甘露聚糖肽的發(fā)酵工藝及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)(C12P)和藥用肽(C07K)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明提供了甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，其中在溶血性鏈球菌的接種、濃縮和活性炭處理處理等方面進(jìn)行了改進(jìn)，使得獲得的甘露聚糖肽中內(nèi)毒素含量顯著減少，提高了用藥的安全性。另外，本發(fā)明還提供了該甘露聚糖肽及其制劑和應(yīng)用等。
【專利說(shuō)明】甘露聚糖肽的發(fā)酵工藝及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)（C12P)和藥用肽（C07K)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及 甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法、其產(chǎn)品和應(yīng)用等。

【背景技術(shù)】
[0002] 甘露聚糖肽，也稱α -甘露聚糖肽或多抗甲素，是一種糖基化肽類大分子物質(zhì)，目 前臨床上主要作為免疫增強(qiáng)劑使用，用于免疫功能低下、腫瘤的輔助治療（減輕放化療的 不良反應(yīng)）。
[0003] 目前，甘露聚糖肽主要通過(guò)溶血性鏈球菌（Streptococcus hemolyticus)發(fā)酵制 備獲得。例如，中國(guó)專利03117578和03117579公開(kāi)了一種甘露聚糖肽藥物組合物及其發(fā) 酵方法，其發(fā)酵過(guò)程包括以〇. 2%的接種量接入溶血性鏈球菌，發(fā)酵20-100小時(shí)，高溫滅活 后濃縮至比重1. 20-1. 22,然后重復(fù)醇沉水溶的步驟直至檢測(cè)合格（這種過(guò)程無(wú)法進(jìn)行標(biāo) 準(zhǔn)化生產(chǎn)），期間加入0. 1-1 %的活性炭于40-KKTC處理，最后對(duì)沉淀用無(wú)水乙醇和丙酮洗 滌，獲得的甘露聚糖肽的重均分子量為1-20萬(wàn)（可以進(jìn)一步截留出1-5萬(wàn)的分子量的產(chǎn) 物），分布系數(shù)（分布寬度）在4. 0以下。
[0004] 中國(guó)專利200510020106公開(kāi)了甘露聚糖肽注射劑及其制備方法，其中對(duì)重均分 子量為4-65萬(wàn)的甘露聚糖肽在活性炭處理步驟中使用80°C保溫30分鐘的手段，使得甘露 聚糖肽中含的內(nèi)毒素含量能夠小于lOEU/mg(實(shí)測(cè)通常在6-13EU/mg之間，超標(biāo)后只能供非 靜脈注射、甚至獸醫(yī)用制劑使用），勉強(qiáng)達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。尤其值得注意的是，該專利認(rèn)為，要 避免高于90°C的高溫活性炭處理，因?yàn)檫@有害于甘露聚糖肽的含量，而且在加了活性炭的 情況下也沒(méi)有降低內(nèi)毒素的含量。
[0005] 然而，由于甘露聚糖肽是溶血性鏈球菌的發(fā)酵產(chǎn)物，無(wú)論如何進(jìn)行純化，其中仍舊 不可避免地包含一定量的容易引起不良反應(yīng)的內(nèi)毒素等。盡管通常人群對(duì)甘露聚糖肽中的 內(nèi)毒素的耐受極限可以達(dá)到15EU/mg，小于lOEU/mg的內(nèi)毒素看似安全，但是甘露聚糖肽的 不良反應(yīng)報(bào)道仍舊層出不窮，包括休克，過(guò)敏，哮喘，甚至死亡等，尤其是身體狀況本身就不 佳的老年人群（也是免疫功能低下和腫瘤的主要病患人群）更為嚴(yán)重（參見(jiàn)高寧，等.甘 露聚糖肽不良反應(yīng)分析.中國(guó)藥師，2011，14(1) : 121)。這樣的不良反應(yīng)在公眾對(duì)藥物安全 性關(guān)注日益增強(qiáng)、藥監(jiān)部門對(duì)藥物干全性監(jiān)管日益加強(qiáng)的情況下，極大地影響了甘露聚糖 肽及其制劑的推廣使用。
