專利名稱：甘露聚糖肽及其制備工藝和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種甘露聚糖肽及其制備工藝和用途，具體地說，是來自于α-溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus-α-Hemolysis)的發(fā)酵產(chǎn)物的一定重均分子量范圍的甘露聚糖肽及其制備工藝和用途。
背景技術(shù)：
隨著環(huán)境的改變，人類腫瘤的發(fā)生率不斷提高，發(fā)生年齡也較過去降低，尋找安全、有效的抗腫瘤藥物是人類一直努力的目標(biāo)。
通過人體防御機(jī)理進(jìn)行腫瘤治療，是70年代末期由美國國立癌癥研究所提倡，80年代在世界范圍內(nèi)逐漸開展，日本在采用免疫激活劑抗腫瘤的研究和開發(fā)方面走在前列，已批準(zhǔn)生產(chǎn)上市的溶血性鏈球菌(OK-432)的鏈球菌制劑1975年上市，云芝胞內(nèi)多糖(PSK即Krestin)真菌多糖制劑1977年上市，兩種藥品的銷售額每年達(dá)1000億日元，行銷世界，銷售額占日本抗腫瘤藥品的一半，1985年十二月又批準(zhǔn)上市的香菇多糖注射劑，正在申請批準(zhǔn)的Sohizop-hyllan(SPG)系列皺菌屬提取的葡聚糖注射劑、ruburatin諾卡氏菌菌體注射劑和bestatin(苯丁異亮氨酸)口服劑，還有十種類似的免疫激活劑正在臨床研究。這類藥物能激活機(jī)體的免疫功能，通過改變腫瘤宿主對腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)能力，改變腫瘤細(xì)胞與宿主的關(guān)系，以達(dá)到治療腫瘤疾患的效果。日本的溶血性鏈球菌SU(OK-432)是減毒的溶血性鏈球菌菌體懸浮于青霉素中的一種生物制劑，副反應(yīng)較重，主要副反應(yīng)是發(fā)熱，注射部位疼痛及細(xì)胞減少而應(yīng)用受限。
中國專利98121898公開了“一種復(fù)合甘露聚糖肽口服液”，該口服液中含有多種成分，其甘露聚糖肽分別來自擔(dān)子真菌、隔擔(dān)子真菌、多孔目真菌，傘科真菌，成分較為復(fù)雜，口服劑量大。
尋找一種新的療效確切、成分清楚、方便服用的抗腫瘤藥物十分必要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘露聚糖肽，它是從α-溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus-α-hemolysis)的發(fā)酵產(chǎn)物中分離提取精制而成。
本發(fā)明的另一目的是提供該甘露聚糖肽的制備以及用途。
本發(fā)明提供一種甘露聚糖肽，主要由甘露聚糖肽組成，其重均分子量為1～20萬，分子量分布系數(shù)在4.0以下，比旋光度為+60°至+90°。
它來自于α-溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus-α-Hemolysis)的發(fā)酵產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供了甘露聚糖肽的制備方法，包含下列步驟a、以α-溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus-α-hemolysis)為生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵；b、從發(fā)酵液提取甘露聚糖肽；c、進(jìn)一步分離得到重均分子量為1～20萬，分子量分布系數(shù)在4.0以下的甘露聚糖肽。
其中還包含步驟d、干燥。
在步驟b中，PH值保持為1.5至6.0；提取溶劑為60％～99.9％的乙醇。
本發(fā)明還提供了甘露聚糖肽在制備免疫增強藥物中的用途。具體的說，所述的免疫增強藥物是腫瘤輔助治療藥物。它還是治療反復(fù)呼吸道感染的藥物，它也是治療白細(xì)胞減少癥的藥物，它還是治療再生障礙性貧血的藥物。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，由有效量甘露聚糖肽與藥學(xué)上可接受的輔助添加成分混合而成。
甘露聚糖肽具有升高白細(xì)胞及增強機(jī)體免疫功能的作用，臨床主要用于免疫功能低下、反復(fù)呼吸道感染、白細(xì)胞減少癥和再生障礙性貧血及腫瘤的輔助治療，也可作為腫瘤輔助治療，減輕放、化療對造血系統(tǒng)的副作用和胃腸道反應(yīng)。
通常，α-溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus-α-hemolysis)的發(fā)酵產(chǎn)物中的甘露聚糖肽是重均分子量為1萬至100萬的甘露聚糖肽的混合物，研究者對各種重均分子量范圍的甘露聚糖肽的藥理活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)截流的重均分子量為1～20萬的甘露聚糖肽的藥理活性較原有的重均分子量為1至100萬的甘露聚糖肽高，且毒性小，因此以本發(fā)明的甘露聚糖肽為藥理活性物質(zhì)制備藥物，其成分更加清楚，療效更好，安全性更高，截流方法簡單，成本低。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式
實例1甘露聚糖肽的制備發(fā)酵過程i、菌種的制備選用菌種是α-溶血性鏈球菌(Streptococcushemolyticus-α-hemolysis)；培養(yǎng)基菌種培養(yǎng)基葡萄糖0.4-0.8％、氯化鈉0.4-0.8％、蛋白胨0.4-1％、牛肉膏0.1-0.5％、綿羊血10％、瓊脂1.5-2％、PH7.2-7.8發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖0.1-0.5％、蛋白胨0.4-0.7％、酵母膏0.4-0.6％、氯化鈉0.4-0.8％、泡敵0.01％提取、精制過程所需原輔材料酒精、丙酮、三氯乙酸、無水乙醇a、母瓶制備啟封菌種冷凍管，用無菌肉湯培養(yǎng)基稀釋，在無菌條件下接入血斜面。18-45℃恒溫培養(yǎng)10-30h；b、子瓶制備將培養(yǎng)好的血斜面菌種在無菌條件下按1-5％接種量接入肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，18-45℃恒溫培養(yǎng)10-30h；c、菌種培養(yǎng)基滅菌溫度為120-124℃，滅菌時間30分鐘，滅菌蒸汽壓力0.12-0.14Mpa；d、發(fā)酵將優(yōu)良的子瓶菌種在無菌條件下按0.2％接種量接入發(fā)酵罐，全過程18-45℃恒溫培養(yǎng)，無菌空氣進(jìn)氣量以能翻動培養(yǎng)液為宜，罐壓不超過0.01Mpa，發(fā)酵周期20-100小時。發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌溫度為120-124℃，蒸汽壓力為0.12-0.14Mpa，時間30min；發(fā)酵至20-100小時，滅活放罐，滅活采用加溫使發(fā)酵液溫度達(dá)到80℃，恒溫30-50分鐘后再降溫放罐，進(jìn)行濃縮，使?jié)饪s液比重控制在1.20-1.22即可；ii、提取a、將i步驟的濃縮液加入1-5倍體積量的乙醇，充分?jǐn)嚢桁o置后離心去除上清液即得到沉淀物；
