán)重程度的干預(yù)措施；以及通過檢測血液及尿液中的生物標(biāo)志物反應(yīng)腎臟纖維化的嚴(yán)重程度，提供有助于慢性腎臟纖維化的早期診斷及監(jiān)測腎臟纖維化的進(jìn)展的干預(yù)措施。附圖說明圖1是CKD患者慢性腎間質(zhì)纖維化時(shí)TNC表達(dá)增加，其中，左上圖為正常對照腎臟，TNC表達(dá)少；右上圖為較彌漫腎間質(zhì)纖維化，可見TNC表達(dá)上調(diào)且位于腎間質(zhì)；下圖為腎間質(zhì)的灶性纖維化組織，可見TNC在纖維化病灶里有顯著的表達(dá)，而在旁邊纖維化不明顯的小管，TNC表達(dá)不明顯。圖2顯示了TNC的表達(dá)隨著纖維化程度的加重而增加，其中，采用WT小鼠和TNC-/-小鼠，檢測UUO后7天、10天TNC及報(bào)告基因eGFP的mRNA表達(dá)，可見在WT小鼠，TNCmRNA水平隨著UUO時(shí)間的延長而逐漸增加，TNC-/-小鼠未檢測到TNCmRNA表達(dá)(左圖)；在TNC-/-小鼠，eGFPmRNA的水平隨著UUO時(shí)間的延長而逐漸增加，WT小鼠未檢測到eGFP的表達(dá)(右圖)。圖3顯示了TNC表達(dá)的細(xì)胞在UUO誘導(dǎo)的纖維化模型中顯著增加，與對照腎臟(左上)相比，UUO5天時(shí)腎髓質(zhì)和皮髓交界線附近tdTomato陽性的細(xì)胞明顯增加，腎皮質(zhì)也有較多的陽性細(xì)胞(右上)，隨著UUO時(shí)間的延長，tdTomato陽性的細(xì)胞進(jìn)一步增加(左下)，在腎臟皮質(zhì)部位有明顯的主要是腎間質(zhì)細(xì)胞的陽性細(xì)胞(右下)。圖4顯示TNC基因缺失改善UUO誘導(dǎo)的慢性腎間質(zhì)纖維化，其中，Masson染色提示和WT小鼠相比，TNC-/-小鼠在UUO5天、7天、10天，慢性腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度均明顯減輕(n＝8，p<0.05)。圖5顯示TNC基因缺失減輕腎間質(zhì)纖維化過程中巨噬細(xì)胞的浸潤，其中圖示為巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物F4/80組化染色，結(jié)果表明，與WT小鼠相比，TNC-/-小鼠在UUO5天、7天和10天，腎組織巨噬細(xì)胞的浸潤明顯減輕，采用ImageJ軟件掃面陽性面積，表明TNC-/-較WT小鼠F4/80陽性面積顯著減少(n＝8，p<0.05)。圖6顯示TNC基因缺失減少纖維化過程中FSP-1陽性細(xì)胞的數(shù)量，其中圖示為FSP-1免疫熒光，與WT小鼠相比，TNC-/-小鼠在UUO5天、7天FSP-1陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯減少(n＝8，p<0.05)。圖7顯示TNC基因缺失改善纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，其中，采用WT和TNC-/-小鼠，檢測UUO7天和UUO10天腎組織纖維化相關(guān)指標(biāo)α-SMA、collagenI、fibronectin及PAI-1的mRNA水平，結(jié)果與WT小鼠相比，TNC-/-小鼠collagenI、fibronectin及PAI-1的水平均明顯降低(n＝4,2wayANOVAp<0.05)，α-SMA的mRNA水平無顯著差異。圖8顯示纖維化過程中TNC的表達(dá)來源于其他細(xì)胞的誘導(dǎo)(UUO模型)，其中，采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，術(shù)前3月給予tamoxifen誘導(dǎo)TNC陽性腎間質(zhì)細(xì)胞基因重組而持續(xù)表達(dá)tdTomato紅色熒光蛋白，經(jīng)3個月的洗脫期，構(gòu)建UUO模型；A、D為未梗阻側(cè)腎臟，可見tdTomato陽性的細(xì)胞位于腎乳頭部位，腎皮質(zhì)有散在少量的陽性細(xì)胞，主要位于腎小球鮑曼氏囊壁；B、E圍術(shù)期未再給予tamoxifen誘導(dǎo)，UUO7天可見腎髓質(zhì)部位的tdTomato陽性細(xì)胞明顯增多，而皮質(zhì)增加的TNC表達(dá)細(xì)胞并不明顯；C、F為圍術(shù)期再次給予tamoxifen誘導(dǎo)，UUO7天可見整個腎臟尤其腎皮質(zhì)部位tdTomato陽性細(xì)胞增加更明顯。圖9顯示纖維化過程中TNC的表達(dá)源于其他細(xì)胞的誘導(dǎo)(IR模型)，其中，采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，術(shù)前3月給予tamoxifen誘導(dǎo)TNC陽性腎間質(zhì)細(xì)胞基因重組而持續(xù)表達(dá)tdTomato紅色熒光蛋白，經(jīng)3個月的洗脫期，構(gòu)建IR模型；A、D為對照側(cè)腎臟，可見tdTomato陽性的細(xì)胞主要位于腎乳頭部位，腎皮質(zhì)僅有散在少量的陽性細(xì)胞，位于腎小球鮑曼氏囊壁；B、E在IR后未再給予tamoxifen誘導(dǎo)，IR后14天可見腎髓質(zhì)部位的tdTomato陽性細(xì)胞明顯增多，而皮質(zhì)增加的TNC表達(dá)細(xì)胞并不明顯；C、F為IR后9天再次給予tamoxifen誘導(dǎo)，IR后14天可見整個腎臟tdTomato陽性細(xì)胞增加更明顯，提示IR晚期纖維化過程中持續(xù)有其他非TNC陽性細(xì)胞被誘導(dǎo)表達(dá)TNC。