一種發(fā)酵黃芪多糖的提取純化方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種發(fā)酵黃芪多糖的提取純化方法和應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)酵黃芪多糖的提取純化方法步驟如下：（1）將發(fā)酵黃芪進(jìn)行溫浸提取，用膜截留超濾器濃縮提取液，通過Sevag法除蛋白，透析，醇沉，洗滌得到發(fā)酵黃芪粗多糖；（2）用DEAESepharoseFastFlow對(duì)發(fā)酵黃芪粗多糖進(jìn)行純化，用超純水洗脫，濃縮、凍干洗脫液，得到中性多糖DF-1；用梯度NaCl洗脫，濃縮、透析、濃縮、凍干洗脫液，得到弱酸性的多糖；（3）將步驟（2）得到的中性多糖DF-1用SephacrylS-400HighReslution制備層析柱進(jìn)行純化，用超純水洗脫，濃縮、凍干洗脫液，得到中性多糖SF-1和SF-2。應(yīng)用本發(fā)明的提取純化方法提取所得發(fā)酵黃芪粗多糖（FAPS）與生藥黃芪多糖（APS）相比，得率及含量均有顯著升高。CGMCC No.42272010.10.19
【專利說明】一種發(fā)酵黃芪多糖的提取純化方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及發(fā)酵黃芪多糖的提取純化方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和中藥現(xiàn)代化研究的日益深入，將發(fā)酵工程應(yīng)用于中藥 制劑的研究與開發(fā)屢見報(bào)道。已有學(xué)者利用不同菌種采用固體和液體發(fā)酵方法對(duì)中藥黃芪 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，研究結(jié)果表明，黃芪經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后多糖和多酚類物質(zhì)的得率和藥效均有顯 著提高。
[0003] 關(guān)于生物多糖的分離純化方法，各種報(bào)道不一，傳統(tǒng)工藝一般采用水煎法，隨著對(duì) 多糖提取純化方法研究的不斷發(fā)展，根據(jù)不同生物多糖的物理化學(xué)特性，發(fā)展出了溫浸法、 飽和生石灰水提法、纖維素酶提取法。但是，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后的中藥產(chǎn)品，其理化性質(zhì)發(fā)生了 一定的變化，選擇合適的PH對(duì)提高多糖的產(chǎn)量和保持其生物活性非常重要。發(fā)酵產(chǎn)品pH值 約為4左右，飽和生石灰水提取法（pH值約為9?11)是否會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)品中的活性物質(zhì)作 用？ H2O2脫色法常用氨水調(diào)節(jié)pH值至9,在反應(yīng)中需80?90 °C加熱1小時(shí)，通過增加過 氧化氫濃度以加快脫色速度。pH的變化是否會(huì)改變發(fā)酵黃芪多糖的含量？非解乳糖鏈球菌 LZMYFGM9分泌的很多酶類可參與生物轉(zhuǎn)化過程，用纖維素酶法提取能否輔助增加發(fā)酵黃芪 多糖的得率？目前尚未見關(guān)于生物轉(zhuǎn)化型中藥多糖提取方法的比較研究。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種發(fā)酵黃芪多糖的提取純化方法及其應(yīng)用。
[0005] 本 申請(qǐng)人:利用一株分離自雞腸道的非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9,保藏編號(hào)：為 CGMCC No. 4227,與中藥黃芪進(jìn)行液體深層共發(fā)酵，開發(fā)出發(fā)酵黃芪產(chǎn)品。本發(fā)明專利在實(shí) 驗(yàn)室已有的搖瓶發(fā)酵技術(shù)基礎(chǔ)上，應(yīng)用IOL發(fā)酵罐通過正交試驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵工藝，建立起 發(fā)酵產(chǎn)品的中試生產(chǎn)工藝。研究表明，該發(fā)酵產(chǎn)品作為飼料添加劑能夠增強(qiáng)肉仔雞生長(zhǎng)性 能，提高機(jī)體免疫力。
