用于減少cd36表達(dá)的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于減少CD36表達(dá)的方法。該方法包括用使得細(xì)胞與有效量的芳族陽(yáng)離子肽接觸，其中該芳族陽(yáng)離子肽具有：至少一個(gè)凈正電荷；最少4個(gè)氨基酸；最多大約20個(gè)氨基酸；凈正電荷的最小數(shù)目（Pm）與氨基酸殘基的總數(shù)（r）之間的關(guān)系，其中3Pm是小于或等于r+1的最大數(shù)；以及芳族基團(tuán)的最小數(shù)目（a）與凈正電荷的總數(shù)（Pt）之間的關(guān)系，其中2a是小于或等于Pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為1時(shí)，Pt也可以是1。
【專利說(shuō)明】用于減少CD36表達(dá)的方法
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年9月18日、分案提交日為2012年2月9日、申請(qǐng)?zhí)枮?01210028972.2、發(fā)明名稱為“用于減少⑶36表達(dá)的方法”的分案申請(qǐng)的再次分案申請(qǐng)，其中，申請(qǐng)?zhí)枮?01210028972.2的分案申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00680040019.2、申請(qǐng)日為2006年9月18日、發(fā)明名稱為“用于減少CD36表達(dá)的方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]本申請(qǐng)要求對(duì)2005年9月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)為60/718，170的優(yōu)先權(quán)。美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)為60/718，170的說(shuō)明書(shū)(專利申請(qǐng))以引用方式結(jié)合于本文。
[0003]在本申請(qǐng)中描述的發(fā)明得到以下單位的資助:美國(guó)國(guó)家藥物濫用研究所(theNational Institute of Drug Abuse),資助號(hào)P01DA08924 ;美國(guó)神經(jīng)疾病與中風(fēng)研究所(the National Institute of Neurological Diseases and Stroke),資助號(hào)R21NS48295 ;以及美國(guó)心肺血液研究所(the National Heart, Lung and Blood Institute),資助號(hào)R01HL082511。美國(guó)政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0004]⑶36是B類清道夫受體家族的一種跨膜蛋白。該蛋白被廣泛表達(dá)在許多細(xì)胞上，如微血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞(例如，腸上皮細(xì)胞和腎小管細(xì)胞等)、胰島細(xì)胞以及心肌細(xì)胞。該受體可以與多種細(xì)胞外配體相互作用，如血小板凝血酶敏感蛋白-1、長(zhǎng)鏈脂肪酸、以及氧化型低密度脂蛋白。
[0005]CD36的異常表達(dá)與多種疾病和病癥有關(guān)。例如，與野生型小鼠相比，當(dāng)進(jìn)食西方飲食(Western diet)時(shí)，缺少⑶36的小鼠具有較少的動(dòng)脈粥樣硬化病變。另外據(jù)報(bào)道，⑶36基因剔除小鼠可避免患有 急性腦缺血。
[0006]因此，用于減少⑶36表達(dá)的方法可有助于治療特征為⑶36異常表達(dá)的疾病或病癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于減少細(xì)胞中的CD36表達(dá)的方法。該方法包括使細(xì)胞與有效量的芳族陽(yáng)離子肽(aromatic-cationic peptide)接觸。
[0008]在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在有需要的哺乳動(dòng)物中減少CD36表達(dá)的方法。該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的芳族陽(yáng)離子肽。
[0009]在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在有需要的哺乳動(dòng)物中治療特征為CD36表達(dá)增加的疾病或病癥的方法。該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的芳族陽(yáng)離子肽。
