靶向硼制劑及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，公開(kāi)了一種靶向硼制劑及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述靶向硼制劑由聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子、表皮生長(zhǎng)因子受體抗體和多面體硼烷組成，所述聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子上連接所述表皮生長(zhǎng)因子受體抗體，內(nèi)部負(fù)載所述多面體硼烷。本發(fā)明所述靶向硼制劑含硼量高，能夠滿(mǎn)足BNCT對(duì)硼原子劑量的要求，對(duì)腫瘤細(xì)胞靶向性好，同時(shí)穩(wěn)定性好、細(xì)胞毒性低，能夠被表面高表達(dá)EGFR的人膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞有效攝取。本發(fā)明所述靶向硼制劑能夠有效提高原位移植瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)硼的含量，經(jīng)中子照射后明顯延長(zhǎng)原位移植瘤裸鼠生存期，適用于硼中子俘獲療法治療腦膠質(zhì)瘤。本發(fā)明所述制備方法操作簡(jiǎn)單，制備得到的靶向硼制劑穩(wěn)定性好。
【專(zhuān)利說(shuō)明】靶向硼制劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及負(fù)載多面體硼烷的表皮生長(zhǎng)因子抗體耦聯(lián)樹(shù) 枝狀大分子靶向給藥系統(tǒng)及其制備方法，適用于硼中子俘獲療法治療腦膠質(zhì)瘤。

【背景技術(shù)】
[0002] 腦膠質(zhì)瘤約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的45%，是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)惡性腫瘤。其特點(diǎn)表現(xiàn) 為腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤邊界不清，手術(shù)難以徹底切除且術(shù)后易復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為手術(shù)結(jié)合 術(shù)后放化療的綜合治療是治療膠質(zhì)瘤的最佳方案。放療因此成為腦膠質(zhì)瘤綜合治療的重要 環(huán)節(jié)之一。
[0003] 硼中子俘獲療法（boronneutroncapturetherapy,BNCT)是一種理論上可以選 擇性殺傷已經(jīng)擴(kuò)散到正常組織中的腫瘤細(xì)胞的治療方法。當(dāng)硼（boron-10,kiB)受到低能量 中子照射時(shí)，即發(fā)生核反應(yīng)，產(chǎn)生具有高線性能量轉(zhuǎn)換的α粒子，殺傷反應(yīng)的范圍在一個(gè) 細(xì)胞內(nèi)（5_9μπι)，其本身衰變?yōu)殇囋?。BNCT治療腦膠質(zhì)瘤臨床試驗(yàn)在美國(guó)、日本、芬蘭、 荷蘭、瑞典等國(guó)家相繼開(kāi)展，多數(shù)試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為BNCT治療膠質(zhì)瘤患者平均生存期和5年生 存率優(yōu)于傳統(tǒng)的放射治療。
[0004] BNCT要取得療效需要特殊的設(shè)備-產(chǎn)生中子源的反應(yīng)堆，鑒于BNCT治療腦膠質(zhì) 瘤的安全性及臨床效果都得到了肯定，我國(guó)于2005年在中國(guó)工程院周永茂及王忠誠(chéng)院士 的積極支持下，北京凱佰特科技有限公司建造了我國(guó)第一臺(tái)也是世界首臺(tái)醫(yī)院中子照射器 (In-HospitalNeutronIrradiator，ΙΗΝΙ-1)。該設(shè)備于 2008 年經(jīng)鑒定后正式運(yùn)轉(zhuǎn)，2010 年獲批準(zhǔn)試運(yùn)行，2012年獲得國(guó)家核工業(yè)部科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)（2012HNJ01D-01)。該設(shè)備具 有經(jīng)濟(jì)、安全、有效、體積小和操作方便的特點(diǎn)，動(dòng)物試驗(yàn)已基本完成，即將進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
[0005] BNCT要取得療效，除了有效的中子發(fā)射源之外，關(guān)鍵問(wèn)題之一是腫瘤細(xì)胞內(nèi)必須 含有足量的kiB原子，且腫瘤中kiB原子的濃度與周?chē)＝M織和血液中濃度的比值大于3 : 1。目前研究顯示，向腫瘤細(xì)胞運(yùn)送足量的kiB原子而盡量減少正常組織的硼含量仍存在問(wèn) 題。臨床試驗(yàn)中允許使用的有兩種含kiB的化合物，即二羥苯丙氨酸硼（BPA)和多面體硼烷 (BSH)，但效果均不理想。因此合成可增加腫瘤吸收比例的含硼制劑，對(duì)運(yùn)用硼中子俘獲療 法治療腦膠質(zhì)瘤具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)目前應(yīng)用于BNCT臨床試驗(yàn)的硼原子攜帶劑在腫瘤組織富集量較低、 靶向性差的缺點(diǎn)，提供一種含硼量高的靶向硼制劑。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種靶向硼制劑，由聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子、表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體和多面 體硼烷組成，所述聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子上連接所述表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體，內(nèi)部負(fù) 載所述多面體硼烷。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述靶向硼制劑的制備方法。
[0010] 一種靶向硼制劑的制備方法，通過(guò)3- (2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯 和十一酸馬來(lái)酰亞胺-酰肼-三氟乙酸鹽將聚酰胺一胺樹(shù)狀大分子和表皮生長(zhǎng)因子抗體相 連接后形成功能化樹(shù)狀大分子，然后負(fù)載多面體硼烷得到所述靶向硼制劑。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，所述的制備方法，具體包括以下步驟：
