用于減少cd36表達(dá)的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于減少CD36表達(dá)的方法。該方法包括用使得細(xì)胞與有效量的芳族陽離子肽接觸，其中該芳族陽離子肽具有：至少一個凈正電荷；最少4個氨基酸；最多大約20個氨基酸；凈正電荷的最小數(shù)目(Pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系，其中3Pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及芳族基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(Pt)之間的關(guān)系，其中2a是小于或等于Pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時，Pt也可以是1。本發(fā)明還提供了芳族陽離子肽在制備用于治療哺乳動物中的動脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用，所述芳族陽離子肽是D-Arg-2'6'Dmt-Lys-Phe-NH2。
【專利說明】用于減少CD36表達(dá)的方法
[0001] 本申請是申請日為2006年9月18日、分案提交日為2012年2月9日、申請?zhí)枮?201210028972. 2、發(fā)明名稱為"用于減少⑶36表達(dá)的方法"的分案申請的再次分案申請，其 中，申請?zhí)枮?01210028972. 2的分案申請是申請?zhí)枮?00680040019. 2、申請日為2006年9 月18日、發(fā)明名稱為"用于減少CD36表達(dá)的方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 本申請要求對2005年9月16日提交的美國臨時申請序列號為60/718, 170的優(yōu) 先權(quán)。美國臨時申請序列號為60/718, 170的說明書（專利申請）以引用方式結(jié)合于本文。
[0003] 在本申請中描述的發(fā)明得到以下單位的資助：美國國家藥物濫用研究所（the National Institute of Drug Abuse)，資助號P01DA08924;美國神經(jīng)疾病與中風(fēng)研究所 (the National Institute of Neurological Diseases and Stroke)，資助號 R2INS48295; 以及美國心肺血液研究所（the National Heart, Lung and Blood Institute)，資助號 R01HL082511。美國政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。

【背景技術(shù)】
[0004] ⑶36是B類清道夫受體家族的一種跨膜蛋白。該蛋白被廣泛表達(dá)在許多細(xì)胞上， 如微血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞（例如，腸上皮細(xì)胞和腎小管細(xì) 胞等）、胰島細(xì)胞以及心肌細(xì)胞。該受體可以與多種細(xì)胞外配體相互作用，如血小板凝血酶 敏感蛋白-1、長鏈脂肪酸、以及氧化型低密度脂蛋白。
[0005] CD36的異常表達(dá)與多種疾病和病癥有關(guān)。例如，與野生型小鼠相比，當(dāng)進(jìn)食西方飲 食（Western diet)時，缺少⑶36的小鼠具有較少的動脈粥樣硬化病變。另外據(jù)報道，⑶36 基因剔除小鼠可避免患有急性腦缺血。
[0006] 因此，用于減少⑶36表達(dá)的方法可有助于治療特征為⑶36異常表達(dá)的疾病或病 癥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于減少細(xì)胞中的CD36表達(dá)的方法。該方 法包括使細(xì)胞與有效量的芳族陽離子肽（aromatic-cationic peptide)接觸。
[0008] 在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在有需要的哺乳動物中減少CD36表達(dá) 的方法。該方法包括給予哺乳動物有效量的芳族陽離子肽。