[0010]在一種進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在有需要的哺乳動(dòng)物中治療輸尿管梗阻的方法。該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的芳族陽(yáng)離子肽。
[0011]在一種更進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種在有需要的哺乳動(dòng)物中治療糖尿病腎病的方法。該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的芳族陽(yáng)離子肽。
[0012]在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于減少取出的器官或組織中的CD36表達(dá)的方法。該方法包括給予哺乳動(dòng)物有效量的芳族陽(yáng)離子肽。[0013]本發(fā)明的方法中所用的芳族陽(yáng)離子肽具有:至少一個(gè)凈正電荷；最少4個(gè)氨基酸；最多大約20個(gè)氨基酸；凈正電荷的最小數(shù)目(Pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系，其中3Pm是小于或等于r+Ι的最大數(shù)；以及芳族基團(tuán)的最小數(shù)目(a)與凈正電荷的總數(shù)(Pt)之間的關(guān)系，其中2a是小于或等于Pt+1的最大數(shù)，除非當(dāng)a為I時(shí)之外，Pt也可以是I。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1，SS-31減少了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的oxLDL (氧化修飾低密度脂蛋白)誘導(dǎo)的⑶36mRNA表達(dá)、⑶36蛋白表達(dá)、以及泡沫細(xì)胞的形成。
[0015]圖2，在患有急性腦缺血的野生型小鼠中，SS-31療法(或治療)減小了梗死體積和腦半球腫脹(hemispheric swelling)。
[0016]圖3，SS_31療法減少了野生型小鼠局部缺血后的腦中的還原型谷胱甘肽(GSH)的降低。
[0017]圖4，在患有急性腦缺血的⑶36基因剔除(敲除)小鼠中，SS-31在減少梗死體積或腦半球腫脹方面沒(méi)有作用(療效)。
[0018]圖5，SS-31沒(méi)有減少來(lái)自⑶36基因剔除小鼠缺血后的腦中的GSH的消耗(排除，depletion)。
[0019]圖6，SS-31減少了野生型小鼠缺血后的腦中的⑶36mRNA的表達(dá)。
[0020]圖7，SS-31降低了在單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)后腎小管細(xì)胞中的⑶36表達(dá)。對(duì)側(cè)未梗阻腎(圖7A);用鹽水處理的動(dòng)物的梗阻腎(圖7B);以及用SS-31處理的獲自大鼠的梗阻腎(圖7C)。
·[0021]圖8，SS-31減少了 UUO后的腎中的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。在梗阻腎中的腎小管細(xì)胞(圖SB);對(duì)側(cè)未梗阻對(duì)照(圖8A);以及來(lái)自用SS-31處理的大鼠的梗阻腎(圖SC)。
[0022]圖9，SS_31減少了 UUO后的梗阻腎中的腎小管細(xì)胞凋亡。來(lái)自鹽水處理的動(dòng)物的梗阻腎(圖9B);對(duì)側(cè)未梗阻對(duì)照(圖9A);來(lái)自SS-31處理的動(dòng)物的梗阻腎(圖9C)。
[0023]圖10，SS-31減少了由UUO誘導(dǎo)的梗阻腎中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。梗阻腎(圖10B);對(duì)側(cè)未梗阻對(duì)照(圖10A);用SS-31處理的大鼠的梗阻腎(圖10C)。
[0024]圖11，SS_31減少了 UUO后的梗阻腎中的間質(zhì)纖維化。梗阻的腎(圖11B);對(duì)側(cè)未梗阻對(duì)照(圖11A);用SS-31處理的大鼠的梗阻腎(圖11C)。
[0025]圖12，用SS-31或SS-20阻止⑶36表達(dá)上調(diào)的離體(分離的)心臟的冷儲(chǔ)存(冷藏)?！氨尘啊睂?duì)照(圖12A和12B)表示來(lái)自正常非缺血心臟的兩個(gè)切片，其沒(méi)有用第一抗0)36抗體(primary ant1-Q)36antibody)加以處理?！罢Ｐ呐K”(圖12C和12D)表示獲自非缺血心臟的兩個(gè)切片。與“正常心臟”相比，來(lái)自代表性心臟(其在4°C的St.Thomas溶液中儲(chǔ)存了 18小時(shí))的切片(圖12E和12F)顯示出增強(qiáng)的CD36染色。在具有InM SS-31(圖12G和12H)或IOOnM SS-20 (圖121和12J)的St.Thomas溶液中儲(chǔ)存的心臟中，CD36染色顯著降低。
