王棗子總萜有效部位及其提取方法、應(yīng)用、組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了王棗子總萜有效部位及其提取方法、應(yīng)用、組合物。該王棗子總萜有效部位含有齊墩果酸和熊果酸，按原料重量百分比組成含有0.02-0.5％的齊墩果酸、0.05-1％的熊果酸。本發(fā)明以藥物的主要成分生產(chǎn)加工成為適宜的藥物制劑作為治療免疫肝損傷疾病，能改善肝臟狀態(tài)，無副作用，經(jīng)藥效學(xué)試驗證明其療效顯著；本發(fā)明中的藥物原料來源易得，易于產(chǎn)業(yè)化，可根據(jù)需要制成各種劑型，為臨床提供更加方便、更加有效、質(zhì)量更加可控的現(xiàn)代中藥，為患者帶來更多的利益，從而產(chǎn)生巨大的社會效益。本發(fā)明還公開該王棗子總萜有效部位的提取方法與在抗免疫肝損傷疾病中的應(yīng)用、具有該王棗子總萜有效部位的藥物組合物。
【專利說明】王棗子總萜有效部位及其提取方法、應(yīng)用、組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥王棗子提取領(lǐng)域，具體涉及一種王棗子總萜有效部位、從中藥王 棗子中提取王棗子總萜有效部位的方法及該王棗子總萜有效部位在抗免疫肝損傷疾病中 的應(yīng)用、具有該王棗子總萜有效部位的藥物組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 病毒性肝炎是一種全世界常見病，我國屬流行嚴(yán)重地區(qū)，各種類型病毒性肝炎嚴(yán) 重威脅著人民的健康，西方國家以丙型肝炎最多，我國主要流行乙型肝炎。在我國，乙型肝 炎病毒攜帶者占人口的10%，占全世界攜帶者的1/3以上?，F(xiàn)乙型肝炎患者約為3000萬。 本病病程迀延，易轉(zhuǎn)變?yōu)槁曰顒有愿窝?、肝硬變及肝癌。我國每年因患乙型肝炎轉(zhuǎn)變?yōu)楦?癌而致死者達16萬人以上，若加上因急性肝功能衰竭及肝硬變而致死者則更多，因此，慢 性肝炎的治療便成為一個迫切需要解決的重大問題。
[0003] 目前國內(nèi)外用于慢性肝炎治療的藥物品種甚多，歸納起來，大體可以分為三類： (一）抗病毒藥，主要有干擾素和幾種核苷類類似物，干擾素對乙型和丙型肝炎的治療效果 約為30-50%，對丙型肝炎的效果似乎比對乙型肝炎稍好，但是停止用藥后一年內(nèi)大部分病 人復(fù)發(fā)，而且藥費相當(dāng)昂貴，進口干擾素一個病人需要人民幣數(shù)萬元，國產(chǎn)干擾素一個病人 藥費也在一萬元以上，干擾素需要肌肉注射，部分病人用藥后有流感樣癥狀的副反應(yīng)。某些 核苷類類似物對肝炎的治療效果不如干擾素，亦存在停止用藥后出現(xiàn)回跳復(fù)發(fā)現(xiàn)象，藥品 價格亦相當(dāng)昂貴，部分病人有副反應(yīng)。為提高療效，國外有人試用干擾素與某些核苷類抗 病毒劑合并使用，結(jié)果療效未見提高。（二）改善肝功能藥，又稱抗肝細(xì)胞損傷藥，如聯(lián)苯 雙酯、五味子制劑及某些中草藥，甘草甜素先由日本研制成功，水飛薊素為德國產(chǎn)品。這類 藥物對降低血清轉(zhuǎn)氨酶，退黃疽有一定效果，其中由我國自行研制的聯(lián)苯雙酷的作用優(yōu)于 其他同類型的藥物。但是這類藥物于停止使用后，大多數(shù)的病人亦出現(xiàn)反跳即復(fù)發(fā)，對肝炎 病毒慢性指標(biāo)轉(zhuǎn)陰似無療效，藥費較便宜，副反應(yīng)少。（三）免疫調(diào)節(jié)藥，如轉(zhuǎn)移因子、白細(xì) 胞介素-2、胸腺肽等，主要來源于非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，大多用在不能應(yīng)用干擾素治療的病 人，或作為聯(lián)合用藥，治療慢性乙型肝炎，HBeAg轉(zhuǎn)陰率在20-30%左右，此類藥物治療肝炎 的確切療效還有待更多的驗證，價格亦相當(dāng)昂貴。從以上所述可以看出，目前尚無滿意的治 慢性病毒性肝炎的藥物。