[0009] 在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在有需要的哺乳動物中治療特征為CD36 表達(dá)增加的疾病或病癥的方法。該方法包括給予哺乳動物有效量的芳族陽離子肽。
[0010] 在一種進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在有需要的哺乳動物中治療輸尿 管梗阻的方法。該方法包括給予哺乳動物有效量的芳族陽離子肽。
[0011] 在一種更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在有需要的哺乳動物中治療糖 尿病腎病的方法。該方法包括給予哺乳動物有效量的芳族陽離子肽。
[0012] 在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于減少取出的器官或組織中的CD36 表達(dá)的方法。該方法包括給予哺乳動物有效量的芳族陽離子肽。
[0013] 本發(fā)明的方法中所用的芳族陽離子肽具有：至少一個凈正電荷；最少4個氨基酸； 最多大約20個氨基酸；凈正電荷的最小數(shù)目（P m)與氨基酸殘基的總數(shù)（r)之間的關(guān)系，其 中3Pm是小于或等于r+Ι的最大數(shù)；以及芳族基團(tuán)的最小數(shù)目（a)與凈正電荷的總數(shù)（P t) 之間的關(guān)系，其中2a是小于或等于Pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時之外，Pt也可以是1。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1，SS-31減少了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的oxLDL(氧化修飾低密度脂蛋白）誘導(dǎo) 的⑶36mRNA表達(dá)、⑶36蛋白表達(dá)、以及泡沫細(xì)胞的形成。
[0015] 圖2,在患有急性腦缺血的野生型小鼠中，SS-31療法（或治療）減小了梗死體積 和腦半球腫脹（hemispheric swelling)。
[0016] 圖3，SS_31療法減少了野生型小鼠局部缺血后的腦中的還原型谷胱甘肽（GSH)的 降低。
[0017] 圖4,在患有急性腦缺血的⑶36基因剔除（敲除）小鼠中，SS-31在減少梗死體積 或腦半球腫脹方面沒有作用（療效）。
[0018] 圖5, SS-31沒有減少來自⑶36基因剔除小鼠缺血后的腦中的GSH的消耗（排除， depletion)〇
[0019] 圖6, SS-31減少了野生型小鼠缺血后的腦中的⑶36mRNA的表達(dá)。
[0020] 圖7, SS-31降低了在單側(cè)輸尿管梗阻（UUO)后腎小管細(xì)胞中的⑶36表達(dá)。對側(cè) 未梗阻腎（圖7-A);用鹽水處理的動物的梗阻腎（圖7-B);以及用SS-31處理的獲自大鼠 的梗阻腎（圖7-C)。
[0021] 圖8, SS-31減少了 UUO后的腎中的脂質(zhì)過氧化作用。在梗阻腎中的腎小管細(xì)胞 (圖8-B);對側(cè)未梗阻對照（圖8-A);以及來自用SS-31處理的大鼠的梗阻腎（圖8-C)。
[0022] 圖9, SS-31減少了 UUO后的梗阻腎中的腎小管細(xì)胞凋亡。來自鹽水處理的動物的 梗阻腎（圖9-B);對側(cè)未梗阻對照（圖9-A);來自SS-31處理的動物的梗阻腎（圖9-C)。
[0023] 圖10，SS_31減少了由UUO誘導(dǎo)的梗阻腎中的巨噬細(xì)胞浸潤。梗阻腎（圖10-B); 對側(cè)未梗阻對照（圖10-A);用SS-31處理的大鼠的梗阻腎（圖10-C)。
[0024] 圖11，SS_31減少了 UUO后的梗阻腎中的間質(zhì)纖維化。梗阻的腎（圖11-B);對側(cè) 未梗阻對照（圖11-A);用SS-31處理的大鼠的梗阻腎（圖11-C)。