[0006] 盡管如此，現(xiàn)有技術(shù)反而不太關(guān)注于此，涉及甘露聚糖肽的文獻(xiàn)更多關(guān)注其制劑 配方，主要由于受到技術(shù)改進(jìn)難度和無(wú)法預(yù)期的影響，對(duì)降低其不良反應(yīng)的因素和工藝的 研究很少，其中，中國(guó)專利200710093102和200710093103公開(kāi)的甘露聚糖肽制備工藝中， 在乙醇沉淀后使用超濾處理截留5萬(wàn)到8萬(wàn)重均分子量的產(chǎn)物，并對(duì)其用溶菌酶處理。然 而，溶菌酶處理非但不能消除菌體殘留物，反而使得較完整而不易釋放出內(nèi)毒素的死菌體 裂解，釋放出內(nèi)毒素，反而增加了產(chǎn)物中內(nèi)毒素的含量，所以該方法沒(méi)有得到推廣使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明人在沒(méi)有現(xiàn)有技術(shù)所能給出成功預(yù)期的情況下，經(jīng)過(guò)艱苦而長(zhǎng)期的摸索， 跳出了上述現(xiàn)有技術(shù)中的一些內(nèi)容的阻礙，在形式非常多樣的甘露聚糖肽組成和工藝環(huán)節(jié) 中，令人意外地摸索出了新的甘露聚糖肽的發(fā)酵工藝，不但能夠標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行，而且可以使獲 得的產(chǎn)物的重均分子量穩(wěn)定在3. 5-5. 8萬(wàn)的窄范圍內(nèi)，分布系數(shù)小于2. 4,即組分更為專 一可控，尤其是顯著降低了其中的內(nèi)毒素含量，使得用藥安全性得以顯著提高，方便推廣使 用。另外，該制備工藝能夠基本沿用現(xiàn)有技術(shù)所需的設(shè)備和試劑，無(wú)需額外投入，使得生產(chǎn) 成本得以降低。
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供新的甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，由該方法制備獲得的甘 露聚糖肽安全有效。本發(fā)明還提供了相應(yīng)的甘露聚糖肽、其制劑和應(yīng)用等。
[0009] 具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，其包括：
[0010] (1)接種溶血性鏈球菌進(jìn)行發(fā)酵；
[0011] (2)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行滅活和濃縮；
[0012] (3)重復(fù)進(jìn)行乙醇沉淀再將沉淀溶解，還包括用活性炭處理；和
[0013] ⑷用有機(jī)溶劑沉淀和/或洗滌；
[0014] 其特征在于，
[0015] (A)步驟（1)中溶血性鏈球菌的接種量為0· 03-0. 1%，優(yōu)選為0· 05-0. 09%，更優(yōu) 選為 0· 06-0. 08 %，如 0· 07 % ;
[0016] (B)步驟（2)中濃縮達(dá)到的比重為L(zhǎng) 12-1. 19,優(yōu)選為L(zhǎng) 13-1. 18,更優(yōu)選為 1. 15-1. 17,如 1. 16 ;
[0017] (C)步驟（3)中重復(fù)最后一次后用活性炭處理，所述活性炭處理的溫度為 90-98°C，優(yōu)選為 92-97°C，更優(yōu)選為 93-96°C，如 95°C ;和 / 或，
[0018] (D)有機(jī)溶劑是氯仿和/或乙醇。目前通常利用溶血性鏈球菌發(fā)酵（如，深層發(fā) 酵）獲得甘露聚糖肽。溶血性鏈球菌也稱溶血鏈球菌。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)發(fā)酵接種量的減少， 有利于溶血性鏈球菌在發(fā)酵罐環(huán)境中的活化，使得發(fā)酵產(chǎn)生的甘露聚糖肽更為專一，而且 以本發(fā)明的接種量接種，也不會(huì)由于接種量過(guò)少而大幅延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間。優(yōu)選在本發(fā)明第一 方面的方法中，溶血性鏈球菌是α_溶血性鏈球菌，如在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，α_溶 血性鏈球菌，優(yōu)選是&S-33菌。
