高血糖素樣肽1(glp-1)藥物制劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及高血糖素樣肽1(GLP-1)藥物制劑。具體地，本發(fā)明公開(kāi)了在體內(nèi)和體外均穩(wěn)定的一種組合物，所述組合物包含與二酮哌嗪(DKP)組合的高血糖素樣肽1(GLP-1)顆粒。該組合物可用作治療疾病的藥物制劑，所述疾病如糖尿病、癌癥和肥胖癥但不僅限于這類(lèi)疾病或病癥。本組合物尤其可用作肺部遞送的藥物制劑。
【專(zhuān)利說(shuō)明】高血糖素樣肽1 (GLP-1)藥物制劑
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的奪叉引用
[0002] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年4月16日、名稱(chēng)為"高血糖素樣肽I(GLP-I)藥物制劑" 的第200780013424. X號(hào)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0003] 本申請(qǐng)是2003年7月22日遞交的美國(guó)申請(qǐng)No. 10/632,878的部分繼續(xù)申請(qǐng) (continuation-in-part),并根據(jù) 35U.S.C. § 119(e)要求2006年4 月 14 日遞交的美國(guó)臨 時(shí)申請(qǐng)No. 60/744, 882的優(yōu)先權(quán)。每份上述優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004] 本發(fā)明涉及藥物制劑的領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)了包含與高血糖素樣肽 l(Glucagon-Like Peptide 1，GLP-1)組合的二酮哌嗪（DKP)顆粒的干粉制劑。本發(fā)明可用 作治療疾病的藥物制劑，所述疾病如糖尿病、癌癥和肥胖癥但不僅限于這類(lèi)疾病。本發(fā)明更 尤其可用作肺部遞送的藥物制劑。

【背景技術(shù)】
[0005] 文獻(xiàn)中公開(kāi)的高血糖素樣肽I (GLP-I)是30或31個(gè)氨基酸的增泌素（incretin)， 其響應(yīng)來(lái)自進(jìn)餐的脂肪、碳水化合物攝取和蛋白質(zhì)而從腸內(nèi)分泌L細(xì)胞中被釋放。發(fā)現(xiàn)在 患有2型糖尿病的個(gè)體中該肽激素的分泌受損，使其成為治療該疾病和其他相關(guān)疾病的可 能候選者。
[0006] 在無(wú)疾病的狀態(tài)下，GLP-I響應(yīng)經(jīng)口攝取的養(yǎng)分（尤其是糖）從腸 L細(xì)胞中分泌， 刺激來(lái)自胰腺的進(jìn)餐誘導(dǎo)的胰島素釋放，抑制來(lái)自肝的高血糖素釋放，以及對(duì)消化道和腦 的其他效應(yīng)。胰腺中的GLP-I效應(yīng)是依賴(lài)于葡萄糖的，使得外源肽施用期間的低血糖風(fēng)險(xiǎn) 最小化。GLP-I還促進(jìn)了胰島素生物合成中的所有步驟，并直接刺激β-細(xì)胞生長(zhǎng)和存活以 及β_細(xì)胞分化。這些效應(yīng)的組合導(dǎo)致提高的β_細(xì)胞量。另外，GLP-I受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo) 致β-細(xì)胞凋亡的減少，這進(jìn)一步有助于提高的β-細(xì)胞量。
[0007] 在胃腸道中，GLP-I抑制GI活動(dòng)力，提高響應(yīng)葡萄糖的胰島素分泌，并降低高血糖 素的分泌，從而有助于減少葡萄糖偏差（glucose excursion)。哨齒類(lèi)中GLP-I的中樞施 用已經(jīng)顯示抑制食物攝取，提示外周降低的GLP-I可直接影響腦。這是可行的，因?yàn)橐呀?jīng)顯 示循環(huán)的GLP-I能夠達(dá)到某些腦區(qū)中的GLP-I受體；即穹隆下器官和最后區(qū)。已知腦的這 些區(qū)域涉及食欲和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)解。有趣的是，胃膨脹激活孤束的動(dòng)眼神經(jīng)核中含GLP-I 的神經(jīng)元，預(yù)示著中樞表達(dá)的GLP-I作為食欲抑制劑的作用。這些假設(shè)由使用GLP-I受體 拮抗劑--毒蜥外泌肽（9-39)的研究支持，所述研究中觀(guān)察到相反作用。在人中，施用的 GLP-I具有飽足效應(yīng)（Verdich et al.，2001)，當(dāng)在6周期間通過(guò)連續(xù)的皮下灌輸提供時(shí)， 糖尿病患者顯示食欲降低，這導(dǎo)致體重的顯著減輕（Zander et al.，2002)。
[0008] GLP-I還已顯示在患有2型糖尿病的患者中有效，當(dāng)作為連續(xù)皮下灌輸提供時(shí)，其 提高胰島素分泌并使得禁食和餐后血糖二者正常化（Nauck et al.，1993)。另外，GLP-I的 灌輸已經(jīng)顯示降低下述患者的葡萄糖水平：先前用非胰島素口服藥物治療的患者和磺酰脲 治療失敗后需要胰島素治療的患者（Nauck et al.，1993)。然而，如本領(lǐng)域中和下面本文中 所記錄到的，單一皮下注射GLP-I的作用提供了令人失望的結(jié)果。盡管達(dá)到了免疫反應(yīng)性 GLP-I的高血漿水平，但是胰島素分泌快速地返回處理前的值，血糖濃度未被正?；∟auck et al.，1996)。只有進(jìn)行重復(fù)的皮下施用時(shí)，對(duì)禁食血糖的作用才能夠比得上靜脈施用 (Nauck et al.，1996)。連續(xù)皮下施用6周顯示降低禁食和餐后葡萄糖濃度并降低HbAlc 水平（Zander et al.，2002)。單一皮下注射GLP-I的短暫效果與其循環(huán)的不穩(wěn)定性相關(guān)。 有證據(jù)表明GLP-I由血漿體外代謝，酶二肽基肽酶-IV (DPP-IV)負(fù)責(zé)該降解（Mentlein et al.，1993)。
[0009] 考慮到GLP-I在糖尿病患者中的生理學(xué)顯著性和外源GLP-I在健康受試者和2 型糖尿病受試者二者中被快速氨基酸末端降解的事實(shí)，許多研究已經(jīng)致力于操作GLP-I的 體內(nèi)穩(wěn)定性作為治療糖尿病的抗糖尿病劑的新穎途徑的可能性（Deacon et al.，2004)。 已經(jīng)研究了兩種獨(dú)立的途徑：1)開(kāi)發(fā)對(duì)酶降解不敏感的GLP-I類(lèi)似物，和2)使用選 擇性酶抑制劑防止體內(nèi)降解并提高完整的、生物活性肽的水平。已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中研 究了抗降解的、名為"增泌素模擬物"的長(zhǎng)效GLP-I類(lèi)似物（例如Liraglutide (Novo Nordisk, Copenhagen,丹麥）；exenatide (毒晰外泌膚-4 ; Byetta? ) (Amylin Inc.，San Diego, CA)和 exenatide-LAR, Eli Lilly, Indianapolis, IN)。抑制負(fù)責(zé)增泌素降解的酶的 二肽基肽酶IV抑制劑（例如由Novartis, Basel,瑞士開(kāi)發(fā)的Vildagliptin (Galvus))和 由 Merck, Whitehouse Station, New Jersey 開(kāi)發(fā)的 Januvia(sitagliptin))也在研究中 (Deacon et al.，2004)。因此，GLP-I的多種作用模式（例如提高的胰島素釋放、延遲的胃 排空和提高的飽滿(mǎn)感）與其低的低血糖傾向似乎為它帶來(lái)了超過(guò)目前可獲得的療法的優(yōu) 點(diǎn)。
[0010] 然而，盡管GLP-I治療中有這些途徑/進(jìn)步，目前糖尿病患者可獲得的藥物均不能 夠在所有的患者中達(dá)到目的（HbAlc、禁食血糖、葡萄糖偏差），且它們均不能避免副作用如 毒性、低血糖、體重增加、惡心和來(lái)自嘔吐的壓力。因此在本領(lǐng)域中，仍然需要作為藥物施用 時(shí)具有長(zhǎng)期效用和最優(yōu)吸收的穩(wěn)定的GLP-I制劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 用作藥物的穩(wěn)定的、可吸入的高血糖素樣肽I (GLP-I)制劑是本領(lǐng)域缺乏的。為了 克服本領(lǐng)域中的缺陷，本發(fā)明提供了與二酮哌嗪（DKP)顆粒組合的、作為藥物的GLP-I制 劑。
[0012] 因此，在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，提供了包含GLP-I分子和二酮哌嗪或其可 藥用鹽的干粉組合物。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的干粉組合物包含選自下組的GLP-I 分子，所述組由天然GLP-1、GLP-I代謝產(chǎn)物、GLP-I類(lèi)似物、GLP-I衍生物、二肽酰-肽 酶-IV(DPP-IV)保護(hù)的GLP-I、GLP-I模擬物、毒蜥外泌肽（exendin)、GLP-I肽類(lèi)似物或 生物合成的GLP-I類(lèi)似物組成。還在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，干粉組合物包含具有式 2, 5-二酮-3, 6-二（4-X-氨丁基）哌嗪的二酮哌嗪，其中X選自由琥珀?；⑽於；ⅠR 來(lái)?；透获R酰基組成的組。在另一實(shí)施方案中，干粉組合物包含二酮哌嗪鹽。還在本發(fā)明 的另一實(shí)施方案中提供了干粉組合物，其中二酮哌嗪為2, 5-二酮-3, 6-二（4-富馬酰-氨 丁基）哌嗪。
[0013] 本發(fā)明還包括干粉組合物，其中GLP-I分子為天然的GLP-I或酰胺化的GLP-I分 子，其中酰胺化的GLP-I分子是GLP-I (7-36)酰胺。
[0014] 還在本發(fā)明的另一具體的實(shí)施方案中，提供了用于制備包含GLP-I分子和二酮哌 嗪的顆粒的方法，所述方法包括步驟：提供包含GLP-I分子的GLP-I溶液；提供能形成顆 粒的二酮哌嗪溶液或二酮哌嗪顆粒的懸浮液；和將GLP-I溶液與二酮哌嗪溶液或懸浮液組 合。在本發(fā)明的其他具體的實(shí)施方案中，用于制備包含GLP-I分子和二酮哌嗪的顆粒的方 法還包括通過(guò)凍干法、過(guò)濾或噴霧干燥從溶液或懸浮液中去除溶劑。還在又一實(shí)施方案中， 本發(fā)明的顆粒通過(guò)去除溶劑形成，或在去除溶劑之前形成。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在用于制備具有GLP-I分子和二酮哌嗪的顆粒的方 法中，提供了選自下組的GLP-I分子，所述組由天然的GLP-UGLP-I類(lèi)似物、GLP-I衍生物、 二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護(hù)的GLP-UGLP-I模擬物、毒蜥外泌肽、GLP-I肽類(lèi)似物或生物 合成的GLP-I類(lèi)似物組成。在另一實(shí)施方案中，用于制備具有GLP-I分子和二酮哌嗪的顆 粒的方法包括以顆粒懸浮液形式提供提供的二酮哌嗪。在又一實(shí)施方案中，二酮哌嗪在溶 液中提供，且該方法包括調(diào)節(jié)溶液的PH，從而沉淀二酮哌嗪并形成顆粒。
[0016] 在本發(fā)明的其他具體實(shí)施方案中，GLP-I溶液處于約1 μ g/ml-50mg/ml、更優(yōu)選 地約0. lmg/ml-10mg/ml的濃度。還在本發(fā)明另一具體的實(shí)施方案中，GLP-I溶液處于約 0· 25mg/ml 的濃度。
[0017] 在用于制備含GLP-I分子和二酮哌嗪顆粒的另一方法中，該方法還包括向溶液 中添加一種試劑，其中所述試劑選自鹽、表面活性劑、離子、滲透物（osmolyte)、離液劑 (chaotrope)和感膠離子（Iyotrope)、酸、堿和有機(jī)溶劑。該試劑促進(jìn)GLP-I和二酮哌嗪 顆粒之間的締合，還改進(jìn)GLP-I分子的穩(wěn)定性和/或藥物動(dòng)力學(xué)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方 案中，該試劑為鹽，例如但不限于氯化鈉。還考慮了該試劑可以是表面活性劑，例如但不 限于 Tween、Triton、pluronic acid、CHAPS、cetrimide 和 Bri j、H(CH2)7S04Na。該試劑可 以是離子，例如陽(yáng)離子或陰離子。該試劑可以是滲透物（穩(wěn)定劑），例如但不限于己二醇 (Hexylene-Glycol, Hex-Gly)、海藻糖、甘氨酸、聚乙二醇（PEG)、三甲胺η-氧化物（TMAO)、 甘露醇和脯氨酸。該試劑可以是離液劑或感膠離子，例如但不限于氯化銫、檸檬酸鈉和硫酸 鈉。該試劑可以是有機(jī)溶劑，例如選自甲醇（MeOH)、乙醇（EtOH)、三氟代乙醇（TFE)和六氟 異丙醇（HFIP)的醇。
[0018] 在本發(fā)明的另一具體實(shí)施方案中，考慮了用于制備含GLP-I分子和二酮哌嗪的顆 粒的方法，其中該方法包括將顆粒懸浮液的PH調(diào)節(jié)至約4或更大。在本發(fā)明的其他實(shí)施方 案中，用于制備顆粒的方法包括GLP-I分子和二酮哌嗪，其中顆粒中的GLP-I分子具有更大 的穩(wěn)定性。
[0019] 本發(fā)明中還考慮了對(duì)需要的受試者施用有效量的GLP-I分子的方法，包括對(duì)受試 者提供GLP-I/二酮哌嗪顆粒。該施用方法可以是靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、經(jīng)直腸或 通過(guò)肺部遞送，但不僅限于此。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用方法是通過(guò)肺部遞送。還在本發(fā)明 的又一實(shí)施方案中，施用的方法包括治療選自下組的病癥或疾病，所述組由糖尿病、局部缺 血、再灌注組織損傷、血脂障礙、糖尿病性心臟病、心肌梗塞、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、肥胖癥、 手術(shù)后的分解代謝改變、高血糖癥、過(guò)敏性腸綜合征、中風(fēng)、神經(jīng)變性病癥、記憶和學(xué)習(xí)障 礙、胰島細(xì)胞移植和再生性治療組成。
[0020] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中施用GLP-I/二酮哌嗪顆粒組合物的方法導(dǎo)致改進(jìn)的 GLP-I藥物代謝動(dòng)力學(xué)半衰期和生物利用度。