[0025] 圖12,用SS-31或SS-20阻止⑶36表達(dá)上調(diào)的離體（分離的）心臟的冷儲存（冷 藏）。"背景"對照（圖12-A和12-B)表示來自正常非缺血心臟的兩個切片，其沒有用第一抗 CD36 抗體（primary anti_CD36antibody)加以處理。"正常心臟"（圖 12-C 和 12-D)表不 獲自非缺血心臟的兩個切片。與"正常心臟"相比，來自代表性心臟（其在4°C的St. Thomas 溶液中儲存了 18小時）的切片（圖12-E和12-F)顯示出增強(qiáng)的⑶36染色。在具有InM SS-31 (圖 12-G 和 12-H)或 IOOnM SS-20(圖 12-1 和 12-J)的 St. Thomas 溶液中儲存的心 臟中，CD36染色顯著降低。
[0026] 圖13，SS_31和SS-20減少了離體豚鼠心臟中的脂質(zhì)過氧化作用，其中離體豚鼠心 臟在延長的（prolonged)冷缺血以后經(jīng)受熱再灌注。經(jīng)受在St. Thomas溶液中冷藏18小 時的心臟的HNE染色（圖13-A)與非缺血心臟的HNE染色進(jìn)行對比（圖13-B)。在貯存于 SS-31 (圖13-C)或SS-20(圖13-D)的心臟中，HNE染色減少。
[0027] 圖14，SS_31和SS-20消除了離體豚鼠心臟中的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其中該離體豚鼠心 臟在持續(xù)的冷缺血以后經(jīng)受熱再灌注。在St. Thomas溶液中經(jīng)受18小時冷藏的心臟（圖 14-C和14-D);非缺血正常心臟（圖14-A和14-B)。在貯存于SS-31 (圖14-E和14-F)或 SS-20(圖14-G和14-H)的心臟中沒有觀察到凋亡的細(xì)胞。
[0028] 圖15，SS_31和SS-20可維持離體豚鼠心臟中的冠狀動脈流量，其中離體豚鼠心臟 在延長的冷缺血以后經(jīng)受熱再灌注。單獨(dú)用心臟停搏液（St. Thomas溶液）或用包含InM SS-31 (圖15-A)或IOOnM SS-20 (圖15-B)的St. Thomas溶液灌注豚鼠心臟3分鐘，然后經(jīng) 受18小時的冷缺血（4°C )。
[0029] 圖16, SS-31防止對糖尿病小鼠近端小管的損傷。通過鏈脲霉素（STZ)注射5天 來誘導(dǎo)糖尿病。在3周后獲得的腎切片顯示，在STZ處理的動物中失去刷狀緣（圖16-B)， 而在未用STZ處理的小鼠中則沒有觀察到失去刷狀緣（圖16-A)。在每日接受SS-31 (3mg/ kg)的用STZ處理的動物中沒有觀察到刷狀緣的喪失（圖16-C)。
[0030] 圖17, SS-31防止了糖尿病小鼠中腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。通過鏈脲霉素（STZ) 注射5天來誘導(dǎo)糖尿病。3周后獲得的腎切片顯示，在STZ處理的動物中近端小管中凋亡的 細(xì)胞顯著增加（圖17-A，圖片b)，而在未用STZ處理的小鼠中則未觀察到近端小管中凋亡 的細(xì)胞顯著增加（圖17-A，圖片a)。在每日接受SS-31 (3mg/kg)的小鼠中未觀察到STZ誘 導(dǎo)的凋亡（圖17-A，圖片c)。SS-31療法顯著降低了由STZ引起的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)（圖 17-B)。

【具體實(shí)施方式】
[0031] Ii
[0032] 本發(fā)明涉及通過某些芳族陽離子肽來減少⑶36表達(dá)。這些芳族陽離子肽是水溶 性的和高極性的。盡管有這些性質(zhì)，但這些肽可以容易地穿透細(xì)胞膜。
[0033] 本發(fā)明所用的芳族陽離子肽包括最少3個氨基酸，并且優(yōu)選包括最少4個氨基酸， 氨基酸通過肽鍵共價相連。
[0034] 在本發(fā)明的芳族陽離子肽中存在的氨基酸的最大數(shù)目為大約20個，它們通過肽 鍵共價相連。優(yōu)選地，氨基酸的最大數(shù)目為約12個，更優(yōu)選約9個，以及最優(yōu)選約6個。最 佳地，在肽中存在的氨基酸的數(shù)目為4個。
[0035] 本發(fā)明所用的芳族陽離子肽的氨基酸可以是任何氨基酸。如在本文中所使用的， 術(shù)語"氨基酸"用來指任何包含至少一個氨基基團(tuán)和至少一個羧基基團(tuán)的有機(jī)分子。優(yōu)選 地，至少一個氨基基團(tuán)是在羧基基團(tuán)的α位。
