本發(fā)明屬生物醫(yī)學類技術領域，涉及Wip1抑制劑CCT007093在制備治療肝再生不足疾病藥物中的應用。

背景技術：
肝臟是人體中具有最強再生能力的組織器官，然而在許多急慢性肝病中，仍然會出現(xiàn)肝細胞再生抑制導致再生不足，嚴重影響健康甚至生命。如肥胖相關的非酒精性脂肪肝再生能力受到損害，更易受到酒精及病毒的作用而出現(xiàn)肝硬化，原位移植物為脂肪肝時，由于肝再生受到抑制，移植病人存活率降低；再生障礙性和爆發(fā)性肝衰竭病人由于缺乏有效的肝再生而導致死亡；肝細胞增殖能力下降導致酒精性肝炎病人死亡率上升；肝再生抑制是老齡化人群肝臟的典型表征，由此導致的>65歲人群肝病死亡率占人群死亡率比例是<45歲人群的4-5倍。此外，肝硬化肝癌更是對人類健康產(chǎn)生嚴重威脅的致死性疾病，在我國僅因慢性肝炎導致肝硬化致死的病人每年就有28萬，肝臟移植為晚期肝硬化和肝癌唯一的治療手段，對肝臟同種異體移植物需求的增長速度遠遠大于實際的供體數(shù)，致使等待肝移植的人數(shù)增加，肝臟先天具備再生能力使得將小體積移植物應用于肝臟移植。然而臨床經(jīng)驗顯示，移植時嚴重失代償?shù)氖荏w往往在圍手術期死亡率明顯升高，這種病人的不良結果提示，其中一些過程是抑制再生造成的。因此，尋找有效的促進肝再生藥物成為以上臨床急慢性肝臟病人的需要。肝臟再生調控是一個復雜的多分子參與過程，為了闡明這種復雜過程的調節(jié)機制，科研人員最常用的模型為小鼠三分之二肝切除術及小鼠肝臟毒性損傷。作為唯一能夠觀察哺乳動物體內(nèi)細胞進程的模型，小鼠三分之二肝臟切除術被研究人員認為是最為實用的再生模型，在肝再生研究中使用也最為廣泛。綜合肝再生機制研究發(fā)現(xiàn)肝臟的再生主要由三大部分調節(jié)網(wǎng)絡構成，即細胞因子調控網(wǎng)絡，生長因子調控網(wǎng)絡和代謝調控網(wǎng)絡。TNFα、IL-6等細胞因子第一時間參與肝臟再生的啟動調控；肝素結合性表皮生長因子(heparin-bindingEGF-likegrowthfactor)，雙調蛋白(amphiregulin)等生長因子緊隨其后促進肝臟再生的進行，mTOR-PS6K信號通路主導了代謝通路調控。Wip1(Wild-typep53-inducedphosphatase)是一種核蛋白，為絲氨酸/蘇氨酸特異蛋白磷酸酶2C型家族中的一員，由PPM1D(proteinphosphatasemagnesium-dependent1delta)基因編碼。作為一個磷酸酶，Wip1基因于1997年被發(fā)現(xiàn)，它的發(fā)現(xiàn)及命名都依賴于大名鼎鼎的原癌基因P53，這和它的功能--抑制P53蛋白的磷酸化相關。隨后Wip1大量下游蛋白相繼發(fā)現(xiàn)，如P38,ARF,ATR,CHK1,ATM,CHK2,MDM2,UNG2,NFκB,γH2X。在許多人類癌癥，如乳腺癌、卵巢透明細胞腺癌、成神經(jīng)細胞瘤、髓母細胞瘤、胃癌、胰腺癌中均檢測到Wip1DNA和RNA的過表達，而敲除PPM1D基因的小鼠能夠抵抗乳腺癌的發(fā)生，提示W(wǎng)ip1基因是一個致癌基因。Wip1在生理病理中的作用越來越受到科研人員的關注。近年來人們在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)敲除Wip1基因可通過ATM-mTOR信號通路影響細胞自嗜功能有效抑制動脈粥樣硬化的形成，在其癌癥功能領域研究亦發(fā)現(xiàn)其可調控DNA甲基化參與癌癥生成的調節(jié)。鑒于Wip1敲除小鼠可正常出生并發(fā)育，科研工作者將Wip1作為癌癥和動脈粥樣硬化的藥物靶點。但在肝臟組織中，Wip1的作用尚不知曉。Wip1抑制劑CCT007093為小分子化合物，CASnumber176957-55-4,分子量272.38518，化學命名為2,5-bis-(2-Thienylidene)cyclopentanone,，分子式為C15H12OS2,化學結構如下：2008年在對高表達Wip1腫瘤細胞的小分子化合物篩選中被發(fā)現(xiàn)，其可特異性殺死高表達Wip1蛋白的腫瘤細胞如乳腺癌細胞，卵巢透明細胞癌細胞。