本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三維組織結(jié)構(gòu)體的制備方法及其應用。

背景技術(shù)：

醫(yī)療行業(yè)面臨著許多緊迫的問題。例如，每年都有大量患有嚴重心臟、腎臟、肝臟、肺等疾病的患者等待器官移植，而且由于可供移植的器官來源有限，其中大多數(shù)患者最終都因等不到移植而死亡。所以，對適用于創(chuàng)傷修復、組織增大、器官修復和器官置換的可植入組織和器官存在迫切的需求。此外，對能促進再生醫(yī)學和組織工程學技術(shù)應用的材料、工具和技術(shù)存在需求。與此同時，平均一種新藥的研發(fā)成本約是50億美元，歷時12年，其中大部分經(jīng)費和時間都花費在化合物篩選和藥物檢測階段。藥物安全性檢測是臨床前試驗與臨床試驗之間的一道重要環(huán)節(jié)。體外仿生的三維復雜組織模型對于藥物篩選、藥致器官損傷的機理研究和疾病治療等領(lǐng)域具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供細胞微球在制備組織結(jié)構(gòu)體中的應用；或細胞微球和基質(zhì)材料在制備組織結(jié)構(gòu)體中的應用。

上述應用中，所述組織結(jié)構(gòu)體為三維組織結(jié)構(gòu)體。

上述應用中，所述細胞微球的直徑為100～1000μm；所述基質(zhì)材料的直徑為50～1000μm。

上述應用中，所述細胞微球與基質(zhì)材料的質(zhì)量比為100:1～1:100。

上述應用中，所述細胞微球按照如下方法1)或2)或3)制備：

1)將細胞A懸浮于載體材料中，得到的細胞微球；

2)將涂覆材料均勻涂覆在1)制備的細胞微球表面，得到的細胞微球；

3)將細胞B均勻粘附在2)制備的細胞微球外周，得到的細胞微球；

所述細胞A和細胞B為相同的細胞或不同細胞。

上述應用中，所述細胞A或細胞B為如下細胞中的至少一種：神經(jīng)細胞、血管細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、全能干細胞、多能干細胞、專能干細胞、免疫細胞、軟骨細胞、骨來源細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、心肌細胞、肝細胞、肝來源的干細胞或祖細胞、肝巨噬細胞、星狀細胞、膽管上皮細胞、腫瘤細胞、肝竇內(nèi)皮細胞和其他各種組織和器官來源細胞；

所述基質(zhì)材料為基質(zhì)微絲材料或所述基質(zhì)材料為將細胞和基質(zhì)微絲材料混合得到的材料；

所述載體材料、所述基質(zhì)微絲材料和所述涂覆材料均為天然生物材料和/或人工合成生物材料；

所述天然生物材料為水凝膠生物材料，所述水凝膠生物材料為如下材料中的至少一種：明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、殼聚糖、層連接蛋白、纖連接蛋白和纖維蛋白；

所述人工合成生物材料為如下材料中的至少一種：聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙交酯、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯或聚氧化乙烯；

所述組織結(jié)構(gòu)體為器官或微器官；所述器官或微器官為肝、腎、胰、脾、肺、心肌、胃、輸尿管、泌尿?qū)Ч?、肝門十二指腸腸導管、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、尿道、腸、食道、膀胱、膽囊或其一部分。

上述應用中，所述載體材料具體為藻酸鹽，所述藻酸鹽尤其具體為海藻酸鈉溶液。

上述應用中，所述基質(zhì)微絲材料具體為藻酸鹽和明膠，所述基質(zhì)微絲材料尤其具體由海藻酸鈉溶液和明膠溶液組成。

上述應用中，所述細胞A具體為間充質(zhì)干細胞，更具體為脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

上述應用中，所述細胞B具體為內(nèi)皮細胞，更具體為人臍靜脈內(nèi)皮細胞。

上述應用中，所述細胞為內(nèi)皮細胞和/或成纖維細胞，更具體為人臍靜脈內(nèi)皮細胞和/或人表皮成纖維細胞。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種組織結(jié)構(gòu)體的制備方法。

本發(fā)明的組織結(jié)構(gòu)體的制備方法為以上述細胞微球和上述基質(zhì)材料為原料，制備組織結(jié)構(gòu)體。

上述方法中，所述方法的步驟為：將上述細胞微球和上述基質(zhì)材料進行生物打印，得到組織結(jié)構(gòu)體；

所述組織結(jié)構(gòu)體為器官或微器官；所述器官或微器官為肝、腎、胰、脾、肺、心肌、胃、輸尿管、泌尿?qū)Ч?、肝門十二指腸腸導管、輸卵管、子宮、氣管、支氣管、淋巴管、尿道、腸、食道、膀胱、膽囊或其一部分。