[0021] 還在本發(fā)明的又一具體實(shí)施方案中，提供了制備具有改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式 的干粉組合物的方法，該方法包括步驟：提供GLP-I分子的溶液；提供能形成顆粒的二酮哌 嗪；形成顆粒；和將GLP-I與二酮哌嗪組合；和之后通過(guò)干燥的方法去除溶劑，獲得干粉，其 中所述干粉具有改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式。經(jīng)改進(jìn)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式包括提高的 GLP-I半衰期和/或經(jīng)改進(jìn)的GLP-I生物利用度。提高的GLP-I半衰期大于或等于7. 5分 鐘。
[0022] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含GLP-I分子和二酮哌嗪組合物或其可藥 用鹽的干粉組合物。在另一實(shí)施方案中，GLP-I分子選自由以下組成的組：天然GLP-1、 GLP-I代謝產(chǎn)物、GLP-I類(lèi)似物、GLP-I衍生物、二肽酰-肽酶-IV(DPP-IV)保護(hù)的GLP-I、 GLP-I模擬物、GLP-I肽類(lèi)似物或生物合成的GLP-I類(lèi)似物。
[0023] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，二酮哌嗪是具有式2, 5-二酮-3,6-二（4-X-氨 丁基）哌嗪的二酮哌嗪，其中X選自由琥珀?；?、戊二酰基、馬來(lái)?；透获R?；M成的 組。在另一實(shí)施方案中，二酮哌嗪是二酮哌嗪鹽。在另一實(shí)施方案中，二酮哌嗪是2, 5-二 酮-3, 6-二（4-富馬酰-氨丁基）哌嗪。
[0024] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，GLP-I分子是天然的GLP-1。在另一實(shí)施方案 中，GLP-I分子是酰胺化的GLP-I分子。在另一實(shí)施方案中，酰胺化的GLP-I分子是 GLP-I (7-36)酰胺。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了形成包含GLP-I分子和二酮哌嗪的顆粒的方 法，該方法包括步驟：提供GLP-I分子；提供下述形式的二酮哌嗪，所述形式選自能形成顆 粒的二酮哌嗪、二酮哌嗪顆粒及其組合；和將GLP-I分子與二酮哌嗪以共溶液的形式組合， 其中形成包含GLP-I分子和二酮哌嗪的顆粒。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括通過(guò)凍干法、過(guò)濾或噴霧干燥從所述 共溶液中去除溶劑。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)去除溶劑形成包含所述GLP-I分子和二酮哌 嗪的顆粒。在另一實(shí)施方案中，在去除溶劑之前形成包含所述GLP-I分子和二酮哌嗪的顆 粒。
[0027] 在另一實(shí)施方案中，GLP-I分子選自由以下組成的組：天然的GLP-1、GLP-I類(lèi)似 物、GLP-I衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護(hù)的GLP-UGLP-I模擬物、GLP-I肽類(lèi)似物或 生物合成的GLP-I類(lèi)似物。在另一實(shí)施方案中，GLP-I分子以溶液的形式提供，所述溶液包 含約1 μ g/ml-50mg/ml的GLP-I濃度。在另一實(shí)施方案中，GLP-I分子以溶液的形式提供， 所述溶液包含約〇. lmg/ml-10mg/ml的GLP-I濃度。在另一實(shí)施方案中，GLP-I分子以溶液 的形式提供，所述溶液包含約〇. 25mg/ml的GLP-I濃度。
[0028] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，二酮哌嗪以二酮哌嗪顆粒懸浮液的形式提供。在另 一實(shí)施方案中，二酮哌嗪以包含能形成顆粒的二酮哌嗪的溶液的形式提供，該方法還包括 調(diào)節(jié)溶液的PH以形成二酮哌嗪顆粒。在另一實(shí)施方案中，該方法還包括向所述溶液或懸 浮液中添加下述試劑，其中所述試劑選自由鹽、表面活性劑、離子、滲透物、離液劑和感膠離 子、酸、堿和有機(jī)溶劑組成的組。在另一實(shí)施方案中，該試劑促進(jìn)GLP-I分子和二酮哌嗪顆 ?；蚰苄纬深w粒的二酮哌嗪之間的締合。在另一實(shí)施方案中，該試劑改善GLP-I分子的穩(wěn) 定性或藥物動(dòng)力學(xué)。在另一實(shí)施方案中，該試劑為氯化鈉。
[0029] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該方法還包括調(diào)節(jié)懸浮液或溶液的pH。在另一實(shí)施 方案中，pH被調(diào)節(jié)至約4.0或更大。還在另一實(shí)施方案中，顆粒中的GPL-I分子具有比天 然GPL-I更大的穩(wěn)定性。
[0030] 在另一實(shí)施方案中，共溶液包含約1 μ g/ml-50mg/ml的GLP-I濃度。在另一實(shí)施 方案中，共溶液包含約〇. lmg/ml-10mg/ml的GLP-I濃度。在另一實(shí)施方案中，共溶液包含 約 0· 25mg/ml 的 GLP-I 濃度。
[0031] 還在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，該方法還包括向共溶液中添加下述試劑，其中所 述試劑選自由鹽、表面活性劑、離子、滲透物、離液劑和感膠離子、酸、堿和有機(jī)溶劑組成的 組。在另一實(shí)施方案中，該試劑促進(jìn)GLP-I分子和二酮哌嗪顆粒或能形成顆粒的二酮哌嗪 之間的締合。在另一實(shí)施方案中，該試劑改善GLP-I分子的穩(wěn)定性或藥物動(dòng)力學(xué)。在另一 實(shí)施方案中，該試劑為氯化鈉。
[0032] 在另一實(shí)施方案中，該方法還包括調(diào)節(jié)共溶液的pH。在另一實(shí)施方案中，pH被調(diào) 節(jié)至約4. 0或更大。
[0033] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了對(duì)需要的受試者施用有效量的GLP-I分子的 方法，包括對(duì)受試者提供包含GLP-I和二酮哌嗪的顆粒。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈內(nèi)、 皮下、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、經(jīng)直腸或通過(guò)肺部遞送完成提供。在其他實(shí)施方案中，通過(guò)肺部遞 送完成提供。
[0034] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該需要包括對(duì)選自下組的病癥或疾病的治療,所述組由糖 尿病、局部缺血、再灌注組織損傷、血脂障礙、糖尿病性心臟病、心肌梗塞、急性冠狀動(dòng)脈綜 合征、肥胖癥、手術(shù)后的分解代謝改變、高血糖癥、過(guò)敏性腸綜合征、中風(fēng)、神經(jīng)變性病癥、記 憶和學(xué)習(xí)障礙、胰島細(xì)胞移植和再生性治療組成。
[0035] 在另一實(shí)施方案中，顆粒的提供導(dǎo)致與天然GLP-I分子相比改進(jìn)的GLP-I藥物代 謝動(dòng)力學(xué)半衰期和生物利用度。
[0036] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了形成具有改進(jìn)的GLP-I藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式 的粉末組合物的方法，該方法包括步驟：提供GLP-I分子；提供溶液中的能形成顆粒的二酮 哌嗪；形成二酮哌嗪顆粒；將GLP-I分子與溶液組合形成共溶液；和通過(guò)噴霧干燥從共溶液 中去除溶劑，形成具有改進(jìn)的GLP-I藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式的粉末。
[0037] 在另一實(shí)施方案中，改進(jìn)的GLP-I藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式包括提高的GLP-I半衰期。 在另一實(shí)施方案中，提高的GLP-I半衰期大于或等于7. 5分鐘。在另一實(shí)施方案中，改進(jìn)的 GLP-I藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式包括與天然GLP-I相比改進(jìn)的GLP-I生物利用度。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0038] 以下附圖構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分，用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的特定方面。通過(guò)以下 附圖，并結(jié)合【具體實(shí)施方式】的詳細(xì)描述，可以更好地理解本發(fā)明。
[0039] 圖1A-1D. GLP-I在多種濃度下的結(jié)構(gòu)分析（pH 4, 20°C )。圖1A-GLP-1的遠(yuǎn)-UV圓 二色性（CD)闡述了隨著濃度的提高，肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)從主要為無(wú)組織的構(gòu)象轉(zhuǎn)化為螺旋構(gòu) 象。圖IB-近-UV CD闡述了三級(jí)結(jié)構(gòu)隨著提高的肽濃度而增加，提示GLP-I的自身締合。 圖IC -由280nm處色氨酸激發(fā)引起的多種濃度下GLP-I (pH 4, 20°C )的熒光發(fā)射。圖ID - 多種濃度下GLP-I (pH 4, 20°C )的透射FTIR。1656CHT1處的酰胺I條帶表明在彡2mg/mL的 濃度下GLP-I具有α -螺旋結(jié)構(gòu)。
[0040] 圖2A-2D.在多種離子強(qiáng)度下（pH 4, 20°C )低濃度GLP-I的結(jié)構(gòu)分析。圖 2A-1. Omg/mL GLP-I的遠(yuǎn)-UV⑶闡明了提高鹽濃度將無(wú)序的GLP-I結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為更有序的 α -螺旋結(jié)構(gòu)。圖2B - I. Omg/mL肽的近-UV⑶證實(shí)了提高NaCl濃度也增強(qiáng)GLP-I的三 級(jí)結(jié)構(gòu)。圖2C -在280nm處色氨酸激發(fā)后多種NaCl濃度下（pH 4, 20°C ) I. Omg/mL GLP-I 的內(nèi)熒光發(fā)射。在高肽濃度下，最大值強(qiáng)度降低并遷移至更短的波長(zhǎng)，這指示了明確定義 的三級(jí)結(jié)構(gòu)。圖2D -在多種離子強(qiáng)度下（pH 4,20°C)10mg/mL GLP-I的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。 近-UV CD譜證實(shí)提高的離子強(qiáng)度增強(qiáng)了自身締合的GLP-I的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0041] 圖3A-3B.多種溫度下（pH 4)10mg/mL GLP-I的結(jié)構(gòu)分析。圖3A-近-UV CD闡 明了提高的溫度下GLP-I寡聚物解離。圖3B-多種溫度下（pH 4) 10mg/mL GLP-I的結(jié)構(gòu)分 析。圖3C-多種溫度下（pH 4)0. 05mg/mL GLP-I的結(jié)構(gòu)分析。遠(yuǎn)-UV⑶闡明了肽對(duì)溫度 是不敏感的。
[0042] 圖 4A-4B.多種 pH 下（20°C )GLP-1 的結(jié)構(gòu)分析。圖 4A-多種 pH 下（20°C ) IOmg/ mL GLP-I的遠(yuǎn)-UV⑶。當(dāng)pH被提高時(shí)，自身締合的GLP-I在pH 6. 3和7. 6之間沉淀，但 是在pH 1. 5和11. 7時(shí)保留螺旋結(jié)構(gòu)。圖4B -放大pH 7. 6處的譜系揭示GLP-I的二級(jí)結(jié) 構(gòu)是無(wú)序的，由濃度降低引起。
[0043] 圖5.通過(guò)HPLC證實(shí)的lmg/mL GLP-I對(duì)脫酰胺作用和氧化作用二者的抗性。通 過(guò)將GLP-I在pH 10. 5時(shí)于40°C孵育5天達(dá)到脫酰胺條件。通過(guò)將GLP-I在0. 1 % H2O2中 于室溫下孵育2小時(shí)達(dá)到氧化條件。
[0044] 圖 6A-6B.攪動(dòng)對(duì) I. 5mg/mL GLP-I 和 9. 4mg/mL GLP-I (pH 4)的三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。 近-UV CD (圖6A)和GLP-I的熒光發(fā)射（圖6B)均闡明了 GLP-I肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)不由于攪動(dòng) 而顯著改變。樣品在室溫下攪動(dòng)30和90分鐘并在280nm處色氨酸激發(fā)后收集熒光發(fā)射譜。
[0045] 圖7A-7C. 10次凍融循環(huán)對(duì)I. 6、5. 1和8. 4mg/mL GLP-I (pH 4)三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。 近-UV⑶（圖7A)和GLP-I的熒光發(fā)射（圖7B)均顯示肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)不因?yàn)槎嘀貎鋈谘h(huán) 而顯著改變。樣品冷凍于-20°C下并在室溫下解凍。在280nm處色氨酸激發(fā)后收集熒光發(fā) 射譜。通過(guò)遠(yuǎn)-UV⑶進(jìn)行類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)顯示11次凍融循環(huán)對(duì)10mg/mL GLP-UpH 4) 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響（圖7C)。
[0046] 圖8A-8B.鹽研究。作為pH和NaCl濃度的函數(shù)的GLP-1/FDKP負(fù)載曲線(xiàn)（圖8A)。 在5mg/mL FDKP和0· 25mg/mL GLP-I下進(jìn)行負(fù)載。NaCl濃度以mM表示。圖8B -作為pH 和NaCl濃度的函數(shù)，描述了在重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中檢測(cè)的GLP-I量。