但其在體內(nèi)是否具有Wip1磷酸酶抑制效果尚未有文獻報道。在本項專利中，我們首次發(fā)現(xiàn)CCT007093在肝再生相關疾病中的應用。具體的，本專利發(fā)現(xiàn)CCT007093在體內(nèi)可發(fā)揮抑制Wip1去磷酸化的作用,加速肝臟再生，降低大部分切肝術后死亡率，同時并未引起再生肝臟組織及再生肝臟中炎癥細胞的改變。本項專利亦揭示了其用于肝再生相關疾病的作用機制。CCT007093在肝臟再生過程中抑制Wip1蛋白的去磷酸化作用，Wip1以mTOR為靶蛋白抑制肝臟損傷后再生。本項專利亦首次揭示mTOR為Wip1的靶蛋白。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對上述問題，提出了Wip1抑制劑CCT007093在制備治療肝再生不足疾病藥物中的應用。本發(fā)明以70﹪切肝術建立小鼠肝再生模型，小鼠肝臟可在11天恢復切肝前比重，符合肝再生表現(xiàn)，造模成功。我們發(fā)現(xiàn)抑制Wip1基因表達可促進肝臟組織再生。抑制Wip1基因表達激活了mTOR-PS6K-PS6信號通路，促進細胞增殖。進一步實驗表明Wip1蛋白可直接去磷酸化mTOR。本發(fā)明首次揭示mTOR為Wip1磷酸酶靶點。同時我們發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)給予Wip1抑制劑CCT007093可起相同的實驗效果，并且CCT007093可提高大部分切肝術后小鼠的生存率。以上實驗結果揭示了CCT007093在促進肝臟再生中的作用及機理。CCT007093的有效用量為3.2mg/kg，藥物配成溶劑，以腹腔注射方式給藥。該劑量可促進小鼠70﹪肝切除術后肝再生并顯著提高80﹪肝切除術后小鼠存活率。本發(fā)明的有益效果是CCT007093能夠促進肝臟組織再生，在肝臟組織大部分丟失時降低死亡率。CCT007093可促進肝臟細胞增殖，增加再生肝臟比重。CCT007093通過直接激活mTOR信號通路促進細胞增殖。本發(fā)明揭露了CCT007093可用于制備治療肝臟再生不足相關疾病的藥物，以及CCT007093用于促進肝臟再生的作用機制。附圖說明圖1為Wip1基因敲除可增加再生肝臟比重；圖2為Wip1基因敲除可增加BRDU標記再生肝細胞數(shù)目；圖3為Wip1基因敲除可增加再生肝臟細胞有絲分裂指數(shù)；圖4為Wip1基因敲除可增加再生肝臟中增殖細胞核蛋白抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen，PCNA)表達水平；圖5為Wip1基因敲除可增加再生肝臟中細胞周期蛋白cyclinD蛋白表達水平；圖6為Wip1基因敲除激活再生肝臟中蛋白合成通路和脂肪酸調控通路；圖7為Wip1基因敲除激活再生肝臟中mTOR-P70S6K信號通路；圖8為mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin；Rapa)可逆轉Wip1基因敲除小鼠中再生肝臟比重增加表型；圖9為mTOR抑制劑雷帕霉素可逆轉Wip1基因敲除小鼠再生肝臟中PCNA表達增高表型；圖10為饑餓后給胰島素刺激可激活HT293細胞內(nèi)mTOR蛋白活性(磷酸化mTOR表達升高)；圖11為在激活mTOR蛋白的細胞內(nèi)轉染W(wǎng)ip1cDNA可降低細胞內(nèi)mTOR信號通路活性(磷酸化mTOR及其下游磷酸化PS6蛋白的表達)圖12為Wip1和mTOR蛋白可直接相互結合，Wip1和PS6K蛋白不存在相互結合；圖13為體外磷酸酶實驗證實Wip1去磷酸化mTORSer2448,Ser2481兩個位點，且該去磷酸化作用可被Wip1抑制劑CCT007093抑制；圖14為CCT007093在小鼠體內(nèi)抑制Wip1去磷酸化作用劑量實驗設計圖；圖15為以磷酸化p53蛋白的表達為檢測指標，檢測三種實驗設計摸索CCT007093在小鼠體內(nèi)腹腔注射抑制Wip1蛋白磷酸