上述方法中，所述生物打印為三維生物打??；所述組織結(jié)構(gòu)體為三維組織結(jié)構(gòu)體。

上述方法中，所述三維生物打印方法是通過生物打印機將上述細胞微球和上述基質(zhì)材料進行生物打印的。

上述方法中，所述生物打印機為單噴頭生物3D打印機、雙噴頭生物3D打印機或多噴頭生物3D打印機。

上述方法中，所述通過單噴頭生物3D打印機將上述細胞微球和上述基質(zhì)材料進行生物打印包括如下步驟：將將上述細胞微球和上述基質(zhì)材料混合，得到混合物；將 所述混合物裝載到單噴頭生物3D打印機的注射器中；打印，得到所述三維組織結(jié)構(gòu)體；

所述通過雙噴頭生物3D打印機將上述細胞微球和上述基質(zhì)材料進行生物打印包括如下步驟：將上述細胞微球裝載到雙噴頭生物3D打印機的一個注射器中作為雙噴頭生物3D打印機的一個噴頭；將上述基質(zhì)材料裝載到雙噴頭生物3D打印機的另一個注射器中作為雙噴頭生物3D打印機的另一個噴頭；打印，得到所述三維組織結(jié)構(gòu)體。

所述通過多噴頭生物3D打印機將上述細胞微球和上述基質(zhì)材料進行打印包括如下步驟：將多種不同的上述細胞微球分別裝載到多噴頭生物3D打印機的多個注射器中作為多噴頭生物3D打印機的多個不同噴頭；將多種不同的基質(zhì)材料裝載到多噴頭生物3D打印機的另外多個注射器中作為多噴頭生物3D打印機的另外多個不同噴頭；打印，得到所述三維組織結(jié)構(gòu)體。

上述方法中，所述生物打印后還包括如下步驟：將生物打印得到的產(chǎn)物用交聯(lián)溶液浸泡處理，培養(yǎng)，得到所述三維組織結(jié)構(gòu)體。

上述方法中，所述交聯(lián)溶液為氯化鈣溶液；所述氯化鈣溶液的濃度為100mmol^-1～1000mmol^-1；所述浸泡處理的時間為10s～10min。

本發(fā)明的最后一個目的是提供由上述方法制備得到的組織結(jié)構(gòu)體。

上述組織結(jié)構(gòu)體在如下(1)-(5)中至少一種中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍：

(1)制備用于治療疾病或病癥的材料；

(2)制備組織修復或再生的材料；

(3)制備矯形或整形的材料；

(4)藥物開發(fā)、藥物篩選、藥物檢測或藥物測試；

(5)構(gòu)建藥理模型、病理模型、組織/器官模型或腫瘤模型。

本發(fā)明制備的組織結(jié)構(gòu)體的優(yōu)點是：

1、細胞存活率高

由于細胞微球的載體材料是生物材料水凝膠，具有粘彈性，在生物打印過程中保護微球內(nèi)部的細胞免受擠壓力的影響，而擠壓力正是生物打印過程中對細胞造成影響和傷害的最主要因素之一，因此本發(fā)明制備的組織結(jié)構(gòu)體的細胞存活率大大提高，接近常規(guī)二維細胞培養(yǎng)，而與普通生物打印工藝條件下存在顯著性差異。

2、可體外仿生復雜組織和器官的精細微結(jié)構(gòu)

由于細胞微球直徑穩(wěn)定在50-1000微米之間可調(diào)，最低可達到30-50微米，細胞微球中可包括一種或多種細胞，細胞微球外周可粘附另外一種或多種細胞，形成具有多種細胞共培養(yǎng)環(huán)境的精細結(jié)構(gòu)，是對體內(nèi)復雜微結(jié)構(gòu)，特別是小葉、小泡和島狀結(jié)構(gòu)的體外仿生結(jié)構(gòu)體；將數(shù)量可控的細胞微球組裝成的一個宏觀活性組織，是對體內(nèi) 復雜組織的體外仿生構(gòu)建結(jié)構(gòu)體。