[0019] 另外優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，發(fā)酵時(shí)間為65-75小時(shí)，優(yōu)選為68-72小 時(shí)，如70小時(shí)。也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，發(fā)酵溫度為37±2°C，優(yōu)選為37±1°C。 本發(fā)明人確定了溶血性鏈球菌的接種量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度，使得發(fā)酵過(guò)程更為標(biāo)準(zhǔn)化， 易于操作，克服了現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)驗(yàn)性操作的缺點(diǎn)。
[0020] 本發(fā)明第一方面的方法在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了多方面改良，發(fā)酵制備獲得的 甘露聚糖肽中內(nèi)毒素的含量顯著降低，使得用藥安全性得到保證，也避免了生產(chǎn)的產(chǎn)品的 浪費(fèi)或者低附加值使用。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，發(fā)酵制備獲得的甘露聚糖肽中 內(nèi)毒素的含量小于5EU/mg，優(yōu)選小于3EU/mg，更優(yōu)選小于2EU/mg，如小于I. 5EU/mg或IEU/ mg 〇
[0021] 本發(fā)明第一方面的方法可以直接獲得分布性質(zhì)更佳的甘露聚糖肽，提升了藥物產(chǎn) 品的質(zhì)量穩(wěn)定性，也方便了生產(chǎn)操作。優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，發(fā)酵制備獲得的甘 露聚糖肽的重均分子量為3-7萬(wàn)，優(yōu)選為3. 2-6. 3萬(wàn)，在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，重均分 子量為3. 5-5. 8萬(wàn)。也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，發(fā)酵制備獲得的甘露聚糖肽的分 布系數(shù)小于2. 4,優(yōu)選小于2. 2,更優(yōu)選小于2。
[0022] 本文中的"重均分子量"是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的術(shù)語(yǔ)，指的是對(duì)高分子聚合物 (對(duì)于本發(fā)明而言，是甘露聚糖肽）中不同分子量進(jìn)行個(gè)數(shù)和重量加權(quán)平均后得到的聚合 物分子量的表征值。
[0023] 由于組合物中不同分子量的甘露聚糖肽的分布寬度可以有較大差異，即使相同的 重均分子量的組合物，其分布寬度也可以不同，這進(jìn)一步帶來(lái)了非常大的多樣性，而本發(fā)明 的藥用高效而安全的甘露聚糖肽的分布系數(shù)小于2. 4,優(yōu)選小于2. 2,更優(yōu)選小于2。多分散 度（polydispersity)，在本文或其他文獻(xiàn)中又被稱為分散指數(shù)、多分散性、分布系數(shù)或分布 寬度，是本領(lǐng)域常用的衡量聚合物分子量分布的指數(shù)，用于表征聚合物分子量分布的寬度， 它是重均分子量（Mw)與數(shù)均分子量（Mn)之比，即Mw/Mn。這個(gè)比值隨分子量分布寬度而變 化。在單分散時(shí)，Mw/Mn等于1，隨著分子量分布變寬，Mw/Mn值逐漸變大。要獲得符合分布 (符合重均分子量和分布系數(shù)）要求的甘露聚糖肽可以通過(guò)改進(jìn)發(fā)酵制備的工藝來(lái)實(shí)現(xiàn)， 也可以通過(guò)專門截留相應(yīng)分子量分布的甘露聚糖肽來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0024] 滅活細(xì)菌通常是高溫滅活細(xì)菌，如在80°C滅活細(xì)菌，然后收集（如離心或過(guò)濾 收集）發(fā)酵液，進(jìn)行濃縮。濃縮的設(shè)備可以是從市場(chǎng)上購(gòu)買的，在本發(fā)明的具體實(shí)施方 式中，使用刮板式薄膜濃縮器。