圖10表達(dá)TNC固有腎臟細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的一個來源，其中，采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，術(shù)前給予tamoxifen誘導(dǎo)TNC陽性腎間質(zhì)細(xì)胞基因重組而持續(xù)表達(dá)tdTomato紅色熒光蛋白，經(jīng)3個月的洗脫期，構(gòu)建IR模型，IR后14天發(fā)現(xiàn)腎髓質(zhì)大部分α-SMA陽性(綠色熒光，eGFP在無抗體染色時(shí)一般檢測不到綠色熒光)的myofibroblast均有紅色熒光蛋白。圖11顯示急性腎小管壞死患者損傷腎小管周圍出現(xiàn)TNC表達(dá)，其中，左上圖為正常腎組織，可見腎小管周圍很少有TNC的表達(dá)，右上和左下為ATN患者，肌酐最高達(dá)900μmol/L，腎活檢時(shí)腎功能已有所恢復(fù)并脫離透析，遺留部分未修復(fù)完成的腎小管，可見其周圍有明顯的TNC表達(dá)。右下為移植腎，由于缺血時(shí)間較長，有顯著的腎小管壞死，移植后腎功能沒有恢復(fù)，可見TNC的表達(dá)更顯著。圖12顯示急性腎臟缺血再灌注損傷后TNC呈一過性表達(dá)增加，其中，上圖為TNC-CreER-eGFP+/-小鼠腎臟IR后不同時(shí)間TNCmRNA的表達(dá)水平，可見IR后2天TNCmRNA表達(dá)水平顯著增加，4天達(dá)峰，6天開始下降，14天雖仍高于正常對照，但已明顯下降；下圖為TNC-CreER-eGFP+/-小鼠腎臟IR后不同時(shí)間TNC的報(bào)告基因eGFP的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果與TNCmRNA變化趨勢相似，反映TNC在急性缺血再灌注損傷后的表達(dá)變化。圖13顯示急性腎臟缺血再灌注損傷后TNC被誘導(dǎo)的主要部位，其中，正常腎臟，TNC的表達(dá)主要位于腎臟乳頭部位，腎臟外髓及皮質(zhì)表達(dá)均少；采用TNC-CreER-eGFP+/-小鼠IR后2天，發(fā)現(xiàn)腎臟外髓、內(nèi)側(cè)皮質(zhì)出現(xiàn)大量表達(dá)eGFP的細(xì)胞，其中以皮髓交界線的表達(dá)增加最為顯著；IR后14天，eGFP表達(dá)的細(xì)胞減少，但較正常對照仍顯著增加，主要位于髓質(zhì)及近髓皮質(zhì)部位。圖14顯示IR14d腎間質(zhì)TNC蛋白表達(dá)水平明顯上升，其中，IR后14天，TNC蛋白表達(dá)水平較正常組織顯著增高，腎皮質(zhì)和髓質(zhì)均有明顯的TNC表達(dá)，以皮髓交界線兩側(cè)及髓質(zhì)部位顯著。圖15顯示TNC誘導(dǎo)表達(dá)的主要時(shí)間，其中，采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，構(gòu)建單側(cè)IR模型，分別于不同時(shí)間注射tamoxifen，觀察tdTomato陽性細(xì)胞的數(shù)量及分布情況；A1-3為IR術(shù)前4周注射tamoxifen1.5mgqd*5d，經(jīng)3周的洗脫期后構(gòu)建IR模型，分別于術(shù)后7天(A1)、14天(A2)、2月(A3)留取腎臟標(biāo)本觀察，提示tdTomato陽性細(xì)胞主要位于腎臟內(nèi)髓部位，數(shù)量較對照組輕度升高；B1-3為IR圍術(shù)期前、后各2天注射tamoxifen1.5mgqd，共4天，分別于術(shù)后7天(B1)、14天(B2)、2月(B3)留取腎臟標(biāo)本觀察，提示tdTomato陽性的細(xì)胞均顯著的增加，主要位于外髓及內(nèi)側(cè)皮質(zhì)，雖然IR后14天腎臟縮小，但tdTomato陽性的細(xì)胞并沒有減少，B3的IR時(shí)間較B1、B2短，因此tdTomato陽性的細(xì)胞也較少；C1-3為術(shù)后全程注射tamoxifen，與圍術(shù)期注射tamoxifen相比tdTomato陽性細(xì)胞數(shù)量有所增加，但分布的范圍無明顯增大，C3腎臟IR后2月的tdTomato陽性細(xì)胞數(shù)量較C1-2少可能與IR時(shí)間較短有關(guān)；D1-4為小鼠留取腎臟標(biāo)本前4天注射tamoxifen1.5mg/d，結(jié)果提示IR后3-7天有大量TNC的誘導(dǎo)表達(dá)，而IR10天以后TNC的誘導(dǎo)表達(dá)明顯減少，IR28天左右，基本沒有TNC的誘導(dǎo)表達(dá)。