3、可體外仿生體內(nèi)的復雜組織和器官

生物3D打印技術(shù)將一定數(shù)量和種類的細胞微球和一定數(shù)量和種類的基質(zhì)材料打印在計算機設(shè)定的空間位置，形成多種成分有機組合的多細胞仿生結(jié)構(gòu)體，是對體內(nèi)復雜組織的體外高度仿生構(gòu)建結(jié)構(gòu)體。

本發(fā)明通過生物3D打印技術(shù)將細胞微球和基質(zhì)材料打印在計算機設(shè)定的空間位置，形成多種成分有機組合的多細胞仿生三維組織結(jié)構(gòu)體，是對體內(nèi)復雜組織的體外高度仿生構(gòu)建結(jié)構(gòu)體。通過實驗證明：本發(fā)明的組織結(jié)構(gòu)體細胞存活率大大提高，不僅可應用于藥物開發(fā)、藥物篩選、藥物檢測、藥物測試、構(gòu)建藥理模型、病理模型、組織/器官模型和腫瘤模型，還可用于治療疾病或病癥、組織修復或再生以及矯形或整形的植入物。

附圖說明

圖1為細胞微球結(jié)構(gòu)的示意圖。其中，圖1A是無外殼細胞微球，1表示細胞，2表示載體材料；圖1B是有外殼微球，1表示細胞，2表示載體材料，3表示外殼材料，4表示外殼細胞。

圖2為細胞微球制備的示意圖。其中，圖2A是細胞微球制備裝置示意圖，11表示微量注射泵，12表示高壓發(fā)電器，13表示收集裝置；圖2B是海藻酸鹽/膠原細胞微球的照片；圖2C是海藻酸鹽/基質(zhì)膠細胞微球的照片。

圖3為單噴頭細胞微球三維打印設(shè)備示意圖。其中，21表示噴頭；22表示打印形成的含有細胞微球、單個細胞、細胞團簇和生長因子的基質(zhì)材料微絲；23表示可三維運動的成形平臺。

圖4為雙噴頭細胞微球三維打印設(shè)備示意圖。其中，31表示第一噴頭；32表示第二噴頭；33表示可三維運動的輔助成形微流控芯片。

圖5為使用本發(fā)明的方法三維打印得到的組織結(jié)構(gòu)體的照片。

圖6為本發(fā)明組織結(jié)構(gòu)體的生物學活性。其中，圖6A為與二維培養(yǎng)細胞相比，三維肝組織結(jié)構(gòu)體的白蛋白分泌隨著時間的變化；圖6B為與二維培養(yǎng)細胞相比，三維肝組織結(jié)構(gòu)體的尿素分泌隨著時間的變化。

圖7為二維種植細胞、細胞微球三維打印、細胞三維打印的細胞存活率。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

3％海藻酸鈉溶液的制備方法：將海藻酸鈉粉末與去離子水按照質(zhì)量比為3︰97的比例混合，在80℃條件下加熱3小時使其均勻溶解，之后分裝，于4℃或者-20℃低 溫保存。每次使用前在細胞培養(yǎng)箱中保溫10min后使其融化為均勻溶液。

海藻酸鈉粉末是Sigma公司的產(chǎn)品。

5％海藻酸鈉溶液的制備方法：將明膠粉末與去離子水按照質(zhì)量比為5︰95的比例混合，在80℃條件下加熱3小時使其均勻溶解，之后分裝，于4℃或者-20℃低溫保存。每次使用前在細胞培養(yǎng)箱中保溫20min后使其融化為均勻溶液。

明膠粉末是Sigma公司的產(chǎn)品。

DMEM培養(yǎng)液是hyclone公司的產(chǎn)品。

二維種植細胞、細胞三維打印組織結(jié)構(gòu)體在文獻“Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro.Zhao Y,Yao R,Ouyang L,Ding H,Zhang T,Zhang K,Cheng S,Sun W.Biofabrication.2014,6(3):035001”中公開過。