b、將所得沉淀物用蒸餾水溶解，調(diào)PH，得到溶解液并將溶解液靜置并控制靜置后的溶解液PH值；c、將溶解液離心去除雜質(zhì)得到清液，準(zhǔn)確量取清液體積，調(diào)PH值，按清液體積計算出所需酒精量，將酒精緩慢加入到清液中，并充分?jǐn)嚢?，靜置后離心去除上清液得到沉淀物；d、以上提取方法按從b-c步驟反復(fù)操作至中間檢測合格為止，即得到的沉淀物為甘露聚糖肽半成品；e、截流，得到重均分子量范圍分別為1-20萬及1-5萬、6-10萬、11-15萬、16-20萬的甘露聚糖肽。
當(dāng)發(fā)酵條件在上述范圍變動時，發(fā)酵產(chǎn)物中的甘露聚糖肽的重均分子量也會變動，如果在1-20萬重均分子量范圍內(nèi)，可以不經(jīng)過截流，直接使用。
iii、精制將ii步驟反復(fù)提取截流得到的重均分子量為1-20萬甘露聚糖肽半成品沉淀物，取樣檢測符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，用無水乙醇進(jìn)行一次脫水，充分研磨成粉狀，得到一次濕粉，再用丙酮進(jìn)行二次脫水，充分?jǐn)嚢璧玫蕉螡穹?，將二次濕粉?0-100℃烘烤4-10小時即得甘露聚糖肽。
其中ii步驟的提取過程中活性炭的使用方法使用量為1L溶解液所需活性炭1-10g，加入活性炭后調(diào)溶解液PH值，將該液體在40-100℃溫度下保溫20-70min，離心，并控制炭脫液PH值。
上述提取全過程中的PH值保持為1.5至6.0。
ii步驟的提取過程中的乙醇濃度為60-99.9％。實例二、甘露聚糖肽鑒定1、菌種的鑒定見菌種鑒定記錄。
2、半成品的鑒定i、吸收度測定取半成品小樣適量，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄VI A)，在260nm的波長處，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波長處，其吸收度不得大于0.20。
ii、含量測定
a、對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的D-甘露糖對照品0.1g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，搖勻。每1ml中含甘露糖50μg。
b、供試品的制備取本品適量，精密稱定，加水溶解制成每1ml中含40μg的溶液。
c、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0m，再加3％苯酚溶液1.0ml，搖勻，沖入硫酸4.5ml，搖勻，放置于室溫，以0管為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV A)在490nm的波長處測定吸收度。以甘露糖μg數(shù)對相應(yīng)的吸收度，計算回歸方程。
d、測定法精密量取供品溶液1.0ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下自“再加苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，測定吸收度，由回歸方程計算甘露糖的含量。
3、成品的鑒定[性狀]本品為白色或微黃色無定形粉末；無臭、無味。
本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。
比旋度取本品，精密稱定，加水溶解并，加水溶解并稀釋成每1ml中約含10mg的溶液，依法測定(中國藥典2000年版二部附錄VI E)，比旋度為+60°至+90°。
i、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液(5→100)1ml，搖勻，沿管壁緩緩加硫酸0.5ml，數(shù)分鐘后，界面呈紫紅色。
ii、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取約10μl點于濾紙上，晾干，用無水乙醇固定，置高碘酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml溶解后，加0.2mol/L醋酸鈉溶液1.5ml與乙醇100ml，混勻即得。置暗處保存，可使用數(shù)月)中浸泡5分鐘，取出，用70％乙醇溶液沖洗，置還原液(取碘化鉀5g，硫代硫酸鈉5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、2mol/L鹽酸液2.5ml，隨加隨攪拌，臨用時配)中浸泡5分鐘，取出，用70％乙醇溶液沖洗，置品紅亞硫酸試液中浸泡約30分鐘，取出，用焦亞硫酸鈉溶液(取焦亞硫酸鈉0.4g，加鹽酸1ml，加水溶解使成100ml，即得)，沖洗，晾干，在濾紙片點樣處應(yīng)呈紫紅色。
iii、取供試品和對照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每1ml中含1mg的溶液作為供試品溶液和對照品溶液，依法試驗(附甘露聚糖肽免疫原性測定法)，供試品和對照品管應(yīng)均無溶血發(fā)生。
i、酸度取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法測定(中國藥典2000年版二部附錄VI H)，pH值應(yīng)為3.0~5.0。
ii、吸收度取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄VI A)，在260nm的波長處，其吸收度不得大于0.25，在280nm的波長處，其吸收度不得大于0.20。
iii、總氮量度取本品，照氮測定法(中國藥典2000年版二部附錄VII D第二法)測定，按干燥品計算，含總氮量應(yīng)為0.8-2.0％。
iv、免疫原性取供試品和對照品適量，分別加氯化鈉注射液制成每1ml中含10mg的溶液，再分別用磷酸鹽緩沖液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀釋液作為供試品溶液和對照品溶液，依法檢查(附甘露聚糖肽免疫原性測定法)，供試品不溶血管的最低濃度應(yīng)不得高于對照品相應(yīng)濃度的一倍以上。
v、干燥失重取本品，在105℃干燥至恒重，減失重量不得過5.0％(中國藥典2000年版二部附錄VIII隊L)。
vi、重金屬取本品1.0g，依法檢查(中國藥典2000年版VIII H)，含重金屬不得過百萬分之二十。