[0006] 本 申請(qǐng)人:通過比較現(xiàn)有技術(shù)中幾種方法，優(yōu)選出溫浸法提取，然后分別以浸提溫 度、加水量、浸提次數(shù)、醇沉酒精濃度為四個(gè)實(shí)驗(yàn)因素，以多糖含量為檢測(cè)指標(biāo)，采用正交 試驗(yàn)法優(yōu)化了提取工藝，得到最佳提取方法。采用膜截留超濾器濃縮多糖提取液，再通過 Sevag法除蛋白，透析法除小分子及兩步柱層析對(duì)粗多糖進(jìn)一步純化。最終獲得了高產(chǎn)、低 耗的發(fā)酵黃芪多糖的分離純化方法。同時(shí)，也為其它液體發(fā)酵中藥多糖的提取純化方法的 選擇提供參考。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本 申請(qǐng)人:采用的技術(shù)方案如下： 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種發(fā)酵黃芪多糖的提取純化方法，步驟如下： (1) 將發(fā)酵黃芪進(jìn)行溫浸提取，濃縮提取液，通過Sevag法除蛋白，透析，濃縮透析液， 醇沉，洗滌得到發(fā)酵黃芪粗多糖； (2) 用DEAE S印harose FastFlow對(duì)發(fā)酵黃芪粗多糖進(jìn)行純化，用超純水洗脫，濃縮、凍 干洗脫液，得到中性多糖DF-I ;用梯度NaCl洗脫，濃縮、透析、濃縮、凍干洗脫液，得到弱酸 性的多糖； (3)將步驟（2)得到的中性多糖DF-I用Sephacryl S-400 High Reslution制備層析 柱進(jìn)行純化，用超純水洗脫，濃縮、凍干洗脫液，得到中性多糖SF-I和SF-2。
[0008] 進(jìn)一步地，所述溫浸提取是先用乙醇溫浸提取，得到藥渣，再將藥渣用純水溫浸提 取。
[0009] 進(jìn)一步地，所述用乙醇溫浸提取是用20倍量(體積：質(zhì)量，mL :g)85% (體積百分比） 乙醇室溫下密閉浸泡6?9h，85°C溫浸1?I. 5h，過濾，濾渣再重復(fù)提取1次；所述用純水 溫浸提取是在藥渣中加入10?15倍量(體積：質(zhì)量，mL :g)純水，室溫浸泡6?9 h，再于 85°C水浴溫浸1?I. 5h，傾出上清液，再重復(fù)溫浸2次；優(yōu)選地，所述用乙醇溫浸提取是用 20倍量(體積：質(zhì)量，mL :g) 85% (體積百分比）乙醇室溫下密閉浸泡8h，85°C溫浸lh，過濾， 濾渣再重復(fù)提取1次；所述用純水溫浸提取是在藥渣中加入10倍量的純水，室溫浸泡8h， 再于85°C水浴溫浸lh，傾出上清液，再重復(fù)溫浸2次。
[0010] 進(jìn)一步地，步驟（1)- (3)中所述濃縮均是采用膜截留超濾器截留分子量為5000 Dal的分子，超濾器工作壓力為0? 2?0? 4 MPa，溫度為25°C。
[0011] 進(jìn)一步地，所述透析是將除蛋白后得到的上清液置于MWCO :7000的透析袋中，流 水透析48 h，蒸餾水透析24 h，直至無白色沉淀。
[0012] 進(jìn)一步地，所述醇沉是在透析液中加入無水乙醇至溶液中乙醇體積百分含量為 80%進(jìn)行醇沉。
[0013] 進(jìn)一步地，所述梯度 NaCl 洗脫是用 0? I mol/L NaCl, 0? 2 mol/L NaCl, 0? 3 mol/L NaCl 和 0? 4mol/L NaCl 洗脫。
[0014] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供應(yīng)用上述提取純化方法得到的發(fā)酵黃芪粗多糖。
[0015] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供發(fā)酵黃芪粗多糖在制備保肝護(hù)肝、抑制肝纖維化藥物 中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種保肝護(hù)肝、抑制肝纖維化藥物，所述藥物的有效 成分為上述的發(fā)酵黃芪粗多糖。
[0017] 本發(fā)明先用高濃度乙醇除去非多糖部分，大大降低了多糖提取純化過程中雜質(zhì)的 干擾，多糖液的濃縮采用截留分子量5000 Dal的超濾器，減少了加熱濃縮對(duì)多糖結(jié)構(gòu)的破 壞及減壓濃縮過程的復(fù)雜操作步驟。通過DEAE Sepharose Fast Flow離子柱層析有效地 脫去多糖顏色，省去了多糖的脫色步驟。本發(fā)明顯著提高了發(fā)酵黃芪多糖的提取效率和純 度。
[0018] 本發(fā)明方法與其它方法的顯著不同在于： 1、先用85%乙醇于85°C溫浸萃取出醇溶部分，再用烘干的藥渣提取發(fā)酵黃芪多糖，這 樣先將醇溶性的非多糖物質(zhì)萃取出，不但省去了后續(xù)多糖純化中除雜的大量工作，也便于 對(duì)醇溶部分的有效成分的分離提取，利于發(fā)酵產(chǎn)品有效成分的充分開發(fā)和高效利用。