化實驗；圖16為CCT007093在小鼠體內(nèi)可激活mTOR信號通路(Ser2448,Ser2481,Ser2159三個mTOR磷酸化位點及下游蛋白磷酸化P70S6K(T389),磷酸化S6(Ser235/236)蛋白的表達)；圖17為CCT007093在293T細胞系激活mTOR信號通路劑量效應關系；對照組(DMSO)，25μMCCT組，50μMCCT組,隨著CCT劑量的增加，mTOR信號通路(Ser2448,Ser2481,Ser2159三個mTOR磷酸化位點及下游蛋白磷酸化P70S6K(T389),磷酸化S6(Ser235/236)蛋白的表達)越來越高；圖18為CCT007093可提高再生肝臟比重；圖19為CCT007093可增加再生肝臟中PCNA表達水平；圖20為CCT007093可提高大部分切肝術后小鼠的存活率；圖21為大部分切肝術后小鼠的存活率與肝比重存在相關性；圖22為腹腔注射CCT007093并未引發(fā)小鼠白細胞亞群(中性粒細胞，淋巴細胞，單核細胞)的絕對數(shù)目改變；圖23為腹腔注射CCT007093并未引發(fā)小鼠白細胞亞群(中性粒細胞，淋巴細胞，單核細胞)的比例改變；圖24為腹腔注射CCT007093并未引發(fā)小鼠大部分切肝術后肝組織結構的病理改變；圖25為腹腔注射CCT007093并未引發(fā)小鼠大部分切肝術后肝組織細胞凋亡。具體實施方式下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明，而非限定本發(fā)明。本發(fā)明使用的Wip1敲除(Wip1-/-)小鼠為LawrenceA.Donehower教授贈送，p21和p53敲除小鼠來自KarlLenhardRudolph教授實驗室。Wip1敲除小鼠分別與p21,p53敲除小鼠交配產(chǎn)生Wip1/p21，Wip1/p53雙基因敲除小鼠。清潔級C57BL/6小鼠購自JacksonLab,飼養(yǎng)于杭州師范大學實驗動物中心清潔級動物房，實驗時小鼠為6-8周齡。在整個體內(nèi)實驗過程中，所有操作均遵守國家及杭州師范大學倫理委員會制定的《實驗動物使用條例》。雷帕霉素購自美國LCLaboratories；二甲基亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO),5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine,BRDU),CCT007093,BRDU抗體，β-肌動蛋白(β-actin)抗體等從美國Sigma-Aldrich公司購買；HT293細胞細胞株由杭州師范大學衰老研究所干細胞實驗室常規(guī)保存；質粒pCMV6-AC-GFP-PPM1D購自美國Origene公司。本發(fā)明中所使用的所有抗體，除特別說明，均購自美國CellSignalingTechnology公司。所有實驗結果均是由獨立的三次重復實驗得到，采用不配對的t檢驗分析數(shù)據(jù)，均用士SEM表示。P值<0.05為顯著性差異標準(*<0.05，**<0.01)。實施例一：Wip1基因敲除可促進小鼠肝臟再生對Wip1基因敲除和同窩對照野生型小鼠實施70﹪肝切除手術，檢測并分析比較手術后不同時間點肝比重、增殖細胞數(shù)量、增殖細胞核抗原(PCNA)表達及細胞周期蛋白CyclinD的表達，分析Wip1對肝再生的作用。結果表明，Wip1-/-小鼠肝切除術后肝比重,肝臟增殖細胞,細胞增殖相關蛋白較Wip1+/+組顯著增加。Wip1-/-組小鼠術后肝重占原肝重比值顯著高于Wip1+/+組(每個時間點n≥12)(圖1)。免疫組化顯示術后Wip1-/-和Wip1+/+組BrdU陽性細胞，Wip-/-組小鼠術后BrdU陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)比值在36h顯著高于Wip1+/+組(圖2)。HE染色顯示術后有絲分裂細胞,Wip1-/-組小鼠術后有絲分裂細胞數(shù)占細胞總數(shù)比值在36h,48h顯著高于Wip1+/+組(圖3)。