vii、異常毒性取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液，依法檢查(中國藥典2000年版附錄XI C)，按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定(供注射用)。[含量測定]a、對照品溶液的制備精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的D-甘露糖對照品0.1g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml，置100ml的量瓶中，加水至刻度，搖勻。每1ml中含甘露糖50μg。
b、供試品的制備取不同含量的甘露聚糖肽供試品5份，精密稱定，加水溶解制成每1ml中含40μg的溶液。
c、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分別置具塞試管中，各加水至1.0m，再加3％苯酚溶液1.0ml，搖勻，沖入硫酸4.5ml，搖勻，放置于室溫，以0管為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IV A)在490nm的波長處測定吸收度。以甘露糖μg數(shù)對相應(yīng)的吸收度，計算回歸方程。
d、測定法精密量取供品溶液1.0ml，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項下自“再加苯酚溶液1.0ml”起，依法操作，測定吸收度，由回歸方程計算甘露糖的含量。
經(jīng)測定，上述方法得到的產(chǎn)品為甘露聚糖肽，含量分別為5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg。實例三測定實例一制備的甘露聚糖肽重均分子量一、儀器島津高效液相色譜儀(包括LC-10AT泵，CTO-10A恒溫柱箱，DGU-14A脫氣裝置，RID-10A示差折光檢測器)；TSK-G4000PWXL(或Shodex Ohpak SB-804HQ)色譜柱；龍智達(dá)接口，計算機(jī)(內(nèi)裝多糖專用GPC軟件)；50ul注射器；Millipore超純水器；0.45um濾膜幫柱頭過濾器，真空抽濾裝置；分析天平。二、試劑和樣品的制備1、超純水2、柱貯存液0.05疊氮化鈉溶液(NaN3)溶液3、流動相0.7％硫酸鈉溶液(內(nèi)含0.02％NaN3)4、供試品溶液分別取原料適量，加流動相制成10mg/ml的溶液。室溫放置過夜0.45um柱頭濾器濾過。
5、標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別取右旋糖酐重均分子量測定對照品(購自中檢所)D0、D4、D5、D6、D7、D8、D2000適量，用流動相溶解制成每1ml約含10mg的溶液。三、實驗方法照2000年版中國藥典右旋糖酐40項下方法測定。四、數(shù)據(jù)處理采用多糖專用GPC軟件計算分子量。五、結(jié)果測定五個重均分子量范圍的樣品，結(jié)果如下重均分子量分別為8.5萬，3.6萬、8.5萬、13.1萬、17.5萬，分布系數(shù)分別為3.3、3.0、3.3、3.0、3.2。
以下通過試驗來進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述藥物的有益效果。這些試驗包括藥效學(xué)試驗，臨床療效觀察試驗。試驗一 藥效學(xué)試驗(一)受試藥物甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)原料由成都利爾藥業(yè)有限公司提供，批號000301，含量84.7％。用此原料生產(chǎn)甘露聚糖肽注射液000401批，規(guī)格5mg/2ml。
原大重均分子量(重均分子量在20萬以上，下同)甘露聚糖肽原料由成都利爾藥業(yè)有限公司提供，批號000101，含量82.1％。用此原料生產(chǎn)甘露聚糖肽注射液000402批，規(guī)格5mg/2ml。
甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)原料由成都利爾藥業(yè)有限公司提供，批號000302，含量84.1％。用此原料生產(chǎn)甘露聚糖肽注射液000403批，規(guī)格5mg/2ml。
甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)原料由成都利爾藥業(yè)有限公司提供，批號000303，含量84.5％。用此原料生產(chǎn)甘露聚糖肽注射液000404批，規(guī)格5mg/2ml。
甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)原料由成都利爾藥業(yè)有限公司提供，批號000304，含量84.3％。用此原料生產(chǎn)甘露聚糖肽注射液000405批，規(guī)格5mg/2ml。
甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)原料由成都利爾藥業(yè)有限公司提供，批號000305，含量83.9％。用此原料生產(chǎn)甘露聚糖肽注射液000406批，規(guī)格5mg/2ml。(二)實驗動物因不同實驗需選用不同的實驗動物，故具體使用動物見實驗方法。(三)劑量選擇采用等劑量比較，即甘露聚糖肽各重均分子量組和原大重均分子量甘露聚糖肽(重均分子量在20萬以上)均選用臨床劑量的10倍量組靜脈注射給藥進(jìn)行實驗比較。(四)統(tǒng)計學(xué)方法采用T檢驗法。(五)甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺引起白細(xì)胞減少的影響1、實驗藥物甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，將藥物用滅菌生理鹽水配制成0.4l溶液，按體重靜脈注射相同體積0.2ml/20g(體重)。2、實驗動物ICR小鼠由四川省醫(yī)藥實驗動物質(zhì)量監(jiān)測中心提供動物級別一級合格證號碼川實動管質(zhì)第80號3、實驗方法取18-22gICR小鼠140只，隨機(jī)分為7組，每組20只，雌雄各半，分組及給藥劑量如下第一組正常對照組，靜脈注射滅菌生理鹽水0.2ml/20g(體重)第二組環(huán)磷酰胺模型組環(huán)磷酰胺腹腔注射100mg/Kg。