[0012] (1)表皮生長(zhǎng)因子受體抗體與高碘酸鈉反應(yīng)，得到氧化的表皮生長(zhǎng)因子受體抗 體；
[0013] (2)聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子與3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反 應(yīng)，得到中間體PAMAM-SPDP;
[0014] (3)步驟（2)反應(yīng)得到的中間體PAMAM-SPDP與DTT反應(yīng)得到PAMAM-SH;
[0015] (4)步驟（3)反應(yīng)得到的PAMAM-SH與i^一酸馬來(lái)酰亞胺-酰肼-三氟乙酸鹽反應(yīng) 得到PAMAM-KMUH;
[0016] (5)步驟⑷反應(yīng)得到的PAMAM-KMUH與步驟（1)中得到的氧化的mAbEGFR偶聯(lián)得 到PAMAMiAbEGFR;
[0017] (6)向步驟（5)反應(yīng)得到的PAMAM-mAbEGFR中加入多面體硼烷BSH，得到所述靶向 硼制劑。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，所述的制備方法步驟（1)中所述的表皮生長(zhǎng)因子受體抗體與 高碘酸鈉摩爾比為1 :10。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述的制備方法步驟（2)中所述的聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子 與3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1 :10。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，所述的制備方法步驟（3)中所述的PAMAM-SPDP與DTT的摩爾 比為1 :1〇。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，所述的制備方法步驟（4)中所述的PAMM-SH與^^一酸馬來(lái)酰 亞胺-酰肼-三氟乙酸鹽的摩爾比為1 :1〇。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，所述的制備方法步驟（5)中所述的PAMAM-KMUH與氧化的表皮 生長(zhǎng)因子受體抗體的摩爾比為10 :1。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，所述的制備方法步驟（6)中所述的PAMAM-mAbEGFR與多面體 硼燒的質(zhì)量比為2 :1。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述靶向硼制劑在制備硼中子俘獲療法的藥物中的 應(yīng)用。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果之一：
[0026] (1)本發(fā)明所述靶向硼制劑將大劑量的多面體硼烷（BSH)負(fù)載于樹(shù)枝狀大分子空 腔內(nèi)，明顯提高了硼原子的給藥量，具有包封率高和載藥量高的優(yōu)點(diǎn)，能夠滿(mǎn)足BNCT對(duì)硼 原子劑量的要求。
[0027] (2)本發(fā)明所述靶向硼制劑連接有腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子受體的抗 體（mAbEGFR)，對(duì)腫瘤細(xì)胞有較好的靶向性，增加腫瘤組織與正常腦組織攝取硼的差異，減 小中子照射時(shí)各種有意義射線對(duì)正常腦組織的損傷，同時(shí)穩(wěn)定性好、細(xì)胞毒性低。
[0028] (3)本發(fā)明所述靶向硼制劑能夠被表面高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體的人膠質(zhì)瘤 U87MG細(xì)胞有效攝取。
[0029] (4)本發(fā)明所述靶向硼制劑能夠有效提高原位移植瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)硼的含量， 經(jīng)中子照射后明顯延長(zhǎng)原位移植瘤裸鼠生存期。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0031] 圖1為實(shí)施例1制備的PAMAMiAbEGFR的SDS-PAGE鑒定結(jié)果；
[0032] 圖2為實(shí)施例3不同濃度的PAMAM-mAbEGFR/BSH對(duì)U87MG細(xì)胞不同時(shí)間增殖率的 影響的結(jié)果圖；其中，為為 〇· 01l·1mol/L、0 為 0· 1μmol/L、B為 1μmol/L、O為 5μmol/ L、□為 10μmol/L;
[0033] 圖3為實(shí)施例4熒光顯微鏡觀察U87MG細(xì)胞對(duì)PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH的內(nèi)吞 情況圖，其中（a)為細(xì)胞內(nèi)吞的熒光照片，（b)為同一視野下光鏡照片；
[0034] 圖4為實(shí)施例6原位移植瘤裸鼠經(jīng)BNCT后的Kaplan-Meier生存曲線；其中對(duì)照 組未經(jīng)任何照射，X線5Gy為經(jīng)5GyX線照射組，INHI-14MV組為僅經(jīng)4MVINHI-I照射組， BSH4MV組為注射BSH后經(jīng)4MVINHI-I照射組，PAB4MV組為注射PAMAM-mAbEGFR/BSH后 經(jīng)4MVINHI-I照射組，X線IOGy為經(jīng)IOGyX線照射組，INHI-18MV組為僅經(jīng)8MVINHI-I 照射組，BSH8MV組為注射BSH后經(jīng)8MVINHI-I照射組，PAB8MV組為注射PAMAM-mAbEGFR/ BSH后經(jīng)8MVINHI-I照射組；
[0035] 圖5為本發(fā)明制備PAMAM-mAbEGFR/BSH的路線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0037] 本發(fā)明針對(duì)腫瘤細(xì)胞對(duì)目前臨床試驗(yàn)中允許使用的兩種kiB制劑吸收的特異性均 不強(qiáng)的缺點(diǎn)，提供了一種腫瘤特異性的靶向硼制劑。所述靶向硼制劑為一種負(fù)載BSH的耦 連EGFR抗體的樹(shù)枝狀大分子（PAMAM-mAbEGFR/BSH)。