但是與現(xiàn)有技術(shù)不同，濃縮達(dá)到的比重比現(xiàn)有技術(shù)小，為 1. 12-1. 19,優(yōu)選為1. 13-1. 18,更優(yōu)選為1. 15-1. 17,如1. 16。這可以減少濃縮操作，節(jié)約成 本。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這樣節(jié)約成本的方式非但沒(méi)有影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量，反而有一點(diǎn)改善甘 露聚糖肽產(chǎn)品質(zhì)量的作用。
[0025] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，步驟（3)中重復(fù)次數(shù)為4-5次，優(yōu)選為4次。這 是本發(fā)明人摸索出的可以標(biāo)準(zhǔn)化操作的次數(shù)，可以有效進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，而可以不必像現(xiàn) 有技術(shù)那樣不斷進(jìn)行中間體檢測(cè)。優(yōu)選步驟（3)中，乙醇沉淀時(shí)乙醇的濃度大于75% (V/ V)，優(yōu)選為75-85% (V/V)。另外優(yōu)選步驟（3)中，用低濃度的乙醇水溶液溶解，如用小于 25% (V/V)的乙醇水溶液溶解，優(yōu)選用15-22% (V/V)的乙醇水溶液溶解。這樣有利于收集 的甘露聚糖肽的分布性質(zhì)。
[0026] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，步驟（3)中每次重復(fù)中包括調(diào)節(jié)pH的步驟。在 本文中，調(diào)節(jié)PH可以使用酸和堿性物質(zhì)進(jìn)行，如三氯乙酸和/或碳酸氫鈉。然而本發(fā)明人 跳出了現(xiàn)有技術(shù)要求將PH值保持為1. 5至5. 0的阻礙，發(fā)現(xiàn)如果能在調(diào)節(jié)中調(diào)高一次pH， 可以有效降低內(nèi)毒素含量并且能夠改善甘露聚糖肽的分布性質(zhì)。所以更優(yōu)選在本發(fā)明第一 方面的方法中，最后一次重復(fù)中調(diào)節(jié)pH至6. 0-6. 5,優(yōu)選6. 1-6. 3,如6. 2。另外優(yōu)選在本 發(fā)明第一方面的方法中，最后一次重復(fù)之前的重復(fù)可以將pH保持在2. 5至4. 5之間，如在 本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，第一次重復(fù)調(diào)節(jié)PH至4. 0-4. 5,優(yōu)選4. 3 ;第二次重復(fù)調(diào)節(jié)pH至 3. 0-3. 5,優(yōu)選3. 3 ;第三次重復(fù)調(diào)節(jié)pH至2. 5-3. 0,優(yōu)選2. 7。
[0027] 本發(fā)明人跳出了現(xiàn)有技術(shù)較低溫度處理活性炭的阻礙，發(fā)現(xiàn)溫度較高有助于進(jìn)一 步降低內(nèi)毒素的含量，綜合其他步驟，可以顯著降低最終的甘露聚糖肽產(chǎn)品中的內(nèi)毒素含 量。
[0028] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，步驟（4)還包括調(diào)節(jié)pH的步驟，優(yōu)選在用有機(jī) 溶劑沉淀和/或洗滌前進(jìn)行，更優(yōu)選調(diào)節(jié)pH至3. 0-3. 5,優(yōu)選3. 1-3. 4,在本發(fā)明的具體實(shí) 施方式中，調(diào)節(jié)至3. 3。
[0029] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的方法中，步驟（4)中，先用氯仿洗滌（即萃?。?，然后用乙 醇沉淀。
[0030] 在第二方面，本發(fā)明提供了甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽中內(nèi)毒素的含量小于 5EU/mg，優(yōu)選小于3EU/mg，更優(yōu)選小于2EU/mg，如小于I. 5EU/mg或lEU/mg。優(yōu)選本發(fā)明第 二方面的甘露聚糖肽是由本發(fā)明第一方面的方法制備的。