第三組甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第四組甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第五組甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第七組原大重均分子量甘露聚糖肽組，給以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g小鼠分組后，除空白對照組外，其余各組每只動物腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/Kg，每日一次，連續(xù)三天，三天后開始給藥，連續(xù)給藥8天。給藥第4、8天，小鼠眼眶取血20ul，用ERMA-PV603自動血細(xì)胞計數(shù)儀(北京埃爾瑪公司生產(chǎn))測定白細(xì)胞數(shù)，實驗結(jié)果見表一，第10天眼眶取血后再股動脈取血用賴氏法測定儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶，然后將小白鼠處死，剝離出股骨，用1ml注射器(連有6號半針頭)吸取一定體積的Hank’s液，沖出股骨中的全部骨髓細(xì)胞，最后將細(xì)胞懸液通過4號針頭的注射器，使細(xì)胞在懸液中充分分散.在顯微鏡下觀察有核細(xì)胞數(shù)，計算骨髓中的有核細(xì)胞數(shù)，實驗結(jié)果見表1。表1甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺引起白細(xì)胞減少的影響組別動物只數(shù) 給藥劑量白細(xì)胞(mg/Kg)(×109/L)第4天第8天第一組20 N.S 14.43±2.14 14.0±1.98第二組20 CY100mg ip 5.51±0.95 ^^4.69±1.06^^第三組20 4+CY100mg ip7.35±1.35**## 8.54±1.25**##第四組20 4+CY100mg ip7.68±1.5**##8.69±1.54**##第五組20 4+CY100mg ip7.46±1.29**## 8.48±1.24**##第六組20 4+CY100mg ip7.59±1.75**## 6.55±1.04**##第七組20 4+CY100mg ip6.16±1.367.48±1.18注^^環(huán)磷酰胺組與正常對照組比較P＜0.01**給藥組與環(huán)磷酰胺組比較P＜0.01##甘露聚糖肽各重均分子量組與原大重均分子量甘露聚糖肽組比較P＜0.01以上實驗結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺引起動物白細(xì)胞明顯降低，與正常對照組比較(P＜0.01)；甘露聚糖肽各重均分子量組及原大重均分子量甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺引起的白細(xì)胞減少有明顯對抗作用，甘露聚糖肽各重均分子量組第4天能明顯增加白細(xì)胞數(shù)量，給藥組與環(huán)磷酰胺組比較有顯著性差異；給藥8天后甘露聚糖肽各重均分子量組及原大重均分子量甘露聚糖肽均能明顯增加白細(xì)胞數(shù)量，給藥組與環(huán)磷酰胺組比較有顯著性差異(P＜0.01)；甘露聚糖肽各重均分子量組與原大重均分子量甘露聚糖肽高劑量組比較(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量組較原大重均分子量甘露聚糖肽升高白細(xì)胞作用起效快，作用效果好。甘露聚糖肽各重均分子量組間比較，P＞0.05，無顯著性差異，表明甘露聚糖肽各重均分子量組作用相當(dāng)。
表2甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺引起副作用的影響組別動物只數(shù) 給藥劑量 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶 有核細(xì)胞數(shù)(mg/Kg)(單位) (個×104/股骨)第一組20N.S 24.6±8.32 1097±384.5第二組20CY100mg ip 42.5±9.16^^415±193.5^^第三組204+CY100mg ip 29.9±8.94**849±218.4**第四組204+CY100mg ip 33.4±9.45**718±225.1**第五組204+CY100mg ip 32.6±8.74**797±184.6**第六組204+CY100mg ip 35.9±8.19**686±174.9**第七組204+CY100mg ip 32.6±8.74**797±184.6**由以上實驗結(jié)果可見，環(huán)磷酰胺給藥后對小鼠產(chǎn)生明顯的毒副反應(yīng)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶明顯高于空白對照組，骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對照組(P＜0.01)，甘露聚糖肽各重均分子量組及原大重均分子量甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺引起的毒副反應(yīng)有明顯減輕作用，給藥組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶明顯低于環(huán)磷酰胺對照組，骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯高于環(huán)磷酰胺對照組(P＜0.01)。(六)甘露聚糖肽注射液對小鼠脾細(xì)胞誘生IL-2的影響1、實驗藥物與材料甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，將藥物用滅菌生理鹽水配制成0.4溶液，按體重給以相同體積0.2ml/20g(體重)。
ConA(德國Serva公司產(chǎn)品)RPMI1640(美國GIBCO產(chǎn)品)HurIL-2標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司產(chǎn)品)3H-Tdr(中科院北京原子能研究所制品)2、實驗動物BALB/C小鼠由四川省醫(yī)藥實驗動物質(zhì)量監(jiān)測中心提供動物級別一級合格證號碼川實動管質(zhì)第80號3、實驗方法取18-22gBALA/C小鼠140只，隨機(jī)分為7組，每組20只，雌雄各半，分組及給藥劑量如下第一組正常對照組，靜脈注射滅菌生理鹽水0.2ml/20g(體重)第二組環(huán)磷酰胺模型組環(huán)磷酰胺腹腔注射100mg/kg。
第三組甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第四組甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第五組甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第七組原大重均分子量甘露聚糖肽組，給以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g小鼠分組后，除空白對照組外，其余各組每只動物腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/Kg，每日一次，連續(xù)五天，五天后開始給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥5天，第6天斷頭處死小鼠。
首先制備小鼠脾細(xì)胞懸液無菌條件下取小鼠脾臟置于盛有Hank’s液的平皿中，用毛玻棒研磨成單個細(xì)胞懸液，經(jīng)200目細(xì)胞篩濾過到離心管中，用Hank’s液離心洗滌2次，用RPMI1640(含5％FeS)培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度到1×107個細(xì)胞/ml，即制成細(xì)胞懸液。