[0038] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0039] -種靶向硼制劑，由聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子、表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體和多面 體硼烷組成，所述聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子上連接所述表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體，內(nèi)部負(fù) 載所述多面體硼烷。
[0040] 其中，多面體硼烷（BSH)分子式為Na2B12H11SH,含有硼原子數(shù)遠(yuǎn)多于含有1個(gè)硼原 子的二羥苯丙氨酸硼（BPA)，本發(fā)明所述靶向硼制劑選用BSH作為負(fù)載硼制劑，提高腫瘤細(xì) 胞吸收硼原子的劑量。
[0041] 聚酰胺一胺樹(shù)狀大分子（PAMAMdendrimer)是一類(lèi)具有三維結(jié)構(gòu)的高分子，與傳 統(tǒng)的線性聚合物在結(jié)構(gòu)上有著很大的區(qū)別，它由引發(fā)核、內(nèi)層重復(fù)單元和外層端基組成，具 有高度的幾何對(duì)稱(chēng)性、精確的分子結(jié)構(gòu)、大量的表面官能團(tuán)和內(nèi)部空腔。聚酰胺一胺樹(shù)狀大 分子內(nèi)部含有大量空間，且能有效與進(jìn)入空腔內(nèi)的小分子復(fù)合成緊密的粒子，在細(xì)胞內(nèi)化 過(guò)程中，緩沖內(nèi)涵體一溶酶體的酸性環(huán)境，幫助包裹的小分子與樹(shù)形分子迅速解離。經(jīng)修飾 的PAMM毒性降低，轉(zhuǎn)染效率增高。本發(fā)明所述靶向硼制劑采用PAMM作為BSH的載藥分 子，提高BSH的負(fù)載量及細(xì)胞內(nèi)吞后的迅速釋放。
[0042] BNCT成功的關(guān)鍵是運(yùn)送足量的wB原子到腫瘤細(xì)胞，而盡量減少正常組織的wB含 量，所以應(yīng)用靶向治療攜帶kiB原子到腫瘤細(xì)胞是一個(gè)理想的治療方法。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是一種廣泛分布于人體組織細(xì)胞膜上的多功 能糖蛋白，EGFR存在于大多數(shù)細(xì)胞中，在40%的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)，在不同級(jí)別膠 質(zhì)瘤組織中，EGFR的表達(dá)隨腫瘤惡性級(jí)別的增高而增高，而正常人腦組織中未見(jiàn)EGFR明顯 表達(dá)，本發(fā)明在所述聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子上連接所述表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體，使得 本發(fā)明所述靶向硼制劑對(duì)EGFR陽(yáng)性的細(xì)胞具有靶向性，進(jìn)而提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)本發(fā)明所 述靶向硼制劑的吸收，從而實(shí)現(xiàn)硼中子俘獲療法。
[0043] 本發(fā)明所述靶向硼制劑能夠靶向性提高腫瘤細(xì)胞對(duì)kiB原子的攝取劑量，增加腫 瘤細(xì)胞與周?chē)＝M織kiB攝取量的差異，為BNCT提供合適的硼原子攜帶劑。
[0044] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述靶向硼制劑中所述表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體 為表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體。
[0045] 本發(fā)明還提供了所述靶向硼制劑的制備方法。
[0046] 一種靶向硼制劑的制備方法，通過(guò)3- (2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯 和十一酸馬來(lái)酰亞胺-酰肼-三氟乙酸鹽將聚酰胺一胺樹(shù)狀大分子和表皮生長(zhǎng)因子抗體相 連接后形成功能化樹(shù)狀大分子，然后負(fù)載多面體硼烷得到所述靶向硼制劑。
[0047] 3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（STOP)，分子式SC12H12N2O4S2，為一 個(gè)短鏈交聯(lián)劑，其通過(guò)羥基琥珀酰亞胺酯活性基團(tuán)連接PAMAM分子上的氨基（-NH2)。十一酸 馬來(lái)酰亞胺-酰肼-三氟乙酸鹽（KMUH)分子式為C15H25N3O3 ·CF3CO2H,為一個(gè)長(zhǎng)鏈交聯(lián)劑， 其通過(guò)馬來(lái)酰亞胺與PAMAM-SH分子上的巰基（-SH)反應(yīng)。本發(fā)明所述制備方法通過(guò)SPDP 和KMUH將表皮生長(zhǎng)因子抗體和聚酰胺-胺樹(shù)狀大分子（PAMM)相連接后形成功能化樹(shù)狀 大分子，對(duì)多面體硼烷（BSH)具有高負(fù)載量和穩(wěn)定性，在獲得良好生物相容性的同時(shí)，增加 腫瘤細(xì)胞對(duì)BSH的吸收劑量。
[0048] 另一方面樹(shù)狀大分子必須依靠較大的尺寸才能體現(xiàn)出腫瘤細(xì)胞的增強(qiáng)滲透滯留 效應(yīng)（EPR效應(yīng)）以及避免被過(guò)早的代謝。盡管高代數(shù)的樹(shù)狀大分子擁有較大的尺寸，但隨 之而來(lái)的卻是更高的系統(tǒng)毒性。本發(fā)明所述制備方法SPDP和KMUH連接鏈段的引入可以幫 助直徑小于9nm的PAMMG6. 0以下較低代數(shù)的樹(shù)狀大分子在不提高代數(shù)的前提下獲得較 大的納米尺寸，提高整個(gè)體系的生物安全性。
[0049] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述靶向硼制劑的制備方法具體包括以下步驟：
[0050] (1)表皮生長(zhǎng)因子受體抗體與高碘酸鈉反應(yīng)，得到氧化的表皮生長(zhǎng)因子受體抗 體；
[0051] (2)聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子與3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反 應(yīng)，得到中間體PAMAM-SPDP;
[0052] (3)步驟⑵反應(yīng)得到的中間體PAMAM-SPDP與DTT反應(yīng)得到PAMAM-SH;
[0053] (4)步驟（3)反應(yīng)得到的PAMAM-SH與i^一酸馬來(lái)酰亞胺-酰肼-三氟乙酸鹽反應(yīng) 得到PAMAM-KMUH;