圖16顯示表達(dá)TNC細(xì)胞的增加程度與腎臟IR損傷的嚴(yán)重程度正相關(guān)，其中，A1-3為IR前4周注射tamoxifen誘導(dǎo)，經(jīng)過洗脫期后，構(gòu)建腎臟IR模型，48h取腎臟觀察，結(jié)果提示tdTomato陽性的細(xì)胞較對照組增加不明顯；B1-3為IR前、后各2天注射tamoxifen，48h取腎臟標(biāo)本觀察，發(fā)現(xiàn)腎臟缺血時(shí)間越長，tdTomato陽性細(xì)胞增加的數(shù)量和范圍越大；C1-3為IR后3天注射Tamoxifen4天，IR后7天觀察，發(fā)現(xiàn)IR50min較IR35min腎臟tdTomato陽性細(xì)胞的數(shù)量及分布范圍均顯著增加。圖17顯示TNC誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞主要位于損傷小管周圍，其中，采用TNC-CreER+/-小鼠，構(gòu)建IR模型，觀察eGFP的主要表達(dá)部位，上圖為IR后2天，下圖為IR后14天，eGFP陽性細(xì)胞主要圍繞損傷的腎小管周圍。圖18顯示TNC基因缺失降低小鼠急性缺血再灌注損傷的生存率，其中，采用同窩TNC-CreER+/+小鼠(即TNC-/-小鼠)和TNC+/+小鼠(n＝14)，構(gòu)建單側(cè)腎臟切除+單側(cè)IR模型，觀察生存情況，結(jié)果提示TNC基因缺陷小鼠較野生型小鼠生存率明顯降低。圖19顯示TNC基因缺失加重小鼠缺血再灌注損傷后腎臟腫脹，其中，采用同窩TNC-CreER+/+小鼠(即TNC-/-小鼠)和TNC+/+小鼠，構(gòu)建單側(cè)腎臟切除+單側(cè)IR模型，分別于IR0天、2天、5天、7天取存活小鼠腎臟(n＝4)，記錄腎臟的重量及小鼠體重，結(jié)果提示TNC-/-小鼠較野生型小鼠體重下降更明顯，腎臟的腫脹(用腎重量/體重表示)也更顯著。圖20顯示TNC基因缺失加重小鼠腎臟IR后的腎功能損傷，其中采用同窩TNC-CreER+/+小鼠(即TNC-/-小鼠)和TNC+/+小鼠，構(gòu)建單側(cè)腎臟切除+單側(cè)IR模型，分別于IR0天、2天、5天、7天取存活小鼠腎臟(n＝4)，留取血清檢測血尿素氮水平，結(jié)果提示TNC-/-小鼠較野生型小鼠腎功能損害更顯著。圖21顯示TNC基因缺失加重小鼠IRI后的腎小管壞死，其中，同窩TNC-CreER+/+小鼠(即TNC-/-小鼠)和TNC+/+小鼠，構(gòu)建單側(cè)腎臟切除+單側(cè)IR模型，分別于IR2天、5天、7天取存活小鼠腎臟(n＝4)，行PAS染色，提示TNC-/-小鼠較野生型小鼠腎小管壞死明顯加重。圖22顯示TNC基因缺失小鼠IRI后腎乳頭部位的損傷明顯加重，其中，同窩TNC-CreER+/+小鼠(即TNC-/-小鼠)和TNC+/+小鼠，構(gòu)建單側(cè)腎臟切除+單側(cè)IR模型，分別于IR2天、5天、7天取存活小鼠腎臟(n＝4)，行PAS染色，提示TNC-/-小鼠較野生型小鼠腎乳頭壞死更明顯。具體實(shí)施方式實(shí)施例1檢測腎組織、血清和尿液中的Tenascin-C，反應(yīng)腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度1.臨床研究獲取于本中心腎活檢證實(shí)存在腎間質(zhì)纖維化的腎組織石蠟切片(n＝5)，行TNC免疫熒光染色，觀察纖維化腎組織中TNC的表達(dá)情況。采用ELISA方法檢測血清和尿液中的Tenascin-C水平。2.實(shí)驗(yàn)動物研究TNC基因缺失對腎間質(zhì)纖維化的影響采用同窩TNC-CreER-eGFP+/+(即TNC-/-)小鼠和野生型小鼠，熒光共染對TNC表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行定性研究采用TNC-CreER-eGFP+/-小鼠，表達(dá)TNC細(xì)胞的譜系追蹤采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠。所有小鼠均為129品系，養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，室內(nèi)溫度保持在25℃，晝夜明暗交替時(shí)間為12/12小時(shí)，自由飲食、飲水和活動。實(shí)驗(yàn)通過倫理委員會批準(zhǔn)，小鼠飼養(yǎng)者均獲得參與動物實(shí)驗(yàn)資格證。3.UUO模型獲得8-10周齡雄性小鼠，術(shù)前用5％水合氯醛麻醉(0.5g水合氯醛溶于10ml無菌生理鹽水，0.008ml/g小鼠體重)，術(shù)中鈍性分離右側(cè)腎臟，雙次結(jié)扎腎下極輸尿管，逐層縫合腹腔。4.TNC誘導(dǎo)表達(dá)的評價(jià)首先采用TNC-CreER+/-小鼠，構(gòu)建UUO模型，分別于UUO后7天和10天檢測腎臟TNC和eGFPmRNA水平(n＝5)，觀察TNCmRNA在IR的變化趨勢。其次采用TNC-CreER+/-小鼠，在UUO后10天通過免疫熒光法檢測eGFP和TNC蛋白的表達(dá)水平及表達(dá)部位。再次采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，于UUO前、后各2天注射tamoxifen，UUO后5天、7天獲得小鼠腎臟標(biāo)本，直接觀察tdTomato陽性的細(xì)胞量及部位，判斷UUO后TNC表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)施例2抑制Tenascin-C的功能，減輕慢性腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展1.