[0019] 2、在多糖的純化中沒有單獨(dú)的脫色步驟，實(shí)驗(yàn)表明，采用常規(guī)的H2O2脫色法并不 適用于發(fā)酵黃芪多糖的脫色，該法脫色過程中需調(diào)整多糖溶液PH至9,但是發(fā)酵黃芪在生 物轉(zhuǎn)化過程中pH為6. 4,發(fā)酵黃芪多糖液由酸性調(diào)節(jié)到堿性可能會(huì)使多糖的理化性質(zhì)發(fā)生 改變，因此不宜使用H2O2脫色。活性炭對(duì)多糖有較強(qiáng)的吸附作用，活性炭用于多糖脫色會(huì)造 成多糖的損失。而直接上DEAE Sepharose Fast Flow離子交換柱，在純化多糖的同時(shí)能夠 有效的脫除色素，純化得到的發(fā)酵黃芪多糖主要為白色的中性多糖，省去了脫色步驟。用超 濾器濃縮多糖液，減少了加熱濃縮及減壓濃縮的復(fù)雜操作和長(zhǎng)時(shí)間加熱過程中對(duì)多糖結(jié)構(gòu) 破壞。本方法在降低能耗、節(jié)省時(shí)間的同時(shí)獲得了理想的脫色和濃縮效果。
[0020] 3、本發(fā)明與纖維素酶輔助提取法、生石灰水提取法、傳統(tǒng)煎煮法相比，具有多糖提 取效率高，多糖純度高，多糖生物活性損傷小，節(jié)能，操作簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)條件可控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0021] 4、應(yīng)用本發(fā)明的提取純化方法提取所得發(fā)酵黃芪粗多糖（FAPS)與生藥黃芪多糖 (APS)相比，得率及含量均有顯著升高。對(duì)非解乳糖鏈球菌LZMYFGM9在發(fā)酵過程中所分泌 的酶系研究結(jié)果表明，在此過程中參與細(xì)菌胞外多糖合成的關(guān)鍵酶（M)P-葡萄糖-4-異構(gòu) 酶)及參與纖維素分解的酶（a -半乳糖苷酶，葡聚-1，6- a -葡萄糖苷酶，葡萄糖激酶)的表 達(dá)量均較發(fā)酵前顯著上調(diào)，說明微生物對(duì)黃芪的生物轉(zhuǎn)化作用可導(dǎo)致發(fā)酵黃芪中多糖種類 和數(shù)量的變化。藥理學(xué)研究表明發(fā)酵黃芪粗多糖還可保護(hù)肝細(xì)胞，在一定程度上抑制肝纖 維化。因此，發(fā)酵黃芪多糖顯示出較好的開發(fā)應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為發(fā)酵黃芪粗多糖的DEAE S印harose Fast Flow洗脫液相圖譜（190 nm和 280 nm)； 圖2為發(fā)酵黃芪粗多糖的DEAE S印harose Fast Flow洗脫液苯酚-硫酸法描繪的多 糖曲線（490nm); 圖3為發(fā)酵黃芪中性多糖組分SF-I和SF-2的S印hacryl S-400 High Reslution洗 脫液相圖譜（190nm和280nm); 圖4為發(fā)酵黃芪中性多糖組分SF-I和SF-2的S印hacryl S-400 High Reslution洗 脫液苯酚-硫酸法描繪多糖曲線（490nm); 圖5為HPGPC-DAD-RI，GPC-MALLS聯(lián)用測(cè)定發(fā)酵黃芪中性多糖組分SF-I絕對(duì)分子量和 相對(duì)分子量圖譜（690nm); 圖6為HPGPC-DAD-RI，GPC-MALLS聯(lián)用測(cè)定發(fā)酵黃芪中性多糖組分SF-2絕對(duì)分子量和 相對(duì)分子量圖譜（690nm); 圖7為黃苗多糖的DEAE Sepharose Fast Flow洗脫液相圖譜（190nm和280nm); 圖8為黃芪多糖的DEAE S印harose Fast Flow洗脫液苯酚-硫酸法描繪的多糖曲線 (490nm)； 圖9為黃芪中性多糖組分SS-I的S印hacryl S-400 High Reslution洗脫液相圖譜 (190nm 和 280nm); 圖10為黃芪中性多糖組分SS-I的S印hacryl S-400 High Reslution洗脫液苯酚-硫 酸法描繪多糖曲線（490nm); 圖11為HPGPC-DAD-RI，GPC-MLLS聯(lián)用測(cè)定黃芪中性多糖組分SS-I絕對(duì)分子量和相 對(duì)分子量圖譜（690nm); 圖12 (A-F)為肝組織切片H. E.染色（H. E. X 100);其中，A為正常對(duì)照組；B為模型組； C為發(fā)酵黃芪提取物低劑量；D為發(fā)酵黃芪提取物中劑量組；E為發(fā)酵黃芪提取物高劑量組； F為秋水仙堿對(duì)照組。
