一種車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，可有效解決治療雌激素不足的用藥，以克服人工合成雌激素在臨床長期應(yīng)用中所帶來的不良反應(yīng)的問題，其解決的技術(shù)方案是，車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，該車前子水提物是，每次加車前子10倍重量的水煎煮3次，每次1h，第一次煎煮時，先浸泡30分鐘，合并3次水煎液，減壓濃縮干燥，得車前子水提物；本發(fā)明車前子水提物在體內(nèi)、體外均具有一定的雌激素樣作用，并經(jīng)反復(fù)多次試驗，均取得了相同或相近的結(jié)果，安全有效，無不良反應(yīng)，有效用于制備雌激素類藥物，開辟了車前子藥用新用途，是車前子用途上的一大創(chuàng)新。
【專利說明】一種車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 圍絕經(jīng)期綜合征是由于婦女卵巢功能衰退，雌激素分泌水平明顯下降，引起的神 經(jīng)、心血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂，導(dǎo)致功能性子宮出血、陣發(fā)性潮熱和出汗、骨質(zhì)疏松、夕卜 陰及陰道萎縮等癥狀及出現(xiàn)精神和植物神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀。在更年期婦女中其發(fā)病率較高， 直接影響到她們的生活質(zhì)量。雌激素替代療法對減輕更年期婦女絕經(jīng)期癥狀、防治骨質(zhì)疏 松有很好的效果。但長期應(yīng)用人工合成雌激素會使子宮內(nèi)膜癌的患病風(fēng)險增加。與孕激素 聯(lián)合應(yīng)用，雖然能減少這種風(fēng)險，但會使乳腺癌及心腦血管病的發(fā)病率增加。人工合成雌激 素在臨床長期應(yīng)用所帶來的不良反應(yīng)一直困擾著人們。
[0003] 植物雌激素是來源于植物，與哺乳動物的類固醇激素-17 β -雌二醇有相似結(jié)構(gòu) 的多羥基化合物。因植物雌激素?zé)o人工合成雌激素替代療法所引起的副作用而引起人們的 廣泛關(guān)注。植物雌激素的雌激素樣作用是雙重的：一方面，在體內(nèi)雌激素水平較低時有擬雌 激素作用；另一方面，當(dāng)體內(nèi)雌激素水平較高時可發(fā)揮抗雌激素活性。因此，近年來植物雌 激素又被稱為"選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑"（seleetive estrogen receptor modulators, SERMs)，其臨床作用正受到眾多學(xué)者的關(guān)注。
[0004] 車前子為車前科植物車前Plantagoasiatica L.或平車前 PlantagodepressaWilld.的干燥成熟種子，夏、秋二季種子成熟時采收果穗，曬干，搓出種 子，除去雜質(zhì)。其主要成分有苯乙醇苷、環(huán)烯醚萜類、黃酮、多糖等。車前子性寒味甘，歸肝、 腎、肺、小腸經(jīng)。據(jù)藥典記載具有清熱利尿通淋，滲濕止瀉，明目，祛痰的功效?，F(xiàn)代藥理及 臨床研究表明車前子還具有抗氧化，免疫調(diào)節(jié)，抗炎，抗病毒，保肝，促進(jìn)傷口愈合，抗腫瘤 及降血壓的作用。但尚未有關(guān)于車前子雌激素樣活性方面的公開報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種車前子水提 物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，可有效解決治療雌激素不足的用藥，以克服人工合成雌激 素在臨床長期應(yīng)用中所帶來的不良反應(yīng)的問題。
[0006] 本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，該車前子 水提物是，每次加車前子10倍重量的水煎煮3次，每次lh，第一次煎煮時，先浸泡30分鐘， 合并3次水煎液，減壓濃縮干燥，得車前子水提物；首先通過小鼠子宮增重實驗對車前子水 提物進(jìn)行了雌激素樣活性的篩選，接著利用MCF-7細(xì)胞增殖實驗對車前子水提物進(jìn)行了體 外雌激素樣活性的研究，最后運用重組DNA技術(shù)，對ERE調(diào)控的報告基因瞬時表達(dá)進(jìn)行檢 測，研究了車前子發(fā)揮雌激素樣活性的作用機制。證明車前子水提物具有雌激素樣作用，其 可有效解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾?。ㄈ鐙D女更年期綜合癥等）的用 藥問題。
[0007] 本發(fā)明車前子水提物在體內(nèi)、體外均具有一定的雌激素樣作用，并經(jīng)反復(fù)多次試 驗，均取得了相同或相近的結(jié)果，安全有效，無不良反應(yīng)，有效用于制備雌激素類藥物，開辟 了車前子藥用新用途，是車前子用途上的一大創(chuàng)新。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 圖1為本發(fā)明的車前子水提物對性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響（i±s，η = 10)示意圖。
[0009] 圖2為本發(fā)明的車前子水提物對MCF-7增殖的影響（?土s，η = 6)示意圖。