慢性腎間質(zhì)纖維化的評價(jià)采用盲法原則由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生完成。采用masson染色，根據(jù)小鼠腎臟橫切面纖維化的嚴(yán)重程度分為0-10分，半定量腎臟的纖維化程度；利用巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物F4/80對小鼠腎臟橫切面進(jìn)行免疫組化染色，采用ImageJ軟件進(jìn)行掃描，通過比較陽性面積的大小，評價(jià)巨噬細(xì)胞的浸潤程度；通過FSP-1對小鼠腎臟橫切面進(jìn)行免疫熒光染色，100倍視野下隨機(jī)選取20個視野，計(jì)算小鼠腎臟橫切面FSP-1陽性細(xì)胞數(shù)；提取整個腎臟mRNA和蛋白，檢測纖維化相關(guān)蛋白包括collagenI，fibronectin，PAI-1，α-SMA的mRNA，比較組間纖維化指標(biāo)的差異。2.表達(dá)TNC細(xì)胞的類型鑒定采用TNC的報(bào)告基因eGFP和多種間質(zhì)細(xì)胞的marker進(jìn)行免疫熒光共染，判斷TNC表達(dá)細(xì)胞是間質(zhì)細(xì)胞中的哪一群細(xì)胞。共染的marker包括間質(zhì)細(xì)胞的PDGFRβ、pericyte的NG2、巨噬細(xì)胞的F4/80、myofibroblast的α-SMA以及FSP-1。結(jié)果使用共聚焦顯微鏡觀察，判斷TNC表達(dá)的細(xì)胞是否是上述細(xì)胞群。由于發(fā)現(xiàn)在IR后纖維化的部位，eGFP陽性和F4/80陽性的細(xì)胞占很大比例，因此采用IR14天腎臟，200倍視野下隨機(jī)選取髓質(zhì)部位20個視野，計(jì)算所有間質(zhì)細(xì)胞以及eGFP陽性細(xì)胞和F4/80陽性細(xì)胞的比例。3.譜系追蹤方法采用TNC-CreER+/+的小鼠與報(bào)告基因小鼠R26-tdTomato+/+進(jìn)行交配，即可獲得TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-雙轉(zhuǎn)基因小鼠。正常情況下，該雙轉(zhuǎn)基因小鼠并不表達(dá)紅色熒光蛋白tdTomato，在tamoxifen的誘導(dǎo)下，表達(dá)TNC的細(xì)胞出現(xiàn)tdTomato表達(dá)而使細(xì)胞發(fā)紅色熒光。該小鼠報(bào)告基因tdTomato與TNC-CreER-eGFP自帶的報(bào)告基因eGFP的區(qū)別：前者需在tamoxifen的誘導(dǎo)下表達(dá)，且在tamoxifen和重組酶Cre同時(shí)存在的情況下給細(xì)胞帶上永久的標(biāo)記；后者不需要tamoxifen誘導(dǎo)，當(dāng)TNC表達(dá)上調(diào)時(shí)上調(diào)，TNC表達(dá)消失時(shí)消失。利用該小鼠造模后可直接熒光顯微鏡觀察特定時(shí)期的TNC表達(dá)細(xì)胞及譜系追蹤。于小鼠4周齡時(shí)予注射tamoxifen1.5mg/d*5d，經(jīng)過3個月的洗脫期，小鼠用于構(gòu)建UUO模型或者IR模型。UUO模型分為2組，組1術(shù)后未再次使用tamoxifen誘導(dǎo)，UUO7天留取腎臟組織直接觀察，tdTomato陽性的細(xì)胞代表術(shù)前原TNC陽性的細(xì)胞及其子代細(xì)胞；組2術(shù)后1-5天再次給予tamoxifen誘導(dǎo)，UUO7天留取腎臟組織直接觀察，tdTomato陽性細(xì)胞代表原TNC陽性細(xì)胞及其子代細(xì)胞，以及UUO過程中被誘導(dǎo)表達(dá)TNC的細(xì)胞。IR模型也分為2組，組1術(shù)后未再次使用tamoxifen誘導(dǎo)，IR14天留取腎臟組織直接觀察，tdTomato陽性的細(xì)胞代表術(shù)前原TNC陽性的細(xì)胞及其子代細(xì)胞；組2術(shù)后9-13天再次給予tamoxifen誘導(dǎo)，IR14天留取腎臟組織直接觀察，tdTomato陽性細(xì)胞代表原TNC陽性細(xì)胞及其子代細(xì)胞，以及IR9天后被誘導(dǎo)表達(dá)TNC的細(xì)胞。利用該方法可以判斷表達(dá)TNC的細(xì)胞是來源于原TNC陽性細(xì)胞的增殖，還是來自于其他細(xì)胞的誘導(dǎo)表達(dá)。通過tdTomato和α-SMA染色的共定位，可判斷原TNC陽性的細(xì)胞是否會變成myofibroblast。此外，為了判斷TNC-CreER誘導(dǎo)系統(tǒng)的leakage情況，我們在譜系追蹤研究前采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-雙轉(zhuǎn)基因小鼠，未予注射tamoxifen，判斷該小鼠在沒有tamoxifen誘導(dǎo)時(shí)存在多少的leakage。實(shí)施例3檢測腎組織、血清和尿液中的Tenascin-C，反應(yīng)急性腎損傷的嚴(yán)重程度1.臨床研究獲取于本中心腎活檢證實(shí)為急性腎小管壞死(ATN)的腎組織石蠟切片(n＝5)，行TNC免疫熒光染色，觀察ATN腎組織中TNC的表達(dá)情況。