[0047] 圖9A-9B.表面活性劑研究。作為pH和表面活性劑的函數(shù)的GLP-1/FDKP負(fù)載曲 線(xiàn)（圖9A)。在5mg/mL FDKP和0· 25mg/mL GLP-I下進(jìn)行負(fù)載。圖9B -作為pH和添加的 表面活性劑的函數(shù)，描述了在重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中檢測(cè)的GLP-I量。
[0048] 圖10A-10D.離子研究。作為pH和離子的函數(shù)的GLP-1/FDKP負(fù)載曲線(xiàn)。在5mg/ mL FDKP和(λ 25mg/mL GLP-I下進(jìn)行負(fù)載（圖IOA和11C)。離子濃度在圖例中示出（mM)。 右側(cè)曲線(xiàn)描述IM NaCl的結(jié)果。圖IOB和IOD -作為pH、離子和IM NaCl的函數(shù)，描述了在 重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中檢測(cè)的GLP-I量。
[0049] 圖11 A -11B.滲透物研究。作為pH的函數(shù)和存在常見(jiàn)穩(wěn)定劑（滲透物）時(shí)的 GLP-1/FDKP 負(fù)載曲線(xiàn)（圖 11A)。在 5mg/mL FDKP 和 0. 25mg/mL GLP-I 下進(jìn)行負(fù)載。圖 IlB-作為pH和滲透物的函數(shù)，描述了在重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中檢測(cè)的GLP-I量。"N/ A "表示樣品中不存在滲透物。
[0050] 圖12A-12B.離液劑/感膠離子研究。作為pH 3. 0(圖12A)和pH 4. 0(圖12C) 下離液劑或感膠離子濃度的函數(shù)的GLP-1/FDKP負(fù)載曲線(xiàn)。在5mg/mL FDKP和0. 25mg/mL GLP-I下進(jìn)行負(fù)載。圖12B和12D -作為pH的函數(shù)和存在多種離液劑或感膠離子時(shí)，描述 了在重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中檢測(cè)的GLP-I量。"N/A"表示樣品中不存在離液劑或感膠離 子。
[0051] 圖13A-13B.醇研究。作為pH和醇的函數(shù)的GLP-1/FDKP負(fù)載曲線(xiàn)。在5mg/mL FDKP和0. 25mg/mL GLP-I下進(jìn)行負(fù)載。對(duì)每種醇評(píng)價(jià)四種醇濃度，5%、10%、15%和20% v/v(圖13A)。TFE =三氟代乙醇；HFIP =六氟異丙醇。圖13B -作為pH和醇（20% )的 函數(shù)，描述了在重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中檢測(cè)的GLP-I量。
[0052] 圖14A-14B.來(lái)自GLP-1/FDKP濃度研究的負(fù)載（圖14A)。負(fù)載在5mg/mL FDKP下 進(jìn)行，分析的GLP-I濃度列于X軸中。圖14B -多種GLP-1/FDKP配方（放大IOOOOx倍）的 掃描電子顯微術(shù)（SEM)圖像顯示球形和棒狀GLP-1/FDKP顆粒組成。（圖A)0. 5mg/mL GLP-I 和 2. 5mg/mL FDKP ;(圖 B) 0· 5mg/mL GLP-I 和 10mg/mL FDKP ;(圖 C) 20mM 氯化鈉、20mM 乙 酸鉀和 20mM 磷酸鉀，pH 4. O 中 0· 5mg/mL GLP-I 和 10mg/mL FDKP ;和（圖 D) 20mM 氯化鈉、 20mM 乙酸鉀和 20mM 磷酸鉀，pH 4. O 中 10mg/mL GLP-I 和 50mg/mL FDKP。
[0053] 圖15.展示脅迫對(duì)多種GLP-1/FDKP制劑的影響。圖例指出凍干前GLP-I對(duì)FDKP 顆粒和溶液中存在的其他組分的質(zhì)量-質(zhì)量百分比。樣品在40°C孵育10天。
[0054] 圖16A-16C. GLP-I的結(jié)構(gòu)。圖16A-描述GLP-I的甘氨酸-延伸的形式（SEQ ID NO. 1)和酰胺化的形式（SEQ ID NO. 2)。FIG. 16B-抑肽酶對(duì)DPPIV活性的抑制。圖 16C - DPPIV抑制劑對(duì)DPPIV活性的抑制。
[0055] 圖17.在肺灌洗液中孵育后檢測(cè)GLP-I。
[0056] 圖18A-18B.描述GLP-I在血漿中的定量。圖18A顯示1:2血漿稀釋液中的定量。 圖18B顯示1:10血楽稀釋液中的定量。
[0057] 圖19A-19B. GLP-I和GLP-I類(lèi)似物對(duì)細(xì)胞存活的影響。GLP-I對(duì)大鼠胰腺上皮 (ARIP)細(xì)胞死亡的影響（圖19A)。在單獨(dú)存在和組合存在GLP-I和十字孢堿（Stau)時(shí)，錨 定蛋白V染色顯示抑制細(xì)胞凋亡（圖19B)。GLP-I的濃度為15nM，十字孢堿的濃度為1 μ M。
[0058] 圖20. GLP-I類(lèi)似物毒蜥外泌肽-4對(duì)細(xì)胞存活力的影響。用0、10、20和40ηΜ毒 蜥外泌肽將ARIP細(xì)胞處理16、24和48小時(shí)。
[0059] 圖21.多種GLP-1/FDKP制劑對(duì)十字孢堿誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響。用GLP-I樣品預(yù) 處理的ARIP細(xì)胞被暴露于5 μ M十字孢堿中4小時(shí)，并用Cell Titer-Glo?分析測(cè)定細(xì)胞 存活力。在4°C和40°C將樣品脅迫處理4周。右側(cè)顯示的對(duì)照樣品（培養(yǎng)基、GLP-USTAU、 GLP+STAU)示出了培養(yǎng)基（不含GLP-I或十字孢堿）中、含GLP-I、含十字孢堿和含GLP-I 與十字孢堿時(shí)細(xì)胞的存活力（注意：圖例不適用于對(duì)照樣品）。顯示的所有結(jié)果是一式三 份運(yùn)行的平均值。
[0060] 圖22A-22B.藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究描述使用多種濃度的GLP-1/FDKP制劑在大鼠 中單一靜脈注射（IV ;圖22A)和肺吹入法（IS ;圖22B)。圖例指出分析的制劑中GLP-I對(duì) FDKP顆粒的質(zhì)量-質(zhì)量百分比。
[0061] 圖23A-23B.給藥后2小時(shí)（圖23A)和6小時(shí)（圖23B)用GLP-1/FDKP制劑給藥 的大鼠中累積食物消耗的減少。
[0062] 圖24.雄性肥胖Zucker大鼠中通過(guò)肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的藥物動(dòng)力學(xué)研 究。數(shù)據(jù)描述了對(duì)照組（空氣；第1組）和GLP-1/FDKP處理組（第2組）在第0、15、30、 45、60和90分鐘的葡萄糖測(cè)量結(jié)果。
[0063] 圖25.雄性肥胖Zucker大鼠中通過(guò)肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的藥物動(dòng)力學(xué)研 究。數(shù)據(jù)描述了對(duì)照組（空氣；第1組）和GLP-1/FDKP處理組（第2組）在第0、15、30、 45、60和90分鐘的GLP-I測(cè)量結(jié)果。
[0064] 圖26.雄性肥胖Zucker大鼠中通過(guò)肺吹入法施用的GLP-1/FDKP的藥物動(dòng)力學(xué)研 究。數(shù)據(jù)描述了對(duì)照組（空氣；第1組）和GLP-1/FDKP處理組（第2組）在第0、15、30、 45、60和90分鐘的胰島素測(cè)量結(jié)果。
[0065] 圖27.雌性大鼠中用通過(guò)肺吹入法施用的多種GLP-I濃度進(jìn)行的GLP-1/FDKP藥 物動(dòng)力學(xué)研究。數(shù)據(jù)描述了對(duì)照組（空氣；第1組）和分別施用了 5%、10%和15% GLP-I 的GLP-1/FDKP處理第2、3和4組在第0、2、5、10、20、30、40和60分鐘的GLP-I測(cè)量結(jié)果。
[0066] 圖28.雌性大鼠中用通過(guò)肺吹入法施用的多種GLP-I濃度進(jìn)行的GLP-1/FDKP藥 物動(dòng)力學(xué)研究。數(shù)據(jù)描述了對(duì)照組（空氣；第1組）和分別施用了 5%、10%和15% GLP-I 的GLP-1/FDKP處理第2、3和4組在第0、2、5、10、20、30、40和60分鐘的FDKP測(cè)量結(jié)果。
[0067] 圖29.雌性大鼠 （η = 10)中的GLP-1/FDKP藥物動(dòng)力學(xué)研究，所述大鼠連續(xù)4天 通過(guò)單一每日肺吹入法施用了含15%61^-1(0.31^61^-1)的61^-1作0即。數(shù)據(jù)顯示連續(xù) 4天在給藥前、給藥后1、2、4和6小時(shí)測(cè)量的平均食物消耗。
[0068] 圖30.雌性大鼠 （η = 10)中的GLP-1/FDKP藥物動(dòng)力學(xué)研究，所述大鼠連續(xù)4天 通過(guò)單一每日肺吹入法施用了含15%61^-1(0.31^61^-1)的61^-1作0即。數(shù)據(jù)顯示連續(xù) 4天在給藥前、給藥后1、2、4和6小時(shí)測(cè)量的平均體重。
[0069] 圖31.在猴子中的GLP-1/FDKP毒物代謝動(dòng)力學(xué)研究，所述猴子連續(xù)5天通過(guò)每日 一次（每天30分鐘）口鼻施用施用了 GLP-1/FDKP。數(shù)據(jù)顯示雄性和雌性中GLP-I的血 漿濃度峰值（Cmax)。動(dòng)物接受對(duì)照（空氣；第1組）、2mg/kg FDK(第2組）或0· 3、I. 0或 2. Omg/kg GLP-1/FDKP (分別為第 3、4 和 5 組）。
[0070] 優(yōu)詵的實(shí)施方案詳沭
[0071] 用作藥物的穩(wěn)定的、可吸入的高血糖素樣肽I(GLP-I)制劑是本領(lǐng)域缺乏的。這 歸因于GLP-I肽體內(nèi)的不穩(wěn)定性。GLP-I化合物在大量條件下趨向于保留在溶液中，并且 當(dāng)作為溶液制劑被施用時(shí)具有相對(duì)短的體內(nèi)半衰期。另外，發(fā)現(xiàn)存在于多種生物學(xué)流體 如肺和血中的二肽基-肽酶IV(DPP-IV)極大地降低GLP-I分子的生物學(xué)半衰期。例如， GLP-I (7-37)的生物學(xué)半衰期已經(jīng)顯示為3到5分鐘；見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 5, 118, 666。GLP-I也 已顯示在胃腸外施用后經(jīng)歷快速的體內(nèi)吸收。類(lèi)似地，酰胺GLP-l(7-36)被皮下施用時(shí)具 有約50分鐘的半衰期；也參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No. 5, 118, 666。
[0072] 本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中GLP-I組合物的快速清除和短半衰期代表了本發(fā)明克服的缺 陷。本發(fā)明通過(guò)提供特別適用于肺部遞送的最優(yōu)化的天然GLP-1/FDKP (富馬酰二酮哌嗪） 制劑克服了本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。在其他具體的方面，本發(fā)明提供了天然GLP-I分子的 制劑，所述制劑可在體內(nèi)引起GLP-I應(yīng)答。還考慮了在這類(lèi)制劑中使用天然GLP-I的變體。 [0073] 為了克服本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了與二酮哌嗪（DKP)顆粒組合的 GLP-I的制劑。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，提供了 GLP-1/DKP制劑用于施用給受試者。在 其他具體的實(shí)施方案中，GLP-1/DKP制劑包含富馬酰二酮哌嗪（FDKP)但不僅限于此，并可 包括其他KDP (不對(duì)稱(chēng)的DKP、xDKP)如2, 5-二酮-3, 6-二（4-琥珀?；?氨丁基）哌嗪 (SDKP)，不對(duì)稱(chēng)的二酮哌嗪，包括僅在DKP環(huán)上一個(gè)位置取代的那些（例如FDKP的"單臂" 類(lèi)似物），和DKP鹽。在本發(fā)明的其他具體的實(shí)施方案中，通過(guò)肺部遞送施用GLP-1/FDKP制 劑。
[0074] 開(kāi)發(fā)GLP-I分子的治療制劑時(shí)，通過(guò)使用多種的生物物理學(xué)和分析技術(shù)評(píng)價(jià)溶液 中GLP-I的結(jié)構(gòu)特征，所述技術(shù)包括遠(yuǎn)紫外線(xiàn)圓二色性（遠(yuǎn)-UV⑶)、近紫外線(xiàn)圓二色性 (近-UV CD)、內(nèi)熒光、傅立葉變換紅外光譜學(xué)（FTIR)、高壓液相色譜（HPLC)和質(zhì)譜（MS)。 圓二色性（CD)技術(shù)是用于分析多種實(shí)驗(yàn)條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的有力工具，并是本領(lǐng)域 公知的。進(jìn)行這些分析的實(shí)驗(yàn)條件包括：濃度、離子強(qiáng)度、溫度、pH、氧化脅迫、攪動(dòng)和多重 凍融循環(huán)對(duì)GLP-I肽的影響。這些分析被設(shè)計(jì)為表征降解的主要途徑以及確立操作GLP-I 肽結(jié)構(gòu)的條件從而達(dá)成優(yōu)選的GLP-1/DKP制劑，所述制劑具有想要的藥物代謝動(dòng)力學(xué)（PK) 和藥物動(dòng)力學(xué)（PD)特征。
[0075] 觀(guān)察到隨著GLP-I濃度提高，肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)從主要是無(wú)組織的構(gòu)象轉(zhuǎn)化為更螺旋 的構(gòu)象。提高溶液中的離子強(qiáng)度引起GLP-I的結(jié)構(gòu)增加，直到其可逆地沉淀為止。NaCl的 存在提高了 GLP-I的三級(jí)結(jié)構(gòu)，這通過(guò)圖2D中所示的近⑶條帶的強(qiáng)度提高顯示。這甚至 在不顯示自身締合的低肽濃度下發(fā)生。提高的離子強(qiáng)度容易地將無(wú)組織的GLP-I轉(zhuǎn)化為 α -螺旋形式（如圖2A中朝向208nm和222nm的遠(yuǎn)⑶最小值遷移所示）和自身締合的構(gòu) 象（如使用提高的鹽和近⑶模式的圖2B和2D中向更短波長(zhǎng)的色氨酸激發(fā)遷移所示）。溫 度和pH有差異地影響GLP-I構(gòu)象，因?yàn)镚LP-I的無(wú)序結(jié)構(gòu)不被這些參數(shù)中任一個(gè)所改變。 另一方面，發(fā)現(xiàn)GLP-I的自身締合構(gòu)象對(duì)熱變性是敏感的并其其溶解度對(duì)pH是敏感的，如 圖4A和4B中所示，該圖顯示在10mg/ml的肽濃度下，在pH 6. 3-7. 6之間GLP-I肽可逆地 沉淀。發(fā)現(xiàn)GLP-I的多種構(gòu)象一般對(duì)攪動(dòng)和多重凍融循環(huán)是穩(wěn)定的。對(duì)GLP-I未觀(guān)察到脫 酰胺，也未觀(guān)察到氧化。