[0004] 慢性病毒性肝炎特別是乙型肝炎，由于肝炎病毒具有可嵌合入人肝細(xì)胞中的DNA、 RNA等生物遺傳性物質(zhì)，利用宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進行復(fù)制，上述分子生物性，導(dǎo)致抗病毒 劑的尋找是當(dāng)今世界面臨的一個難題。此外，幾乎所有的病毒性的發(fā)生，不僅取決于病毒， 還取決于人的個體因素。目前的研宄發(fā)現(xiàn)，機體自身疫應(yīng)答在病毒性肝炎的發(fā)展機制中具 有非常重要的意義，乙型肝炎病毒對肝細(xì)胞傷主要是由免疫反應(yīng)引起的，同時肝炎病毒感 染誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡或壞死都伴有片斷化或是彌漫性降解的損傷現(xiàn)象，故除抗病毒外，促 進損傷肝細(xì)胞的修復(fù)以找針對性較強的免疫調(diào)節(jié)藥物，也將是該類疾病治療藥物研宄的方 向之一。
[0005] 從中草藥中研宄開發(fā)保肝藥物是一極具前景的領(lǐng)域。國外已有成功的先例，如日 本從甘草中研制開發(fā)的甘草甜素類藥物和歐洲所開發(fā)的水飛薊素 ，己成為國際天然藥物市 場上重要的保肝產(chǎn)品。目前我國臨床上也有不少的天然藥物制劑用于肝炎的治療，但從臨 床療效、品種銷量和附加值看，中草藥制劑并不占優(yōu)勢。自1985年我國《新藥審批方法》實 施以來，已批準(zhǔn)的國家級中藥新藥約1000個，其中可用于肝炎治療的中藥新藥約70個，并 且大部分抗肝炎中藥新藥為三類、四類，說明對于慢性肝炎等難治性疾病，中醫(yī)中藥有一定 的獨特療效，同時亦說明，抗肝炎新藥開發(fā)存在低水平重復(fù)現(xiàn)象，由于中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以 及作用機理不明確，至今未有高效低毒的現(xiàn)代抗肝炎中藥面世。
[0006] 唇形科香茶菜屬含有多種活性物質(zhì)，程培元等對我國已研宄的香茶菜屬中的25 個品種的70多個新二萜類化合物作了綜述，發(fā)現(xiàn)其中相當(dāng)部分化合物具有細(xì)胞毒、抗腫瘤 和抗菌活性，并對香茶菜屬植物中二萜類化合物抗腫瘤活性基因及構(gòu)效關(guān)系作了探討。在 藥效學(xué)方面，文獻報道了香茶菜甲素對四氯化碳肝損傷的保護，發(fā)其具有明顯的護肝作用。 在臨床上文獻報道了香茶菜屬植物三姐妹Rterifdia Haraa復(fù)方制劑治療乙肝有明顯療 效。
[0007] 肝臟是產(chǎn)生細(xì)胞因子的主要器官，又是細(xì)胞因子的主要靶器官之一，細(xì)胞因子網(wǎng) 絡(luò)的平衡失常是多種肝病，如慢性病毒性肝炎導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷、肝細(xì)胞纖維化的主要病 理機制。近年來研宄最為廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF- K B是調(diào)節(jié)前炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞表面受 體和粘附因子表達的最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。在肝臟的炎癥損傷方面，NF-κ B通過調(diào)控前 炎性細(xì)胞因子（IL-6, TNF-α)、趨化因子和細(xì)胞粘附因子的轉(zhuǎn)錄直接參與肝臟的急性和慢 性炎癥。