然后進(jìn)行IL-2誘生及IL-2活性測定。
IL-2誘生取脾細(xì)胞懸液1×107個細(xì)胞/ml，加入康氏試管，每管加入ConA5ug，置37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)48小時，離心管收集上清液，置4℃冰箱保存，待活性測定。
IL-2活性測定取生長良好的CTLL細(xì)胞1×105個細(xì)胞/ml，用96孔培養(yǎng)板，每孔加入CTLL細(xì)胞100ml(1(104個細(xì)胞/孔)實驗孔加入待測樣品100ul，陽性對照孔以HurIL-2標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照空以PRMI1640100ul代替，同時設(shè)ConA(0.5ug/孔)作對照，每組兩平行孔置37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時，每孔加入3.71×104Bq3H-Tdr再培養(yǎng)6小時，用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集在49型玻璃纖微孔濾膜上，每孔用重蒸餾水洗滌抽濾5次，取出濾膜放入閃爍瓶中用國產(chǎn)液閃儀計數(shù)測定Cpm。結(jié)果以CPM表示。
CPM＝實驗孔Cpm-加ConA孔Cpm實驗結(jié)果見表3。表3甘露聚糖肽對小鼠脾細(xì)胞IL-2分泌的影響組別 動物只數(shù)給藥劑量CPM(X±SD)(只) (mg/Kg)第一組20 N.S 26113.8±4745.6第二組20 CY100mg ip14557.6±2864.4^^第三組20 4+CY100mg ip 19341.5±2157.3**#第四組20 4+CY100mg ip 19278.6±2669.7**#第五組20 4+CY100mg ip 19375.9±2634.0**#第六組20 4+CY100mg ip 19274.8±2457.1**#第七組20 4+CY100mg ip 17475.9±2114.6**注^^與正常對照組比較P＜0.01**與環(huán)磷酰胺對照組比較P＜0.01#原大重均分子量甘露聚糖肽組與甘露聚糖肽各重均分子量組比較P＜0.05由以上結(jié)果表明環(huán)磷酰胺引起小鼠脾淋巴細(xì)胞中TH細(xì)胞分泌IL-2降低，與正常對照組比較(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量組及原大重均分子量甘露聚糖肽能明顯拮抗環(huán)磷酰胺引起小鼠脾細(xì)胞中TH細(xì)胞分泌IL-2降低，能促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞中TH細(xì)胞分泌IL-2，給藥組與環(huán)磷酰胺對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，甘露聚糖肽各重均分子量組與原大重均分子量甘露聚糖肽高劑量組比較有差異(P＜0.05)，表明甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞中TH細(xì)胞分泌IL-2作用較原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。甘露聚糖肽各重均分子量組間比較，P＞0.05，無顯著性差異，表明甘露聚糖肽各重均分子量組作用相當(dāng)。(七)甘露聚糖肽注射液對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響1、實驗藥物甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，將藥物用滅菌生理鹽水配制成0.4mg/ml溶液，按體重給以相同體積0.2ml/20g(體重)。
ConA(德國Serva公司產(chǎn)品)；RPMI1640(美國GIBCO產(chǎn)品)2、實驗動物BALB/C小鼠由四川省醫(yī)藥實驗動物質(zhì)量監(jiān)測中心提供動物級別一級合格證號碼川實動管質(zhì)第80號3、實驗方法取18-21gBALB/C小鼠140只，按體重、雌雄隨機(jī)分為7組，每組20只，雌雄各半，其分組及給藥劑量如下第一組正常對照組，靜脈注射滅菌生理鹽水0.2ml/20g(體重)第二組環(huán)磷酰胺模型組環(huán)磷酰胺腹腔注射100mg/Kg。
第三組甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第四組甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第五組甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第七組原大重均分子量甘露聚糖肽組，給以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g小鼠分組后，除空白對照組外，其余各組每只動物腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/Kg，每日一次，連續(xù)五天，五天后開始給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥5天，第6天斷頭處死小鼠。首先制備小鼠脾細(xì)胞懸液無菌條件下取小鼠脾臟置于盛有Hank’s液的平皿中，用毛玻棒研磨成單個細(xì)胞懸液，經(jīng)200目細(xì)胞篩濾過到離心管中，用Hank’s液離心洗滌2次，用RPMI1640(含5％FeS)培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度到1×107個細(xì)胞/ml，即制成細(xì)胞懸液。然后進(jìn)行小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗取96孔平底培養(yǎng)板，每孔加入上述脾細(xì)胞懸液100ul(1×107個細(xì)胞/ml)；實驗孔加入ConA(終濃度為5ug/ml)；對照孔不加ConA。每組兩復(fù)孔，用RPMI1640培養(yǎng)液補足體積至200ml/孔，置37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)結(jié)束前16小時每孔加入7.3×104Bq3H-TDR培養(yǎng)完畢，用多頭細(xì)胞收集器將細(xì)胞收集在49型玻璃纖維濾膜上，每孔用重蒸餾水洗滌抽濾5次，取出濾膜放入閃爍瓶中，用國產(chǎn)液閃儀計數(shù)測定cpm，結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)表示。實驗結(jié)果見表4。 