Westernblot圖顯示肝切除術后各時間點PCNA，CyclinD蛋白表達，Wip1-/-組小鼠PCNA蛋白表達量在24h,48h顯著高于Wip1+/+組(圖4)。Wip-/-組小鼠CyclinD蛋白表達量在36h,48h，72h顯著高于Wip1+/+組(圖5)。以上結果表明Wip1缺失可通過增加進入增殖周期細胞數(shù)量加速肝組織再生。實施例二：mTOR信號通路是Wip1促進肝再生的靶點1.部分切肝術后肝再生過程中，mTOR信號通路在Wip1-/-組小鼠中高表達。為進一步探討Wip1基因缺失促進肝臟再生的分子機制，我們對Wip-/-組和Wip1+/+組小鼠70﹪肝臟切除術后24和36小時的再生肝組織進行基因芯片分析，對差異蛋白高表達進行信號通路分析，結果表明Wip-/-組小鼠蛋白和脂肪酸代謝信號通路顯著高于Wip1+/+組(圖6)。根據(jù)文獻(1.Espeillac,C.,etal.,S6kinase1isrequiredforrapamycin-sensitiveliverproliferationaftermousehepatectomy.JClinInvest,2011.121(7):p.2821-32.2.Goggin,M.M.,etal.,Rapamycin-sensitiveinductionofeukaryoticinitiationfactor4Finregeneratingmouseliver.Hepatology,2004.40(3):p.537-44.)報道，部分切肝術后mTOR信號通路為調控代謝的主要通路。我們對部分肝臟切除術后Wip1-/-和Wip1+/+組小鼠再生肝組織進行中的mTOR信號通路蛋白進行westernblot分析發(fā)現(xiàn)，磷酸化mTOR及其下游蛋白磷酸化p70S6K蛋白表達在Wip1-/-組顯著高于Wip1+/+組，表明在肝再生過程中mTOR信號通路在Wip-/-組顯著活躍于Wip1+/+組(圖7)。2.mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)可逆轉Wip1-/-組小鼠在部分肝臟切除術后肝再生加速表型在部分切肝術前2小時開始對Wip1-/-組小鼠腹腔注射雷帕霉素2.5mg/kg/d，部分肝切除術后36小時犧牲小鼠，取出再生肝組織，稱重，結果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素注射后Wip1-/-組和Wip1+/+組小鼠再生肝重比體重較注射前均顯著下降，且兩組小鼠下降至同一水平(圖8)。對再生肝組織進行Westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素注射后PCNA蛋白在Wip1-/-組和Wip1+/+組表達均顯著下調，且下調后的PCNA蛋白表達在Wip1-/-組和Wip1+/+組無顯著差異(圖9)。以上結果提示W(wǎng)ip1-/-組小鼠部分肝切除術后再生加速依賴于mTOR信號通路。3.Wip1蛋白可與mTOR蛋白特異性結合并直接去磷酸化mTOR蛋白。對HT293細胞進行無血清培養(yǎng)16小時，隨后加入10﹪血清和100nM胰島素37℃培養(yǎng)10分鐘，可檢測到磷酸化mTOR蛋白(ser2448,ser2481)高表達(圖10)。在該細胞中過表達Wip1cDNA可顯著降低磷酸化mTOR及其下游蛋白磷酸化S6(Ser235/236)表達水平(圖11)。Wip1蛋白分別和mTOR蛋白、p70S6K蛋白進行免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)Wip1蛋白可直接結合mTOR蛋白并不與p70S6K蛋白進行直接結合(圖12)。為進一步確認Wip1蛋白是否可以直接去磷酸化mTOR蛋白，我們進行了體外磷酸酶實驗，具體如下，裂解過表達mTOR蛋白的細胞，使用mTOR蛋白抗體和免疫磁珠純化磷酸化mTOR蛋白，加入過表達Wip1cDNA細胞的裂解液，進行Westernblot分析，發(fā)現(xiàn)磷酸化mTOR蛋白表達顯著下降。