[0008] 近年來的研宄表明，腫瘤壞死因子-α (TNF-α )在肝臟炎癥性損傷中起著非常重 要的作用。在ConA注射2后小時，TNF-α已為峰值，預(yù)先給予抗TNF-α血清，血清TNF-α 水平下降，并且完全保護了肝臟受損傷，鑒于巨噬細(xì)胞合成TNF- α的能力大于T淋巴細(xì)胞， 可以推測T淋巴細(xì)胞活化后刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF- α，可能在這一病理過程中發(fā)揮重要作 用。
[0009] 王賽子Rabdosia amethy Stoides(Benth)Hara系唇形科香茶菜屬植物，我省主要 生長在宿州北部一帶的山區(qū)，是野生藥用植物。長期以來，當(dāng)?shù)厝罕娪蟹猛鯒椬訙珌碇委?疾病的傳統(tǒng)，且流傳著"是瘡不是瘡，三碗王棗子湯"的說法。民間用于治療急性傳染性肝 炎，具有抗菌、消炎和抗腫瘤作用等。王棗子含有很多化學(xué)成分，如王棗子提取物IG-I及 H-l、H-9,王棗子IG-I及甲素，王棗子乙素、二萜類、三萜類、總萜、黃酮及葡萄糖苷等，其中 總萜類成分對刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的免疫肝損傷具有顯著的保護作用。
[0010] 在病毒性肝炎的病理進程中，T淋巴細(xì)胞的活化導(dǎo)致的肝細(xì)胞免疫損傷是導(dǎo)致肝 功能損害的直接因素。多年來應(yīng)用的實驗性肝損害模型（如細(xì)菌脂多糖、D氨基半乳糖）所 介導(dǎo)的肝損害，多不能很好地反映此病理特點，不適用于有護肝作用的免疫調(diào)節(jié)劑或影響 免疫系統(tǒng)的護肝藥的藥效評價。自1992年Tiegs等成功應(yīng)用刀豆蛋白A誘發(fā)了小鼠特異性 肝損傷，其致病特點與我們目前所知的人類病毒性肝炎的病理機制有許多的相似之處。一 般認(rèn)為，肝內(nèi)免疫反應(yīng)是引起病毒性肝損傷的重要機制之一，例如乙型肝炎的發(fā)病過程中， 引起肝細(xì)胞損傷和破壞的直接因素是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。以免疫學(xué)機制誘發(fā)的肝 損傷模型的建立，為肝損傷的研宄開辟了新的途徑，對研宄病毒性肝炎的防治具有重要意 義。因此，我們選用免疫性肝損傷模型開展王棗子總萜護肝作用的研宄。然而王棗子總萜 有效部位并不容易提取，這對王棗子總萜的應(yīng)用起到了一定的阻礙，不利于王棗子總萜的 醫(yī)藥推廣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明公開了一種王棗子總萜有效部位、從中藥王棗子中提取該王棗子總萜有效 部位的方法及該王棗子總萜有效部位在抗免疫肝損傷中的應(yīng)用、具有該王棗子總萜有效部 位的藥物組合物。本發(fā)明研宄了王棗子總萜護肝作用的初步分子作用機理，為把王棗子總 萜開發(fā)成防治肝損傷的藥物提供理論依據(jù)。本發(fā)明對王棗子總萜類成分進行提取、分離與 純化，并基于人類病毒性肝炎免疫紊亂的病理特點，建立小鼠免疫性肝損傷的模型，觀察王 棗子總萜對免疫性肝損傷小鼠血清酶學(xué)和病理組織學(xué)的影響，王棗子總萜對免疫肝損傷關(guān) 鍵炎性介質(zhì)TNF-α和IFN-Y蛋白水平的影響，以及對TNF-α上游信號分子核轉(zhuǎn)錄分子 NF-κ B的調(diào)控機制研宄，探討免疫性肝損傷過程中，王棗子總萜護肝作用的初步分子作用 機理，為把王棗子總萜開發(fā)成防治肝損傷的藥物提供理論依據(jù)。
[0012] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種王棗子總萜有效部位，其含有齊墩果酸和熊果酸，按原 料重量百分比組成含有〇. 02%至0. 5%的齊墩果酸、0. 05%至1 %的熊果酸。按該王棗子總 萜有效部位的重量百分比，齊墩果酸含量占〇. 8%至8%，熊果酸含量占1. 0%至12%。
[0013] 本發(fā)明還提供一種從中藥王棗子中提取總萜有效部位的方法，其包括以下步驟：