實施例1、細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體的制備方法

一、實驗儀器和材料的準備

1、實驗儀器

(1)細胞微球生成裝置

本發(fā)明的細胞微球生成裝置在文獻“Rui Yao,et al.,Alginate and alginate/gelatin microspheres for human adipose-derived stem cell encapsulation and differentiation,Biofabrication 4,2012”中公開過，主要包括三個部分：注射泵(微量注射泵)(如圖2A中的11所示)、高壓發(fā)電器(如圖2A中的12所示)和收集裝置(如圖2A中的13所示)。上述高壓發(fā)電器的型號為SA167-6，購自中國天津，具有0-40kV的ad/dc輸出電壓；上述注射泵為TS2-60，購自Longer Pump Ltd，泵送速度為0-90ml/分鐘；上述收集裝置的主要部分是有機玻璃盒，其前面是一塊滑動的玻璃。在上部面板的中間設(shè)置套管，平端注射針頭和注射管通過上述套管與注射泵相連接。上述套管確保是垂直的，并且協(xié)助調(diào)節(jié)針頭與固化溶液的距離。套管的底部是開口的，使得便于正電極連接。將具有把手的銅片嵌入到底部面板的中心，并將其與負電極相連。將位于培養(yǎng)皿中的固化溶液置于銅片之上。然后以特定的速率擠出含有細胞的載體溶液(例如海藻酸鹽、海藻酸鹽/明膠、海藻酸鹽/膠原溶液、海藻酸鈉/基質(zhì)膠溶液)，使得溶液落至固化溶液。

(2)生物三維打印機在文獻“Rui Yao,et al.,In Vitro Angiogenesis of 3D Tissue Engineered Adipose Tissue,Journal of Bioactive and Compatible Polymer,2009,24：5”中公開過。包括單噴頭生物3D打印機(單噴頭3D打印機的示意圖如圖3所示)、雙噴頭生物3D打印機(雙噴頭3D打印機的示意圖如圖4所示)和多噴頭生物3D打印機。多噴頭、雙噴頭生物3D打印機的結(jié)構(gòu)基本與單噴頭3D打印機相同，區(qū)別僅在于有兩 套或者多套噴頭系統(tǒng)(即包括兩個或者多個噴頭以及與各個噴頭相連的管路和獨立或者聯(lián)動的驅(qū)動機構(gòu))。

(3)聚二甲基硅氧烷微流控生物芯片在文獻“Juliana M.Chan，et al.,Engineering of In Vitro 3D Capillary Beds by Self-Directed Angiogenic Sprouting,PLOS ONE,2012,7(12):e50582”中公開過。

2、實驗材料

(1)脂肪來源間充質(zhì)干細胞(hADSC)是Invitrogen公司的產(chǎn)品。

(2)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)是Invitrogen公司的產(chǎn)品。

(3)人表皮成纖維細胞(HDF)是ScienCell公司的產(chǎn)品。

二、細胞微球的制備

1、I型膠原/海藻酸鈉細胞微球的制備

將0.2mL的I型膠原溶液(4mg/mL)輕柔地加入到7mL海藻酸鈉溶液(2.5％)(Sigma-Aldrich)，將PH調(diào)節(jié)至7.2，得到膠原/海藻酸鈉溶液，將其作為細胞微球的載體材料。

將hADSC細胞均勻懸浮于上述膠原/海藻酸鈉溶液，使其密度為10⁶細胞/mL，然后通過上述細胞微球生成裝置來產(chǎn)生細胞微球。細胞微球生成裝置的參數(shù)為10kV電壓、10mL/h的推送速率、35mm電極距離以及27號針。從固化溶液中收集細胞微球后，將其用PBS溶液(Sigma-Aldrich)清洗兩次，然后在增殖培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)中培養(yǎng)3天，再在分化培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清、1μM地塞米松、10μg/ml胰島素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX的DMEM培養(yǎng)液)中培養(yǎng)16天。在實驗過程中培養(yǎng)基每2-3天更換一次。圖1A為根據(jù)上述方法制備得到的細胞微球的示意圖，圖2B為根據(jù)上述方法制備得到的I型膠原/海藻酸鈉細胞微球的照片。

2、基質(zhì)膠/海藻酸鈉細胞微球的制備

在冰上將1mL的基質(zhì)膠溶液(在DMEM培養(yǎng)液中15倍稀釋)輕柔地加入到1mL海藻酸鈉溶液(6％)(Sigma-Aldrich)，得到基質(zhì)膠/海藻酸鈉溶液，將其作為細胞微球的載體材料。

將hADSC細胞均勻懸浮于上述基質(zhì)膠/海藻酸鈉溶液中，使其密度為10⁶細胞/mL，然后通過細胞微球生成裝置來產(chǎn)生細胞微球。細胞微球生成裝置的參數(shù)為10kV電壓、10mL/h的推送速率、35mm電極距離以及27號針。從固化溶液中收集細胞微球后，將其用PBS溶液清洗兩次，然后在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，再在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)16天。在實驗過程中培養(yǎng)基每2-3天更換一次。圖2C為根據(jù)上述方法制備得到的基質(zhì)膠/海藻酸鈉細胞微球的照片。