[0076] 還在多種條件下觀(guān)察了 GLP-I對(duì)FDKP顆粒的吸附，所述條件包括pH、GLP-I濃 度的改變，和多種表面活性劑、鹽、離子、離液劑和感膠離子、穩(wěn)定劑和醇濃度的改變。發(fā)現(xiàn) GLP-I對(duì)FDKP顆粒的吸附受pH的強(qiáng)影響，特別是在約pH 4. O或更大時(shí)發(fā)生結(jié)合。發(fā)現(xiàn)其 他賦形劑對(duì)GLP-I對(duì)FDKP顆粒的吸附具有有限的影響。
[0077] 在開(kāi)發(fā)本發(fā)明的GLP-1/DKP制劑時(shí)，評(píng)價(jià)了可能影響或沖擊其體內(nèi)可遞送性和吸 收的大量參數(shù)。這類(lèi)參數(shù)包括例如GLP-I肽的結(jié)構(gòu)、在某配制條件下分子上的表面電荷、作 為制劑的溶解度和穩(wěn)定性，以及對(duì)絲氨酸蛋白酶降解的易感性和體內(nèi)穩(wěn)定性；這些均在產(chǎn) 生可被容易地吸收且顯示延長(zhǎng)的生物學(xué)半衰期的制劑時(shí)起關(guān)鍵的作用。
[0078] 在多種條件下體外和體內(nèi)測(cè)試了獲得的GLP-1/FDKP制劑的穩(wěn)定性。通過(guò)HPLC分 析和基于細(xì)胞的測(cè)定法分析了 GLP-I的穩(wěn)定性。另外，在肺灌洗液（其含有DPP-IV)中檢 查了 GLP-I的穩(wěn)定性。還發(fā)現(xiàn)天然GLP-I的穩(wěn)定性在溶液中是濃度依賴(lài)性的。
[0079] 還使用體外GLP-I生物活性研究用于GLP-1/FDKP負(fù)載的研究，并測(cè)定了體內(nèi)效 力。該策略有助于進(jìn)一步鑒定領(lǐng)先的GLP-1/FDKP配制方法。另外，基于GLP-I已經(jīng)顯示通 過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、刺激β-細(xì)胞增殖和胰島再生在提高β-細(xì)胞量中起作用的事實(shí)，通過(guò)基 于細(xì)胞的測(cè)定法檢查本發(fā)明的GLP-1/FDKP制劑的增殖和抗細(xì)胞凋亡潛能。
[0080] 因此，本發(fā)明提供了包含與富馬酰基二酮哌嗪（FDKP)組合的天然人GLP-I的最優(yōu) 化的制劑，該制劑是穩(wěn)定的并且抗降解。
[0081] II. GLP-I 分子
[0082] 在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，提供了最優(yōu)化的制劑，其包含與二酮哌嗪如富馬酰 基二酮哌嗪（FDKP)組合的天然人高血糖素樣肽I (GLP-I)。本發(fā)明的這類(lèi)GLP-1/FDKP制劑 是穩(wěn)定的并且抗降解。
[0083] 人GLP-I是本領(lǐng)域公知的，并且來(lái)源于遠(yuǎn)端回腸 （distal ileum)中、胰腺中和 腦中L-細(xì)胞合成的前高血糖素原（preproglucagon)多肽。GLP-I是30-31個(gè)氨基酸的 肽，其以?xún)煞N分子形式存在：7-36和7-37,其中7-36形式是主要的。前高血糖素原成為 GLP-I (7-36)酰胺和GLP-I (7-37)延長(zhǎng)形式的加工主要發(fā)生在L-細(xì)胞中。本領(lǐng)域已經(jīng)顯 示在禁食狀態(tài)下，GLP-I的血漿水平為約40pg/ml。進(jìn)餐后，GLP-I血漿水平迅速提高至約 50_165pg/ml。
[0084] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"GLP-1分子"是指GLP-I蛋白質(zhì)、肽、多肽、類(lèi)似物、模擬物、衍生 物、同種型、片段等等。這類(lèi)GLP-I分子可包括天然存在的GLP-I多肽（GLP-1 (7-37)0H、 GLP-I (7-36)NH2)和GLP-I代謝產(chǎn)物如GLP-I (9-37)。因此，在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中， GLP-I分子包括：天然的GLP-1、GLP-I類(lèi)似物、GLP-I衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保 護(hù)的GLP-I、GLP-I模擬物、GLP-I肽類(lèi)似物或生物合成的GLP-I類(lèi)似物。
[0085] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"類(lèi)似物"包括與另一化合物的結(jié)構(gòu)相似的化合物。例如，抗病毒 化合物阿昔洛韋（acyclovir)是一種核苷類(lèi)似物，其與衍生自堿基鳥(niǎo)嘌呤的核苷鳥(niǎo)苷結(jié)構(gòu) 上類(lèi)似。因此，阿昔洛韋模擬鳥(niǎo)苷（生物學(xué)上與鳥(niǎo)苷類(lèi)似），并且通過(guò)置換病毒核酸中的鳥(niǎo) 苷殘基（或與之競(jìng)爭(zhēng)）來(lái)干擾DNA合成并阻止翻譯/轉(zhuǎn)錄。因此，與另一（親本化合物） 具有結(jié)構(gòu)類(lèi)似性的化合物是類(lèi)似物，其模擬親本化合物的生物學(xué)或化學(xué)活性。將化合物確 定為類(lèi)似物不需要最大或最小的基本或功能基團(tuán)取代數(shù)量，只要類(lèi)似物能夠以一些相關(guān)的 模式（同一地、補(bǔ)充地或競(jìng)爭(zhēng)地）模擬親本化合物的生物學(xué)特性或化學(xué)特性即可。類(lèi)似物 可以是并且通常是親本化合物的衍生物（見(jiàn)下文"衍生物"）。本文公開(kāi)的化合物的類(lèi)似物 可以具有等于、小于或大于它們親本化合物的活性。
[0086] 本文使用的"衍生物"是指天然地或合成地從親本化合物制成（或衍生）的化合 物。衍生物可以是類(lèi)似物（見(jiàn)上文"類(lèi)似物"）并從而可具有類(lèi)似的化學(xué)或生物學(xué)活性。然 而，與類(lèi)似物不同，衍生物不必須模擬親本化合物的生物學(xué)或化學(xué)活性。將化合物確定為 衍生物不需要最大或最小的基本或功能基團(tuán)取代數(shù)量。例如，盡管抗病毒化合物甘克洛韋 (ganclovir)是阿昔洛韋的衍生物，但是甘克洛韋具有與阿昔洛韋不同的抗病毒活性譜系 和不同的毒物學(xué)特性。本文公開(kāi)的化合物的衍生物與其親本化合物比較時(shí)可以具有相等、 更小、更大或甚至不相似的活性。
[0087] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"代謝產(chǎn)物"是指代謝的任何中間產(chǎn)物或產(chǎn)物，并包括大分子和小 分子。本文使用時(shí)和適當(dāng)時(shí)，該定義適用于初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物。初級(jí)代謝產(chǎn)物直接涉及 活體生物正常的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖。次級(jí)代謝產(chǎn)物不直接涉及這些過(guò)程，但是典型地具有重 要的生態(tài)學(xué)功能（例如抗生素）。
[0088] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"生物合成的"是指活體生物對(duì)化合物的任何生產(chǎn)。
[0089] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"能形成顆粒的"是指化學(xué)的、生物合成的或生物學(xué)實(shí)體或化合 物，其能夠形成固體顆粒，通常在液體培養(yǎng)基中形成。顆粒的形成典型地發(fā)生在能形成顆 粒的實(shí)體暴露于某條件下時(shí)，所述條件例如為pH、溫度、濕度和/或摩爾滲透壓濃度/重量 摩爾滲透壓濃度。對(duì)所述條件的暴露可導(dǎo)致例如結(jié)合、聚結(jié)、凝固和/或脫水，從而形成顆 粒。沉淀反應(yīng)是能形成顆粒事件的一個(gè)例子。
[0090] 本文使用的"共溶液"是由至少兩種化學(xué)、生物學(xué)和/或生物合成的實(shí)體組成的任 何介質(zhì)。例如，可以通過(guò)將包含至少一種化學(xué)、生物學(xué)和/或生物合成的實(shí)體的液體與包含 化學(xué)、生物學(xué)和/或生物合成的實(shí)體的固體組合來(lái)形成共溶液。在另一個(gè)例子中，可以通過(guò) 將包含至少一種化學(xué)、生物學(xué)和/或生物合成的實(shí)體的液體與包含化學(xué)、生物學(xué)和/或生物 合成的實(shí)體的另一種液體組合來(lái)形成共溶液。在又一個(gè)例子中，可以通過(guò)向單個(gè)溶液中添 加至少兩種固體形成共溶液，所述每種固體包含至少一種化學(xué)、生物學(xué)和/或生物合成的 實(shí)體。
[0091] 本發(fā)明中考慮的天然GLP-I是具有SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的 多肽。天然GLP-I肽在體內(nèi)于數(shù)分鐘內(nèi)被快速的切割和滅活。
[0092] 本發(fā)明的GLP-I類(lèi)似物可包括毒蜥外泌肽，其為被發(fā)現(xiàn)是GLP-I受體激動(dòng)劑的肽； 這類(lèi)類(lèi)似物可還包括毒蜥外泌肽1到4。毒蜥外泌肽在毒蜥（Gila-monster)的毒液中被 發(fā)現(xiàn)，并與哺乳動(dòng)物GLP-I分享約53%的氨基酸同源性。毒蜥外泌肽還具有對(duì)GLP-I受體 的類(lèi)似親合力。據(jù)報(bào)道毒蜥外泌肽-3和毒蜥外泌肽_4刺激胰腺腺泡細(xì)胞中的cAMP生產(chǎn) 和淀粉酶從胰腺腺泡細(xì)胞中的釋放（Malhotra et al.，1992 ;Raufman et al.，1992 ;Singh et al.，1994)。已經(jīng)提出了毒蜥外泌肽-3作為促胰島素劑用于治療糖尿病和預(yù)防高血糖 癥的用途（美國(guó)專(zhuān)利No. 5, 424, 286)。
[0093] 毒蜥外泌肽的羧基末端片段如毒蜥外泌肽[9-39](羧基酰胺化的分子）和穿過(guò) 9-39的片段3-39已經(jīng)被報(bào)道為是GLP-I的有力的和選擇性的拮抗劑（Goke et al.，1993 ; Raufman et al.，1991 ;Schepp et al.，1994 ;Montrose_Rafizadeh et al.，1996)。文獻(xiàn) 還證實(shí)了毒蜥外泌肽[9-39]在體內(nèi)封閉內(nèi)源GLP-1，導(dǎo)致減少的胰島素分泌（Wang et al.，1995 ;D' Alessio et al.，1996)。毒蜥外泌肽-4有效結(jié)合分泌胰島素的β -TCl細(xì)胞 上的GLP-I、來(lái)自胰腺的分散的腺泡細(xì)胞和來(lái)自胃的壁細(xì)胞。毒蜥外泌肽-4肽也在經(jīng)分離 的胃中刺激促生長(zhǎng)素抑制素釋放和抑制胃泌素釋放中起作用（Goke et al.，1993; Sch印ρ et al.，1994;Eissele et al. ,1994)。在用克隆的GLP-I受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，毒蜥外泌肽-4 被報(bào)道為激動(dòng)劑（即其促進(jìn)cAMP)，而毒蜥外泌肽[9-39]被定義為拮抗劑（即其阻斷毒蜥 外泌肽-4和GLP-I的刺激作用）。還發(fā)現(xiàn)毒蜥外泌肽是抗降解的。
[0094] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案考慮了肽模擬物的用途。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，肽 模擬物是生物學(xué)上模擬激素、細(xì)胞因子、酶底物、病毒或其他生物分子上活性決定簇的肽， 并可拮抗、刺激或以其他方式調(diào)節(jié)天然配體的生理活性。參閱例如BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al·，Eds. ,Chapman and Hall, New York(1993)中的 Johnson et al·，"Peptide Turn Mimetics"。使用肽模擬物的潛在原理是蛋白質(zhì)的肽主鏈主要以確定 氨基酸側(cè)鏈方向有助于分子相互作用的方式存在。預(yù)計(jì)肽模擬物允許與天然分子相似的分 子相互作用。
[0095] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的GLP-I分子會(huì)具有天然GLP-I的至少一種生物活性， 例如與GLP-I受體結(jié)合并引發(fā)導(dǎo)致促胰島素活性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的能力。在本發(fā)明的其 他實(shí)施方案中，GLP-I分子可以是肽、多肽、蛋白質(zhì)、類(lèi)似物、模擬物、衍生物、同種型、片段 等等，其維持天然存在的GLP-I的至少一種生物活性。GLP-I分子還可包括可藥用鹽和前 藥，和前藥的鹽，天然存在的人GLP-I的多形體（polymorph)、水合物、溶劑合物、生物活性 片段、生物活性變體和立體異構(gòu)體，以及天然存在的人GLP-I的激動(dòng)劑、模擬物和拮抗劑變 體。包括毒蜥外泌肽1到4的毒蜥外泌肽家族，及其多肽融合物。本發(fā)明的GLP-I分子也 可以包括二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護(hù)的GLP-1，其阻止或抑制GLP-I的降解。