[0014] (1)取干凈的王棗子粉碎，加15至35倍重量、70%至95%的乙醇，50至80°C超 聲提取40至lOOmin，提取液過濾，濾液用鹽酸調(diào)pH值=1-3,對濾液加熱回流水解20至 40min，向水解液里加入0. 5-1. 0倍體積的水充分混勻，再用等體積的三氯甲烷萃取若干 次，合并萃取液；
[0015] (2)將所得的王棗子萃取液減壓濃縮，進行柱分離，以水及乙醇洗脫，收集相應(yīng)流 份，凍干，即得上述王棗子總萜有效部位。
[0016] 作為上述方案的進一步改進，該分離柱為大孔樹脂柱，該大孔樹脂柱的大孔吸附 樹脂為D101、AB-8、HPD100A、HPD400、HPD600、HPD750中的至少一種。優(yōu)選地，吸附時間為 6至10小時后，以1至4BV/h流速進行洗脫，先用3至6BV的水洗柱除去水溶性雜質(zhì)，再用 3至6BV40%至60%乙醇洗脫，合并乙醇洗脫液，凍干，即得純度多50%王棗子總萜有效部 位。
[0017] 作為上述方案的進一步改進，該分離柱為聚酰胺柱，以水洗脫，提取液與填料的 重量比為1 : 25-40,洗脫1-3個柱體積后，開始收集流份2-6個柱體積，凍干，即得純度 多50 %王棗子總萜有效部位。
[0018] 作為上述方案的進一步改進，該分離柱為葡聚糖凝膠柱，該葡聚糖凝膠柱選自 G-10、G-25、G-50、LH-20。優(yōu)選地，以水洗脫，提取液與填料的重量比為1 : 20-50,洗脫1-3 個柱體積后，開始收集流份2-6個柱體積，凍干，即得純度多50%王棗子總萜有效部。
[0019] 作為上述方案的進一步改進，該分離柱為反向C18,以水洗脫，提取液與填料的重 量比為1 : 10-20,洗脫2-4個柱體積后，開始收集流份收集相應(yīng)的流份5-11個柱體積，凍 干，即得純度多50%王棗子總萜有效部位。
[0020] 作為上述方案的進一步改進，該分離柱為C8柱，以水洗脫，提取液與填料的重量 比為I : 20-50,洗脫1-3個柱體積后，開始收集流份2-6個柱體積，凍干，即得純度多50% 王棗子總萜有效部位。
[0021] 本發(fā)明還提供一種上述王棗子總萜有效部位在抗免疫肝損傷中的應(yīng)用。特別是在 治療病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝壞死、脂肪肝、膽汁郁積、肝纖維化、肝硬化及肝癌等 的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明還提供一種治療免疫肝損傷疾病的藥物組合物，該藥物組合物中包含一種 作為主要成分的上述王棗子總萜有效部位。
[0023] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0024] (1)提供一種從中藥材王棗子中提取的總萜類有效部位，以藥物的主要成分生產(chǎn) 加工成為適宜的藥物制劑作為治療免疫肝損傷疾病，能改善肝臟狀態(tài)，無副作用，經(jīng)藥效學(xué) 試驗證明其療效顯著；
[0025] (2)本發(fā)明中的藥物原料來源易得，易于產(chǎn)業(yè)化，可根據(jù)需要制成各種劑型，為臨 床提供更加方便、更加有效、質(zhì)量更加可控的現(xiàn)代中藥，為患者帶來更多的利益，從而產(chǎn)生 巨大的社會效益；
[0026] (3)本發(fā)明的藥物所治療的免疫肝損傷疾病主要包括：病毒性肝炎、自身免疫性 肝炎、肝壞死、脂肪肝、膽汁郁積、肝纖維化、肝硬化及肝癌等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為齊墩果酸和熊果酸對照品測定的色譜圖。
[0028] 圖2為王棗子提取液樣品測定的齊墩果酸和熊果酸色譜圖。
[0029] 圖3齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0030] 圖4A、圖4B、圖4C、圖4D、圖4E、圖4F為王棗子總萜不同劑量對肝損傷的保護作用 的HE染色圖：圖4A正常對照組，圖4B正常對照組+王棗子有效部位高劑量組，圖4C模型 組，圖4D王棗子有效部位低劑量組，圖4E王棗子有效部位中劑量組，圖4F王棗子有效部位 高劑量組。