3、外周粘附細胞的I型膠原/海藻酸鈉細胞微球的制備

將0.2mL的I型膠原溶液(4mg/mL)輕柔地加入到7mL海藻酸鈉溶液(2.5％)(Sigma-Aldrich)，將PH調(diào)節(jié)至7.2，得到膠原/海藻酸鈉溶液，將其作為細胞微球的載體材料。

將hADSC細胞均勻懸浮于上述膠原/海藻酸鈉溶液，使其密度為10⁶細胞/mL，然后通過上述細胞微球生成裝置來產(chǎn)生細胞微球。細胞微球生成裝置的參數(shù)為10kV電壓、10mL/h的推送速率、35mm電極距離以及27號針。從固化溶液中收集細胞微球后，將其用PBS溶液(Sigma-Aldrich)清洗兩次，然后在增殖培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液)中培養(yǎng)3天，再在分化培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清、1μM地塞米松、10μg/ml胰島素，200μM吲哚美辛和0.5mM IBMX的DMEM培養(yǎng)液)中培養(yǎng)16天。第17天時，將在1mL的I型膠原溶液(0.2mg/mL)與細胞微球均勻混合后在室溫下靜置30min，使膠原纖維通過自組裝作用在細胞微球表面均勻涂覆一層。之后將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ScienCell公司產(chǎn)品)以10⁵細胞/mL的密度均勻懸浮在內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基中(ScienCell公司產(chǎn)品)形成內(nèi)皮細胞懸浮液，將1mL內(nèi)皮細胞懸浮液與細胞微球均勻混合，并在共培養(yǎng)培養(yǎng)基(內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基與分化培養(yǎng)基1:1混合)中共培養(yǎng)3天，形成內(nèi)皮細胞均勻粘附在膠原/海藻酸鈉細胞微球的外周。實驗過程中培養(yǎng)基每2-3天更換一次。圖1B為根據(jù)上述方法制備得到的含有外周粘附細胞的細胞微球的示意圖。

三、單噴頭細胞微球組織結(jié)構(gòu)體的制備方法

1、將密度為10⁶個細胞/mL的hADSC細胞與3％的海藻酸鈉溶液(細胞微球載體材料)均勻混合后，加入到上述細胞微球生成裝置中，生產(chǎn)得到細胞微球。裝置的參數(shù)為：7kV電壓、15mL/h推進速度、45mm液面高度、27#針頭。

2、將密度為10⁵個細胞/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)(購自Invitrogen)與基質(zhì)微絲材料均勻混合，得到含HUVEC的基質(zhì)材料；上述基質(zhì)微絲材料的制備方法：將0.5％的海藻酸鈉與5％的明膠按照體積比為1:1的比例混合，得到基質(zhì)微絲材料。

3、將步驟1中得到的細胞微球與步驟2中得到的含HUVEC的基質(zhì)材料按質(zhì)量比1:1的比例混合，得到混合物，將其裝載到1mL一次性無菌注射器中，利用壓力擠出單噴頭生物3D打印機，在步進電機速度2mm/s，掃描速度10mm/s的參數(shù)條件下，在無菌的平面平臺上三維打印，形成體積為1cm/1cm/0.5cm的預凝膠組織結(jié)構(gòu)體。

4、用100mmol^-1的氯化鈣溶液浸泡上述預凝膠組織結(jié)構(gòu)體30s，完成交聯(lián)過程，之后用生理鹽水潤洗三次，得到單噴頭細胞微球組織結(jié)構(gòu)體；將其培養(yǎng)在添加20％FBS的DMEM培養(yǎng)液的生物反應器中37℃浸泡培養(yǎng)

四、雙噴頭細胞微球組織結(jié)構(gòu)體的制備方法

1、將密度為10⁶個細胞/mL的hADSC細胞與3％的海藻酸鈉溶液(細胞微球載體材料)均勻混合后，加入到上述細胞微球生成裝置中，生產(chǎn)得到細胞微球。裝置的參數(shù)為：7kV電壓、15mL/h推進速度、45mm液面高度、27#針頭。

2、將密度為5000個細胞/mL的步驟1得到的細胞微球與添加20％FBS的DMEM培養(yǎng)基均勻混合，得到待打印的細胞微球，將其裝載到1mL一次性無菌注射器中作為雙噴頭生物3D打印機的一個噴頭(細胞微球噴頭)。