表4甘露聚糖肽對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響組別 動物只數(shù) 給藥劑量 SI(X±SD)(只) (mg/Kg)第一組20 N.S74.7±13.47第二組20 CY100mg ip 31.4±9.13^^第三組20 4+CY100mg ip 54.0±11.24**#第四組20 4+CY100mg ip 55.1±9.58**#第五組20 4+CY100mg ip 54.9±12.06**#第六組20 4+CY100mg ip 53.8±10.54**#第七組20 4+CY100mg ip 46.3±11.35**注^^與正常對照組比較P＜0.01**與環(huán)磷酰胺對照組比較P＜0.01#原大重均分子量甘露聚糖肽組與甘露聚糖肽各重均分子量組比較P＜0.05以上實驗結(jié)果表明環(huán)磷酰胺抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，與正常對照組比較(P＜0.01)，甘露聚糖肽各重均分子量組及原大重均分子量甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，各劑量組與環(huán)磷酰胺對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量組與原大重均分子量甘露聚糖肽高劑量組比較有差異(P＜0.05)，甘露聚糖肽各重均分子量組對淋巴細(xì)胞的增殖作用較原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。甘露聚糖肽各重均分子量組間比較，P＞0.05，無顯著性差異，表明甘露聚糖肽各重均分子量組作用相當(dāng)。(八)甘露聚糖肽注射液對血清溶血素生成的影響1、實驗藥物甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，將藥物用滅菌生理鹽水配制成0.4溶液，按體重給以相同體積0.2ml/20g(體重)。2、實驗動物ICR小鼠由四川省醫(yī)藥實驗動物質(zhì)量監(jiān)測中心提供動物級別一級合格證號碼川實動管質(zhì)第80號3、實驗方法取18-21gICR小鼠140只，按體重、雌雄隨機(jī)分為7組，每組20只，雌雄各半，其分組及給藥劑量如下第一組正常對照組，靜脈注射滅菌生理鹽水0.2ml/20g(體重)第二組環(huán)磷酰胺模型組腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/Kg。
第三組甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第四組甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第五組甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第七組原大重均分子量甘露聚糖肽組，給以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g小鼠分組后，除空白對照組外，其余各組每只動物腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/Kg，每日一次，連續(xù)五天，五天后開始給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥4天，第四天開始進(jìn)行免疫，用0.2ml/只5％雞紅細(xì)胞懸液腹腔注射進(jìn)行免疫，免疫后24小時給藥一次，給藥后24小時再進(jìn)行免疫一次，連續(xù)免疫三次，于第10天小鼠斷頭取血，離心分離血清，取血清按1∶100(ml/ml)加生理鹽水稀釋，再取1ml稀釋液加0.5ml 5％雞紅細(xì)胞懸液，0.5ml豚鼠血清(在冰箱中加入)，放入37℃恒溫箱中30min取出，于冰箱中終止反應(yīng)，取上清液在570nm處測定光密度，比較各組光密度值。
雞紅細(xì)胞懸液的制備從雞翅下靜脈取血盛入裝有玻珠的三角瓶，除去纖維蛋白后，用阿氏液保存血球，臨用前用生理鹽水離心洗滌3次，按5％(ml/ml)加生理鹽水配成雞紅細(xì)胞懸液備用。
豚鼠血清制備從豚鼠心臟抽血離心，取血清按10％(ml/ml)加入生理鹽水配成血清液備用。
實驗結(jié)果見表5。表5甘露聚糖肽對血清溶血素生成的影響(X±SD)組別 動物只數(shù) 給藥劑量 OD(mg/Kg) (X±SD)第一組20 N.S 0.88±0.095第二組20 CY100mg ip 0.42±0.105^^第三組20 4+CY100mg ip0.64±0.138**##第四組20 4+CY100mg ip0.58±0.105**##第五組20 4+CY100mg ip0.59±0.118**##第六組20 4+CY100mg ip0.51±0.104**##第七組20 4+CY100mg ip0.51±0.104**注^^與空白對照組比較P＜0.01，**與環(huán)磷酰胺對照組比較P＜0.01，#甘露聚糖肽各重均分子量組與原大重均分子量甘露聚糖肽低劑量組比較P＜0.01以上實驗結(jié)果表明環(huán)磷酰胺使血清溶血素的生成降低，與正常對照組比較(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量組及原大重均分子量甘露聚糖肽能增加血清溶血素的生成，各劑量組與環(huán)磷酰胺對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)。甘露聚糖肽各重均分子量組與原大重均分子量甘露聚糖肽組比較P＜0.01，表明甘露聚糖肽各重均分子量組作用較原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。甘露聚糖肽各重均分子量組間比較，P＞0.05，無顯著性差異，表明甘露聚糖肽各重均分子量組作用相當(dāng)。(九)甘露聚糖肽小鼠碳粒廓清試驗1、實驗藥物甘露聚糖肽注射液000401、000402、000403、000404、000405、000406批，將藥物用滅菌生理鹽水配制成0.4mg/ml溶液，按體重給以相同體積0.2ml/20g(體重)。2、實驗動物ICR小鼠由四川省醫(yī)藥實驗動物質(zhì)量監(jiān)測中心提供動物級別一級合格證號碼川實動管質(zhì)第80號3、實驗方法取18-21gICR小鼠100只，按體重、雌雄隨機(jī)分為5組，每組20只，雌雄各半，其分組及給藥劑量如下第一組正常對照組，靜脈注射滅菌生理鹽水0.2ml/20g(體重)第二組環(huán)磷酰胺模型組腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/Kg。