[0023] 圖13 (A-F)為肝組織切片Masson染色（MassonX 100);其中，A為正常對(duì)照組，B 為模型組，C為發(fā)酵黃芪提取物低劑量組，D為發(fā)酵黃芪提取物中劑量組，E為發(fā)酵黃芪提取 物高劑量組，F(xiàn)為秋水仙堿對(duì)照組。
[0024] 圖14 (A-F)為透射電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)；其中，A :對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞高爾基 體形態(tài)正常，狄氏間隙內(nèi)無膠原纖維增生(透射電鏡X 12000);B :發(fā)酵黃芪提取物高劑量組 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪變明顯，細(xì)胞核、線粒體基本正常，狄氏間隙中未見膠原增生，肝細(xì)胞間隙增 寬(透射電鏡X12000);C :中劑量發(fā)酵黃芪提取物組肝組織狄氏間隙內(nèi)有膠原纖維增生，月旨 肪空泡化明顯(透射電鏡X 12000) ;D :低劑量發(fā)酵黃芪提取物組肝組織狄氏間隙內(nèi)有大量 膠原纖維增生，脂肪空泡化明顯(透射電鏡X12000);E :秋水仙堿組狄氏間隙內(nèi)有膠原纖維 增生，肝血竇內(nèi)可見紅細(xì)胞(透射電鏡X15000);F :模型組大鼠肝細(xì)結(jié)構(gòu)模糊，界限不清。狄 氏間隙中可見大量的膠原纖維束橫斷面(透射電鏡X 12000)。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。
[0026] 本發(fā)明中多糖含量的測(cè)定采用苯酚_硫酸法，步驟如下： a、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取減壓干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于500 mL容 量瓶中，加水至刻度，配成〇. 2 mg/mL的葡萄糖溶液。分別吸取對(duì)照品溶液0. I mL、0. 3 mL、 0. 5 mL、0. 7 mL、0. 9 mL、l. I mL和1.3 mL，分別用純水定容至2. 5 mL，各精密吸取0. 2 mL 于具塞試管中，加入5%苯酚溶液0. I mL，搖勻，再垂直迅速加入濃硫酸0. 5 mL，振搖，室溫 靜置10 min，沸水浴加熱15 min，冷水中冷卻。隨行空白對(duì)照。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值， 以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（x)，吸光值(A)為縱坐標(biāo)（y)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn) 曲線方程為：y=〇. 〇335x (R2=O. 9994)其中：y為吸光值，X為葡萄糖濃度（mg/L)，R2為相關(guān) 系數(shù)； b、 多糖含量測(cè)定：用蒸餾水將制得的發(fā)酵黃芪多糖配成濃度為I. 0 mg/mL的溶液，取 0. 2 mL按步驟a的方法測(cè)定490 nm的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖的濃度； c、 發(fā)酵黃芪多糖含量（％)=(標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得多糖質(zhì)量/發(fā)酵黃芪多糖質(zhì)量)X 100% ; d、 發(fā)酵黃芪多糖得率（％)=(多糖的質(zhì)量/發(fā)酵黃芪產(chǎn)品的質(zhì)量）X 100%。
[0027] 實(shí)施例1 本實(shí)施例中與黃芪共發(fā)酵的菌種為一株分離自雞腸道內(nèi)的非解乳糖鏈球菌 (泣a/acte心)LZMYFGM9,其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4227。保藏日期：2010 年10月19日；保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏單位簡(jiǎn) 稱：CGMCC ;保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；該菌種的培養(yǎng)特性見中國(guó) 專利文獻(xiàn)ZL 201210141827. 5 (發(fā)明名稱：一種非解乳糖鏈球菌及其應(yīng)用）。
[0028] 本實(shí)施例發(fā)酵黃芪多糖中蛋白含量的測(cè)定采用索萊寶公司BCA蛋白濃度測(cè)定試 劑盒檢測(cè)。