[0054] (5)步驟⑷反應(yīng)得到的PAMAM-KMUH與步驟（1)中得到的氧化的mAbEGFR偶聯(lián)得 到 PAMAM-mAbEGFR ;
[0055] (6)向步驟（5)反應(yīng)得到的PAMAM-mAbEGFR中加入多面體硼烷BSH，得到所述靶向 硼制劑。
[0056] 其中，本發(fā)明所述靶向硼制劑的制備方法步驟（1)所述表皮生長(zhǎng)因子受體抗體 mAbEGFR與高碘酸鈉（NaKM)反應(yīng)，得到氧化的表皮生長(zhǎng)因子受體抗體，使表皮生長(zhǎng)因子受 體抗體形成羰基（C = 0)官能團(tuán)。
[0057] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述mAbEGFR與NaKM反應(yīng)為mAbEGFR與NaKM在pH為 4. 5的0.IM醋酸鹽緩沖液中混合，室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)混合物脫鹽，用pH7. 5的50mM磷酸鹽 緩沖液洗脫，得到氧化的表皮生長(zhǎng)因子受體抗體。
[0058] 進(jìn)一步的，步驟（1)中所述的mAbEGFR與NaKM摩爾比優(yōu)選為1 :10。
[0059] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述靶向硼制劑中所述表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體 為表皮生長(zhǎng)因子受體的單克隆抗體。
[0060] 本發(fā)明所述靶向硼制劑的制備方法步驟（2)中聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子（PAMM) 與3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（STOP)反應(yīng)，
[0061] SPDP的羥基琥珀酰亞胺酯活性基團(tuán)與PAMAM分子上的氨基（-NH2)連接得到中間 體PAMAM-SPDP。
[0062] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟（2)中PAMAM與SPDP反應(yīng)為PAMAM與SPDP在 pH7. 5的0.IM磷酸鹽緩沖液中混合，室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)混合物脫鹽，用pH7. 5的50mM磷酸 鹽緩沖液洗脫，得到中間體PAMAM-SPDP。
[0063] 進(jìn)一步的，步驟（2)中所述PAMAM與SPDP的摩爾比優(yōu)選為1 :10。
[0064] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子為5. 0代溶液，其分子量為28824， 分子末端為氨基（-NH2)。
[0065] 本發(fā)明所述靶向硼制劑的制備方法步驟（3)PAMAM-SPDP與DTT反應(yīng)，DTT還原 SPDP分子上的吡啶二硫基，形成巰基（-SH)，得到PAMAM-SH。
[0066] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟（3)中PAMAM-SPDP與DTT反應(yīng)為DTT溶液與 PAMAM-SPDP室溫反應(yīng)30min，反應(yīng)混合物脫鹽，用pH7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液洗脫，得到 PAMAM-SH；
[0067] 進(jìn)一步的，步驟（3)中所述的PAMAM-SPDP與DTT的摩爾比優(yōu)選為1 :10。
[0068] 其中，所述DTT溶液的配置方法為DTT(購(gòu)于Sigma公司）溶于為pH7. 5的0·IM 磷酸鹽緩沖液中，加入10v/v%二甲基亞砜（DMSO)。
[0069] 優(yōu)選的，步驟（3)中所述pH 7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液中含10v/v% DMS0。
[0070] 本發(fā)明所述靶向硼制劑的制備方法步驟（4)PAMAM-SH與i^一酸馬來(lái)酰亞胺-酰 肼-三氟乙酸鹽（KMUH)反應(yīng)，KMUH中的馬來(lái)酰亞胺與PAMAM-SH分子上的巰基（-SH)連接 得到PAMAM-KMUH。
[0071] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟（4)中PAMM-SH與KMUH反應(yīng)為將步驟（3)反應(yīng) 得到的PAMAM-SH與KMUH在DMSO中混合，室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)混合物脫鹽，用pH7. 5的50mM 磷酸鹽緩沖液洗脫，得到PAMAM-KMUH。
[0072] 進(jìn)一步的，步驟（4)中所述的PAMAM-SH與KMUH的摩爾比優(yōu)選為1 :10。
[0073] 優(yōu)選的，步驟（4)中所述pH7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液中含10v/v%DMS0。
[0074] 本發(fā)明所述靶向硼制劑的制備方法步驟（5)PAMAM-KMUH與步驟（1)中得到的氧 化的mAbEGFR偶聯(lián)，PAMAM-KMUH上的酰肼與氧化的mAbEGFR上的羰基（C= 0)反應(yīng)得到 PAMAMiAbEGFR;
[0075] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟（5)中所述PAMAM-KMUH與氧化的mAbEGFR偶聯(lián) 為PAMAM-KMUH與氧化的mAbEGFR混合，室溫反應(yīng)24h，得到的偶聯(lián)物PAMAM-mAbEGFR。
[0076] 其中，步驟（5)中所述的PAMAM-KMUH與氧化的mAbEGFR的摩爾比優(yōu)選為10:1。
[0077] 進(jìn)一步的，所述步驟（5)還包括對(duì)得到的PAMAM-mAbEGFR進(jìn)行濃縮純化的步驟。
[0078] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述濃縮純化為通過(guò)超濾濃縮到I 再使用層析 色譜法純化，用pH7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液洗脫，得到PAMAM-mAbEGFR。
[0079] 優(yōu)選的，所述層析色譜法純化為Sephacryl S-300層析色譜柱純化。
[0080] 優(yōu)選的，所述濃縮純化中所述pH7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液中含lOv/v%DMS0。