第三組甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第四組甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量1-5萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第五組甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量6-10萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量11-15萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第六組甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)組，給以甘露聚糖肽(重均分子量16-20萬)4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g第七組原大重均分子量甘露聚糖肽組，給以原大重均分子量甘露聚糖肽4mg/Kg，0.4mg/ml溶液給以0.2ml/20g小鼠分組后，除空白對照組外，其余各組每只動物腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/Kg，每日一次，連續(xù)五天，五天后開始給藥，每天給藥一次，連續(xù)給藥5天，于第6天給藥1小時后，小鼠尾靜脈注射印度墨汁(用1％明膠液稀釋4倍)0.1ml/10g體重，于注射墨汁后5分鐘及20分鐘用毛細(xì)吸管從小鼠眼眶后靜脈叢取血0.025ml，立刻吹入0.1％Na2CO3液2ml中，充分洗滌毛細(xì)管中血液，用0.025ml正常小鼠血溶于0.1％Na2CO3液2ml中調(diào)零，于分光光度計675nm比色，計算吞噬指數(shù)K。K=lgC1-lgC2t2-t1]]>式中C為光密度值t為時間實驗結(jié)果見表6。表6甘露聚糖肽注射液碳粒廓清實驗結(jié)果組別動物只數(shù) 給藥劑量 吞噬指數(shù)(mg/Kg) (K)第一組 20 N.S 0.0312±0.0027第二組 20 CY100mg ip 0.0102±0.0017^^第三組 20 4+CY100mg ip0.0222±0.0021**##第四組 20 4+CY100mg ip0.0194±0.0017**##第五組 20 4+CY100mg ip0.0203±0.0019**##第六組 20 4+CY100mg ip0.0186±0.0020**##第七組 20 4+CY100mg ip0.0203±0.0014**注^^與正常對照組比較P＜0.01，**與環(huán)磷酰胺對照組比較P＜0.01，##甘露聚糖肽各劑量組與原大重均分子量甘露聚糖肽組比較P＜0.01以上實驗結(jié)果表明環(huán)磷酰胺腹腔注射給藥使小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能減弱，吞噬指數(shù)K明顯降低，與正常對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)；甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺引起小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能減弱具有增強作用，各劑量組與環(huán)磷酰胺對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，甘露聚糖肽各重均分子量組與原大重均分子量甘露聚糖肽組比較P＜0.01，表明甘露聚糖肽各重均分子量組增強小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能作用較原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。甘露聚糖肽各重均分子量組間比較，P＞0.05，無顯著性差異，表明甘露聚糖肽各重均分子量組作用相當(dāng)。(十)結(jié)論通過甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)及原大重均分子量甘露聚糖肽藥效學(xué)實驗，結(jié)果如下1、甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)及原大重均分子量甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺引起的白細(xì)胞減少有明顯拮抗作用，甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)4天能明顯增加白細(xì)胞數(shù)量，給藥8天后甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)及原大重均分子量甘露聚糖肽均能明顯增加白細(xì)胞數(shù)量，表明甘露聚糖肽對白細(xì)胞減少具有明顯升高作用。甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)較原大重均分子量甘露聚糖肽升高白細(xì)胞作用起效快，作用效果好。
2、甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)及原大重均分子量甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺引起的毒副反應(yīng)有明顯減輕作用，能降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，使骨髓有核細(xì)胞數(shù)增加。表明甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)及原大重均分子量甘露聚糖肽能減輕放、化療引起的毒副作用。
3、甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)及原大重均分子量甘露聚糖肽對環(huán)磷酰胺引起免疫功能低下具有明顯增強作用，能增加小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，促進(jìn)IL-2的生成，促進(jìn)血清溶血素的生成，增強小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能，表明甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)及原大重均分子量甘露聚糖肽對免疫功能低下具有明顯增強作用，以上增強免疫功能作用甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)較原大重均分子量甘露聚糖肽作用好。