[0031] 優(yōu)選本發(fā)明第二方面的甘露聚糖肽的均重分子量為3-7萬(wàn)，優(yōu)選為3. 2-6. 3萬(wàn)，特 別優(yōu)選在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，重均分子量為3. 5-5. 8萬(wàn)。也優(yōu)選本發(fā)明第二方面的 甘露聚糖肽的分布系數(shù)小于2. 4,優(yōu)選小于2. 2,更優(yōu)選小于2。
[0032] 本發(fā)明第二方面特別優(yōu)選的甘露聚糖肽的質(zhì)量（包括分布性質(zhì)和內(nèi)毒素含量等） 優(yōu)于當(dāng)前報(bào)道的甘露聚糖肽。
[0033] 在第三方面，本發(fā)明提供了甘露聚糖肽制劑，其包含本發(fā)明第二方面的甘露聚糖 肽和藥學(xué)上可接受的輔料。優(yōu)選其中，以甘露聚糖肽計(jì)，內(nèi)毒素的含量小于5EU/mg，優(yōu)選小 于3EU/mg，更優(yōu)選小于2EU/mg，如小于I. 5EU/mg或lEU/mg。
[0034] 在本文中，藥學(xué)上可接受的輔料包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、pH調(diào) 節(jié)劑等，它們與活性成分相容。運(yùn)用藥學(xué)上可接受的輔劑制備藥物組合物對(duì)本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。本發(fā)明的甘露聚糖肽制劑包含本發(fā)明第二個(gè)方面的甘露聚糖肽作 為活性成分，將該活性成分和藥學(xué)上可接受的輔料組合在一起，配制成各種制劑，優(yōu)選為固 體制劑和液體制劑。本發(fā)明的制劑可以為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊（包括持續(xù)釋 放或延遲釋釋放形式）、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、注射劑等劑型 以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥方式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內(nèi)、皮 下、眼內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)過(guò)皮膚等的給藥形式。優(yōu)選本發(fā)明的藥物制劑為注射劑或凍干粉針劑， 最優(yōu)選為注射劑。
[0035] 載體、賦形劑、稀釋劑、pH調(diào)節(jié)劑是藥學(xué)上可接受的并與活性成分相容?？梢赃x 用的合適的賦形劑優(yōu)選但不僅限于水、生理鹽水、甘油、乙醇或其類似物及其組合，更優(yōu)選 是水。當(dāng)本發(fā)明的藥物制劑為注射劑時(shí)，優(yōu)選其中藥學(xué)上可接受的載體選自甘露醇、乳 糖、右旋糖酐、葡萄糖、甘氨酸、水解明膠、聚維酮和氯化鈉中的一種或幾種，更優(yōu)選是甘露 醇；優(yōu)選其中藥學(xué)上可接受的PH調(diào)節(jié)劑使酸性或堿性物質(zhì)，如鹽酸、檸檬酸、氫氧化鈉、氫 氧化鉀、碳酸氫鈉，更優(yōu)選是碳酸氫鈉。本發(fā)明的藥物制劑中活性成分的含量可以根據(jù)具 體劑型、給藥方式以及給藥對(duì)象的情況而定，如，優(yōu)選注射劑中每支甘露聚糖肽的含量為 l-12mg，如2. 5、5或10mg。由于本發(fā)明的甘露聚糖肽的內(nèi)毒素含量低，而其他輔料無(wú)需細(xì)菌 發(fā)酵獲得，理論上可以做到無(wú)菌，所以即使配制成大劑量的制劑，也能使其中內(nèi)毒素含量低 于人體耐受極限。所以，本發(fā)明優(yōu)選提供大劑量的甘露聚糖肽制劑。