[0029] 本實(shí)施例發(fā)酵黃芪中生藥黃芪的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78 %，即每400g發(fā)酵黃芪凍干粉中 含生藥黃芪的質(zhì)量為312g。
[0030] 本實(shí)施例中發(fā)酵黃芪凍干粉的制備方法為：將潔凈的黃芪生藥飲片粉碎后，過20 目篩，用10 L發(fā)酵罐發(fā)酵黃芪，發(fā)酵菌株非解乳糖鏈球菌CGMCC No. 4227的菌液濃度為 2X108個(gè)/mL，接菌量為5 % (占發(fā)酵總體積)，黃芪用量為8 % (黃芪質(zhì)量：發(fā)酵液體積， g:mL)，溫度39 °C，轉(zhuǎn)速200 r/min，pH值6. 4,溶氧量10 %，中和劑為6 mol/L的NaOH，發(fā) 酵時(shí)間48 h。發(fā)酵結(jié)束后，凍干發(fā)酵黃芪液得發(fā)酵黃芪產(chǎn)品。
[0031] 其中，發(fā)酵黃芪的液體培養(yǎng)基由以下重量份數(shù)的成分制備完成：乳清粉：25. 79 份；蛋白胨：2. 28份；葡萄糖：0. 60份；酵母粉：1. 56份；硫酸鎂：0. 04份；檸檬酸三銨： 〇. 40份；硫酸氫二鉀：0. 40份；乙酸鈉：1. 00份；黃芪粉：80份；水：1000份。
[0032] 本發(fā)明的一種發(fā)酵黃芪多糖的提取純化方法，包括以下步驟： (1)稱取發(fā)酵黃芪凍干粉400g (過20目篩)，用20倍量（8000mL)，體積百分比85%乙 醇室溫下密閉浸泡8h，85°C溫浸lh，過濾，濾渣再重復(fù)提取1次。藥渣于鼓風(fēng)干燥箱中50°C 烘干至無醇味用于提取發(fā)酵黃芪多糖。
[0033] (2)向步驟（1)所得藥渣中加入10倍量（mL/g)純水，室溫下浸泡8h，再于85°C水 浴溫浸lh，傾出上清液。再將濾渣重復(fù)溫浸提取進(jìn)行兩次：即向藥渣中加入10倍量（mL/g) 純水，室溫下浸泡8h，再于85°C水浴溫浸lh，傾出上清液。合并三次上清液，離心后，采用 Sartorius Vivaflow 200截留分子量為5000 Dal的超濾器濃縮上清液至1:5,超濾器工作 壓力為0.2?0.4 MPa，溫度為25°C。再輔助水浴加熱90°C濃縮至1:1 (每毫升提取液中 含發(fā)酵黃芪I g)。
[0034] (3)用Sevag法除去步驟（2)所得濃縮液中蛋白（Sevag法：加入1/3體積Sevag 試劑(氯仿：正丁醇=4:1)，低溫下磁子攪拌30min，離心3600 r/min，Imin,吸取上清液重復(fù) 操作5次，直至BCA試劑盒檢測(cè)蛋白含量較穩(wěn)定，約為2 ii g/mL)。
[0035] (4)將步驟（3)所得上清液置于MWCO :7000的透析袋中，流水透析48h，蒸餾水透 析24h。用PMgNO3溶液及PzffiaCl 2檢測(cè)透析效果，直至無白色沉淀。再將透析液用超濾器 濃縮至1:1 (生藥黃芪質(zhì)量：濃縮液體積，g :mL)，超濾器的工作壓力為0. 2?0. 4MPa，溫度 為 25°C。
[0036] (5)在步驟（4)所得濃縮液中加入無水乙醇至溶液中乙醇含量為80% (體積比)， 室溫下醇沉8h，離心3000r/min，5min，棄上清。用4倍量（mL/g)純水溶解沉淀，80%酒精醇 沉，離心，棄上清，反復(fù)操作2次。用無水乙醇I: I (mL/g)洗漆2次，離心3000r/min，5min ; 棄上清，分別用丙酮、乙醚I: I (mL/g)各洗漆1次，離心3000r/min，5 min ;棄上清，將沉淀 置于50°C鼓風(fēng)干燥箱烘干至基本無乙醚味（24 h)，得發(fā)酵黃芪粗多糖（FAPS) 18 g，多糖得 率達(dá)4. 5%，苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66. 3%。
[0037] (6) Biologic DuoFIow 層析系統(tǒng)，用 DEAE Sepharose FastFlow 制備層析柱（<!> 1 cmX17. 5 cm)，精確稱取步驟（5)所得發(fā)酵黃芪粗多糖100 mg，溶于ImL純水(預(yù)先溶脹 12h，必要時(shí)輔助60°C水浴加熱)，離心10000g/min，5min。取上清液，過0. 45 ii m濾膜，將濾 液緩慢上樣于DEAE Sepharose Fast Flow層析柱。然后分別用超純水、0.1 mol/L NaCl、 0.2 mol/L NaCl、0. 3 mol/L NaCl 和 0.4 mol\L NaCl 各 41 mL (3 倍柱體積）依次洗脫。 流速I mL/min，在線檢測(cè)280 nm和190 nm下的液相色譜圖（見圖1)，自動(dòng)部份收集器收集 洗脫液，每管2 mL。