[0026]圖13，SS_31和SS-20減少了離體豚鼠心臟中的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，其中離體豚鼠心臟在延長(zhǎng)的(prolonged)冷缺血以后經(jīng)受熱再灌注。經(jīng)受在St.Thomas溶液中冷藏18小時(shí)的心臟的HNE染色(圖13A)與非缺血心臟的HNE染色進(jìn)行對(duì)比(圖13B)。在貯存于SS-31(圖13C)或SS-20 (圖13D)的心臟中，HNE染色減少。[0027]圖14，SS-31和SS-20消除了離體豚鼠心臟中的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其中該離體豚鼠心臟在持續(xù)的冷缺血以后經(jīng)受熱再灌注。在St.Thomas溶液中經(jīng)受18小時(shí)冷藏的心臟(圖14C和14D);非缺血正常心臟(圖14A和14B)。在貯存于SS-31 (圖14E和14F)或SS-20(圖14G和14H)的心臟中沒(méi)有觀察到凋亡的細(xì)胞。
[0028]圖15，SS-31和SS-20可維持離體豚鼠心臟中的冠狀動(dòng)脈流量，其中離體豚鼠心臟在延長(zhǎng)的冷缺血以后經(jīng)受熱再灌注。單獨(dú)用心臟停搏液(St.Thomas溶液)或用包含InMSS-31 (圖15A)或IOOnM SS-20 (圖15B)的St.Thomas溶液灌注豚鼠心臟3分鐘，然后經(jīng)受18小時(shí)的冷缺血(4°C)。
[0029]圖16，SS-31防止對(duì)糖尿病小鼠近端小管的損傷。通過(guò)鏈脲霉素(STZ)注射5天來(lái)誘導(dǎo)糖尿病。在3周后獲得的腎切片顯示，在STZ處理的動(dòng)物中失去刷狀緣(圖16B)，而在未用STZ處理的小鼠中則沒(méi)有觀察到失去刷狀緣(圖16A)。在每日接受SS-31 (3mg/kg)的用STZ處理的動(dòng)物中沒(méi)有觀察到刷狀緣的喪失(圖16C)。
[0030]圖17，SS-31防止了糖尿病小鼠中腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。通過(guò)鏈脲霉素(STZ)注射5天來(lái)誘導(dǎo)糖尿病。3周后獲得的腎切片顯示，在STZ處理的動(dòng)物中近端小管中凋亡的細(xì)胞顯著增加(圖17A，圖片b)，而在未用STZ處理的小鼠中則未觀察到近端小管中凋亡的細(xì)胞顯著增加(圖17A，圖片a)。在每日接受SS-31 (3mg/kg)的小鼠中未觀察到STZ誘導(dǎo)的凋亡(圖17A，圖片c)。SS-31療法顯著降低了由STZ引起的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(圖17B)。
【具體實(shí)施方式】
[0031]|i
[0032]本發(fā)明涉及通過(guò)某些芳族陽(yáng)離子肽來(lái)減少⑶36表達(dá)。這些芳族陽(yáng)離子肽是水溶性的和高極性的。盡管有這些性質(zhì)，但這些肽可以容易地穿透細(xì)胞膜。
[0033]本發(fā)明所用的芳族陽(yáng)離子`肽包括最少3個(gè)氨基酸，并且優(yōu)選包括最少4個(gè)氨基酸，氨基酸通過(guò)肽鍵共價(jià)相連。
[0034]在本發(fā)明的芳族陽(yáng)離子肽中存在的氨基酸的最大數(shù)目為大約20個(gè)，它們通過(guò)肽鍵共價(jià)相連。優(yōu)選地，氨基酸的最大數(shù)目為約12個(gè)，更優(yōu)選約9個(gè)，以及最優(yōu)選約6個(gè)。最佳地，在肽中存在的氨基酸的數(shù)目為4個(gè)。
[0035]本發(fā)明所用的芳族陽(yáng)離子肽的氨基酸可以是任何氨基酸。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”用來(lái)指任何包含至少一個(gè)氨基基團(tuán)和至少一個(gè)羧基基團(tuán)的有機(jī)分子。優(yōu)選地，至少一個(gè)氨基基團(tuán)是在羧基基團(tuán)的α位。
[0036]氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如，二十種最常見(jiàn)的通常存在于哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)中的左旋(L)氨基酸，即，丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gin)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、異亮氨酸(lieu)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)Jf氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、以及纈氨酸(Val)。