[0096] 本發(fā)明的GLP-I分子包括肽、多肽、蛋白質(zhì)及其衍生物，其含有氨基酸取代、改進(jìn) 溶解度、賦予對(duì)氧化的抗性、提高生物效力，或提高循環(huán)中的半衰期。因此，本發(fā)明中考慮 的GLP-I分子包含氨基酸取代、刪除或添加，其中所述氨基酸選自本領(lǐng)域公知的那些。分子 的N端或C端也可以被修飾，例如但不限于被酰化、乙?；?、酰胺化。因此，在本發(fā)明中，術(shù) 語(yǔ)"氨基酸"是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及氨基酸類(lèi)似物和氨基酸模擬物， 其以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能。天然編碼的氨基酸是20種常見(jiàn)的氨基酸 (丙氨酸、精氨酸、天冬酰氨、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨 酸）和焦賴(lài)氨酸（pyrolysine)和硒代半胱氨酸（selenocysteine)。氨基酸類(lèi)似物是指具 有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，所述基本化學(xué)結(jié)構(gòu)即與氫、羧基、氨 基和R基團(tuán)結(jié)合的α碳，例如高絲氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基 锍、瓜氨酸、羥基谷氨酸、羥基脯氨酸和praline。這類(lèi)類(lèi)似物具有經(jīng)修飾的R基團(tuán)（例如 正亮氨酸），但是保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中考慮的氨基酸 還包括與α-氨基酸相似的β-氨基酸，因?yàn)樗鼈兒邪被撕汪然?。然而，在?氨基 酸中，兩個(gè)碳原子分開(kāi)這些功能性末端。帶有特定側(cè)鏈的β-氨基酸能夠作為a (C2)碳或 β (C3)碳上的R或S異構(gòu)體存在。這導(dǎo)致對(duì)任何給定的側(cè)鏈而言總共四種可能的非對(duì)映異 構(gòu)體。
[0097] 本發(fā)明的GLP-I分子也可包括雜種GLP-I蛋白、其融合蛋白、寡聚體和多聚體、同 系物、糖基化模式變體和突變蛋白質(zhì)，其中GLP-I分子保持天然分子的至少一種生物活性， 并且與其合成或制造方法無(wú)關(guān)，所述方法包括但不限于重組（無(wú)論是從cDNA、基因組DNA、 合成的DNA或其它形式的核酸產(chǎn)生）、合成和基因激活方法。重組DNA技術(shù)是本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員公知的（見(jiàn)Russell, D.W.，et al. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N. Y.，2001)。
[0098] III.二酮哌嗪
[0099] 二酮哌嗪因?yàn)槠湫纬晌⒘５哪芰Χ潜绢I(lǐng)域公知的，所述能力適用于藥物遞送和 穩(wěn)定。在本發(fā)明中，使用二酮哌嗪有助于GLP-I分子的吸收，從而提供抗降解的穩(wěn)定制劑。 [0100] 可使用多種方法，其中二酮哌嗪可以形成整和GLP-I分子的顆粒，或GLP-I分子能 夠吸附在上面的顆粒。這可涉及將二酮哌嗪溶液與GLP-I分子的溶液或懸浮液混合然后沉 淀，隨后形成包含二酮哌嗪和GLP-I的顆粒?；蛘?，可以沉淀二酮哌嗪形成顆粒，并隨后與 GLP-I分子的溶液混合。二酮哌嗪顆粒與GLP-I分子之間的締合可以通過(guò)溶劑去除來(lái)進(jìn)行， 或在干燥之前可以包括特定的步驟（如pH調(diào)節(jié)），從而促進(jìn)締合。
[0101] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的二酮哌嗪包括但不限于3, 6-二（4-富馬 酰-氨丁基）-2,5_二酮哌嗪，也已知為（E)-3,6-二[4-(N-羧基-2-丙烯基）氨丁 基]-2, 5-二酮哌嗪（其也被稱(chēng)作富馬酰二酮哌嗪或FDKP)。
[0102] 本發(fā)明中考慮的其他二酮哌嗪包括，但不限于3, 6-二（4-氨丁基）-2,5-二酮哌 嗪的衍生物例如：3, 6-二（琥珀酰-4-氨丁基）-2, 5-二酮哌嗪（在本文中也稱(chēng)作3, 6-二 (4-羧丙基）氨丁基-2, 5-二酮哌嗪；琥珀酰二酮哌嗪或SDKP) ;3, 6-二（馬來(lái)酰-4-氨丁 基）-2, 5-二酮哌嗪；3, 6-二（檸康酰-4-氨丁基）-2-5-二酮哌嗪；3, 6-二（戊二酰-4-氨 丁基）-2,5-二酮哌嗪；3,6_二（丙二酰-4-氨丁基）-2,5-二酮哌嗪；3, 6-二（草酰-4-氨 丁基）-2, 5-二酮哌嗪及其衍生物。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮了二酮哌嗪鹽的用途。 這類(lèi)鹽可包括例如任何可藥用的鹽，如二酮哌嗪的Na、K、Li、Mg、Ca、銨或單、二或三烷基銨 (如衍生自三乙胺、丁胺、二乙醇胺、三乙醇胺或吡啶等等）鹽。鹽可以是單鹽、二鹽或混合 的鹽。也考慮了二酮哌嗪的更高級(jí)的鹽，其中R基團(tuán)含有多于一個(gè)酸基。在本發(fā)明的其它 方面，試劑的基本形式可以與二酮哌嗪混合形成二酮哌嗪的藥物鹽，從而該藥物是二酮哌 嗪的平衡陽(yáng)離子（counter cation)。本文考慮的鹽的一個(gè)例子以非限制性的方式包括FDKP 二鈉。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)N〇:ll/210, 710教導(dǎo)了使用DKP的藥物遞送，其涉及DKP鹽的所有內(nèi) 容通過(guò)參考并入本文。
[0103] 如本文中別處所公開(kāi)的，本發(fā)明還使用了新穎的FDKP不對(duì)稱(chēng)類(lèi)似物xDKP，例如 (E) -3- (4- (3, 6-二氧代哌嗪-2-基）丁基氨基甲?；?丙烯酸；(E) -3- (3- (3, 6-二氧 代哌嗪-2-基）丙基-氨基甲?；┍┧幔缓臀?-3-(4-(5-異丙基-3,6-二氧代哌 嗪-2_基）-丁基氨基甲?；┍┧?，并在題為〃Asymmetrical FDKP Analogs for Use as Drug Delivery Agents"的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)中公開(kāi)，該申請(qǐng)?jiān)谂c此一致的日期提交并 以其整體并入本文（代理人案號(hào)No. 51300-00041)。
[0104] 二麗脈嚷可以如下形成：如1^1：(3]13181^，6七31.，（]\六11161'.〇16111.3〇(3· 68:879-80 ; 1946)所述通過(guò)氨基酸酯衍生物的環(huán)二聚體作用j[JKopple，etal.，（J.0rg· Chem. 33:862-64 ; 1968)所述通過(guò)二肽酯衍生物的環(huán)化或通過(guò)氨基酸衍生物在高沸點(diǎn)溶劑 中的熱脫水，所述文件的教導(dǎo)被引入本文。
[0105] 用于合成和制備二酮哌嗪的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并公開(kāi)于美 國(guó)專(zhuān)利 5, 352, 461 ;5, 503, 852 ;6, 071，497 ;6, 331，318 ;6, 428, 771 和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng) No. 20060040953中。美國(guó)專(zhuān)利No. 6, 444, 226和6, 652, 885描述了在水性懸浮液中制備和 提供二酮哌嗪微粒，所述水性懸浮液中被添加了活性試劑的溶液，從而使活性試劑與顆粒 結(jié)合。這些專(zhuān)利還描述了通過(guò)凍干法去除液體介質(zhì)產(chǎn)生包含活性劑的微粒的方法，改變這 類(lèi)懸浮液的溶劑條件以促進(jìn)活性試劑與顆粒的結(jié)合則在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列N 〇:60/717, 524 和 11/532,063(二者均題為"Method of Drug Formulation Based on Increasing the Affinity of Active Agents for Crystalline Microparticle Surfaces"）和 11/532, 065(題為"Method of Drug Formulation Based on Increasing the Affinity of Active Agents for Crystalline Microparticle Surfaces·"）中教導(dǎo)。還參閱美國(guó)專(zhuān) 利No. 6, 440,463和2005年8月23日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列No: 11/210, 709和美國(guó)專(zhuān) 利申請(qǐng)No. 11/208,087。在一些情況下，考慮到通過(guò)例如2006年2月22日提交的題為〃A Method For Improving the Pharmaceutic Properties of Microparticles Comprising Diketopiperazine and an Active Agent. "的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列No. 11/678, 046 中公開(kāi)的 噴霧干燥方法干燥本發(fā)明的被負(fù)載的二酮哌嗪顆粒。每份專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)針對(duì)它們涉及二 酮哌嗪的內(nèi)容通過(guò)參考并入本文。
[0106] IV. GLP-1/DKP顆粒的治療制劑
[0107] 本發(fā)明還提供了用于施用給需要治療的受試者的GLP-1/FDKP制劑。本發(fā)明中考 慮的受試者可以是家居寵物或人。在某些實(shí)施方案中，治療是針對(duì)II型糖尿病、肥胖癥、癌 癥或其任何相關(guān)疾病和/或病癥。人是尤其優(yōu)選的受：試者。
[0108] 本發(fā)明中考慮的其它疾病或病癥包括，但不限于腸易激綜合征、心肌梗死、缺血、 再灌注組織損傷、血脂障礙、糖尿病心肌病、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、代謝綜合征、手術(shù)后分 解代謝改變、神經(jīng)變性病癥、記憶和學(xué)習(xí)障礙、胰島細(xì)胞移植和再生治療或中風(fēng)。本發(fā)明考 慮的其它疾病和/或病癥包括與上文所列的相關(guān)的任何疾病和/或病癥，其可以通過(guò)對(duì)需 要的受試者施用GLP-1/FDKP干粉制劑來(lái)治療。本發(fā)明的GLP-1/FDKP干粉制劑也可以用于 治療II型糖尿病和高血糖癥的人細(xì)胞中β細(xì)胞分化的誘導(dǎo)。
[0109] 還在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，考慮到受試者可以是家居寵物或動(dòng)物，包括大 鼠、兔子、倉(cāng)鼠、荷蘭豬、沙土鼠（gerbil)、旱獺、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬、猴子和猿（包 括猩猩、長(zhǎng)臂猿和狒狒）。
[0110] 還考慮到本發(fā)明的GLP-1/FDKP顆粒制劑可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的和 用于臨床或非臨床目的的多種施用途徑施用。本發(fā)明的GLP-1/FDKP組合物可以被施用至 任何靶向的生物膜，優(yōu)選受試者的粘膜。施用可以通過(guò)任何途徑進(jìn)行，所述途徑包括但不限 于經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、全身性靜脈注射、皮下、通過(guò)血或淋巴提供的分區(qū)施用、直接施用至受 侵襲的位點(diǎn)或甚至通過(guò)局部手段進(jìn)行。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，GLP-1/FDKP組合物的 施用通過(guò)肺部遞送。
[0111] 本發(fā)明中可以使用的其它備選的施用途徑可包括：真皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病 灶內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸的、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、血 管內(nèi)（intravesicular)、粘膜的、心包內(nèi)、支氣管局部施用，使用氣霧劑，注射、灌輸、連續(xù) 灌輸、集中灌注直接沐浴靶細(xì)胞，通過(guò)導(dǎo)管、通過(guò)灌洗，在霜?jiǎng)┲?、在液體組合物（例如脂 質(zhì)體）中，或通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)計(jì)數(shù)人員會(huì)制造的其它方法或前述的任何組合（參閱例如 Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990,其涉及給藥方法的全部?jī)?nèi)容通過(guò)參考并入 本文）。
[0112] 作為干粉制劑，本發(fā)明的GLP-1/DKP顆?？梢酝ㄟ^(guò)吸入被遞送至呼吸系統(tǒng)的特定 區(qū)域，這取決于顆粒的大小。另外，GLP-1/DKP顆?？梢员恢圃斐勺銐蛐《軗饺腱o脈注射 懸浮液劑型中。對(duì)于經(jīng)口遞送而言，可以可以被摻入懸浮液、片劑或膠囊中。GLP-1/DKP組 合物可以從吸入裝置被遞送，所述吸入裝置例如霧化器、壓力定量氣霧劑、干粉吸入器和噴 霧器。