用苯酚-硫酸法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以490 nm下吸光值(A)對(duì)洗脫管數(shù)作 圖，描繪洗脫曲線，分別收集各洗脫峰，濃縮(用超濾器濃縮至1:1(生藥黃芪質(zhì)量：濃縮液體 積，g :mL)，超濾器的工作壓力為0. 2?0. 4MPa，溫度為25°C。）、透析(將上清液置于MWCO : 7000的透析袋中，流水透析48h，蒸餾水透析24h。用PMgNO3溶液及PzffiaCl2檢測(cè)透析效 果，直至無白色沉淀)、濃縮(再將透析液用超濾器濃縮至1:1 (生藥黃芪質(zhì)量：濃縮液體積， g :mL))、凍干。其中，中性多糖DF-I為超純水洗脫所得，苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為92. 1 % (見圖2)。梯度NaCl洗脫得到弱酸性的多糖。
[0038] (7)Biologic DuoFIow 層析系統(tǒng)，用 Sephacryl S-400 High Reslution 制備層析 柱（〇1 cmX95 cm)，精確稱取步驟（6)超純水洗脫得到的發(fā)酵黃芪多糖DF-I 40 mg，溶于 I mL超純水(預(yù)先溶脹12 h)，離心10000 g/min，5 min。取上清液，過0.45 iim濾膜，將濾 液緩慢上樣于Sephacryl S-400 High Reslution層析柱。用超純水220 mL (3倍柱體積） 洗脫，流速0.4 mL/min，在線檢測(cè)190 nm和280 nm下的液相色譜圖（見圖3)，自動(dòng)部份收 集器收集洗脫液，每管2 mL。用苯酚-硫酸法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以490 nm下吸光值(A)對(duì)洗 脫管數(shù)作圖，描繪洗脫曲線，分別收集各洗脫峰，濃縮(用超濾器濃縮至1:1 (生藥黃芪質(zhì)量： 濃縮液體積，g :mL)，超濾器的工作壓力為0. 2?0. 4MPa，溫度為25°C。）、凍干。在濃縮過程 中使用的超濾器的工作壓力為〇. 2?0. 4MPa，溫度為25°C。超純水洗脫得到SF-I和SF-2 兩個(gè)中性多糖組分，苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為97. 5%和97. 0% (見圖4)。
[0039] (8) HPGPC-DAD-RI聯(lián)用技術(shù)測(cè)定多糖的純度，GPC-MALLS聯(lián)用技術(shù)分析多糖組分 的絕對(duì)分子量，采用Ultrahydrogel? 1000, 500色譜柱串聯(lián)凝膠色譜，流動(dòng)相為含0. 2 % NaN3的0. 9 mol/L NaCl溶液，流速I mL/min，柱溫30°C ;MALLS光源氣體為氦氣和氖氣，檢 測(cè)波長(zhǎng)690 nm。用流動(dòng)相將SF-I和SF-2配制成50mg/mL，經(jīng)0. 22 ii m膜過濾，上樣分析 相對(duì)分子量和絕對(duì)分子量(見圖5,圖6)。分析結(jié)果表明SF-I的重均分子量為I. 008X IO5 Dal，數(shù)均分子量為9. 39 X IO4 Dal ;SF-2的重均分子量為6. 386 X IO4 Dal，數(shù)均分子量為 6. 340X IO4 Dal (見表 1)。
[0040] 實(shí)施例2 生藥黃芪多糖的提取純化包括以下步驟： (1)稱取生藥黃芪粉312 g (過20目篩)，用20倍量（6240 mL)85%乙醇室溫下密閉浸 泡8 h，85 °C溫浸I h，過濾，濾渣再重復(fù)提取1次。藥渣于鼓風(fēng)干燥箱中50 °C烘干至無醇 味用于提取生藥黃芪多糖。
[0041] (2)向步驟（1)所得藥渣中加入10倍量（mL/g)純水，室溫下浸泡8 h，再于85 °〇水浴溫浸I h，傾出上清液。再將此步驟重復(fù)進(jìn)行兩次。合并三次上清液，離心后，采用 Sartorius Vivaflow 200截留分子量為5000 Dal的超濾器濃縮上清液至1:5,再輔助水浴 加熱90 °C濃縮至1:1 (每毫升提取液中含生藥黃芪I g)。
[0042] (3)用Sevag法除去步驟（2)所得濃縮液中蛋白（加入1/3體積Sevag試劑(氯仿： 正丁醇=4:1)，低溫下磁子攪拌30min，離心3600r/min，Imin,吸取上清液重復(fù)操作5次，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白含量較穩(wěn)定，約為g/mL)。