[0036] 氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如，二十種最常見的通常 存在于哺乳動物蛋白質(zhì)中的左旋（L)氨基酸，S卩，丙氨酸（Ala)、精氨酸（Arg)、天冬酰胺 (Asn)、天冬氨酸（Asp)、半胱氨酸（Cys)、谷氨酰胺（Gln)、谷氨酸（Glu)、甘氨酸（Gly)、組氨 酸（His)、異亮氨酸（Ileu)、亮氨酸（Leu)、賴氨酸（Lys)、蛋氨酸（Met)、苯丙氨酸（Phe)、脯 氨酸（Pro)、絲氨酸（Ser)、蘇氨酸（Thr)、色氨酸（Trp)、酪氨酸（Tyr)、以及纈氨酸（Val)。 [0037] 其它天然存在的氨基酸包括，例如，在與蛋白質(zhì)合成無關(guān)的代謝過程中合成的氨 基酸。例如，氨基酸鳥氨酸和瓜氨酸是在尿素產(chǎn)生過程中，在哺乳動物代謝中合成的。天然 存在的氨基酸的另一個實(shí)例包括羥脯氨酸（Hyp)。
[0038] 本發(fā)明所用的的肽可選地包含一種或多種非天然存在的氨基酸。最佳地，該肽沒 有天然存在的氨基酸。該非天然存在的氨基酸可以是左旋（L-)氨基酸、右旋（D-)氨基酸、 或其混合。
[0039] 非天然存在的氨基酸是那些氨基酸，其通常不是在生物體的正常代謝過程中合成 的，并且并不天然存在于蛋白質(zhì)中。此外，本發(fā)明所用的非天然存在的氨基酸優(yōu)選還不被常 見蛋白酶所識別。
[0040] 非天然存在的氨基酸可以存在于肽的任何位置。例如，非天然存在的氨基酸可以 在N-端、C-端、或在N-端與C-端之間的任何位置。
[0041] 非天然氨基酸可以，例如，包括不存在于天然氨基酸中的烷基、芳基、或烷基芳基 基團(tuán)。非天然烷基氨基酸的某些實(shí)例包括α -氨基丁酸、β -氨基丁酸、Y -氨基丁酸、δ -氨 基戊酸、以及ε-氨基己酸。非天然芳基氨基酸的某些實(shí)例包括鄰氨基苯甲酸、間氨基苯甲 酸、以及對氨基苯甲酸。非天然烷基芳基氨基酸的某些實(shí)例包括鄰氨基苯乙酸、間氨基苯乙 酸、對氨基苯乙酸、以及 Υ-苯基-β-氨基丁酸。
[0042] 非天然存在的氨基酸包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生 物可以，例如，包括將一個或多個化學(xué)基團(tuán)加入天然存在的氨基酸。
[0043] 例如，可以將一個或多個化學(xué)基團(tuán)加到苯丙氨酸或酪氨酸殘基的芳香環(huán)的2'、3'、 4'、5'、或6'位的一個或多個，或加到色氨酸殘基的苯并環(huán)的4'、5'、6'、或7'位的一個或 多個。該基團(tuán)可以是可加入芳環(huán)的任何化學(xué)基團(tuán)。這種基團(tuán)的某些實(shí)例包括：支鏈或直鏈 C1-C4燒基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、或叔丁基、C1-C 4燒基氧基（即燒氧 基）、氨基、C1-C4烷基氨基和C1-C 4二烷氨基（例如甲氨基、二甲氨基）、硝基、羥基、鹵素（即 氟、氯、溴、或碘）。天然存在氨基酸的非天然存在的衍生物的某些具體實(shí)例包括正纈氨酸 (Nva)和正亮氨酸（Nle)。
[0044] 本發(fā)明方法中所用的肽的氨基酸的修飾的另一個實(shí)例是肽的天冬氨酸或谷氨酸 殘基的羧基基團(tuán)的衍生化。衍生化的一個實(shí)例是利用氨或利用伯胺或仲胺（例如甲胺、乙 胺、二甲胺或二乙胺）的酰胺化作用。衍生化的另一個實(shí)例包括利用例如甲醇或乙醇的酯 化作用。
[0045] 另一種這樣的修飾包括賴氨酸、精氨酸，或組氨酸殘基的氨基基團(tuán)的衍生化。例 如，可以酰化上述氨基基團(tuán)。一些適宜的?；鶊F(tuán)包括，例如包含上述任何C 1-C4烷基基團(tuán) 的苯甲酰基基團(tuán)或烷?；鶊F(tuán)，如乙酰基或丙?；鶊F(tuán)。
[0046] 非天然存在的氨基酸優(yōu)選是抗常見蛋白酶的，并且更優(yōu)選對常見蛋白酶不敏感。 抗蛋白酶或?qū)Φ鞍酌覆幻舾械姆翘烊淮嬖诘陌被釋?shí)例包括任何上述天然存在的L-氨基 酸的右旋（D-)形式、以及L-和/或D-非天然存在的氨基酸。D-氨基酸通常并不存在于蛋 白質(zhì)中，雖然它們存在于某些肽類抗生素中，其中肽類抗生素是通過不同于細(xì)胞的正常核 糖體蛋白合成方法的方式而被合成的。如在本文中所使用的，D-氨基酸被認(rèn)為是非天然存 在的氨基酸。