[0081] 本發(fā)明所述靶向硼制劑的制備方法步驟（6)向PAMAM-mAbEGFR中加入多面體硼烷 (BSH)，負(fù)載wB原子得到靶向硼制劑。
[0082] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述步驟（6)中所述向PAMAM-mAbEGFR中加入BSH為 PAMAM-mAbEGFR載體溶液置于燒杯中，向其中逐步加入BSH，直至BSH不再溶解為止，放入 25°C恒溫?fù)u床中震蕩24小時(shí)，得到負(fù)載BSH的PAMAM-mAbEGFR載體（PAMAM-mAbEGFR/BSH) 的飽和溶液，飽和溶液過(guò)膜處理，收集濾液即得靶向硼制劑。
[0083] 其中，步驟（6)中所述的PAMAM-mAbEGFR與BSH的質(zhì)量比優(yōu)選為2:1。
[0084] 優(yōu)選的，所述過(guò)膜為過(guò)0. 22 μ m的膜。
[0085] 進(jìn)一步的，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述靶向硼制劑的制備方法中步驟（1)、（2)、（3)和 (4)中所述的反應(yīng)混合物脫鹽均使用SephadexG25層析色譜柱，以去除未反應(yīng)的小分子物 質(zhì)。
[0086] 本發(fā)明采用SDS-PAGE凝膠電泳、MTT、熒光顯微鏡、中子照射后的抑瘤效應(yīng)等方法 測(cè)試本發(fā)明制備的負(fù)載的多面體硼烷的耦聯(lián)表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體的樹(shù)枝狀大分 子，具體測(cè)試結(jié)果如下：
[0087] (I) SDS-PAGE凝膠電泳鑒定：
[0088] SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示mAbEGFR單體（分子量85KD左右）的條 帶對(duì)應(yīng)的分子量約在85KD左右，合成后的PAMAM-mAbEGFR條帶的分子量約在115KD左右， 且在85KD左右無(wú)可見(jiàn)條帶，表明經(jīng)層析純化后的PAMAM-mAbEGFR溶液中不含有未結(jié)合的 mAbEGFR。
[0089] (2) BSH 在 PAMAM-mAbEGFR/BSH 中承載劑量的確定：
[0090] 繪制硼標(biāo)準(zhǔn)品曲線，將PAMAM-mAbEGFR/BSH濾液稀釋到一定濃度，用感應(yīng)耦合等 離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES)檢測(cè)樣品硼的含量。載體中BSH的濃度根據(jù)載藥前后 BSH的差值來(lái)計(jì)算，得出負(fù)載在PAMAM-mAbEGFR上的BSH為280mg/g。
[0091] (3)細(xì)胞毒性考察：
[0092] 將不同濃度的合成材料PAMAM-mAbEGFR/BSH與細(xì)胞共同孵育不同時(shí)間，通過(guò)MTT 試驗(yàn)檢測(cè)增殖細(xì)胞活性，結(jié)果顯示負(fù)載BSH的靶向EGFR樹(shù)枝狀大分子對(duì)細(xì)胞增殖率沒(méi)有明 顯的影響，各組間無(wú)顯著差異（P>〇. 05)，說(shuō)明該合成材料有良好的生物相容性，沒(méi)有明顯的 毒性。
[0093] (4)生物活性檢測(cè)：
[0094] 將帶有綠色熒光的EGFR單克隆抗體mAbEGFR-FITC代替制備步驟（1)中的 mAbEGFR，使得制備所得負(fù)載BSH的靶向EGFR的樹(shù)枝狀大分子PAMAM-mAbEGFR-FITC/ BSH帶有綠色熒光。選用EGFR表達(dá)陽(yáng)性的U87MG細(xì)胞作為靶細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀 察細(xì)胞對(duì)PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH的內(nèi)吞情況。結(jié)果顯示PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH 在1μM時(shí)已有90 %以上U87MG細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，且強(qiáng)度較高，說(shuō)明此時(shí)已攝取大量 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH。
[0095] (5)穩(wěn)定性測(cè)試
[0096] 將制備的PAMAM-mAbEGFR/BSH溶液放置-20°C環(huán)境，分別于1，3，6個(gè)月取樣，觀察 溶液性狀，同時(shí)進(jìn)行BSH承載量和生物活性檢測(cè)。結(jié)果顯示PAMAM-mAbEGFR放置不同時(shí)間 BSH的承載量和合成物的生物活性沒(méi)有沒(méi)有明顯的改變。
[0097] (6)原位移植瘤模型裸鼠體內(nèi)硼C°B)生物分布檢測(cè)：
[0098] 建立裸鼠原位移植瘤模型，采用靜脈注射和對(duì)流增強(qiáng)傳送兩種方式向腫瘤細(xì)胞輸 送PAMAM-mAbEGFR/BSH，劑量相當(dāng)于BSH100mg/kg體重，裸鼠分批于注射后6h、12h、24h、 36h和48h收集血液后處死，分離腫瘤組織、正常腦組織、肝臟和腎臟，采用ICP-AES檢測(cè)樣 本中含wB的濃度。結(jié)果顯示高分子PAMAM-mAbEGFR/BSH經(jīng)靜脈注射無(wú)法到達(dá)腦組織和腦 腫瘤組織，對(duì)流增強(qiáng)傳送方式給藥能夠被腫瘤組織大量吸收。24h時(shí)PAMAM-mAbEGFR/BSH在 腫瘤組織內(nèi)已經(jīng)明顯擴(kuò)散，且硼含量符合BNCT要求，此時(shí)適合中子照射。
[0099] (7)BNCT的原位移植瘤裸鼠抑瘤效應(yīng)檢測(cè)：