[0036] 在第四方面，本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的甘露聚糖肽制劑的制備方法，其包括 將本發(fā)明第二方面的甘露聚糖肽和藥學(xué)上可接受的輔料混合的過(guò)程。藥物制劑的制備方式 可以采用本專業(yè)的一般技術(shù)人員所公知的方法從而制備成合適的制劑。例如，可包括將甘 露聚糖肽稀釋成注射劑的過(guò)程。在第五方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面的甘露聚糖肽 在制備免疫增強(qiáng)的藥物中的應(yīng)用。所述藥物是安全的，例如比現(xiàn)有技術(shù)或者SFDA的標(biāo)準(zhǔn)的 內(nèi)毒素含量更低。具體地，優(yōu)選在本發(fā)明第五方面的應(yīng)用中，所述藥物以甘露聚糖肽計(jì)，內(nèi) 毒素的含量小于5EU/mg，優(yōu)選小于3EU/mg，更優(yōu)選小于2EU/mg，如小于I. 5EU/mg或IEU/ mg。另外本發(fā)明第五方面的應(yīng)用中，所述藥物是本發(fā)明第三方面的甘露聚糖肽制劑。
[0037] 在本文中，給藥的有效量和形式一般由醫(yī)師根據(jù)患者的具體情況（如年齡、體重、 性別、患病時(shí)間、身體狀況等）確定。適合的給藥形式有口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈 內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)過(guò)皮膚等給藥形式，優(yōu)選注射給藥。給藥的有效量也可以通過(guò)本發(fā) 明【具體實(shí)施方式】中所列的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所使用的有效劑量來(lái)?yè)Q算，換算規(guī)則可以根據(jù)各國(guó)藥 物監(jiān)管機(jī)構(gòu)（如，SFDA)的指引來(lái)進(jìn)行，也可以參見(jiàn)黃繼漢等（藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與 人體間的等效劑量換算.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004S印；9 (9) : 1069-1072)報(bào)道的換 算規(guī)則。由于本發(fā)明的甘露聚糖肽更加安全，因此更加方便醫(yī)師使用，用藥更少地受身體狀 況本身就不佳的老年人群（也是免疫功能低下和腫瘤的主要病患人群）限制。
[0038] 本發(fā)明的有益效果在于：成功地獲得了新的甘露聚糖肽，不但能夠標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行發(fā) 酵生產(chǎn)，而且其實(shí)踐中生產(chǎn)出的組成分布穩(wěn)定且分布寬度窄，尤其是顯著降低了其中的內(nèi) 毒素含量，使得用藥安全性得以顯著提高，方便推廣使用；另外，該甘露聚糖肽的制備工藝 能夠基本沿用現(xiàn)有技術(shù)所需的設(shè)備和試劑，無(wú)需額外投入，使得生產(chǎn)成本得以降低。
[0039] 為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。需要特別指出的是， 這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
[0040] 另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文 內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 以下采用具體的實(shí)施例進(jìn)行描述，如有未盡之處，可以參考本領(lǐng)域通用的書(shū)籍和 手冊(cè)以及中國(guó)藥監(jiān)管理部門（SFDA)的指引和所用試劑和設(shè)備的廠商所提供的說(shuō)明書(shū)等。 [0042] 對(duì)比例現(xiàn)有技術(shù)優(yōu)化的甘露聚糖肽的制備
[0043] 基本參照中國(guó)專利03117578所述的實(shí)例1 (其中包含實(shí)例2的鑒定過(guò)程）發(fā)酵制 備甘露聚糖肽，只是其中活性炭的使用參照中國(guó)專利200510020106記載的最優(yōu)條件（80°C 保溫30分鐘）進(jìn)行，獲得了現(xiàn)有技術(shù)（對(duì)比）的甘露聚糖肽。該方法生產(chǎn)的不同批次的 產(chǎn)物的分子量分布不穩(wěn)定，重均分子量在2-20萬(wàn)的范圍內(nèi)都有出現(xiàn)，分布寬度很廣，如需 要較專一的組分，則要在上述過(guò)程中增加截留特定分子量的膜過(guò)濾等進(jìn)一步的步驟才能獲 得，所以可以增加采用膜過(guò)濾截留的方式制備較低重均分子量的甘露聚糖肽。