[0113] 在其它實(shí)施方案中，考慮向需要的患者施用"有效量"的GLP-1/DKP制劑。本發(fā)明 中考慮的"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑是指GLP-I化合物、類(lèi)似物或肽模擬物等等的量， 該用量會(huì)在一些程度上緩解被治療的疾病、病癥或障礙的一個(gè)或多個(gè)癥狀。在一個(gè)實(shí)施方 案中，"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑應(yīng)當(dāng)是通過(guò)將血漿胰島素水平提高、禁食血糖水平 減少或降低和胰腺β-細(xì)胞量提高至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多（但不限于此）來(lái)治療糖尿病的61^-1 分子的量。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮通過(guò)對(duì)需要這類(lèi)治療的受試者施用藥物 有效量的GLP-I分子來(lái)治療肥胖癥。在這類(lèi)情況下，"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑應(yīng)當(dāng) 是通過(guò)將體重減少或降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50% 或更多（但不限于此）的GLP-I分子的量。本發(fā)明還考慮了施用"有效量"的GLP-1/DKP 干粉制劑用于通過(guò)對(duì)需要這類(lèi)治療的受試者施用藥物有效量的GLP-I分子來(lái)控制飽滿(mǎn)感。 就非限制性的方式而言，GLP-I分子可以是毒蜥外泌肽分子如毒蜥外泌肽-1或-4。在這類(lèi) 情況下，"有效量"的GLP-1/DKP干粉制劑應(yīng)當(dāng)是將饑餓感受和食物攝入（例如通過(guò)質(zhì)量或 卡路里含量測(cè)量）減少至少約 5% ,6%、7%、8%、9%、10%、11 %、12%、13%、14%、15%、 16 %U7 %U8 %U9 %,20 %,21 %,22 %,23 %,24 %,25 %,26 %,27 %,28 %,29 %,30 %, 35%、40%、45%、50%或更多（但不限于此）的61^-1分子的量。"有效量"的61^-1/1)即 干粉制劑還可以被定義為足夠可檢測(cè)地和可重復(fù)地改善、減少、最小化或限制疾病或病癥 或其癥狀的程度的量。也可能使用"有效量"的本發(fā)明制劑消除、清除或治愈疾病或病癥。
[0114] 在對(duì)需要的受試者施用本發(fā)明的GLP-1/FDKP組合物時(shí)，組合物的實(shí)際劑量可以 以物理和生理因素為基礎(chǔ)確定，所述因素如體重、病癥的嚴(yán)重性、被治療的疾病類(lèi)型、先前 或共存的治療干涉、患者的特發(fā)?。╥diopathy)和施用途徑。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠基于一個(gè) 或多個(gè)這些因素確定實(shí)際的劑量。
[0115] 本發(fā)明的GLP-1/DKP制劑可以被施用一次或多于一次，取決于待治療的疾病或病 癥。GLP-1/DKP制劑的施用可以以下述間隔被提供給受試者，所述間隔在數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù) 天、數(shù)周或數(shù)月的范圍內(nèi)變化。在一些情況下，治療方案的計(jì)時(shí)可涉及施用后GLP-I分子的 半衰期。在其它實(shí)施方案中，例如在治療具體的或復(fù)雜的疾病或病癥如癌癥時(shí)，例如可期望 施用含藥物賦形劑或試劑的本發(fā)明的GLP-1/DKP制劑。在這類(lèi)情況下，可以由藥物賦形劑 或試劑指導(dǎo)施用方案。
[0116] V.實(shí)施例
[0117] 以下的實(shí)施例包括在本文中用于闡述本發(fā)明的某些實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)明白，實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)闡明了在本發(fā)明的實(shí)踐中適當(dāng)?shù)匕l(fā)揮功能的代表性技術(shù)。然 而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的啟發(fā)下應(yīng)當(dāng)明白，可以在公開(kāi)的特定實(shí)施方案中進(jìn)行許 多改變，并且仍然獲得相似或類(lèi)似的結(jié)果，而不偏離本發(fā)明的宗旨和范圍。
[0118] 實(shí)施例1
[0119] GLP-I結(jié)構(gòu)的牛物物理學(xué)分析和分析法分析
[0120] 為了分析GLP-I的結(jié)構(gòu)和行為，使用了大量的生物物理學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)。這些 技術(shù)包括遠(yuǎn)紫外線(xiàn)圓二色性（遠(yuǎn)-UV⑶)、近紫外線(xiàn)圓二色性（近-UV⑶)、內(nèi)熒光、傅立葉 變換紅外光譜學(xué)（FTIR)、高壓液相色譜（HPLC)和質(zhì)譜（MS);其均是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公 知的。使用大范圍的條件研究濃度、離子強(qiáng)度、溫度、pH、氧化脅迫、攪動(dòng)和多重凍融循環(huán)對(duì) GLP-I肽的影響；其均在下文更詳細(xì)地描述。也使用這些分析表征降解的主要途徑，并確立 操作GLP-I的肽結(jié)構(gòu)從而達(dá)成某GLP-1/DKP制劑的條件。
[0121] 實(shí)駘步驟
[0122] GLP-1 購(gòu)自 American Peptide (Sunnyvale, CA)或 AnaSpec (San Jose, CA)，或內(nèi)部 制造 （MannKind Corporation, Valencia, CA)。在 pH 4.0 和 2〇°C (除非另有說(shuō)明）下分 析多種濃度的水性GLP-I樣品。樣品一般是新鮮制備的并在每次實(shí)驗(yàn)前與適當(dāng)?shù)奶砑觿?(例如鹽、pH緩沖液、H2O 2等，如果有的話(huà)）混合。用遠(yuǎn)-UV⑶和透射傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜 (FTIR)收集多種條件下GLP-I的二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)量結(jié)果。另外，使用近-UV⑶和內(nèi)熒光，通過(guò) 監(jiān)測(cè)其芳香族殘基（即色氨酸）周?chē)沫h(huán)境來(lái)分析GLP-I的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0123] GLP-I的濃度依賴(lài)件結(jié)構(gòu)
[0124] 使用圓二色性（CD)譜分析分子（如蛋白質(zhì)或肽）可能顯示的α -螺旋、隨機(jī)卷 曲、β-折疊片層、β-轉(zhuǎn)角和隨機(jī)卷曲。具體地，使用遠(yuǎn)-UV⑶測(cè)定蛋白質(zhì)和肽中二級(jí)結(jié) 構(gòu)的類(lèi)型，例如純?chǔ)?螺旋、β-片層等。另一方面，使用近-UV⑶分析分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 因此，為了檢查濃度對(duì)GLP-I的影響，使用遠(yuǎn)-UV⑶和近-UV⑶技術(shù)二者。
[0125] 圖IA中的遠(yuǎn)UV-CD證實(shí)了在大范圍的濃度（例如L 8、4· 2、5· 1、6· 1、7· 2和8. 6mg/ ml)下，GLP-I形成兩種不同的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)包括α -螺旋和隨機(jī)卷曲。通過(guò)205nm處的巨 大單個(gè)最小值確定，在低濃度（< 2mg/mL)下GLP-I主要是無(wú)組織的。通過(guò)208nm和224nm 處的兩個(gè)最小值確定，當(dāng)濃度提高時(shí)肽采取α -螺旋結(jié)構(gòu)（圖1A)。
[0126] 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析提示高濃度的GLP-I結(jié)構(gòu)是自身締合的構(gòu)象（即寡聚物）。近-UV ⑶和熒光發(fā)射數(shù)據(jù)均支持該假設(shè)。近-UV⑶（圖1Β)中250-300nm之間的陽(yáng)性條帶揭示了 GLP-I具有確定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在更高的濃度下增加。更特別地，這些條帶表明肽的芳 香族殘基被大量地固定，并存在于明確定義的環(huán)境中。
[0127] 類(lèi)似地，多種濃度下（pH 4. 0, 20°C )GLP_1的熒光發(fā)射顯示芳香族殘基色氨酸 (其也在近-UV⑶譜中顯示強(qiáng)烈的條帶）存在于明確定義的三級(jí)結(jié)構(gòu)中；顯示的數(shù)據(jù)得自 280nm處的色氨酸激發(fā)（圖1C)。對(duì)低濃度GLP-I而言355nm處的熒光最大值表明色氨酸 被暴露于溶劑中，且不存在顯著的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在高肽濃度下，最大值強(qiáng)度降低并遷移至更短 的波長(zhǎng)，表明更多確定的三級(jí)結(jié)構(gòu)。
[0128] 為了進(jìn)一步測(cè)定GLP-I自身締合構(gòu)象的潛在的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在多種濃度下（pH 4. 0, 20°C )進(jìn)行FTIR分析。1656cm-1處的酰胺I條帶清楚地表明在彡2mg/mL的濃度下 GLP-I具有α -螺旋結(jié)構(gòu)（圖1D)。因此，GLP-I不形成β -片層結(jié)構(gòu)；取而代之，在高濃度 下肽更可能產(chǎn)生螺旋束。
[0129] 另外，實(shí)驗(yàn)顯示這些不同的GLP-I結(jié)構(gòu)不是通過(guò)樣品處理產(chǎn)生的。與將肽直接溶 于緩沖液中制備的GLP-I相比，來(lái)自濃縮的儲(chǔ)存溶液的稀釋液產(chǎn)生類(lèi)似的遠(yuǎn)-UV CD、近-UV CD和熒光發(fā)射譜。
[0130] 離子強(qiáng)度對(duì)GLP-I的影響
[0131] 還進(jìn)行了一些研究來(lái)測(cè)定離子強(qiáng)度對(duì)GLP-I肽的影響。圖2A (遠(yuǎn)-UV-⑶）闡述了 提高鹽的濃度（從IOOmM到IOOOmM)將無(wú)序的GLP-I結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為α -螺旋構(gòu)象，如208nm 和224nm處的最小值所揭示的那樣。將NaCl濃度提高至IM后，很多肽（在I. Omg/mL時(shí)） 從溶液中沉淀出來(lái)（圖2A)。然而，這種類(lèi)型的沉淀顯示用水稀釋后溶解，從而確定了在高 離子強(qiáng)度下GLP-I可以被可逆地沉淀。
[0132] 鹽還顯示產(chǎn)生并促進(jìn)GLP-I的三級(jí)結(jié)構(gòu)。這在圖2B(近-UV-⑶）中例證，其中 I. Omg/mL GLP-I在無(wú)鹽時(shí)不顯示信號(hào)，但是顯示清楚的三級(jí)結(jié)構(gòu)，該三級(jí)結(jié)構(gòu)隨著提高 的離子強(qiáng)度而強(qiáng)化。280nm處色氨酸激發(fā)后在多種NaCl濃度下（pH 4. 0, 20°C ) I. 0mg/mL GLP-I的熒光發(fā)射（圖2C)證實(shí)了這些結(jié)果。提高的離子強(qiáng)度引起熒光最大值遷移至更短 的波長(zhǎng)，表明1.0mg/mL GLP-I的三級(jí)結(jié)構(gòu)既被產(chǎn)生又被增強(qiáng)。
[0133] 另外，使用近-UV⑶譜在多種離子強(qiáng)度下（pH 4. 0, 20°C )對(duì)10mg/mL GLP-I的三 級(jí)結(jié)構(gòu)分析證實(shí)提高的離子強(qiáng)度也增強(qiáng)了 GLP-I的自身締合構(gòu)象（圖2D)。
[0134] 因此，數(shù)據(jù)提示離子強(qiáng)度對(duì)GLP-I的結(jié)構(gòu)具有巨大的影響，引起蛋白質(zhì)既采取 α-螺旋構(gòu)象又締合成為寡聚體。另外，提高溶液中的離子強(qiáng)度引起GLP-I的寡聚化提高， 直到其可逆地沉淀為止。該事件在低肽濃度（其中最初不存在三級(jí)結(jié)構(gòu)）以及高肽濃度 (其已經(jīng)顯示大量二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)）下是明顯的。因此，提高的離子強(qiáng)度容易地將無(wú)組織 的GLP-I轉(zhuǎn)化為α -螺旋和自身締合的構(gòu)象。另外，觀(guān)察到的分光鏡結(jié)果與先前顯示的提 高的肽濃度的影響是可比較的。
[0135] 淵度和DH對(duì)GLP-I的影響
[0136] 還進(jìn)行了研究來(lái)測(cè)定GLP-I的自身締合的構(gòu)象是否對(duì)溫度或pH的改變敏感。圖 3A(近-UV-⑶）證實(shí)隨著溫度提高，lOmg/mL GLP-I的三級(jí)結(jié)構(gòu)顯著地離解。另一方面， 在多種溫度和pH 4. 0下，溫度對(duì)低濃度（0. 05mg/mL)的GLP-I不具有影響；見(jiàn)圖3B和 3C(遠(yuǎn)-UV-⑶）。遠(yuǎn)-UV⑶闡明了肽對(duì)溫度是不敏感的。因此，提高的分子運(yùn)動(dòng)顯著地妨 礙了 GLP-I的自身締合。
[0137] 相反，圖4A (遠(yuǎn)-UV-⑶）證實(shí)α -螺旋GLP-I構(gòu)象的溶解度是pH敏感的。盡管在 pH 4. 4和以下時(shí)，lOmg/mL GLP-I的結(jié)構(gòu)是相對(duì)均一的（即GLP-I保持螺旋），但是當(dāng)pH提 高至接近或處于中性（pH 6. 3和7. 6之間）時(shí)，一些沉淀發(fā)生并產(chǎn)生無(wú)序的譜系。其中發(fā) 生了沉淀的樣品具有更低的強(qiáng)度，因?yàn)槿芤褐写嬖诟俚目扇苄訥LP-1。該無(wú)序的結(jié)構(gòu)通過(guò) 圖4A(遠(yuǎn)-UV-⑶）中208nm處觀(guān)察到的單個(gè)最小值確定，這在圖4B(近-UV-⑶）中進(jìn)一步描 述并且有可能得自沉淀后溶液中GLP-I的減少。當(dāng)pH提高至高于GLP-I的5. 5的pi時(shí)， 可發(fā)生該沉淀。然而，隨著pH從接近中性提高至11. 7,大部分沉淀再溶解，表明該沉淀是可 逆的。在PHIL 7剩余的未溶解的GLP-I沉淀會(huì)引起溶液中肽量降低，從而降低遠(yuǎn)-UVCD譜 系的強(qiáng)度，如圖4A中所觀(guān)察到的。還觀(guān)察到當(dāng)凍干的GLP-I粉末與pH 9緩沖液混合為高 濃度GLP-I時(shí)，GLP-I是極端不溶的。
[0138] GLP-I的穩(wěn)定件
[0139] 通過(guò)測(cè)定GLP-I肽對(duì)脫酰胺作用和氧化作用的抗性以及對(duì)攪動(dòng)和凍融循環(huán)影響 的抗性來(lái)測(cè)定其穩(wěn)定性。
[0140] 將處于pH 10.5的GLP-l(lmg/mL)在40°C孵育5天，之后進(jìn)行反相HPLC和電噴射 質(zhì)譜（MS)用于脫酰胺作用和氧化作用分析。也使用HPLC和MS對(duì)GLP-I樣品（lmg/mL)進(jìn) 行氧化研究，所述樣品在存在〇. 1% H2O2時(shí)孵育2小時(shí)。