[0100] 測(cè)試分為對(duì)照組（未照射）、X線照射組、INHI-I組（僅用中子照射）、BSH組和 PAMAM-mAbEGFR/BSH組。體外培養(yǎng)EGFR陽(yáng)性膠質(zhì)瘤細(xì)胞種植后出現(xiàn)明顯的顱內(nèi)移植瘤癥 狀時(shí)用于BNCT實(shí)驗(yàn)。BSH在靜脈注射后3h進(jìn)行中子照射是目前BNCT研究最常用的方式， 此時(shí)腫瘤硼濃度較高，且腫瘤與正常腦組織及腫瘤與血液硼濃度比值適合BNCT治療。其 中BSH組裸鼠于靜脈注射后3h進(jìn)行中子照射，PAMAM-mAbEGFR/BSH組裸鼠于對(duì)流增強(qiáng)傳送 注射后24h進(jìn)行中子照射，照射時(shí)間點(diǎn)硼濃度使用ICP-AES檢測(cè)，結(jié)果顯示兩組硼濃度有明 顯差異（P〈〇. 01)。BSH組腫瘤濃度為8. 65± 1.32μg/g，腫瘤與正常腦組織硼濃度比值為 2. 65,腫瘤與血液硼濃度比值為2. 02 ;PAMAM-mAbEGFR/BSH組腫瘤濃度為30. 54±0. 82μg/ g，腫瘤與正常腦組織硼濃度比值為11. 70,腫瘤與血液硼濃度比值為大于30。所有照射均 使用INHI-I在裸鼠麻醉后進(jìn)行，照射時(shí)使用富含鋰的照射盒遮擋中子射線，僅將腫瘤部位 暴露于照射盒的孔道處接受中子照射。INHI-I最大功率30KW，最大熱中子通量為1Χ109η/ (cm*s)，照射分為4MV-min和8MV-min。從照射之日算起，計(jì)算移植瘤裸鼠生存時(shí)間。采用 中位生存期（mediansurvivaltime，MeST)、平均生存時(shí)間（meansurvivaltime，MST)、 Kaplan-Meier生存曲線作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，可見(jiàn)給于PAMAM-mAbEGFR/BSH后進(jìn)行BNCT明顯提高 了顱內(nèi)移植瘤裸鼠的生存時(shí)間，與對(duì)照組比較（P〈〇. 01)、INHI-1組比較（P〈0. 01)、同劑量X 線組比較（P〈〇. 05)、BSH組比較（P〈0. 05)均有顯著差異。
[0101] 本發(fā)明所述靶向硼制劑能夠被表面高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞有 效攝取，并且能夠有效提高原位移植瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)硼的含量，用于腫瘤的硼中子俘獲 療法。因此本發(fā)明還提供了所述靶向硼制劑在制備硼中子俘獲療法的藥物中的應(yīng)用。
[0102] 本發(fā)明至少具有以下有益效果之一：
[0103] (1)本發(fā)明所述靶向硼制劑將大劑量的多面體硼烷（BSH)負(fù)載于樹(shù)枝狀大分子空 腔內(nèi)，明顯提高了硼原子的給藥量，具有包封率高和載藥量高的優(yōu)點(diǎn)，能夠滿(mǎn)足BNCT對(duì)硼 原子劑量的要求。
[0104] ⑵本發(fā)明所述靶向硼制劑連接有腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子受體的抗 體（mAbEGFR)，對(duì)腫瘤細(xì)胞有較好的的靶向性，增加腫瘤組織與正常腦組織攝取硼的差異， 減小中子照射時(shí)各種有意義射線對(duì)正常腦組織的損傷，同時(shí)穩(wěn)定性好、細(xì)胞毒性低。
[0105] (3)本發(fā)明所述靶向硼制劑能夠被表面高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體的人膠質(zhì)瘤 U87MG細(xì)胞有效攝取。
[0106] (4)本發(fā)明所述靶向硼制劑能夠有效提高原位移植瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)硼的含量， 經(jīng)中子照射后明顯延長(zhǎng)原位移植瘤裸鼠生存期。
[0107] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。其 中實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第 三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠 商所建議的條件。所述SPDP和KMUH購(gòu)于Pierce公司，PAMAM和DTT購(gòu)于Sigma公司。
[0108]實(shí)施例 I :PAMAM-mAbEGFR/BSH 的制備
[0109] (1)表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體mAbEGFR 0· Img與高碘酸鈉2mg在pH為4. 5的 0. IM醋酸鹽緩沖液Iml中混合，使用磁珠在室溫不停攪拌2h，反應(yīng)混合物經(jīng)S印hadexG25 層析色譜柱脫鹽，去除過(guò)量的高碘酸鈉，用pH 7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液洗脫，收集得到的 氧化的表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體；
[0110] (2)5%聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子（PAMM)溶液（Sigma公司）0. 58ml，其中含有 PAMAM 29mg，與3. 12mg SPDP在pH為7. 5的0· IM磷酸鹽緩沖液Iml中混合，室溫反應(yīng)2h， 反應(yīng)混合物經(jīng)S印hadexG25層析色譜柱脫鹽，去除未反應(yīng)的SPDP，用pH 7. 5的50mM磷酸 鹽緩沖液洗脫，得到中間體PAMAM-SPDP ;
[0111] (3)1.54mg DTT溶于pH 7. 5的0. IM磷酸鹽緩沖液Iml中，加入0. lgDMSO,配成含 10% DMSO的DTT溶液。配置的DTT溶液與步驟（2)反應(yīng)得到的PAMAM-SPDP混合，室溫反 應(yīng)30min。反應(yīng)混合物經(jīng)SephadexG25層析色譜柱脫鹽，用pH 7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液 (含10% DMS0)洗脫，去除未反應(yīng)的DTT，得到PAMAM-SH ;
[0112] (4)將反應(yīng)得到的PAMAM-SH與4. Img KMUH在DMSO中混合，室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)混 合物經(jīng)S印hadexG25層析色譜柱脫鹽，用pH 7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液（含10% DMS0)洗 脫，去除未反應(yīng)的KMUH，得到PAMAM-KMUH ;
[0113] (5)得到的PAMAM-KMUH與步驟（1)中得到的氧化的mAbEGFR混合，室溫反應(yīng)24h， 得到的耦聯(lián)物PAMAM-mAbEGFR，再使用S印hacryIS-300層析色譜柱純化，用pH7. 5的50mM 磷酸鹽緩沖液（含10%二甲基亞砜）洗脫，得到PAMAM-mAbEGFR，通過(guò)超濾濃縮到lml，冷凍 干燥成為白色粉末；
[0114] (6)PAMAMiAbEGFR載體0· Img加入雙蒸水中，攪拌均勻定容至1ml，向其中逐步加 入BSH，直至BSH不再溶解為止，此時(shí)加入BSH質(zhì)量為0. 05mg。放入25°C恒溫?fù)u床中震蕩 24小時(shí)，得到PAMAM-mAbEGFR載體負(fù)載的BSH(PAMAM-mAbEGFR/BSH)飽和溶液。飽和溶液過(guò) 膜（0. 22μm)處理，除去未溶解的BSH，收集濾液，得到PAMAM-mAbEGFR/BSH。