采用ELISA方法檢測血清和尿液中的Tenascin-C水平。2.實(shí)驗(yàn)動物研究腎臟IR后TNCmRNA的表達(dá)增加采用TNC-CreER-eGFP+/-小鼠，研究IR后TNC表達(dá)細(xì)胞增加及增加的位置分別采用TNC-CreER-eGFP+/-小鼠和TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，研究TNC基因缺失對IR腎損傷的影響采用同窩TNC-CreER-eGFP+/-(即TNC-/-)和野生型小鼠。所有小鼠均為129品系，養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，室內(nèi)溫度保持在25℃，晝夜明暗交替時(shí)間為12/12小時(shí)，自由飲食、飲水和活動。實(shí)驗(yàn)通過倫理委員會批準(zhǔn)，小鼠飼養(yǎng)者均獲得參與動物實(shí)驗(yàn)資格證。3.TNC-CreER；R26-tdTomato雙轉(zhuǎn)基因小鼠的獲取及實(shí)驗(yàn)采用TNC-CreER+/+的小鼠與報(bào)告基因小鼠R26-tdTomato+/+進(jìn)行交配，即可獲得TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-雙轉(zhuǎn)基因小鼠。TNC-CreER小鼠為本實(shí)驗(yàn)室制備，R26-tdTomato小鼠購自Jax實(shí)驗(yàn)室。正常情況下，該雙轉(zhuǎn)基因小鼠并不表達(dá)紅色熒光蛋白tdTomato，在tamoxifen的誘導(dǎo)下，表達(dá)TNC的細(xì)胞出現(xiàn)tdTomato表達(dá)而使細(xì)胞發(fā)紅色熒光。該小鼠報(bào)告基因tdTomato與TNC-CreER-eGFP自帶的報(bào)告基因eGFP的區(qū)別：前者需在tamoxifen的誘導(dǎo)下表達(dá)，且在tamoxifen和重組酶Cre同時(shí)存在的情況下給細(xì)胞帶上永久的標(biāo)記；后者不需要tamoxifen誘導(dǎo)，當(dāng)TNC表達(dá)上調(diào)時(shí)上調(diào)，TNC表達(dá)消失時(shí)消失。利用該小鼠造模后可直接熒光顯微鏡觀察特定時(shí)期的TNC表達(dá)細(xì)胞及譜系追蹤。4.腎臟缺血再灌注損傷模型的構(gòu)建本部分研究TNC基因缺失對IR腎損傷嚴(yán)重程度的影響采用單側(cè)腎臟切除+單側(cè)腎臟缺血再灌注損傷40min，獲得8-10周齡雄性小鼠，I/R前用5％水合氯醛麻醉(0.5g水合氯醛溶于10ml無菌生理鹽水，0.008ml/g小鼠體重)，術(shù)中鈍性分離右側(cè)腎臟，結(jié)扎腎蒂，切除腎臟，再鈍性分離左側(cè)腎臟周圍軟組織，定位腎動脈，血管夾夾閉，見腎臟立刻失去血供，變?yōu)樯n白，記錄腎臟缺血時(shí)間，傷口表面覆蓋鹽水紗布，將動物移至溫控板上，體表覆蓋干紗布。腎臟缺血40min后小心移除血管夾，肉眼觀察腎臟恢復(fù)灌注，逐層縫合腹腔。其他研究采用單側(cè)腎臟IR模型，獲得8-10周齡雄性小鼠，I/R前用5％水合氯醛麻醉，術(shù)中鈍性分離左側(cè)腎臟周圍軟組織，定位腎動脈，血管夾夾閉，見腎臟立刻失去血供，變?yōu)樯n白，記錄腎臟缺血時(shí)間，傷口表面覆蓋鹽水紗布，將動物移至溫控板上，體表覆蓋干紗布。腎臟缺血時(shí)間根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求決定，分別為35min、40min、50min、60min和70min，后小心移除血管夾，肉眼觀察腎臟恢復(fù)灌注，逐層縫合腹腔。5.IR后TNC誘導(dǎo)表達(dá)的變化趨勢和部位首先采用TNC-CreER+/-小鼠，構(gòu)建單側(cè)IR50min模型，分別于IR后2天、4天、6天和14天檢測腎臟TNC和eGFPmRNA水平(n＝5)，觀察TNCmRNA在IR的變化趨勢。其次采用TNC-CreER+/-小鼠，在IR后2天、7天和14天通過免疫熒光法檢測eGFP和TNC蛋白的表達(dá)水平及表達(dá)部位。再次采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，分別于IR前4周注射tamoxifen，IR后1、2天注射tamoxifen，IR后3、4天注射tamoxifen，IR后1、2、4、6天注射tamoxifen，均于IR后7天獲得小鼠腎臟標(biāo)本，直接觀察tdTomato陽性的細(xì)胞量及部位，分析不同時(shí)間TNCmRNA的誘導(dǎo)情況。6.IR后TNC誘導(dǎo)表達(dá)位置與損傷小管的關(guān)系采用TNC-CreER+/-小鼠，構(gòu)建單側(cè)IR50min模型，分別于IR后2天和14天留取腎臟冰凍標(biāo)本，采用eGFP抗體染色，觀察eGFP陽性部位周圍腎小管的損傷情況。