[0141] 圖5描述了 GLP-I在脫酰胺和氧化條件下的穩(wěn)定性。HPLC色譜圖闡明了 GLP-I在 相同的滯留時(shí)間下洗脫，并且所分析的失穩(wěn)條件沒(méi)有產(chǎn)生降解峰。另外，MS分析對(duì)所有樣 品產(chǎn)生了類(lèi)似的質(zhì)量3297g/mol，表明該質(zhì)量未被改變。數(shù)據(jù)還闡明了在多種條件下孵育 時(shí)肽保持純凈和完整。因此，未觀(guān)察到GLP-I的脫酰胺。GLP-I也顯示對(duì)氧化脅迫是穩(wěn)定 的，如在存在0. 1% H2O2時(shí)所觀(guān)察的那樣，其中GLP-I的純度和質(zhì)量保持完整，如通過(guò)HPLC 和MS分別測(cè)定的那樣?？傊淮嬖跍魰r(shí)間或質(zhì)量值的改變，并且未產(chǎn)生降解峰，從而證 實(shí)了 GLP-I肽對(duì)脫酰胺和氧化均是抗性的。
[0142] 攪動(dòng)和連續(xù)的凍融循環(huán)對(duì)多種濃度的GLP-I的影響用近-UV⑶和內(nèi)熒光分析。 9. 4和I. 5mg/mL GLP-I的攪動(dòng)不產(chǎn)生肽的顯著改變，如通過(guò)近-UV⑶（圖6A)和熒光發(fā)射 (圖6B)所觀(guān)察到的那樣。將樣品在室溫下攪動(dòng)30和90分鐘，并在280nm處色氨酸激發(fā)后 收集熒光發(fā)射譜。在獨(dú)立的凍融研究中，將含I. 6、5. 1和8. 4mg/mL GLP-I (pH 4. 0)的溶液 在-20°C冷凍并在室溫下熔化。通過(guò)近-UV⑶（圖7A)和熒光發(fā)射（圖7B)指導(dǎo)和分析10 次凍融循環(huán)對(duì)GLP-I的影響。在280nm處色氨酸激發(fā)后收集熒光發(fā)射譜。兩種分析均顯示 肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)不由于多重凍融循環(huán)而可觀(guān)地改變。在類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)中，分析11次凍融循環(huán)對(duì) 10mg/mL GLP-UpH 4. 0)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響（圖7C)。遠(yuǎn)-UV⑶闡明了肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)不因?yàn)?多重凍融循環(huán)而顯著改變。
[0143] 總之，得自以上實(shí)驗(yàn)的生物物理學(xué)分析顯示GLP-I肽的結(jié)構(gòu)受其在溶液中濃度的 強(qiáng)烈影響。當(dāng)GLP-I的濃度被提高時(shí)，α-螺旋更加突出。另外，提高離子強(qiáng)度增強(qiáng)（在一 些情況下產(chǎn)生）三級(jí)GLP-I結(jié)構(gòu)。
[0144] 實(shí)施例2
[0145] GLP-I/FDKP 吸附研究
[0146] 通過(guò)進(jìn)行吸附研究評(píng)價(jià)懸浮液中GLP-I與二酮哌嗪（DKP)顆粒的相互作用。吸附 研究中的變量探究了靜電、氫鍵、水結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)柔性和特異的鹽-配對(duì)相互作用對(duì)GLP-I/ DKP相互作用的影響。另外，測(cè)試了若干種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑對(duì)GLP-I與DKP表面吸附的 影響。
[0147] 使用預(yù)先形成的DKP懸浮液顆粒（即FDKP)，研究了 GLP-I吸附至預(yù)先形成的DKP 顆粒表面的條件。FDKP顆粒懸浮液（其中FDKP顆粒是預(yù)先形成的）與3Χ pH緩沖液和3Χ 添加劑或賦形劑的溶液組合。最終溶液具有5, mg/ml的FDKP濃度和0. 25, mg/ml (5% w/w) 的GLP-I濃度。上清液中未結(jié)合的GLP-I從懸浮液中濾除。用100, mM碳酸氫銨溶解FDKP 顆粒與結(jié)合的GLP-I蛋白質(zhì)，并過(guò)濾以分離任何聚集的GLP-I蛋白質(zhì)。通過(guò)HPLC定量上清 液和重建的級(jí)分中的GLP-I量。進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，其中使用的條件包括使用添加劑（例如 鹽、表面活性劑、離子、滲透物、離液齊U、感膠離子）和多種濃度的GLP-1。得自這些研究的結(jié) 果在下文描述。
[0148] 鹽研究。-通過(guò)HPLC分析觀(guān)察鹽對(duì)GLP-I與FDKP顆粒結(jié)合的影響。在存在0、 25、50、100、250、500、1000 和 1500mM NaCl 時(shí)于 5mg/mL FDKP 和 0· 25mg/mL GLP-I 下進(jìn)行 GLP-1/FDKP顆粒的負(fù)載（圖8A)。還作為pH和NaCl濃度的函數(shù)，評(píng)價(jià)了在重建的無(wú) FDKP 對(duì)照樣品中檢測(cè)的GLP-I量（圖8B)。兩組數(shù)據(jù)組中的pH均用20mM磷酸鹽/20mM乙酸鹽 混合物控制。
[0149] 如在圖8A中所觀(guān)察到的，GLP-I對(duì)FDKP的最佳結(jié)合（吸附）受到懸浮液pH的強(qiáng) 烈影響。在4和以上的pH下，溶液中GLP-1/FDKP比例為5% w/w時(shí)，觀(guān)察到約3. 2%到約 4%的GLP-I對(duì)FDKP的結(jié)合。在存在0和25mM NaCl時(shí)，在pH 2.0下基本上沒(méi)有明顯的 GLP-I對(duì)FDKP顆粒的吸附，但是用提高的離子強(qiáng)度觀(guān)察到一些明顯的負(fù)載。在含> IM NaCl 的無(wú) FDKP對(duì)照中觀(guān)察到GLP-I沉淀，圖8B。在彡IM NaCl下該明顯的負(fù)載是GLP-I肽在高 離子強(qiáng)度下可逆沉淀（鹽析）的結(jié)果。不含F(xiàn)DKP顆粒的高鹽GLP-I對(duì)照也在重建的樣品 中顯示高GLP-I水平，表明收集上清液時(shí)GLP-I已經(jīng)被濾器捕獲。低于IM NaCl時(shí)，不存在 FDKP顆粒的情況下沒(méi)有GLP-I沉淀的跡象。
[0150] 表面活件劑研究.-通過(guò)HPLC分析研究表面活性劑對(duì)GLP-I與FDKP顆粒結(jié)合的 影響。負(fù)載在存在表面活性劑時(shí)5mg/ml FDKP和0. 25mg/mL GLP-I下進(jìn)行（圖9A)。也作 為pH和表面活性劑的函數(shù)評(píng)價(jià)了在重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中檢測(cè)的GLP-I量（圖9B)。 pH和對(duì)照樣品條件與上面描述的用于離子強(qiáng)度研究的條件相同。該研究中使用的表面活 性劑包括：〇· 〇9mM 的 fcij 78、0· OlmM 的 Tween 80、0· 2mM 的 Triton X、0. 12mM 的 Pluronic F68、0. 9mM 的 H(CH2)7S04Na、0. 9mM 的 CHAPS、0. 9 mM 的 Cetrimide。存在每種表面活性劑時(shí) GLP-I的負(fù)載曲線(xiàn)作為pH的函數(shù)針對(duì)GLP-1/FDKP顯示。
[0151] 數(shù)據(jù)顯示針對(duì)GLP-1/FDKP顆粒的pH吸附曲線(xiàn)不受接近其臨界膠團(tuán)濃度（CMC)的 表面活性劑的存在影響，所述臨界膠團(tuán)濃度即分開(kāi)下述界限的小范圍的濃度：在其以下事 實(shí)上檢測(cè)不到聚集物/膠團(tuán)的界限，且在其以上事實(shí)上所有額外的表面活性劑分子均形成 聚集物的界限。因此，還提示了任何這些表面活性劑可被用于最優(yōu)化如下所述的穩(wěn)定性和 /或藥物代謝動(dòng)力學(xué)（PK)。如上文鹽研究中可證實(shí)的，GLP-I與FDKP顆粒的相互作用受懸 浮液的pH影響。
[0152] 離子研究。對(duì)該實(shí)驗(yàn)而言，進(jìn)行兩種不同的離子研究來(lái)測(cè)定離子對(duì)GLP-I與FDKP 顆粒結(jié)合的影響。在兩種研究中，Cr為陽(yáng)離子的平衡離子，Na+為陰離子的平衡離子。如先 前實(shí)驗(yàn)所述進(jìn)行GLP-1/FDKP顆粒的負(fù)載。如上文所述控制pH。在存在和不存在NaCl (其 被用于更好地評(píng)價(jià)高離子強(qiáng)度的情況）時(shí)用pH3. 0、3. 5、4. 0或5. 0的pH緩沖液制備樣品。 個(gè)體樣品中如下包含其他離子：20或250mM的LiCl、20或250mM的NH4C1、20或250mM的 NaF 和 20 或 250mM 的 NaCH3COO15
[0153] 如圖IOA所示，來(lái)自第一個(gè)離子研究的數(shù)據(jù)顯示作為pH和離子的函數(shù)的GLP-I/ FDKP負(fù)載曲線(xiàn)。在無(wú) NaCl時(shí)，20或250mM濃度的氟化物強(qiáng)烈地影響（增強(qiáng)）低pH下的吸 附，其中250mM的NaF濃度顯示與pH無(wú)關(guān)的最大的結(jié)合。觀(guān)察到該模式是由于溶液中的氟 而不是鈉，因?yàn)樘妓釟溻c在20和250nM不具有相同的作用。另外,這些作用不是樣品中鈉 的結(jié)果，因?yàn)槿鐖D8中所示，類(lèi)似濃度的鹽不顯示該作用。存在IM NaCl時(shí)，所有的離子給 出了高的"表觀(guān)"負(fù)載。對(duì)IM NaCl，而言該"表觀(guān)"負(fù)載由存在高離子強(qiáng)度時(shí)GLP-I肽從溶 液中鹽析引起。這在圖IOB中進(jìn)一步闡明，所述圖IOB顯示GLP-I存在于含IM NaCl的重 建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中。針對(duì)這些對(duì)照樣品檢測(cè)的GLP-I的量在更大的離子濃度下提高， 因?yàn)樗鼈冊(cè)黾恿藰悠分械目傠x子強(qiáng)度。
[0154] 在第二個(gè)離子實(shí)驗(yàn)（圖10C)中，在存在20或250mM KC1、20或250mM咪唑、20或 250mM Nal、或20或250mM NaPO4時(shí)制備GLP- 1/FDKP樣品。數(shù)據(jù)顯示250mM咪唑在存在 IM NaCl時(shí)降低負(fù)載，250mM磷酸鹽和250mM均給出高的"表觀(guān)"負(fù)載（圖10C)。根據(jù)在OM 和IM NaCl濃度下重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中檢測(cè)的GLP-I量（圖10D)，這些影響是由離子 對(duì)GLP-I肽自身的影響而不是對(duì)肽與FDKP顆粒相互作用的影響引起。磷酸鈉和碘化鈉引 起不存在NaCl時(shí)一些GLP-I的鹽析。另外，咪唑幫助將GLP-I溶解于IM NaCl樣品中，從 而給出更低的"表觀(guān)"負(fù)載。在250mM磷酸鹽和碘化物的OM NaCl對(duì)照中也觀(guān)察到了沉淀。
[0155] 滲誘物研究。也通過(guò)HPLC分析觀(guān)察GLP-I對(duì)FDKP顆粒的結(jié)合。圖IlA顯示存在 常見(jiàn)的穩(wěn)定劑（滲透物）時(shí)作為pH函數(shù)的GLP-1/FDKP負(fù)載曲線(xiàn)。如先前實(shí)驗(yàn)中所述進(jìn)行 GLP-1/FDKP顆粒的負(fù)載。類(lèi)似地，如上文所述控制pH。在pH 3. 0和存在20、50、100、150、 200或300mM的滲透物（穩(wěn)定劑）時(shí)制備樣品。滲透物為己二醇（Hex-Gly)、海藻糖、甘氨 酸、PEG、TMAO、甘露醇或脯氨酸；N/A表示無(wú)滲透物。在類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)中，樣品中滲透物（穩(wěn)定 齊U)的濃度被保持恒定在lOOmM，PH從2. O到4. O變化。
[0156] 研究的滲透物（穩(wěn)定劑）均對(duì)GLP-I到FDKP表面的吸附?jīng)]有可觀(guān)的影響，無(wú)論pH 被維持在pH 3. 0而滲透物的濃度變化（圖IlA ;左側(cè)曲線(xiàn)）還是滲透物濃度被維持恒定在 IOOmM而改變pH(圖IlA ;右側(cè)曲線(xiàn)）。在重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品中未檢測(cè)到GLP-I沉淀 (圖11B)。這些滲透物可被用于最優(yōu)化穩(wěn)定性和/或藥物代謝動(dòng)力學(xué)。
[0157] 離液劑和感膠離子研究。研究影響水和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的離子種類(lèi)（離液劑和感膠 離子），確定這些因素在GLP-I對(duì)FDKP吸附中的作用。如先前的實(shí)驗(yàn)中所述進(jìn)行GLP-I/ FDKP顆粒的負(fù)載。類(lèi)似地，如上文所述控制pH。在pH 3. 0和存在0、20、50、100、150、200或 300mM下述離液劑或感膠離子時(shí)制備樣品，所述離液劑或感膠離子為：NaSCN、CsCl、Na 2S04、 (CH3)3N-HCU Na2NO3、檸檬酸鈉和NaClO4。在類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)中，樣品中離液劑或感膠離子的濃 度被保持恒定在lOOmM，PH從2. 0到4. 0變化。
[0158] 圖12A顯示作為pH和離液劑和/或感膠離子的函數(shù)的GLP-1/FDKP負(fù)載曲線(xiàn)。在 低pH( < 3)時(shí)，對(duì)于分析的不同離液劑發(fā)生了負(fù)載中的顯著變化，特別是在較高的離液劑 濃度下。然而在PH 4時(shí)，未觀(guān)察到變化（圖12C)。因此，這些試劑顯示在不利的較低pH下 促進(jìn)GLP-I對(duì)FDKP顆粒的結(jié)合，但是在對(duì)結(jié)合有利的較高pH條件下具有非常少的影響。來(lái) 自重建的無(wú) FDKP對(duì)照樣品的數(shù)據(jù)提示在pH 3.0下觀(guān)察到的負(fù)載改變部分歸因于特定的離 液劑在多種程度上影響GLP-I肽的鹽析（沉淀）（圖12B和12D)。這對(duì)強(qiáng)離液劑如NaSCN 和NaClO4而言是顯著的。