[0037]其它天然存在的氨基酸包括，例如，在與蛋白質(zhì)合成無(wú)關(guān)的代謝過(guò)程中合成的氨基酸。例如，氨基酸鳥(niǎo)氨酸和瓜氨酸是在尿素產(chǎn)生過(guò)程中，在哺乳動(dòng)物代謝中合成的。天然存在的氨基酸的另一個(gè)實(shí)例包括羥脯氨酸(Hyp)。
[0038]本發(fā)明所用的的肽可選地包含一種或多種非天然存在的氨基酸。最佳地，該肽沒(méi)有天然存在的氨基酸。該非天然存在的氨基酸可以是左旋(L-)氨基酸、右旋(D-)氨基酸、或其混合。
[0039]非天然存在的氨基酸是那些氨基酸，其通常不是在生物體的正常代謝過(guò)程中合成的，并且并不天然存在于蛋白質(zhì)中。此外，本發(fā)明所用的非天然存在的氨基酸優(yōu)選還不被常見(jiàn)蛋白酶所識(shí)別。
[0040]非天然存在的氨基酸可以存在于肽的任何位置。例如，非天然存在的氨基酸可以在N-端、C-端、或在N-端與C-端之間的任何位置。
[0041]非天然氨基酸可以，例如，包括不存在于天然氨基酸中的烷基、芳基、或烷基芳基基團(tuán)。非天然烷基氨基酸的某些實(shí)例包括α -氨基丁酸、β -氨基丁酸、Y -氨基丁酸、δ -氨基戊酸、以及ε-氨基己酸。非天然芳基氨基酸的某些實(shí)例包括鄰氨基苯甲酸、間氨基苯甲酸、以及對(duì)氨基苯甲酸。非天然烷基芳基氨基酸的某些實(shí)例包括鄰氨基苯乙酸、間氨基苯乙酸、對(duì)氨基苯乙酸、以及Y -苯基氨基丁酸。 [0042]非天然存在的氨基酸包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以，例如，包括將一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)加入天然存在的氨基酸。
[0043]例如，可以將一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)加到苯丙氨酸或酪氨酸殘基的芳香環(huán)的V、
、或V位的一個(gè)或多個(gè)，或加到色氨酸殘基的苯并環(huán)的V ,6'、或W位的一個(gè)或多個(gè)。該基團(tuán)可以是可加入芳環(huán)的任何化學(xué)基團(tuán)。這種基團(tuán)的某些實(shí)例包括:支鏈或直鏈C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、或叔丁基、CrC4烷基氧基(即烷氧基)、氨基、C1-C4烷基氨基和C1-C4 二烷氨基(例如甲氨基、二甲氨基)、硝基、羥基、鹵素(即氟、氯、溴、或碘)。天然存在氨基酸的非天然存在的衍生物的某些具體實(shí)例包括正纈氨酸(Nva)和正亮氨酸(Nle)。
[0044]本發(fā)明方法中所用的肽的氨基酸的修飾的另一個(gè)實(shí)例是肽的天冬氨酸或谷氨酸殘基的羧基基團(tuán)的衍生化。衍生化的一個(gè)實(shí)例是利用氨或利用伯胺或仲胺(例如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺)的酰胺化作用。衍生化的另一個(gè)實(shí)例包括利用例如甲醇或乙醇的酯化作用。
[0045]另一種這樣的修飾包括賴氨酸、精氨酸，或組氨酸殘基的氨基基團(tuán)的衍生化。例如，可以?；鲜霭被鶊F(tuán)。一些適宜的?；鶊F(tuán)包括，例如包含上述任何C1-C4烷基基團(tuán)的苯甲?；鶊F(tuán)或烷?；鶊F(tuán)，如乙?；虮；鶊F(tuán)。
[0046]非天然存在的氨基酸優(yōu)選是抗常見(jiàn)蛋白酶的，并且更優(yōu)選對(duì)常見(jiàn)蛋白酶不敏感?？沟鞍酌富?qū)Φ鞍酌覆幻舾械姆翘烊淮嬖诘陌被釋?shí)例包括任何上述天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)形式、以及L-和/或D-非天然存在的氨基酸。D-氨基酸通常并不存在于蛋白質(zhì)中，雖然它們存在于某些肽類抗生素中，其中肽類抗生素是通過(guò)不同于細(xì)胞的正常核糖體蛋白合成方法的方式而被合成的。如在本文中所使用的，D-氨基酸被認(rèn)為是非天然存在的氨基酸。
[0047]為了使蛋白酶敏感性降到最小程度，本發(fā)明方法中所用的肽應(yīng)具有少于5個(gè)、優(yōu)選少于4個(gè)、更優(yōu)選少于3個(gè)、以及最優(yōu)選少于兩個(gè)由常見(jiàn)蛋白酶識(shí)別的相鄰的L-氨基酸，而不考慮氨基酸是天然存在的還是非天然存在的。最佳地，該肽僅具有D-氨基酸,而沒(méi)有L-氨基酸。
[0048]如果肽包含蛋白酶敏感的氨基酸序列，則至少一個(gè)氨基酸優(yōu)選為非天然存在的D-氨基酸,從而賦予蛋白酶抗性(蛋白酶耐受性,protease resistance)。蛋白酶敏感序列的一個(gè)實(shí)例包括兩個(gè)或更多容易被常見(jiàn)蛋白酶(如內(nèi)肽酶和胰蛋白酶)切割的相鄰的堿性氨基酸。堿性氨基酸的實(shí)例包括精氨酸、賴氨酸以及組氨酸。