[0044] 實(shí)施例1本發(fā)明的甘露聚糖肽的制備
[0045] 基本參照中國(guó)專利03117578所述的實(shí)例1進(jìn)行，所不同點(diǎn)在于：將α -溶血性鏈 球菌在無(wú)菌條件下按0. 07%接種量接入發(fā)酵罐，以37土 rc的溫度恒溫培養(yǎng)70小時(shí)，期間 通入無(wú)菌空氣，使得罐壓處在0. 005-0. OlMPa之間；然后，滅活細(xì)菌，放出發(fā)酵罐中的發(fā)酵 液，通入刮板式薄膜濃縮器（可購(gòu)自上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司）濃縮至濃縮液比重 達(dá)到1. 16 ;
[0046] 然后，向濃縮液加入90% (V/V)乙醇直至乙醇濃度達(dá)到78% (V/V)，邊加邊攪拌， 而后室溫（25°C )靜置12小時(shí)，離心收集沉淀，獲得第一次乙醇沉淀物；然后，加入第一次 乙醇沉淀物5倍重量的純化水進(jìn)行溶解，然后加入三氯乙酸調(diào)節(jié)pH至4. 3,再加入90 % (V/ V)乙醇直至乙醇濃度達(dá)到20% (V/V)，靜置12小時(shí)，離心收集溶液，獲得第一次水溶液；
[0047] 然后，向第一次水溶液加入90 % (V/V)乙醇直至乙醇濃度達(dá)到78% (V/V)，邊加邊 攪拌，而后室溫（25°C )靜置3. 5小時(shí)，離心收集沉淀，獲得第二次乙醇沉淀物；然后，加入 第二次乙醇沉淀物5倍重量的純化水進(jìn)行溶解，然后加入三氯乙酸調(diào)節(jié)pH至3. 3,再加入 90% (V/V)乙醇直至乙醇濃度達(dá)到20% (V/V)，靜置4. 5小時(shí)，離心收集溶液，獲得第二次 水溶液；
[0048] 然后，向第二次水溶液加入90 % (V/V)乙醇直至乙醇濃度達(dá)到78% (V/V)，邊加邊 攪拌，而后室溫（25°C )靜置3. 5小時(shí)，離心收集沉淀，獲得第三次乙醇沉淀物；然后，加入 第三次乙醇沉淀物5倍重量的純化水進(jìn)行溶解，然后加入三氯乙酸調(diào)節(jié)pH至2. 7,再加入 90% (V/V)乙醇直至乙醇濃度達(dá)到20% (V/V)，靜置4. 5小時(shí)，離心收集溶液，獲得第三次 水溶液；
[0049] 然后，向第三次水溶液加入90 % (V/V)乙醇直至乙醇濃度達(dá)到78% (V/V)，邊加邊 攪拌，而后室溫（25°C )靜置2. 5小時(shí)，離心收集沉淀，獲得第四次乙醇沉淀物；然后，加入 第四次乙醇沉淀物5倍重量的純化水進(jìn)行溶解，然后加入飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6. 2， 靜置4小時(shí)，離心收集溶液，獲得第四次水溶液；
[0050] 然后，向第四次水溶液以1% (W/V)的比例加入活性炭，于95°C保溫50分鐘，然后 于室溫（25°C )靜置1. 5小時(shí)，過(guò)濾收集濾液，即獲得活性炭處理水溶液；
[0051] 然后，向活性炭處理水溶液加入三氯乙酸調(diào)節(jié)pH至3. 3,加入等體積氯仿，離心后 收集水相，并向水相加入90% (V/V)乙醇直至乙醇濃度達(dá)到78% (V/V)，邊加邊攪拌，而后 室溫（25°C )靜置3. 5小時(shí)，離心收集沉淀，干燥后即獲得本發(fā)明方法制備的甘露聚糖肽。
[0052] 對(duì)采用上述方法制備的不同批次的甘露聚糖肽進(jìn)行檢測(cè)，其重均分子量和分布系 數(shù)如下表1所示，表明本發(fā)明的方法可以直接獲得重均分子量較小而且分布較專一的甘露 聚糖肽。
[0053] 表1不同批次的甘露聚糖肽的重均分子量和分布系數(shù)