以上實驗結(jié)果表明甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)較原大重均分子量甘露聚糖肽起效快，療效好，可能與甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)純度較高，更易被機(jī)體吸收有關(guān)，臨床用于甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)將會取得更好的療效，以上實驗結(jié)果為甘露聚糖肽提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使用重均分子量為1-20萬的甘露聚糖肽提供了較好的藥效學(xué)實驗基礎(chǔ)。實驗例二 臨床試驗通過對871例白細(xì)胞減少及免疫功能低下患者(包括300例反復(fù)上感患者)的臨床治療對照觀察，結(jié)果表明1、甘露聚糖肽對反復(fù)上感患者，均有較好的療效，兩組間比較有顯著性差異；結(jié)合治療前后上感次數(shù)分析，兩組治療前后均存在顯著性差異，P＜0.05，而治療后兩組間有顯著性差異，甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)較原甘露聚糖肽療效好。2、甘露聚糖肽能有效提高白細(xì)胞數(shù)水平，其治療前后白細(xì)胞值比較，P＜0.05，存在顯著性差異，但治療后甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)組與原甘露聚糖肽組間有顯著性差異；進(jìn)一步觀察提示，兩組顯效病人平均療程比較，甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)組明顯優(yōu)于原甘露聚糖肽組，兩組間差異顯著，P＜0.05；兩組患者治療停藥后白細(xì)胞值稍有下降，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，均無顯著性差異，P＞0.05；對照兩組不同病因治療后白細(xì)胞變化，P＞0.05，無顯著性差異。3、免疫球蛋白IgM、IgA、IgG值變化，兩組患者治療后，均有明顯升高，各單項值治療前后比較，均存在顯著性差異，P＜0.05，而治療后兩組間免疫球蛋白IgM、IgA、IgG值變化比較，有顯著性差異。4、兩組患者治療后，T細(xì)胞亞群(T4、T8)，均有顯著提高，兩組治療前后T細(xì)胞亞群T4、T8細(xì)胞數(shù)值比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05，存在顯著性差異，但兩組治療后各單項指標(biāo)，P＜0.05，有顯著性差異。根據(jù)上述結(jié)果說明，甘露聚糖肽對反復(fù)上感患者的治療，在臨床上具有較好的療效，同時該藥能顯著提高患者的白細(xì)胞及免疫球蛋白等水平。在運用過程中發(fā)現(xiàn)，甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)較原甘露聚糖肽療效好，并且在白細(xì)胞減少患者治療上，甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)較原甘露聚糖肽療程明顯較原甘露聚糖肽為短，兩者間差異顯著。
結(jié)果表明甘露聚糖肽，對臨床反復(fù)易感患者，在治療上顯現(xiàn)了較好的效果，并能明顯提高和增強白細(xì)胞數(shù)及免疫功能，其療效滿意，安全可靠，該藥的臨床運用，為反復(fù)上感患者的治療，提供了一種新的治療選擇。甘露聚糖肽(重均分子量1-20萬)較原甘露聚糖肽療效好，表明選擇重均分子量為1-20萬的甘露聚糖肽在臨床使用中能更好地發(fā)揮治療作用。
通過實施例的方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種甘露聚糖肽，其特征是主要由甘露聚糖肽組成，重均分子量為1～20萬。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘露聚糖肽，其特征是重均分子量為1～20萬，分子量分布系數(shù)在4.0以下，比旋光度為+60°至+90°。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘露聚糖肽，其特征是來自于α-溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus-α-Hemolysis)的發(fā)酵產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1或2所述的甘露聚糖肽的制備方法，包含下列步驟a、以α-溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus-α-hemolysis)為生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵；b、從發(fā)酵液提取甘露聚糖肽；c、進(jìn)一步分離得到重均分子量為1～20萬，分子量分布系數(shù)在4.0以下的甘露聚糖肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甘露聚糖肽的制備方法，還包含d、干燥。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甘露聚糖肽的制備方法，步驟b中，PH值保持為1.5至6.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甘露聚糖肽的制備方法，步驟b中，提取溶劑為60％～99.9％的乙醇。
8.權(quán)利要求1或2所述的甘露聚糖肽在制備免疫增強藥物中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的甘露聚糖肽的用途，其特征是所述的免疫增強藥物是腫瘤輔助治療藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的甘露聚糖肽的用途，其特征是所述的免疫增強藥物是治療反復(fù)呼吸道感染的藥物。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的甘露聚糖肽的用途，其特征是所述的免疫增強藥物是治療白細(xì)胞減少癥的藥物。
12.根據(jù)權(quán)利要求7所述的甘露聚糖肽的用途，其特征是所述的免疫增強藥物是治療再生障礙性貧血的藥物。
13.一種藥物組合物，其特征是由有效量的權(quán)利要求1、2或3所述的甘露聚糖肽與藥學(xué)上可接受的輔助添加成分混合而成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種甘露聚糖肽，具體地說，它是來自于α－溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolyticus－α－Hemolysis)的發(fā)酵產(chǎn)物。這種甘露聚糖肽重均分子量為1～20萬，分子量分布系數(shù)為4.0以下，本發(fā)明還提供了甘露聚糖肽的制備工藝和用途。
文檔編號A61P37/04GK1440980SQ03117579
公開日2003年9月10日 申請日期2003年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者陳云華, 余清和, 李軍, 李麗, 劉艷 申請人:成都利爾藥業(yè)有限公司