[0115] 合成過(guò)程中對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體單克隆抗體連接的樹(shù)狀大分子PAMAM-mAbEGFR 使用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0116] 由圖1結(jié)果可見(jiàn)，mAbEGFR在80kb左右出現(xiàn)條帶，而制備的PAMAM-mAbEGFR樣品 于IlOkba左右出現(xiàn)條帶，且80kb處無(wú)任何條帶，表明mAbEGFR與PAMAM已連接，且經(jīng)層析 純化后的收集液PAMM:mAbEGFR= 1:1連接。
[0117] 進(jìn)一步繪制硼標(biāo)準(zhǔn)品曲線，將PAMAM-mAbEGFR/BSH濾液稀釋到一定濃度，用感應(yīng) 耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-AES)檢測(cè)樣品硼的含量。載體中BSH的濃度根據(jù) 載藥前后BSH的差值來(lái)計(jì)算，得出負(fù)載在PAMAM-mAbEGFR上的BSH為280mg/g，即每摩爾 PAMAMiAbEGFR分子負(fù)載有BSH為 58. 8kg(58. 8kg/mol)。
[0118] 上述這些測(cè)試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計(jì)合成的載藥抗體連接的樹(shù)狀大分子 PAMAM-mAbEGFR/BSH〇
[0119] 實(shí)施例 2 :PAMAM-mAbEGFR/BSH的制備
[0120] (DmAbEGFR0· 3mg與高碘酸鈉6mg在pH為4. 5的0·IM醋酸鹽緩沖液3ml中混 合，使用磁珠在室溫不停攪拌2h，反應(yīng)混合物經(jīng)S印hadexG25層析色譜柱脫鹽，去除過(guò)量 的高碘酸鈉，用PH7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液洗脫，收集得到的氧化的表皮生長(zhǎng)因子受體單 克隆抗體；
[0121] (2)聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子PAMAM(Sigma公司）溶液I. 74ml，其中含PAMM 87mg，與9. 36mgSPDP在pH為ρΗ7· 5的0·IM磷酸鹽緩沖液3ml中混合，反應(yīng)2h，反應(yīng)混合 物經(jīng)S印hadexG25層析色譜柱脫鹽，去除未反應(yīng)的SPDP，用pH7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液 洗脫，得到中間體PAMAM-SPDP;
[0122] (3) 4. 62mgDTT溶于pH7. 5的0·IM磷酸鹽緩沖液3ml中，加入0· 3gDMS0,配成含 10%DMSO的DTT溶液。配置的DTT溶液與步驟（2)反應(yīng)得到的PAMAM-SPDP混合，室溫反 應(yīng)30min。反應(yīng)混合物經(jīng)SephadexG25層析色譜柱脫鹽，用pH7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液 (含10%DMS0)洗脫，去除未反應(yīng)的DTT，得到PAMAM-SH;
[0123] (4)將反應(yīng)得到的PAMAM-SH與12. 3mgKMUH在DMSO中混合，室溫反應(yīng)2h，反應(yīng)混 合物經(jīng)S印hadexG25層析色譜柱脫鹽，用pH7. 5的50mM磷酸鹽緩沖液（含10 %DMS0)洗 脫，去除未反應(yīng)的KMUH，得到PAMAM-KMUH;
[0124] (5)得到的PAMAM-KMUH與步驟（1)中得到的氧化的mAbEGFR混合，室溫反應(yīng)24h， 得到的PAMAM-mAbEGFR，再使用S印hacrylS-300層析色譜柱純化，用pH7. 5的50mM磷酸 鹽緩沖液（含10 %二甲基亞砜）洗脫，得到PAMAM-mAbEGFR，通過(guò)超濾濃縮到3ml，冷凍干燥 成為白色粉末；
[0125] (6)PAMAM-mAbEGFR載體0. 5mg加入雙蒸水中，攪拌均勻定容至5ml，向其中逐步加 入BSH，直至BSH不再溶解為止，此時(shí)加入BSH質(zhì)量為0. 25mg。放入25°C恒溫?fù)u床中震蕩 24小時(shí)，得到PAMAM-mAbEGFR載體負(fù)載的BSH(PAMAM-mAbEGFR/BSH)飽和溶液。飽和溶液過(guò) 膜（0. 22μm)處理，除去未溶解的BSH，收集濾液得到PAMAM-mAbEGFR/BSH;
[0126] 對(duì)PAMAM-mAbEGFR進(jìn)行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，結(jié)果同實(shí)施例1制 備的PAMAM-mAbEGFR，顯示mAbEGFR與PAMAM已連接，且經(jīng)層析純化后的收集液PAMAM: mAbEGFR= 1:1連接。進(jìn)一步以ICP-AES測(cè)定產(chǎn)物PAMAM-mAbEGFR/BSH中硼的含量，結(jié)果表 明PAMAM-mAbEGFR上的BSH為280mg/g，這些測(cè)試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計(jì)合成的載藥抗 體連接的樹(shù)狀大分子PAMAM-mAbEGFR/BSH。
[0127] 實(shí)施例3 :細(xì)胞毒性考察
[0128] 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞，以IO4個(gè)/孔接種于96孔板，37°C培養(yǎng) 24h后移棄培養(yǎng)液，PAMAM-mAbEGFR/BSH配制成 0、0. 01、0.l、l、5、10ymol/L共 6 個(gè)濃度梯 度的無(wú)血清培養(yǎng)基加入細(xì)胞中分別培養(yǎng)24、48和72h，吸去含藥培養(yǎng)液，每孔加入0. 2ml含 0. 5mg/mlMTT的無(wú)血清培養(yǎng)液，于37°C繼續(xù)孵育4h，吸去含有MTT的培養(yǎng)液，用PBS清洗2 次后，每孔加入0. 2mlDMS0,震蕩IOmin溶解均勻，酶標(biāo)儀570nm處測(cè)定吸光度A值，計(jì)算細(xì) 胞增殖率，結(jié)果見(jiàn)圖2。其中細(xì)胞增殖率的計(jì)算公式如下：
[0129] 細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值X100%。