實(shí)施例4急性期上調(diào)Tenascin-C的功能，減輕急性腎損傷的嚴(yán)重程度1.TNC影響急性腎損傷嚴(yán)重程度的研究方法采用同窩的TNC-/-和WT小鼠各至少20只，構(gòu)建單側(cè)腎切+單側(cè)腎臟缺血再灌注損傷(UN+UIR)模型，術(shù)后隔天記錄小鼠體重，體重減輕用體重下降百分比，即(當(dāng)天體重-基礎(chǔ)體重)/基礎(chǔ)體重表示，同時(shí)記錄自然死亡的小鼠；于IR2天、5天和7天分別取尚存活的小鼠每組各4只，留取血清，采用生化檢測儀檢測血清尿素氮，留腎臟標(biāo)本，秤腎臟的重量，一半留石蠟組織，另一半冰凍組織。石蠟切片PAS染色觀察急性腎小管壞死的嚴(yán)重程度。2.急性腎小管壞死嚴(yán)重程度的病理評價(jià)方法采用盲法原則由有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生完成。根據(jù)石蠟切片PAS染色，每個標(biāo)本在光鏡400倍下選取皮質(zhì)和外髓(不同標(biāo)本之間兩者選取比例一致)至少40個不重疊視野，判斷腎小管損傷程度。腎小管損傷定義為腎小管擴(kuò)張或小管上皮細(xì)胞脫落或細(xì)胞腫脹或者小管基底膜裸露，其嚴(yán)重程度根據(jù)損傷的比例分為5個級別：評分評分標(biāo)準(zhǔn)0分損傷腎小管小于5％1分損傷腎小管小于5％-25％2分損傷腎小管25％--50％3分損傷腎小管50-75％4分損傷腎小管超過75％3.統(tǒng)計(jì)分析小鼠術(shù)后的生存率差異采用K-M曲線表示，組間比較采用logrank方法檢驗(yàn)。體重的變化采用repeatedmeasurementANOVA分析，腎臟重量變化的比較和血清尿素氮的比較采用twowayANOVA分析，余連續(xù)變量的比較采用t檢驗(yàn)，分類變量的比較采用卡方檢驗(yàn)。本發(fā)明上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：一、檢測組織、血清和尿液中的Tenascin-C，反應(yīng)腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度1.CKD患者腎間質(zhì)纖維化時(shí)TNC表達(dá)升高取腎活檢組織證實(shí)存在腎間質(zhì)纖維化的石蠟切片，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)在輕度腎間質(zhì)纖維化時(shí)小管周圍的間質(zhì)即出現(xiàn)明顯的TNC表達(dá)，隨著間質(zhì)纖維化嚴(yán)重程度的增加，TNC的表達(dá)也增加，且無論是彌漫的間質(zhì)纖維化還是灶性的纖維化組織，TNC的表達(dá)均顯著增加。2.慢性腎臟纖維化時(shí)TNC的表達(dá)增加采用WT小鼠和TNC-/-小鼠，構(gòu)建UUO模型，發(fā)現(xiàn)在WT小鼠，隨著UUO時(shí)間的延長，TNCmRNA的表達(dá)逐漸升高，而TNC-/-小鼠TNC報(bào)告基因eGFPmRNA的結(jié)果也一致，兩者均說明隨著組織纖維化的加重，TNC基因轉(zhuǎn)錄逐漸增加。對腎組織進(jìn)行TNC及eGFP染色，結(jié)果表明纖維化后TNC蛋白及eGFP的表達(dá)也是顯著增加的。3.慢性腎臟纖維化過程中表達(dá)TNC的細(xì)胞明顯增加UUO是經(jīng)典的慢性腎間質(zhì)纖維化模型，采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠構(gòu)建UUO模型，并在術(shù)前2天至術(shù)后2天予tamoxifen誘導(dǎo)Cre基因重組。結(jié)果提示隨著UUO時(shí)間的延長，tdTomato陽性的細(xì)胞逐漸增多，增多的部位不僅位于腎髓質(zhì)，在腎皮質(zhì)部位也有顯著的tdTomato陽性細(xì)胞的增多。該結(jié)果進(jìn)一步證明在慢性腎間質(zhì)纖維化過程中，腎皮質(zhì)和髓質(zhì)均有明顯的TNC表達(dá)。二、抑制Tenascin-C的功能，減輕慢性腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展1.TNC基因缺失緩解慢性腎間質(zhì)纖維化采用WT及TNC-CreER+/+(即TNC-/-小鼠)，構(gòu)建UUO模型，發(fā)現(xiàn)和WT小鼠相比，TNC基因缺失可減輕腎間質(zhì)的纖維化，Masson染色纖維化評分明顯降低，巨噬細(xì)胞的浸入減少(F4/80陽性面積減少)，F(xiàn)SP-1陽性細(xì)胞的數(shù)量減少，纖維化相關(guān)指標(biāo)包括collagenI、fibronectin、PAI-1的mRNA水平也明顯降低。這些結(jié)果均提示TNC基因缺失可減輕慢性腎臟纖維化。2.表達(dá)TNC細(xì)胞的譜系追蹤既然TNC在慢性腎間質(zhì)纖維化過程中表達(dá)增加，且TNC基因缺失可明顯減輕腎臟纖維化，那么表達(dá)TNC的細(xì)胞來自于哪里呢？是原有TNC陽性細(xì)胞的增殖遷移還是其他間質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)？因此我們對表達(dá)TNC的細(xì)胞進(jìn)行譜系追蹤。