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，其包括： (1) 接種溶血性鏈球菌進(jìn)行發(fā)酵； (2) 對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行滅活和濃縮； (3) 重復(fù)進(jìn)行乙醇沉淀再將沉淀溶解，還包括用活性炭處理；和 (4) 用有機(jī)溶劑沉淀和/或洗滌； 其特征在于， (A) 步驟（1)中溶血性鏈球菌的接種量為0. 03-0. 1%，優(yōu)選為0. 05-0. 09%，更優(yōu)選為 0? 06-0. 08%，如 0? 07% ; (B) 步驟⑵中濃縮達(dá)到的比重為1. 12-1. 19,優(yōu)選為1. 13-1. 18,更優(yōu)選為 1. 15-1. 17,如 1. 16 ; (C) 步驟（3)中重復(fù)最后一次后用活性炭處理，所述活性炭處理的溫度為90-98°C，優(yōu) 選為92-97 °C，更優(yōu)選為93-96 °C，如95 °C ;和， (D) 步驟（4)中有機(jī)溶劑是氯仿和/或乙醇。
2. 權(quán)利要求1所述的甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，其中溶血性鏈球菌是a-溶血性鏈 球菌；和/或，發(fā)酵時(shí)間為65-75小時(shí)，優(yōu)選為68-72小時(shí)，如70小時(shí)；和/或，發(fā)酵溫度為 37±2°C，優(yōu)選為 37±1°C。
3. 權(quán)利要求1所述的甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，其中發(fā)酵制備獲得的甘露聚糖肽中 內(nèi)毒素的含量小于5EU/mg，優(yōu)選小于3EU/mg，更優(yōu)選小于2EU/mg，如小于1. 5EU/mg或1EU/ mg〇
4. 權(quán)利要求1所述的甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，其中發(fā)酵制備獲得的甘露聚糖肽的 重均分子量為3-7萬(wàn)，優(yōu)選為3. 2-6. 3萬(wàn)，更優(yōu)選為3. 5-5. 8萬(wàn)；和/或，發(fā)酵制備獲得的甘 露聚糖肽的分布系數(shù)小于2. 4,優(yōu)選小于2. 2,更優(yōu)選小于2。
5. 權(quán)利要求1所述的甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，其中步驟（3)中重復(fù)次數(shù)為4-5次， 優(yōu)選為4次。
6. 權(quán)利要求1所述的甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，其中步驟（3)中每次重復(fù)中包括調(diào) 節(jié)pH的步驟；優(yōu)選最后一次重復(fù)中調(diào)節(jié)pH至6. 0-6. 5,優(yōu)選6. 1-6. 3,如6. 2。
7. 權(quán)利要求1所述的甘露聚糖肽的發(fā)酵制備方法，其中步驟（4)還包括調(diào)節(jié)pH的步 驟，優(yōu)選調(diào)節(jié)pH至3. 0-3. 5,優(yōu)選3. 1-3. 4,如3. 3。
8. 甘露聚糖肽，所述甘露聚糖肽中內(nèi)毒素的含量小于5EU/mg，優(yōu)選小于3EU/mg，更優(yōu) 選小于 2EU/mg，如小于 1. 5EU/mg 或 lEU/mg ; 進(jìn)一步優(yōu)選，所述甘露聚糖肽的重均分子量為3-7萬(wàn)，優(yōu)選為3. 2-6. 3萬(wàn)，更優(yōu)選為 3. 5-5. 8萬(wàn)；和/或，所述甘露聚糖肽的分布系數(shù)小于2. 4,優(yōu)選小于2. 2,更優(yōu)選小于2。
9. 甘露聚糖肽制劑，優(yōu)選是注射劑，其包含權(quán)利要求8所述的甘露聚糖肽和藥學(xué)上可 接受的輔料，藥學(xué)上可接受的輔料如甘露醇和碳酸氫鈉。
10. 權(quán)利要求8所述的甘露聚糖肽在制備免疫增強(qiáng)的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P37/04GK104404114SQ201410745357
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】梁曉東, 王淑娟, 賈志丹 申請(qǐng)人:國(guó)藥一心制藥有限公司, 國(guó)藥一心醫(yī)藥研發(fā)（北京）有限公司