[0130] 由圖2結(jié)果可見(jiàn)，PAMAM-mAbEGFR/BSH對(duì)細(xì)胞增殖率沒(méi)有明顯的影響，各組間無(wú)顯 著差異（P>〇. 05)，10μmol/LPAMAM-mAbEGFR/BSH在U87MG細(xì)胞中孵育72h最大抑制率細(xì) 胞增殖9. 55%，在最大給藥劑量的10倍濃度時(shí)仍未達(dá)到半數(shù)致死量，說(shuō)明PAMAM-mAbEGFR/ BSH細(xì)胞毒性較低，具有良好的生物相容性。
[0131] 實(shí)施例4 :生物活性檢測(cè)
[0132] 將帶有綠色熒光的EGFR單克隆抗體mAbEGFR-FITC代替制備步驟⑴中 的mAbEGFR，使得制備所得負(fù)載多面體硼烷的靶向表皮生長(zhǎng)因子受體的樹(shù)枝狀大分子 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH帶有綠色熒光。其他制備步驟與本發(fā)明產(chǎn)品PAMAM-mAbEGFR/ BSH完全相同。EGFR表達(dá)陽(yáng)性的人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的 高糖DMEM培養(yǎng)基中。以IO5個(gè)/孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h貼壁，加入含有IyM的 PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH的無(wú)血清培養(yǎng)液，于37°C培養(yǎng)24h，PBS清洗兩次，換常規(guī)培養(yǎng)液， 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH的內(nèi)吞情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0133] 圖2結(jié)果顯示PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH在1μM時(shí)已有90%以上U87MG細(xì)胞出現(xiàn) 綠色熒光，且強(qiáng)度較高，說(shuō)明此時(shí)已攝取大量PAMAM-mAbEGFR-FITC/BSH。
[0134] 實(shí)施例5 :穩(wěn)定性測(cè)試
[0135]將實(shí)施例1制備的PAMAM-mAbEGFR/BSH溶液放置-20°C環(huán)境，分別于1，3，6個(gè)月取 樣，觀察溶液性狀，同時(shí)進(jìn)行BSH承載量和生物活性檢測(cè)。測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。
[0136] 表IPAMAM-mAbEGFR放置不同時(shí)間對(duì)BSH承載量和生物活性測(cè)試
[0137]

【權(quán)利要求】
1. 一種靶向硼制劑，由聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子、表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體和多面體 硼烷組成，所述聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子上連接所述表皮生長(zhǎng)因子受體的抗體，內(nèi)部負(fù)載 所述多面體硼烷。
2. -種靶向硼制劑的制備方法，通過(guò)3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯和 十一酸馬來(lái)酰亞胺-酰肼-三氟乙酸鹽將聚酰胺一胺樹(shù)狀大分子和表皮生長(zhǎng)因子抗體相連 接后形成功能化樹(shù)狀大分子，然后負(fù)載多面體硼烷得到所述靶向硼制劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，具體包括以下步驟： (1) 表皮生長(zhǎng)因子受體抗體與高碘酸鈉反應(yīng)，得到氧化的表皮生長(zhǎng)因子受體抗體； (2) 聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子與3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)， 得到中間體PAMAM-SPDP ; (3) 步驟（2)反應(yīng)得到的中間體PAMAM-SPDP與DTT反應(yīng)得到PAMAM-SH ; (4) 步驟（3)反應(yīng)得到的PAMAM-SH與十一酸馬來(lái)酰亞胺-酰肼-三氟乙酸鹽反應(yīng)得到 PAMAM-KMUH ； (5) 步驟（4)反應(yīng)得到的PAMAM-KMUH與步驟（1)中得到的氧化的mAbEGFR偶聯(lián)得到 PAMAM-mAbEGFR ； (6) 向步驟（5)反應(yīng)得到的PAMAM-mAbEGFR中加入多面體硼烷BSH，得到所述靶向硼制 劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，步驟（1)中所述的表皮生長(zhǎng)因子受體抗體與高碘 酸鈉摩爾比為1 :10。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，步驟（2)中所述的聚酰胺一胺樹(shù)枝狀大分子與 3-(2-吡啶二巰基）丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1 :10。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，步驟（3)中所述的PAMAM-SPDP與DTT的摩爾比為 1 :10。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，步驟⑷中所述的PAMAM-SH與i^一酸馬來(lái)酰亞 胺-酰肼-三氟乙酸鹽的摩爾比為1 :1〇。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，步驟（5)中所述的PAMAM-KMUH與氧化的表皮生長(zhǎng) 因子受體抗體的摩爾比為10 :1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，步驟（6)中所述的PAMAM-mAbEGFR與多面體硼烷 的質(zhì)量比為2 :1。
10. 權(quán)利要求1所述靶向硼制劑在制備硼中子俘獲療法的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104399094SQ201410609140
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月3日
【發(fā)明者】孫婷, 周幽心, 王中 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院