首先采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，未給予tamoxifen誘導(dǎo)，構(gòu)建UUO10天/IR7天模型，判斷造模后該小鼠leakage的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)tdTomato陽性的細(xì)胞較造模前明顯增多，但與注射tamoxifen的小鼠相比，其陽性細(xì)胞的比例還是很小的。因此，我們繼續(xù)使用該小鼠，術(shù)前3月給予tamoxifen誘導(dǎo)TNC陽性腎間質(zhì)細(xì)胞基因重組而持續(xù)表達(dá)tdTomato紅色熒光蛋白，經(jīng)過3個月的洗脫期，構(gòu)建UUO模型。對照組tdTomato陽性的細(xì)胞主要位于腎乳頭部位，腎皮質(zhì)有散在少量的陽性細(xì)胞，位于腎小球鮑曼氏囊壁；若圍術(shù)期未再給予tamoxifen誘導(dǎo)，UUO7天腎髓質(zhì)部位的tdTomato陽性細(xì)胞明顯增多，說明UUO過程中tdTomato陽性細(xì)胞(即原TNC表達(dá)細(xì)胞)出現(xiàn)明顯增殖；若圍術(shù)期再次給予tamoxifen誘導(dǎo)，UUO7天腎髓質(zhì)和皮質(zhì)部位tdTomato陽性細(xì)胞增生較未再次tamoxifen誘導(dǎo)的小鼠更明顯，說明UUO過程中TNC的表達(dá)來源于其他細(xì)胞的誘導(dǎo)。類似地，在IR14天模型中，對照腎臟的tdTomato陽性細(xì)胞主要位于腎乳頭部位，術(shù)后未再次tamoxifen誘導(dǎo)，可見原TNC表達(dá)細(xì)胞出現(xiàn)增殖，若在IR9天后(腎小管壞死修復(fù)完成)再次予tamoxifen誘導(dǎo)，可見腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)tdTomato陽性細(xì)胞的增加更加明顯，提示在IR晚期纖維化過程中，仍有TNC被誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)TNC的細(xì)胞來源于其他非TNC表達(dá)細(xì)胞的誘導(dǎo)。3.腎髓質(zhì)TNC陽性細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化為myofibroblast細(xì)胞采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，術(shù)前3月給予tamoxifen誘導(dǎo)TNC陽性腎間質(zhì)細(xì)胞基因重組而持續(xù)表達(dá)tdTomato紅色熒光蛋白，經(jīng)過3個月的洗脫期，構(gòu)建IR模型，發(fā)現(xiàn)腎髓質(zhì)大部分α-SMA陽性(綠色熒光，eGFP在沒有抗體染色的情況下一般檢測不到綠色熒光)的myofibroblast均有紅色熒光蛋白，提示這些myofibroblast均來自原有TNC陽性間質(zhì)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)分化。三、檢測腎組織、血清和尿液中的Tenascin-C，反應(yīng)急性腎損傷的嚴(yán)重程度1.急性腎小管壞死患者TNC表達(dá)上調(diào)在人腎組織中，正常腎小管周圍很少有TNC的表達(dá)，當(dāng)發(fā)生ATN后，損傷腎小管周圍的TNC表達(dá)明顯上調(diào)，上調(diào)的水平與損傷的嚴(yán)重程度正相關(guān)。2.腎臟缺血再灌注損傷后TNC表達(dá)增加TNC-CreER-eGFP+/-小鼠急性缺血再灌注損傷后，TNCmRNA表達(dá)顯著增加，4天達(dá)高峰，6天開始下降，14天接近正常對照；TNC的報(bào)告基因eGFP的mRNA表達(dá)水平變化趨勢同TNCmRNA，IR后6天TNC的表達(dá)開始下降。免疫熒光提示表達(dá)eGFP的細(xì)胞顯著增加，其中以外髓及內(nèi)側(cè)皮質(zhì)增加明顯，IR后2天，eGFP陽性的細(xì)胞已明顯增加，皮髓交界線部位的增加尤其顯著；IR后14天，eGFP陽性的細(xì)胞較IR后2天明顯下降，但較正常小鼠仍增加，主要分布于外髓部位。3.TNC一過性誘導(dǎo)表達(dá)主要在IR后的1周采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，構(gòu)建單側(cè)IR模型，分別于不同時(shí)間注射tamoxifen，觀察tdTomato陽性細(xì)胞的數(shù)量及分布情況。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)IR前4周注射tamoxifen，經(jīng)過洗脫期后再構(gòu)建IR模型，結(jié)果tdTomato陽性的細(xì)胞僅輕度增加，增加的細(xì)胞主要來源于正常情況下固有TNC表達(dá)細(xì)胞的增殖或者少量leakage，分布于腎髓質(zhì)。當(dāng)圍術(shù)期給予tamoxifen誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)無論是IR后7天、14天、2月，tdTomato陽性的細(xì)胞均顯著增加，IR14天和IR7天相比，陽性細(xì)胞增多的數(shù)量并不顯著，提示TNC的誘導(dǎo)表達(dá)主要在前7天，IR2月可能因缺血時(shí)間較短(45minvs50min)，陽性細(xì)胞增加的數(shù)量較前者少。