【具體實施方式】
[0031] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0032] 王棗子總萜有效部位含有齊墩果酸和熊果酸，按原料重量百分比組成含有0. 02% 至0.5%的齊墩果酸、0.05%至1%的熊果酸。齊墩果酸和熊果酸的分子式分別如下：
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種王棗子總萜有效部位，其特征在于：其含有齊墩果酸和熊果酸，按原料重量百 分比組成含有0. 02%至0. 5%的齊墩果酸、0. 05%至1 %的熊果酸。
2. -種王棗子總萜有效部位，其特征在于：其含有齊墩果酸和熊果酸，按該王棗子總 萜有效部位的重量百分比，齊墩果酸含量占〇. 8%至8%，熊果酸含量占1. 0%至12%。
3. -種從中藥王棗子中提取總萜有效部位的方法，其特征在于，其包括以下步驟： (1) 取干凈的王棗子粉碎，加15至35倍重量、70%至95%的乙醇，50至80°C超聲提取 40至lOOmin，提取液過濾，濾液用鹽酸調(diào)pH值=1-3,對濾液加熱回流水解20至40min，向 水解液里加入〇. 5-1. 0倍體積的水充分混勻，再用等體積的三氯甲烷萃取若干次，合并萃 取液； (2) 將所得的王棗子萃取液減壓濃縮，進行柱分離，以水及乙醇洗脫，收集相應(yīng)流份，凍 干，即得如權(quán)利要求1或2所述的王棗子總萜有效部位。
4. 如權(quán)利要求3所述的從中藥王棗子中提取總萜有效部位的方法，其特征在于，該分 離柱為大孔樹脂柱，該大孔樹脂柱的大孔吸附樹脂為D101、AB-8、HPD100A、HPD400、HPD600、 HPD750中的至少一種，吸附時間為6至10小時后，以1至4BV/h流速進行洗脫，先用3至 6BV的水洗柱除去水溶性雜質(zhì)，再用3至6BV40%至60%乙醇洗脫，合并乙醇洗脫液，凍干， 即得純度多50%王棗子總萜有效部位。
5. 如權(quán)利要求3所述的從中藥王棗子中提取總萜有效部位的方法，其特征在于，該分 離柱為聚酰胺柱，以水洗脫，提取液與填料的重量比為1 : 25-40,洗脫1-3個柱體積后，開 始收集流份2-6個柱體積，凍干，即得純度多50%王棗子總萜有效部位。
6. 如權(quán)利要求3所述的從中藥王棗子中提取總萜有效部位的方法，其特征在于，該分 離柱為葡聚糖凝膠柱，該葡聚糖凝膠柱選自G-10、G-25、G-50、LH-20,以水洗脫，提取液與填 料的重量比為1 : 20-50,洗脫1-3個柱體積后，開始收集流份2-6個柱體積，凍干，即得純 度多50 %王棗子總萜有效部。
7. 如權(quán)利要求3所述的從中藥王棗子中提取總萜有效部位的方法，其特征在于，該分 離柱為反向C18,以水洗脫，提取液與填料的重量比為1 : 10-20,洗脫2-4個柱體積后，開 始收集流份收集相應(yīng)的流份5-11個柱體積，凍干，即得純度多50%王棗子總萜有效部位。
8. 如權(quán)利要求3所述的從中藥王棗子中提取總萜有效部位的方法，其特征在于，該分 離柱為C8柱，以水洗脫，提取液與填料的重量比為1 : 20-50,洗脫1-3個柱體積后，開始收 集流份2-6個柱體積，凍干，即得純度多50%王棗子總萜有效部位。
9. 一種如權(quán)利要求1或2所述的王棗子總萜有效部位在抗免疫肝損傷中的應(yīng)用。
10. -種治療免疫肝損傷疾病的藥物組合物，其特征在于：該藥物組合物中包含一種 作為主要成分的王棗子總萜有效部位，該王棗子總萜有效部位為如權(quán)利要求1或2所述的 王棗子總萜有效部位。
【文檔編號】A61P37/02GK104435095SQ201410648925
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】段紅, 翟科峰, 王維維, 孫玉雪, 曹穩(wěn)根, 高貴珍, 趙亮 申請人:宿州學(xué)院