[0047] 為了使蛋白酶敏感性降到最小程度，本發(fā)明方法中所用的肽應(yīng)具有少于5個、優(yōu) 選少于4個、更優(yōu)選少于3個、以及最優(yōu)選少于兩個由常見蛋白酶識別的相鄰的L-氨基酸， 而不考慮氨基酸是天然存在的還是非天然存在的。最佳地，該肽僅具有D-氨基酸，而沒有 L-氨基酸。
[0048] 如果肽包含蛋白酶敏感的氨基酸序列，則至少一個氨基酸優(yōu)選為非天然存在的 D-氨基酸，從而賦予蛋白酶抗性（蛋白酶耐受性，protease resistance)。蛋白酶敏感序 列的一個實(shí)例包括兩個或更多容易被常見蛋白酶（如內(nèi)肽酶和胰蛋白酶）切割的相鄰的堿 性氨基酸。堿性氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、賴氨酸以及組氨酸。
[0049] 重要的是，與肽中的氨基酸殘基總數(shù)相比，在生理pH下芳族陽離子肽具有最小數(shù) 目的凈正電荷。在生理PH下凈正電荷的最小數(shù)目將在下文稱作（p m)。肽中氨基酸殘基的 總數(shù)將在下文稱作（r)。
[0050] 下文提及的凈正電荷的最小數(shù)目均是在生理pH下。如在本文中所使用的術(shù)語"生 理pH"是指哺乳動物身體的組織和器官的細(xì)胞內(nèi)的正常pH。例如，人的生理pH通常為約 7. 4,但哺乳動物的正常生理pH可以是從約7. 0至約7. 8的任何pH。
[0051] 如在本文中所使用的，術(shù)語"凈電荷"是指在肽中存在的氨基酸所攜帶的正電荷數(shù) 目和負(fù)電荷數(shù)目的差值。在本說明書中，應(yīng)當(dāng)明了，凈電荷是在生理PH下測量的。在生理 pH下帶正電荷的天然存在的氨基酸包括L-賴氨酸、L-精氨酸、以及L-組氨酸。在生理pH 下帶負(fù)電荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
[0052] 通常，肽具有帶正電荷的N-末端氨基基團(tuán)和帶負(fù)電荷的C-末端羧基基團(tuán)。這些 電荷在生理pH下彼此抵消。
[0053] 作為計算凈電荷的實(shí)例，肽：Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg具有一個帶負(fù) 電荷的氨基酸（即谷氨酸）和四個帶正電荷的氨基酸（即兩個精氨酸殘基、一個賴氨酸、以 及一個組氨酸）。因此，上述肽具有三個凈正電荷。
[0054] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，芳族陽離子肽在生理pH下的凈正電荷的最小數(shù)目 (Pm)與氨基酸殘基的總數(shù)（r)之間的關(guān)系為：其中3p m是小于或等于r+Ι的最大數(shù)。在該 實(shí)施方式中，凈正電荷的最小數(shù)目（Pm)與氨基酸殘基的總數(shù)（r)之間的關(guān)系如下：
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 芳族陽離子肽在制備用于治療哺乳動物中的動脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用，其中， 所述芳族陽離子肽是D-Arg-2' 6' Dmt-LyS-Phe-NH2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述哺乳動物是人。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述哺乳動物患有II型糖尿病。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述肽被配制為口服地、局部地、系統(tǒng)地、靜脈內(nèi) 地、皮下地或肌內(nèi)地給予。
【文檔編號】A61K38/07GK104324360SQ201410509385
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2006年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2005年9月16日
【發(fā)明者】黑茲爾·H·塞托, 劉少毅, 趙圣煦 申請人:科內(nèi)爾研究基金會