[0159] 有機(jī)物研究。評(píng)價(jià)下述醇來(lái)確定螺旋構(gòu)象在GLP-I對(duì)FDKP的吸附中所起的作用， 所述醇已知通過(guò)提高氫鍵的鍵合強(qiáng)度在無(wú)組織的肽中誘導(dǎo)螺旋構(gòu)象。如先前實(shí)驗(yàn)中所述進(jìn) 行GLP-1/FDKP顆粒的負(fù)載。類(lèi)似地，如上文所述控制pH。在pH 2· 0、3· 0、4· 0和5. 0下觀(guān) 察每種醇的作用。使用的醇為：甲醇（MeOH)、乙醇（EtOH)、三氟代乙醇（TFE)或六氟異丙醇 (HFIP)。在5%、10%、15%和20% v/v的濃度下評(píng)價(jià)每種醇。
[0160] 圖13A顯示對(duì)每種濃度的每種醇而言作為pH函數(shù)的GLP-1/FDKP負(fù)載曲線(xiàn)。在pH 3. 0下，低濃度的HFIP (5% )導(dǎo)致高吸附，如GLP-I對(duì)FDKP顆粒的質(zhì)量比所證實(shí)的那樣。只 有最強(qiáng)的H-鍵增強(qiáng)（成螺旋）醇HFIP對(duì)緩沖的懸浮液中的吸附具有影響。在更高濃度的 HFIP(20%)下，GLP-1/FDKP吸附被抑制。圖13B顯示在20%的醇濃度下，在重建的無(wú) FDKP 對(duì)照樣品中未記錄到顯著的GLP-I沉淀。
[0161] 這提示藥物的構(gòu)象柔性（即能夠形成的FDKP-接觸物的熵和數(shù)量）可在吸附中起 作用。數(shù)據(jù)提示H-鍵合在上述條件下GLP-I與FDKP表面的相互作用中可起作用。基于該 數(shù)據(jù)，還推測(cè)如果H-鍵合作為FDKP-GLP-I相互作用中主要的和一般的力作用，則應(yīng)期待更 多和更強(qiáng)的作用。
[0162] 濃度研究。-在多種GLP-I濃度下研究了 GLP-I對(duì)FDKP顆粒表面的吸附。圖14A 顯示多種PH下作為GLP-I濃度函數(shù)的來(lái)自GLP-1/FDKP的負(fù)載曲線(xiàn)。GLP-I濃度為0. 15、 0· 25、0· 4、0· 5、0· 75、1· 0、1· 5、2· 0、5· 0 或 10mg/mL。樣品的 pH 為 2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5 或 5. 0〇
[0163] 當(dāng)FDKP濃度被保持恒定在5mg/mL而GLP-1濃度提高時(shí)，觀(guān)察到FDKP顆粒上 GLP-I負(fù)載的提高。在pH 4下當(dāng)GLP-I的濃度為10mg/mL時(shí)，觀(guān)察到FDKP顆粒上接近20% 的GLP-I吸附。驚人的是，在高濃度GLP-I下未觀(guān)察到FDKP顆粒上負(fù)載的GLP-I吸附飽和。 該觀(guān)察結(jié)果可能歸因于GLP-I自身締合成為多層體。
[0164] 通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM)對(duì)GLP-1/FDKP制劑形態(tài)學(xué)的分析顯示GLP-1/FDKP顆 粒作為晶體或平板樣結(jié)構(gòu)存在，其能夠形成包含多于一個(gè)GLP-1/FDKP顆粒的聚集物（圖 14B)。通過(guò)凍干溶液制備這些制劑，所述溶液含有：（圖A)0. 5mg/mL GLP-I和2. 5mg/mL FDKP ;(圖 B) 0· 5mg/mL GLP-I 和 10mg/mL FDKP ;(圖 C) 20mM 氯化鈉、20mM 乙酸鉀和 20mM 磷 酸鉀，pH 4. 0 中 0· 5mg/mL GLP-I 和 10mg/mL FDKP ;和（圖 D)20mM 氯化鈉、20mM 乙酸鉀和 20mM 磷酸鉀，pH 4. 0 中 10mg/mL GLP-I 和 50mg/mL FDKP
[0165] 結(jié)果概沭
[0166] 總之，對(duì)GLP-I與FDKP顆粒相互作用的吸附研究顯示GLP-I以pH-依賴(lài)性的方式 與DKP顆粒表面結(jié)合，在pH 4或之上具有高吸附。發(fā)現(xiàn)DKP顆粒表面對(duì)GLP-I的吸附受 到pH最強(qiáng)影響，在pH 2. 0時(shí)基本沒(méi)有吸附，在pH > 4. 0時(shí)有重大的相互作用。根據(jù)觀(guān)察， 在低PH下鈉和氟離子增強(qiáng)吸附。其他添加劑如表面活性劑和常用的穩(wěn)定劑僅對(duì)GLP-I與 FDKP顆粒表面的吸附具有輕微影響。
[0167] 另外，GLP-I自身的特性影響這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)GLP-I的行為是非典型并且驚 人的，因?yàn)槲从^(guān)察到飽和吸附，這歸因于高濃度下GLP-I的自身締合。高濃度下GLP-I的自 身締合允許可能的多層GLP-I肽對(duì)DKP顆粒的包裹，從而促進(jìn)更高百分比的GLP-I肽負(fù)載。 該驚人的自身締合性質(zhì)證實(shí)在制備穩(wěn)定的GLP-I施用形式中是有益的。另外，GLP-I的自 身締合構(gòu)象可以能夠減少或延遲其在血中的降解。然而，注意到當(dāng)操作締合的GLP-I時(shí)必 須小心，因?yàn)槠鋵?duì)溫度和高pH是敏感的。
[0168] 實(shí)施例3
[0169] GLP-1/FDKP制劑的完整件分析
[0170] 以來(lái)自實(shí)施例1和2中實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇了具有表1中所述特征的一系列 GLP-I制劑用于本文討論的細(xì)胞存活力測(cè)定。大部分制劑含有GRAS ("一般被認(rèn)為安全的"） 賦形劑，但是一些被選擇以允許研究穩(wěn)定性和吸附之間的關(guān)系。
[0171] 表 L 針對(duì)完整性相分析（Integrity Phase Analysis)選擇的 GLP-1/FDKP。
[0172]

【權(quán)利要求】
1. 一種干粉組合物，其包含含有吸附了 GLP-1分子的多肽的二酮哌嗪的微粒，其中所 述GLP-1分子選自由以下物質(zhì)組成的組：天然的GLP-1、GLP-1代謝產(chǎn)物、GLP-1類(lèi)似物、 GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護(hù)的GLP-UGLP-1模擬物、GLP-1肽類(lèi)似物或生 物合成的GLP-1類(lèi)似物。
2. 權(quán)利要求1的干粉組合物，其中所述二酮哌嗪是具有式2, 5-二酮-3, 6-二（4-X-氨 丁基）哌嗪的二酮哌嗪，其中X選自由琥珀?；?、戊二?；?、馬來(lái)酰基和富馬?；M成的組。
3. 權(quán)利要求2的干粉組合物，其中所述二酮哌嗪是2, 5-二酮-3, 6-二（4-富馬酰-氨 丁基）哌嗪。
4. 權(quán)利要求1的干粉組合物，其中所述GLP-1分子是天然的GLP-1。
5. 權(quán)利要求1的干粉組合物，其中所述GLP-1分子是酰胺化的GLP-1分子。
6. 權(quán)利要求5的干粉組合物，其中所述酰胺化的GLP-1分子是GLP-1 (7-36)酰胺。
7. 用于形成包含吸附了 GLP-1分子的二酮哌嗪的顆粒的方法，所述方法包括步驟： 提供GLP-1分子； 提供下述形式的二酮哌嗪，所述形式選自能形成顆粒的二酮哌嗪、二酮哌嗪顆粒及其 組合；和 將所述GLP-1分子與所述二酮哌嗪以共溶液的形式組合，其中形成包含所述吸附了 GLP-1分子的二酮哌嗪的所述顆粒，并且其中所述GLP-1分子選自由以下物質(zhì)組成的組：天 然的GLP-1、GLP-1代謝產(chǎn)物、GLP-1類(lèi)似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護(hù) 的GLP-1、GLP-1模擬物、GLP-1肽類(lèi)似物或生物合成的GLP-1類(lèi)似物。
8. 權(quán)利要求7的方法，其還包括通過(guò)凍干法、過(guò)濾或噴霧干燥從所述共溶液中去除溶 劑。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中通過(guò)去除所述溶劑形成包含所述吸附了 GLP-1分子的二酮 哌嗪的所述顆粒。
10. 權(quán)利要求8的方法，其中在去除所述溶劑之前形成包含所述吸附了 GLP-1分子的二 酮哌嗪的所述顆粒。
11. 權(quán)利要求7的方法，其中所述GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含約 1 μ g/ml_50mg/ml 的 GLP-1 濃度。
12. 權(quán)利要求7的方法，其中所述GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含約 0· lmg/ml-10mg/ml 的 GLP-1 濃度。
13. 權(quán)利要求7的方法，其中所述GLP-1分子以溶液的形式提供，所述溶液包含約 0· 25mg/ml 的 GLP-1 濃度。
14. 權(quán)利要求7的方法，其中所述二酮哌嗪以二酮哌嗪顆粒懸浮液的形式提供。
15. 權(quán)利要求7的方法，其中所述二酮哌嗪以包含能形成顆粒的二酮哌嗪的溶液的形 式提供，所述方法還包括調(diào)節(jié)所述溶液的pH以形成二酮哌嗪顆粒。
16. 權(quán)利要求14或15的方法，其還包括向所述溶液或懸浮液中添加試劑，其中所述試 劑選自由鹽、表面活性劑、離子、滲透物、離液劑和感膠離子、酸、堿和有機(jī)溶劑組成的組。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述試劑促進(jìn)所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪顆?；蛩?述能形成顆粒的二酮哌嗪之間的締合。
18. 權(quán)利要求16的方法，其中所述試劑改善所述GLP-1分子的穩(wěn)定性或藥物動(dòng)力學(xué)。
19. 權(quán)利要求16的方法，其中所述試劑為氯化鈉。
20. 權(quán)利要求14或15的方法，其還包括調(diào)節(jié)所述懸浮液或溶液的pH。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述pH被調(diào)節(jié)至約4或更大。
22. 權(quán)利要求7的方法，其中所述顆粒中的所述GLP-1分子具有更高的穩(wěn)定性。
23. 權(quán)利要求7的方法，其中所述共溶液包含約1 μ g/ml-50mg/ml的GLP-1濃度。
24. 權(quán)利要求7的方法，其中所述共溶液包含約0. lmg/ml-10mg/ml的GLP-1濃度。
25. 權(quán)利要求7的方法，其中所述共溶液包含約0. 25mg/ml的GLP-1濃度。
26. 權(quán)利要求7的方法，其還包括向所述共溶液中添加試劑，其中所述試劑選自由鹽、 表面活性劑、離子、滲透物、離液劑和感膠離子、酸、堿和有機(jī)溶劑組成的組。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述試劑促進(jìn)所述GLP-1分子和所述二酮哌嗪顆?；蛩?述能形成顆粒的二酮哌嗪之間的締合。
28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述試劑改善所述GLP-1分子的穩(wěn)定性或藥物動(dòng)力學(xué)。
29. 權(quán)利要求26的方法，其中所述試劑為氯化鈉。
30. 權(quán)利要求7的方法，其還包括調(diào)節(jié)所述共溶液的pH。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述pH被調(diào)節(jié)至約4或更大。
32. 吸附了 GLP-1分子的二酮哌嗪微粒在制造用于治療病癥或疾病的藥物中的用途， 其中所述病癥或疾病選自由糖尿病、局部缺血、再灌注組織損傷、血脂障礙、糖尿病性心臟 病、心肌梗塞、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、肥胖癥、手術(shù)后的分解代謝改變、高血糖癥、過(guò)敏性腸 綜合征、中風(fēng)、神經(jīng)變性病癥、記憶和學(xué)習(xí)障礙、胰島細(xì)胞移植和再生性治療組成的組，其中 所述GLP-1分子選自由以下物質(zhì)組成的組：天然的GLP-1、GLP-1代謝產(chǎn)物、GLP-1類(lèi)似物、 GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護(hù)的GLP-1、GLP-1模擬物、GLP-1肽類(lèi)似物或生 物合成的GLP-1類(lèi)似物。
33. 權(quán)利要求32的用途，其中所述藥物通過(guò)靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、經(jīng)直腸或 通過(guò)肺部遞送進(jìn)行給藥。
34. 權(quán)利要求32的用途，其中所述藥物通過(guò)肺部遞送進(jìn)行給藥。
35. 形成具有改善的GLP-1藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式的粉末組合物的方法，所述方法包括 步驟： 提供GLP-1分子，其中所述GLP-1分子選自由以下物質(zhì)組成的組：天然的GLP-UGLP-1 代謝產(chǎn)物、GLP-1類(lèi)似物、GLP-1衍生物、二肽基肽酶-IV(DPP-IV)保護(hù)的GLP-1、GLP-1模 擬物、GLP-1肽類(lèi)似物或生物合成的GLP-1類(lèi)似物； 提供溶液中的能形成顆粒的二酮哌嗪； 形成二酮哌嗪顆粒； 將所述GLP-1分子與所述溶液組合形成共溶液；和 通過(guò)噴霧干燥從所述共溶液中去除溶劑，形成具有改善的GLP-1藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式 并且包含下述微粒的粉末，所述微粒含有吸附了 GLP-1分子的二酮哌嗪。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述改善的GLP-1藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式包含提高的 GLP-1半衰期。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述提高的GLP-1半衰期大于或等于7. 5分鐘。
38. 權(quán)利要求35的方法，其中所述改善的GLP-1藥物代謝動(dòng)力學(xué)模式包括與天然 GLP-1相比改善的GLP-1生物利用度。
【文檔編號(hào)】A61K38/26GK104288756SQ201410514033
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2007年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2006年4月14日
【發(fā)明者】斯蒂芬尼·戈恩, 大衛(wèi)·布蘭特, 柯哈瓦·蓋爾伯, 馬克·金, 韋曼·溫蒂爾·師特漢姆, 凱斯·奧伯格, 安德里亞·勒龍-貝, 馬克·J·豪肯森, 瑪麗·法瑞斯 申請(qǐng)人:曼金德公司