[0010] 圖3為本發(fā)明的車前子水提物通過ERa介導(dǎo)的對ERE調(diào)控的報告基因瞬時表達(dá) 檢測結(jié)果（Jr土s，η = 3)示意圖。
[0011] 圖4為本發(fā)明的車前子水提物通過ERP介導(dǎo)的對ERE調(diào)控的報告基因瞬時表達(dá) 檢測結(jié)果（η = 3)示意圖。

【具體實施方式】
[0012] 以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0013] 實施例1
[0014] 車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，該車前子水提物是，將車前子IOOg每 次加 IOOOml的水煎煮3次，每次lh，第一次煎煮時，先浸泡30分鐘，合并3次水煎液，減壓 濃縮干燥，得車前子水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為12. 14%。
[0015] 實施例2
[0016] 車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，該車前子水提物是，將車前子500g每 次加5000ml的水煎煮3次，每次lh，第一次煎煮時，先浸泡30分鐘，合并3次水煎液，減壓 濃縮干燥，得車前子水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為12. 91 %。
[0017] 實施例3
[0018] 車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，該車前子水提物是，將車前子IOOOg 每次加10000ml的水煎煮3次，每次lh，第一次煎煮時，先浸泡30分鐘，合并3次水煎液，減 壓濃縮干燥，得車前子水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為13. 42%。
[0019] 根據(jù)上述方法按車前子和水的比例可以通過工業(yè)化生產(chǎn)制得任意量的車前子水 提物，用于制備雌激素類藥物，可有效解決治療由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的疾病 的用藥問題，并經(jīng)試驗得到了充分證明，相關(guān)試驗資料如下：
[0020] 1實驗材料
[0021] I. 1實驗藥物
[0022] 車前為車前科植物車前Plantagoasiatica L.或平車前 PlantagodepressaWilld.的干燥成熟種子，夏，秋二季種子成熟時采收果穗，曬干，搓出種 子，除去雜質(zhì)。車前子加10倍重量的水煎煮3次，每次lh，第一次煎煮時，先浸泡30分鐘， 合并3次水煎液，減壓濃縮干燥，得車前子水提物。
[0023] 1. 2實驗動物與細(xì)胞株及質(zhì)粒
[0024] 昆明種小鼠，雌性，出生21天（剛斷乳），體重9?12g，購于河南省實驗動物中 心。人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。HEK293 細(xì)胞株購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。β -半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal)對 照質(zhì)粒P β gal-Contro 1、重組報告基因 pERE-TAL-luc由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究 所葉棋濃博士惠贈。重組人ER a (humanER a，hER α )表達(dá)載體pCXN2_hER α和重組人 ERi3(humanERi3，hERi3)表達(dá)載體 pCXN2_hERi3 由東京大學(xué)醫(yī)學(xué)系 Satoshi Inoue 博士惠 贈。
[0025] 1. 3主要試劑
[0026] DMEM高糖培養(yǎng)基和陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000Reagent購自Gibco Invitrogen公司；胎牛血清購自廣州四季青公司；無酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基、葡聚糖-活 性炭去激素胎牛血清購自Hyclone公司；17 β -雌二醇（17 β -estrogen, E2)、氨節(jié)青霉素 (Amp)、Tris堿均購自Sigma公司；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥）；鄰-硝基苯-β -D-半乳批 喃糖苷（O-Nitrophenyl- β -D-galactopyranoside, ONPG)、EDTA、MTT 及 DMSO 為 Amresco 公司產(chǎn)品；Steady-Glo穩(wěn)定突光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒（Steady-Glo Luciferase Assay Systerm)、閃亮裂解緩沖液（Glolysis Buffer)購自Promega公司；酵母粉（0X0ID公司）； 胰蛋白胨（0X0ID公司）；瓊脂糖（Biowest公司）；感受態(tài)大腸桿菌DH5a (TransGen公司）； 質(zhì)粒小提試劑盒（天根公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0027] 1. 4主要儀器