3、將密度為10⁵個細胞/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)(購自ScienCell)與基質(zhì)微絲材料(0.5％的海藻酸鈉與5％的明膠混合物按體積比1:1的比例混合)均勻混合，得到含有HUVEC的基質(zhì)材料，將其裝載到1mL一次性無菌注射器中作為雙噴頭生物3D打印機的另一個噴頭(基質(zhì)材料噴頭)。

4、采用雙噴頭生物3D打印機，在計算機軟件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，將待打印的細胞微球和基質(zhì)材料分別打印在特定位置，在無菌的平面平臺上三維打印，形成體積為1cm/1cm/0.5cm的預凝膠組織結(jié)構(gòu)體。其中細胞微球噴頭為壓電驅(qū)動，二次方曲線驅(qū)動波形，電壓100V，80Hz振動頻率；基質(zhì)材料噴頭采用壓力擠出驅(qū)動，在步進電機速度2mm/s，掃描速度10mm/s的參數(shù)條件下完成打印。

5、用100mmol^-1的氯化鈣溶液浸泡預凝膠組織結(jié)構(gòu)體30s，完成交聯(lián)過程，之后用生理鹽水潤洗三次，得到雙噴頭細胞微球組織結(jié)構(gòu)體，將其培養(yǎng)在添加20％FBS的DMEM培養(yǎng)液的生物反應器中。

五、多噴頭細胞微球組織結(jié)構(gòu)體的制備方法

1、將密度為10⁶個細胞/mL的hADSC細胞與3％的海藻酸鈉溶液(細胞微球載體材料)均勻混合后，加入到上述細胞微球生成裝置中，生產(chǎn)得到細胞微球。裝置的參數(shù)為：7kV電壓、15mL/h推進速度、45mm液面高度、27#針頭。

2、將密度為5000個細胞/mL的步驟1得到的細胞微球與添加20％FBS的DMEM培養(yǎng)基均勻混合，得到待打印的細胞微球，將其裝載到1mL一次性無菌注射器中作為多噴頭生物3D打印機的一個噴頭(細胞微球噴頭)。

3、將密度為10⁶個細胞/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)(購自ScienCell)與基質(zhì)微絲材料(0.5％的海藻酸鈉與5％的明膠混合物按體積比1:1的比例混合)均勻混合，得到含有HUVEC的基質(zhì)材料，將其裝載到1mL一次性無菌注射器中作為多噴頭生物3D打印機的另一個噴頭(基質(zhì)材料噴頭1)。

4、將密度為10⁶個細胞/mL的人表皮成纖維細胞(HDF)(購自ScienCell)與基質(zhì)微絲材料(1％的海藻酸鈉與15倍稀釋的基質(zhì)膠按體積比1:1的比例混合)均勻混合，得到含有HDF的基質(zhì)材料，將其裝載到1mL一次性無菌注射器中作為多噴頭生 物3D打印機的第三個噴頭(基質(zhì)材料噴頭2)。

5、采用多噴頭細胞打印機，在計算機軟件(Microsoft,AT640,Redmond,WA)控制下，將步驟2、3、4中待打印的細胞微球和基質(zhì)材料分別打印在特定位置，在無菌的平面平臺上三維打印，形成體積為1cm/1cm/0.5cm的預凝膠組織結(jié)構(gòu)體。其中細胞微球噴頭為壓電驅(qū)動，二次方曲線驅(qū)動波形，電壓100V，80Hz振動頻率；基質(zhì)材料噴頭采用壓力擠出驅(qū)動，在步進電機速度2mm/s，掃描速度10mm/s的參數(shù)條件下完成打印。

6、用100mmol^-1的氯化鈣溶液浸泡預凝膠組織結(jié)構(gòu)體30s，完成交聯(lián)過程，之后用生理鹽水潤洗三次，得到多噴頭細胞微球組織結(jié)構(gòu)體，將其培養(yǎng)在添加20％FBS的DMEM培養(yǎng)液的生物反應器中。

六、借助芯片的細胞微球組織結(jié)構(gòu)體的制備方法

1、制備聚二甲基硅氧烷微流控生物芯片

使用本領(lǐng)域公知的光刻蝕和軟光刻的方法制備聚二甲基硅氧烷微流控生物芯片。采用AutoCAD 2009軟件(Autodesk,San Rafael,CA)設(shè)計芯片裝置的構(gòu)圖，之后采用高分辨率打印機(深圳市路維電子有限公司)將芯片裝置的負模印刷在透明掩膜表面。采用標準的光刻蝕技術(shù)制備晶片(Seoulin Biosciences,Seoul,South Korea)。具體步驟如下：