當(dāng)IR后全程注射tamoxifen誘導(dǎo)時(shí)，tdTomato陽性細(xì)胞較圍術(shù)期誘導(dǎo)雖有所增加，但范圍擴(kuò)大得并不明顯。當(dāng)留取腎臟標(biāo)本前4天注射tamoxifen誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)TNC的誘導(dǎo)表達(dá)主要在IR前7天，IR10天后TNC的誘導(dǎo)表達(dá)已經(jīng)顯著減少，IR28天時(shí)幾乎沒有TNC的誘導(dǎo)表達(dá)。由此可見，TNC的誘導(dǎo)表達(dá)主要發(fā)生在IR后的1周，結(jié)果和TNC及eGFPmRNA在IR后的變化趨勢相一致，且TNC的誘導(dǎo)表達(dá)主要位于腎臟皮髓交界線的兩側(cè)，越靠近外側(cè)腎臟皮質(zhì)，TNC的誘導(dǎo)表達(dá)越少，這和腎臟IR后損傷最嚴(yán)重的部位相一致，提示TNC誘導(dǎo)表達(dá)可能和腎臟急性缺血再灌注損傷的修復(fù)相關(guān)。比較IR圍術(shù)期即給予tamoxifen誘導(dǎo)和IR3天后再誘導(dǎo)，后者在髓質(zhì)部位TNC的誘導(dǎo)表達(dá)較少，提示IR后1-2天，TNC的誘導(dǎo)表達(dá)主要位于髓質(zhì)，3天后外移至皮髓交界線兩側(cè)，而在前2天有表達(dá)TNC的細(xì)胞其TNC表達(dá)已下調(diào)，說明TNC的一過性表達(dá)時(shí)間短暫。4.TNC的誘導(dǎo)表達(dá)與損傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)由于eGFP表達(dá)熒光較弱，因此我們采用TNC-CreER+/-；R26-tdTomato+/-小鼠，構(gòu)建單側(cè)不同嚴(yán)重程度的IR模型，觀察tdTomato陽性細(xì)胞的數(shù)量。當(dāng)IR前4周tamoxifen誘導(dǎo)時(shí)，不同缺血時(shí)間tdTomato陽性細(xì)胞的變化數(shù)量較正常對照變化均不明顯。當(dāng)圍術(shù)期tamoxifen誘導(dǎo)時(shí)，隨著缺血時(shí)間的增加，IR后2天tdTomato陽性細(xì)胞的數(shù)量也增加。當(dāng)IR時(shí)間均為50分鐘時(shí)，圍術(shù)期tamoxifen誘導(dǎo)的小鼠腎臟tdTomato陽性的細(xì)胞較術(shù)前4周誘導(dǎo)的明顯增多，說明TNC的表達(dá)不是來自于原TNC表達(dá)細(xì)胞的增殖，而是其他未表達(dá)TNC的細(xì)胞被誘導(dǎo)表達(dá)TNC。當(dāng)IR后3天開始tamoxifen誘導(dǎo)，7天觀察腎臟tdTomato陽性細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)缺血時(shí)間長的腎臟陽性細(xì)胞的數(shù)量也顯著增加。由此可見，TNC誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量與缺血再灌注損傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。5.表達(dá)TNC的細(xì)胞主要位于損傷腎小管的周圍IR后eGFP陽性的細(xì)胞一般圍繞著損傷的腎小管，在IR后2天，eGFP陽性的細(xì)胞圍繞的腎小管有上皮細(xì)胞的腫脹壞死，在IR后14天，修復(fù)好的腎小管已無eGFP陽性的細(xì)胞包圍，而在損傷較嚴(yán)重，仍有形態(tài)異常的腎小管周圍持續(xù)有eGFP陽性的細(xì)胞存在，表明TNC的表達(dá)還在誘導(dǎo)。由此可見，TNC表達(dá)于損傷的腎小管周圍可能和腎小管的修復(fù)密切相關(guān)。四、急性期上調(diào)Tenascin-C的功能，減輕急性腎損傷的嚴(yán)重程度，TNC基因缺失加重腎臟急性缺血再灌注損傷采用同窩TNC-CreER+/+小鼠(即TNC-/-小鼠)和TNC+/+小鼠，構(gòu)建單側(cè)腎臟切除+單側(cè)IR模型，發(fā)現(xiàn)TNC-/-小鼠生存率較野生型小鼠明顯降低，WT組在IR2天、5天和7天為獲得腎臟標(biāo)本各處死4只小鼠，整個觀察過程中未出現(xiàn)小鼠死亡；TNC-/-小鼠在IR2天、5天和7天也各處死3-4只小鼠，但整個觀察期死亡率超過50％以上。所有造模后TNC-/-小鼠體重下降更明顯，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死的小鼠腎臟腫脹更厲害，腎功能更差，病理腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎小管壞死更嚴(yán)重，存在顯著的差異腎乳頭部位有大量的管型；病理評分，IR2天時(shí)，WT組小鼠均1-2分，而TNC-/-小鼠均4分，IR7天時(shí)，WT組小鼠0-1分，而TNC-/-小鼠均2-3分。由此可見，TNC基因缺失顯著加重急性腎損傷的嚴(yán)重程度。當(dāng)前第1頁1 2 3