[0043] (4)將步驟（3)所得上清液置于MWCO :7000的透析袋中，流水透析48h，蒸餾水透 析24h。用1% AgNO3溶液及1% BaCl2檢測(cè)透析效果，直至無白色沉淀。再將透析液濃縮至 1:1。
[0044] (5)在步驟（4)所得濃縮液中加入無水乙醇至80% (體積比)，室溫下醇沉8h，離心 3000r/min，5min，棄上清。用2倍量（mL/g)純水溶解沉淀，80%酒精醇沉，離心，棄上清，反 復(fù)操作2次。用無水乙醇1:1 (mL/g)洗漆2次，離心3000 r/min，5min;棄上清，分別用丙 酮、乙醚1:1 (mL/g)各洗漆1次，離心3000 r/min，5min;棄上清，將沉淀置于50°C鼓風(fēng)干 燥箱烘干至基本無乙醚味（24 h)，得生藥黃芪多糖（APS) 8. 7g，多糖得率達(dá)2. 8%，苯酚-硫 酸法測(cè)定其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39. 8 %。
[0045] (6) Biologic DuoFIow 層析系統(tǒng)，用 DEAE Sepharose Fast Flow 制備層析柱 (O IcmX 17. 5cm)，精確稱取稱取步驟（5)所得生藥黃芪多糖（APS) lOOmg，溶于I mL純水 (預(yù)先溶脹12 h，必要時(shí)輔助60 °C水浴加熱)，離心10000 g/min，5 min。取上清液，過0.45 Um濾膜，上樣于DEAE Sepharose Fast Flow層析柱。然后分別用超純水34 mL(2. 5倍柱 體積)，0.1111〇1/1恥(：148 1111(3.5倍柱體積)、0.2 111〇1/1恥(：148 1111(3.5倍柱體積)、 0.3 mol/L NaCl 41 mL (3 倍柱體積)、0.4 mol\L NaCl 41 mL (3 倍柱體積)依次洗脫。流 速I mL/min，檢測(cè)280 nm和190 nm下的液相色譜圖（見圖7)，自動(dòng)部份收集器收集洗脫液， 每管2 mL。用苯酚-硫酸法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以490 nm下吸光值（A)對(duì)洗脫管數(shù)作圖，描繪 洗脫曲線，分別收集各洗脫峰，濃縮(用超濾器濃縮至1:1 (生藥黃芪質(zhì)量：濃縮液體積，g: mL)，超濾器的工作壓力為0. 2?0. 4MPa，溫度為25°C。）、透析(將上清液置于MWCO :7000的 透析袋中，流水透析48h，蒸餾水透析24h。用PMgNO3溶液及PzffiaCl 2檢測(cè)透析效果，直至 無白色沉淀)、濃縮(再將透析液用超濾器濃縮至1:1 (生藥黃芪質(zhì)量：濃縮液體積，g :mL))、 凍干。其中，中性多糖DS-I為超純水洗脫所得，苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為89. 8% (見圖8)。梯度NaCl洗脫得到弱酸性的多糖。
[0046] (7)Biologic DuoFIow 層析系統(tǒng)，用 Sephacryl S-400 High Reslution 制備層析 柱（〇1 cmX95 cm)，精確稱取步驟（6)超純水洗脫得到的生藥黃芪中性多糖DS-I 40 mg， 溶于I mL超純水(預(yù)先溶脹12 h)，離心10000 g/min，5 min。取上清液，過0. 45 iim濾膜， 上樣于Sephacryl S-400 High Reslution層析柱。用超純水220 mL (3倍柱體積）洗脫， 流速0.4 mL/min，檢測(cè)190 nm和280 nm下的液相色譜圖（見圖9)，自動(dòng)部份收集器收集洗 脫液，每管2 mL。用苯酚-硫酸法進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以490 nm下吸光值(A)對(duì)洗脫管數(shù)作圖， 描繪洗脫曲線，分別收集各洗脫峰，濃縮(用超濾器濃縮至1:1(生藥黃芪質(zhì)量：濃縮液體積， g :mL)，超濾器的工作壓力為0. 2?0. 4MPa，溫度為25°C。）、凍干。超純水洗脫得SS-I中性 多糖組分，苯酚-硫酸法測(cè)定其多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96. 2 % (見圖10)。