[0028] 普通手術(shù)器械；二氧化碳培養(yǎng)箱（STIK);倒置顯微鏡（NIKON ECLIPSE TS100); SORVALL ST16R Centrifuge 高速低溫冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific 公司）；酶 標(biāo)儀（BI0-RAD680);純水儀（Sartorius611VF) ;90-3磁力攪拌器（上海振捷實驗設(shè)備有限 公司）；ZRD-7080全自動新型鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；微量加樣器 (Nichipet EX PLUS) ;AB204-N電子讀數(shù)分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公 司產(chǎn)品）；10cm培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、凍存管均為Corning公司生產(chǎn)；超凈工作臺（江蘇蘇 凈集團）；Bio Mate3S 紫外分光光度計（Thermo Fisher Scientific 公司）；Veritas? 微板 光度計（TurnerBioSystems公司）；SK6200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公 司）；LRH系列生化培養(yǎng)箱（上海一 ;〖亙科技有限公司）。
[0029] 2實驗方法
[0030] 2.1小鼠子宮增重實驗
[0031] 將小鼠按體重均衡和隨機的原則分組。給藥持續(xù)7天?？瞻讓φ战M每日蒸餾水 0. 2ml · IOg4灌胃；陽性對照組每日戊酸雌二醇（0. 33mg ·〇灌胃；車前子水提物按 臨床用藥的20倍量X提取率為低劑量，臨床用藥的40倍量X提取率為高劑量計算，配成 相應(yīng)濃度的混懸液，每日按〇.2ml · IOg4灌胃。最后一次給藥24h后，脫頸處死小鼠，立即 摘取子宮稱重，計算子宮系數(shù)（子宮濕重X(體重ΓΧΙΟΟ%)。實驗平行重復(fù)三次。結(jié)果 與空白組相比，計算P值，考察有無統(tǒng)計學(xué)意義。
[0032] 2. 2MCF-7細(xì)胞增殖實驗
[0033] MCF-7細(xì)胞（人乳腺癌細(xì)胞）經(jīng)無酚紅含5 %去雌激素血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1 周后，選取對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS洗兩次，用0.05%胰蛋白酶消化后，加入無酚紅DMEM培養(yǎng) 基吹打均勻，以6Χ IO4個/ml的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為200 μ 1。培養(yǎng) 24h待細(xì)胞貼壁后，換為含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。37°C、5 % CO2培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT溶液 (5mg .ι?Γ1) 20 μ 1，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150 μ 1DMS0,震蕩5-10min， 使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀在490nm下測定各孔吸光度值（A)，計算平均A值和增殖率 (Proliferation Rate, PR)。實驗平行重復(fù)三次。
[0034] PR%=(實驗組A值-空白組A值）X空白組A值_1X100%
[0035] 2. 3ERE調(diào)控的報告基因瞬時表達(dá)檢測
[0036] 2. 3. 1細(xì)胞接種
[0037] 于轉(zhuǎn)染前24h將處于對數(shù)生長期的ΗΕΚ293細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）接種于24孔板， 密度為16. OX IO4個/0. 5ml/孔，且培養(yǎng)液為含10 %去雌激素血清的不含抗生素的無酚紅 DMEM培養(yǎng)液，分別設(shè)置空白對照孔、雌二醇孔及待測藥物孔。
[0038] 2. 3. 2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
[0039] (1)待細(xì)胞布皿80%-90%時，小心吸出原培養(yǎng)基，加入420μ 1含10%去雌激素 血清的不含抗生素的無酚紅DMHM培養(yǎng)基。
[0040] (2)取 3 只 EP 管，ER α 管中加 490 μ 1 無酚紅 DMEM 培養(yǎng)基、9 μ lpCXN2_hER α 質(zhì)粒（80ng · μ Γ1)、9μ lpERE-TAL-luc 質(zhì)粒（400ng · μ Γ1)、9μ Ιρβ gal-Control 質(zhì) 粒（200ng · μ Γ1) ;ERP 管中加 490 μ 1 無酚紅 DMEM 培養(yǎng)基、9 μ lpCXN2-hERP 質(zhì)粒 (80ng· μ Γ〇、9μ1 pERE-TAL-Iuc 質(zhì)粒（400ng· μ Γ〇、9μ1 Pgal-Control 質(zhì)粒 (200ng · μ Γ1);脂質(zhì)體管中加入1000 μ 1無酚紅DMEM培養(yǎng)基和36 μ 1陽離子脂質(zhì)體。