(1)將SU-8光致抗蝕劑均勻旋涂在清潔的硅晶片表面；

(2)將光掩模放置在晶片上方，通過紫外光照射交聯(lián)暴露部分的SU-8光致抗蝕劑。晶片形成后經(jīng)過硬化、清洗、風干等步驟形成母模。

(3)制備微流控芯片裝置

將聚二甲基硅氧烷(Sylgard 184,Dow Corning,Midland,MI)彈性體脫氣后倒入晶片，并在80℃的烤箱內(nèi)過夜烘烤形成聚合的聚二甲基硅氧烷芯片裝置。將聚二甲基硅氧烷芯片從硅晶片上剝離，切除邊角，用壓縮空氣清洗、高溫滅菌后備用。使用前30min之內(nèi)采用等離子處理機(Harrick Expanded Plasma Cleaner,Harrick Plasma,Ithaca,NY)處理聚二甲基硅氧烷芯片2min以提高其親水性和細胞親和力。

2、將密度為10⁶個細胞/mL的hADSC細胞與3％的海藻酸鈉溶液(細胞微球載體材料)均勻混合后，加入到上述細胞微球生成裝置中，生產(chǎn)得到細胞微球。裝置的參數(shù)為：7kV電壓、15mL/h推進速度、45mm液面高度、27#針頭。

3、將密度為10⁵個細胞/mL的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)(購自Invitrogen)與基質(zhì)微絲材料(0.5％的海藻酸鈉與5％的明膠混合物按體積比為1:1混合)均勻混合，得到含有HUVEC的基質(zhì)材料。

4、將步驟2中得到的細胞微球與步驟3中得到的含HUVEC的基質(zhì)材料按質(zhì)量比 1:1的比例混合，得到混合物，將混合物裝載到1mL一次性無菌注射器中，利用壓力擠出單噴頭生物3D打印機，在步進電機速度2mm/s，掃描速度10mm/s的參數(shù)條件下，將所述混合物打印到聚二甲基硅氧烷芯片的預定位置。采用等離子處理機(Harrick Expanded Plasma Cleaner,Harrick Plasma,Ithaca,NY)處理蓋玻片(泰州市華億康醫(yī)療器械有限)2min以提高其親水性和細胞親和力。將蓋玻片與聚二甲基硅氧烷芯片輕壓封片后形成體積與芯片對應的預凝膠組織結(jié)構(gòu)體。

5、在微流控生物芯片中，以10mL/h流速，用100mmol^-1的氯化鈣溶液浸泡預凝膠組織結(jié)構(gòu)體10s，完成交聯(lián)過程，之后用生理鹽水潤洗三次，得到借助芯片的細胞微球組織結(jié)構(gòu)體，將其在芯片流體條件下培養(yǎng)在添加20％FBS的DMEM培養(yǎng)液中。

實施例2、細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體的細胞存活率測定

本發(fā)明的細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體細胞存活率的檢測方法有兩種：

一、細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體熒光染色死活檢測

利用Calcein-AM細胞活性試劑盒(SIGMA)檢測細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體中細胞存活率，具體步驟如下：

1、將1μM Calcein-AM和2μM碘化丙啶配置為熒光染液，采用磷酸緩沖液分別輕柔清洗實施例1中制備的多噴頭細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體(細胞微球三維打印)、二維種植細胞(二維種植)、細胞三維打印組織結(jié)構(gòu)體(細胞三維打印)3次后，避光浸泡在熒光染液中15min。

2、采用激光共聚焦顯微鏡(LSM710META,Zeiss)分析獲取紅色和綠色熒光圖片。

3、采用Image Pro Plus軟件的圖像分析計數(shù)功能計算細胞存活率：綠色細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

二、組織結(jié)構(gòu)體溶解為二維細胞/材料混合物熒光染色死活檢測

利用Calcein-AM細胞活性試劑盒(SIGMA)檢測細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體中細胞存活率，具體步驟如下：