[0047] (8) HPGPC-DAD-RI聯(lián)用技術(shù)測(cè)定多糖的純度，GPC-MALLS聯(lián)用技術(shù)分析多糖組分 的絕對(duì)分子量，采用Ultrahydrogel? 1000, 500色譜柱串聯(lián)凝膠色譜，流動(dòng)相為含0. 2 % 似隊(duì)的0. 9 mol/L NaCl溶液，流速I mL/min，柱溫30 °C;MALLS光源氣體為氦氣和氖氣， 檢測(cè)波長(zhǎng)690 nm。用流動(dòng)相將SS-I配制成50 mg/mL，經(jīng)0. 22 ii m膜過濾，上樣分析相對(duì) 分子量和絕對(duì)分子量(見圖11)。分析結(jié)果表明SS-I的重均分子量為I. 836X IO5 Dal，數(shù)均 分子量為1. 649X IO5 Dal (見表1)。
[0048] 表1發(fā)酵黃芪和生藥黃芪的中性多糖3個(gè)組分的分子特征參數(shù)

【權(quán)利要求】
1. 一種發(fā)酵黃芪多糖的提取純化方法，其特征在于：步驟如下： (1) 將發(fā)酵黃芪凍干粉進(jìn)行溫浸提取，濃縮提取液，通過Sevag法除蛋白，透析，濃縮透 析液，醇沉，洗滌得到發(fā)酵黃芪粗多糖； (2) 用DEAE S印harose FastFlow對(duì)發(fā)酵黃芪粗多糖進(jìn)行純化，用超純水洗脫，濃縮、凍 干洗脫液，得到中性多糖DF-1 ;用梯度NaCl洗脫，濃縮、透析、濃縮、凍干洗脫液，得到弱酸 性的多糖； (3) 將步驟（2)得到的中性多糖DF-1用Sephacryl S-400 High Reslution制備層析 柱進(jìn)行純化，用超純水洗脫，濃縮、凍干洗脫液，得到中性多糖SF-1和SF-2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：所述溫浸提取是先用乙醇溫浸 提取，得到藥渣，再將藥渣用純水溫浸提取。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取純化方法，其特征在于：所述用乙醇溫浸提取是用20倍 量(體積：質(zhì)量，mL :g)85% (體積百分比）乙醇室溫下密閉浸泡6?9h，85°C溫浸1?1. 5h， 過濾，濾渣再重復(fù)提取1次；所述用純水溫浸提取是在藥渣中加入10?15倍量(體積：質(zhì) 量，mL :g)純水，室溫浸泡6?9 h,再于85°C水浴溫浸1?1. 5h,傾出上清液，再重復(fù)溫浸 2次；優(yōu)選地，所述用乙醇溫浸提取是用20倍量(體積：質(zhì)量，mL :g) 85% (體積百分比）乙 醇室溫下密閉浸泡8h，85°C溫浸lh，過濾，濾渣再重復(fù)提取1次；所述用純水溫浸提取是在 藥渣中加入10倍量的純水，室溫浸泡8h，再于85°C水浴溫浸lh，傾出上清液，再重復(fù)溫浸2 次。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：步驟（1)- (3)中所述濃縮均是 采用膜截留超濾器截留分子量為5000 Dal的分子，超濾器工作壓力為0.2?0.4 MPa，溫度 為 25°C。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：所述透析是將除蛋白后得到的 上清液置于MWCO :7000的透析袋中，流水透析48h，蒸餾水透析24h，直至無白色沉淀。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：所述醇沉是在透析液中加入無 水乙醇至溶液中乙醇體積百分含量為80%進(jìn)行醇沉。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取純化方法，其特征在于：所述梯度NaCl洗脫是用0. 1 mol/L NaCl，0. 2 mol/L NaCl，0. 3 mol/L NaCl 和 0· 4mol/L NaCl 洗脫。
8. 應(yīng)用權(quán)利要求1?7所述的提取純化方法得到的發(fā)酵黃芪粗多糖。
9. 發(fā)酵黃芪粗多糖在制備保肝護(hù)肝、抑制肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
10. -種保肝護(hù)肝、抑制肝纖維化藥物，其特征在于：所述藥物的有效成分為權(quán)利要求 8所述的發(fā)酵黃芪粗多糖。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK104277133SQ201410407891
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年8月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月18日
【發(fā)明者】秦哲, 李建喜, 楊志強(qiáng), 王學(xué)智, 張景艷, 王旭榮, 王磊, 孔曉軍, 孟嘉仁, 張凱 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所