[0041] (3)倒轉(zhuǎn)混勻脂質(zhì)體管，室溫放置5min，取510 μ 1分別加入ERa和ERP管，輕輕 混勻，室溫放置20min ;
[0042] (4)取80ylERa管中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分別加入24孔板ERa實驗孔，取 80 μ 1ER0管中脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物分別加入24孔板ER β實驗孔。前后搖勻，放入培養(yǎng)箱。
[0043] (5) 4_6h后加入對照藥物和檢測藥物。
[0044] 2. 3. 3ERE調(diào)控的報告基因瞬時表達(dá)檢測
[0045] 加藥后24h的細(xì)胞，從培養(yǎng)箱中取出，室溫平衡20min，吸去培養(yǎng)液。按照 Steady-Glo穩(wěn)定突光素酶檢測系統(tǒng)試劑盒（Steady-Glo Luciferase Assay System)及閃 亮裂解緩沖液（Glolysis Buffer)改良操作步驟操作，收集細(xì)胞裂解上清液，加入熒光素酶 反應(yīng)底物（熒光素），置于暗處，用Veritas?微板光度計檢測熒光強度。
[0046] 2. 3. 4 β -gal 活性檢測
[0047] 為了考察轉(zhuǎn)染效率，對內(nèi)參照β -gal活性進(jìn)行檢測。
[0048] (1) 54 μ 1 β -巰基乙醇加入40ml Z-buffer中，混勻，取EP管，每管加1800 μ 1 ;
[0049] (2)每管加20 μ 1裂解上清液；
[0050] (3)每管加400 μ I 0NPG，倒轉(zhuǎn)混勻；
[0051] (4)放置37°C溫箱，至顯黃色；
[0052] (5)加 Na2CO3Iml 終止反應(yīng)；
[0053] ⑶測 OD42〇 值；
[0054] (7)計算標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素酶活性；
[0055] 3統(tǒng)計學(xué)處理
[0056] 實驗數(shù)據(jù)以i±S表示，SPSS18. 0進(jìn)行單因素方差分析統(tǒng)計處理。
[0057] 4實驗結(jié)果
[0058] 4. 1車前子水提物對性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響
[0059] 結(jié)果顯示，車前子水提物低劑量與空白對照組相比能極顯著誘導(dǎo)性未成熟雌性小 鼠子宮系數(shù)的增加（P〈〇. 01)，車前子高劑量組與空白對照組相比能顯著誘導(dǎo)性未成熟雌性 小鼠子宮系數(shù)的增加（P〈〇. 05)。提示車前子水提物在體內(nèi)具有雌激素樣活性。見表1，圖 1〇
[0060] 表1車前子水提物對性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響（S±s，η = 10)
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，該車前子水提物是，每次加車前子 10倍重量的水煎煮3次，每次lh，第一次煎煮時，先浸泡30分鐘，合并3次水煎液，減壓濃 縮干燥，得車前子水提物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所 述的車前子水提物是，車前子l〇〇g每次加 l〇〇〇ml的水煎煮3次，每次lh，第一次煎煮時，先 浸泡30分鐘，合并3次水煎液，減壓濃縮干燥，得車前子水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為 12. 14%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所 述的車前子水提物是，車前子500g每次加5000ml的水煎煮3次，每次lh，第一次煎煮時，先 浸泡30分鐘，合并3次水煎液，減壓濃縮干燥，得車前子水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率為 12. 91%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的車前子水提物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所 述的車前子水提物是，車前子l〇〇〇g每次加 l〇〇〇〇ml的水煎煮3次，每次lh，第一次煎煮時， 先浸泡30分鐘，合并3次水煎液，減壓濃縮干燥，得車前子水提物，連續(xù)反復(fù)三次，平均得率 為 13. 42%。
【文檔編號】A61P5/30GK104288239SQ201410481701
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】鄭曉珂, 馮志毅, 張娜, 王曉帆, 赫金麗, 李玲玲, 袁培培, 劉小盼, 李鵬飛, 婁永, 匡海學(xué) 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院