1、將1μM Calcein-AM和2μM碘化丙啶配置為熒光染液，采用磷酸緩沖液輕柔清洗實施例1中制備的多噴頭細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體(細胞微球三維打印)、二維種植細胞(二維種植)、細胞三維打印組織結(jié)構(gòu)體(細胞三維打印)3次后，加入55mM檸檬酸鈉溶解結(jié)構(gòu)體和細胞微球。

2、1000rpm，10min離心收集細胞，將細胞避光懸浮在熒光染液中15min。

3、采用熒光顯微鏡(Nikon 90I,Nikon)分析獲取紅色和綠色熒光圖片。

4、采用Image Pro Plus軟件的圖像分析計數(shù)功能計算細胞存活率：綠色細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

方法一的檢測結(jié)果如圖7所示：二維種植細胞(二維種植)的存活率95％±0.8％，細胞微球三維打印組織結(jié)構(gòu)體(細胞微球三維打印)中細胞存活率為93％±1.5％，且與二維細胞種植結(jié)果相比沒有顯著性差異；細胞三維打印組織結(jié)構(gòu)體(細胞三維打印)的細胞存活率為91％±1.2％，且與二維種植細胞(二維種植)結(jié)果和細胞微球三維打印組織結(jié)構(gòu)體(細胞微球三維打印)相比都有顯著性差異。方法二的檢測結(jié)果和方法一無顯著差異。

實施例3、細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體的生物活性測定

本實施例在不同時間點收集實施例1中單噴頭細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體，通過測定其細胞代謝活性來確定本發(fā)明的組織結(jié)構(gòu)體的生物學活性。以二維種植細胞為對照，二維種植細胞使用常規(guī)二維培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)方法(常規(guī)二維培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)方法在文獻“Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro.Zhao Y,Yao R,Ouyang L,Ding H,Zhang T,Zhang K,Cheng S,Sun W.Biofabrication.2014,6(3):035001”中公開過)培養(yǎng)得到二維培養(yǎng)物。

分別在培養(yǎng)后第1、2、3、4和5天收集單噴頭細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體和二維培養(yǎng)物，3000rpm離心5分鐘，使用Hitachi 7600系列自動生化分析儀(Hitachi,Tokyo,Japan)來分析單噴頭細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體和二維培養(yǎng)物的白蛋白(ALB)和尿素(UREA)分泌情況。

部分結(jié)果如圖6所示：圖6A為二維培養(yǎng)細胞與三維組織結(jié)構(gòu)體的白蛋白分泌隨著時間的變化；圖6B為二維培養(yǎng)細胞與三維組織結(jié)構(gòu)體的尿素分泌隨著時間的變化。結(jié)果表明：在相同條件下培養(yǎng)的三維組織結(jié)構(gòu)體的生物學活性顯著高于二維培養(yǎng)物。

雙噴頭生物3D打印機準備的三維組織結(jié)構(gòu)體和多噴頭生物3D打印機準備的三維組織結(jié)構(gòu)體與單噴頭生物3D打印機準備的三維組織結(jié)構(gòu)體的生物活性無顯著差異。

實施例4、細胞微球三維組織結(jié)構(gòu)體在檢測藥物毒性中的應用

將實施例1中步驟四的雙噴頭生物3D打印機準備的三維組織結(jié)構(gòu)體在制備完成并培養(yǎng)10天后進行藥物毒性檢測。具體步驟如下：

1、采用磷酸緩沖液輕柔清洗雙噴頭生物3D打印機準備的三維組織結(jié)構(gòu)體3次，分別加入血藥濃度的降脂藥物--非諾貝特(DMEM培養(yǎng)基+200μM棕櫚酸+25μM非諾貝特)、DMEM培養(yǎng)基(正常培養(yǎng)組)、普通非諾貝特(DMEM培養(yǎng)基+25μM非諾貝特)，培養(yǎng)48h后，分別從培養(yǎng)基中取出雙噴頭生物3D打印機準備的三維組織結(jié)構(gòu)體。

2、分別將取出雙噴頭生物3D打印機準備的三維組織結(jié)構(gòu)體3000rpm離心5分 鐘，使用Hitachi 7600系列自動生化分析儀(Hitachi,Tokyo,Japan)來分析樣品的白蛋白(ALB)分泌情況，以檢測藥物對其的急性毒性。

檢測結(jié)果如圖6所示：在24h、48h、72h、96h、120h時，二維種植細胞和細胞微球三維打印結(jié)構(gòu)體分泌的白蛋白濃度分別為0.1、2、1.1、1.3、0.8μg/mL和5、4.9、5.1、12.4、22.3μg/mL。