[0049]重要的是，與肽中的氨基酸殘基總數(shù)相比，在生理pH下芳族陽(yáng)離子肽具有最小數(shù)目的凈正電荷。在生理pH下凈正電荷的最小數(shù)目將在下文稱作(pm)。肽中氨基酸殘基的總數(shù)將在下文稱作(r)。
[0050]下文提及的凈正電荷的最小數(shù)目均是在生理pH下。如在本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“生理pH”是指哺乳動(dòng)物身體的組織和器官的細(xì)胞內(nèi)的正常pH。例如，人的生理pH通常為約
7.4，但哺乳動(dòng)物的正常生理pH可以是從約7.0至約7.8的任何pH。
[0051]如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“凈電荷”是指在肽中存在的氨基酸所攜帶的正電荷數(shù)目和負(fù)電荷數(shù)目的差值。在本說(shuō)明書(shū)中，應(yīng)當(dāng)明了，凈電荷是在生理PH下測(cè)量的。在生理PH下帶正電荷的天然存在的氨基酸包括L-賴氨酸、L-精氨酸、以及L-組氨酸。在生理pH下帶負(fù)電荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
[0052]通常，肽具有帶正電荷的N-末端氨基基團(tuán)和帶負(fù)電荷的C-末端羧基基團(tuán)。這些電荷在生理pH下彼此抵消。
[0053]作為計(jì)算凈電荷的實(shí)例，肽:Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg具有一個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸(即谷氨酸)和四個(gè)帶正電荷的氨基酸(即兩個(gè)精氨酸殘基、一個(gè)賴氨酸、以及一個(gè)組氨酸)。因此，上述肽具有三個(gè)凈正電荷。
[0054]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，芳族陽(yáng)離子肽在生理pH下的凈正電荷的最小數(shù)目(Pffl)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系為:其中3pm是小于或等于r+Ι的最大數(shù)。在該實(shí)施方式中，凈正電荷的最小數(shù)目(Pm)與氨基酸殘基的總數(shù)(r)之間的關(guān)系如下:
[0055]
【權(quán)利要求】
1.芳族陽(yáng)離子肽在制備用于治療哺乳動(dòng)物急性腦缺血的藥物中的應(yīng)用，其中，所述芳族陽(yáng)離子妝選自由 Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2 和 D_Arg_2' , 6' -Dmt-Lys-Phe-NH2 所構(gòu)成的組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述肽是D-Arg-2',6' -Dmt-Lys-Phe-NH2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述肽是Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述哺乳動(dòng)物是人。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中，所述藥物配制成口服地、局部地、全身地、靜脈內(nèi)地、皮下地、或肌內(nèi)地給予。
6.芳族陽(yáng)離子肽在制備用于減少取出的器官或取出的組織中的⑶36表達(dá)的藥物組合物中的應(yīng)用，其中，所述芳族陽(yáng)離子肽選自由Phe-D-Arg-Phe-Lys-NHx和D-Arg-2' , 6' -Dmt-Lys-Phe-NH2 所構(gòu)成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中，所述肽是D-Arg-2^-Dmt-Lys-Phe-NH2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)`用，其中，所述肽是Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2。
【文檔編號(hào)】A61P9/10GK103784937SQ201310627156
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2006年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2005年9月16日
【發(fā)明者】黑茲爾·H·塞托, 劉少毅, 趙圣煦 申請(qǐng)人:科內(nèi)爾研究基金會(huì)