加入Wip1抑制劑CCT007093后該抑制作用可被逆轉(圖13)。以上結果提示W(wǎng)ip1蛋白可直接去磷酸化mTOR蛋白。實施例三：Wip1抑制劑CCT007093可促進肝再生，并顯著改善大部分切肝術后小鼠的生存率1.CCT007093可在體內(nèi)發(fā)揮Wip1抑制劑效果CCT007093在DMSO中稀釋為2.5mg/ml，分不同劑量和次數(shù)對進行70﹪切肝術的野生型C57小鼠進行腹腔注射(圖14)，收集術后36小時再生肝臟組織，Westernblot分析Wip1經(jīng)典下游蛋白磷酸化p53的表達檢測CCT007093抑制效果，結果發(fā)現(xiàn)CCT007093在使用3.2mg/kg的注射劑量，四次注射的情況下可達到對Wip1的最佳抑制效果(圖15)。2.CCT007093可激活mTOR信號通路對野生型小鼠四次注射3.2mg/kg的CCT007093，并進行70﹪切肝術，收集術后36小時再生肝組織，Westernblot檢測mTOR信號通路蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)CCT007093可顯著升高磷酸化mTOR(ser2448,ser2481,ser2159)及其下游蛋白磷酸化p70S6K(T389),磷酸化S6(Ser235/236)的表達(圖16)。在HT293細胞中通過血清饑餓實驗激活mTOR信號通路，隨后分別加入25μM和50μMCCT007093，結果發(fā)現(xiàn)磷酸化mTOR(ser2448,ser2481,ser2159)及其下游蛋白磷酸化p70S6K(T389),磷酸化S6(Ser235/236)的表達水平隨著CCT007093劑量的升高而升高。該實驗結果提示CCT007093的加入與mTOR信號通路的表達存在劑量效應關系(圖17)。3.CCT007093可加速70﹪切肝術后小鼠肝組織再生對野生型小鼠四次注射3.2mg/kg的CCT007093，并進行70﹪切肝術，術后36小時犧牲小鼠，取出再生肝組織，稱重，結果發(fā)現(xiàn)，CCT007093注射后小鼠再生肝重比體重較注射前均顯著升高(圖18)。對再生肝組織進行Westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)CCT007093注射后PCNA蛋白表達顯著升高(圖19)。以上結果提示CCT007093注射可加速小鼠部分肝切除術后再生。4.CCT007093可降低大部分切肝術后小鼠的死亡率對野生型小鼠進行80﹪切肝術，并在術前12小時注射3.2mg/kg的CCT00709312小時每次，記錄CCT007093組及對照組小鼠死亡時間，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，CCT007093可顯著延長80﹪切肝術后小鼠存活時間(圖20)，并且小鼠存活時間延長與小鼠肝重之間存在相關性(圖21)。以上結果提示CCT007093可通過加速大部分切肝術后小鼠肝組織再生改善小鼠術后生存率。實施例四：Wip1抑制劑CCT007093腹腔注射并未在體內(nèi)引起免疫細胞改變，破壞肝組織結構或引起細胞凋亡等不良反應CCT007093組及對照組小鼠取血，抗凝，全自動血細胞計數(shù)儀進行血細胞計數(shù)分析小鼠體內(nèi)白細胞，發(fā)現(xiàn)白細胞中中性粒細胞，單核細胞，嗜酸性粒細胞的絕對數(shù)目(圖22)和比例(圖23)均無改變。對大部分切肝術24，48小時后小鼠的肝組織進行固定，包埋，石蠟切片，HE染色發(fā)現(xiàn)，CCT007093組小鼠肝組織結構正常(圖24)。對大部分切肝術24小時后小鼠的肝組織進行固定，包埋，石蠟切片，TUNEL染色分析細胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)CCT007093組小鼠肝組織細胞并未出現(xiàn)細胞凋亡及壞死(圖25)。上述實施例并非是對于本發(fā)明的限制，本發(fā)明并非僅限于上述實施例，只要符合本發(fā)明要求，均屬于本發(fā)明的保護范圍。