梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗及其制備方法。該梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗是將鹿源BVDV(牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒)接種培養(yǎng)至3～6代、穩(wěn)定的、單層鋪滿的MDBK細胞的細胞瓶進行培養(yǎng)，挑選在培養(yǎng)72～144小時之間發(fā)生細胞病變(CPE)的細胞瓶，病變后反復凍融，收集病毒液，在病毒液中加入甲醛滅活，之后將滅活之后的病毒液與白油、司本組成的油劑相混合，并加入硬脂酸鋁，得到梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗。
【專利說明】梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002]梅花鹿粘膜病由牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒(BVDV)引起的一種以發(fā)熱、粘膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、免疫耐受與持續(xù)感染、免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、懷孕母鹿流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或畸形胎為主要特征的一種接觸性傳染病，嚴重影響?zhàn)B鹿業(yè)健康發(fā)展。當前制約梅花鹿產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的瓶頸問題一是針對梅花鹿粘膜病專用疫苗在我國尚屬空白，大多數(shù)養(yǎng)鹿場處于無免疫狀況。
[0003]滅活疫苗是指將病原生物及其代謝產(chǎn)物用物理或化學的方法使其失去毒力，但仍保留其免疫原性而制成。接種后能產(chǎn)生特異性免疫力。在機體內(nèi)不能生長繁殖，相對安全穩(wěn)定。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗及其制備方法。
[0005]本發(fā)明所提供的梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗，是將胎牛腎細胞(MDBK)接種牛病毒性腹瀉/粘膜病毒(BVDV)毒株得到的病毒液滅活得到的。
[0006]本發(fā)明提供一種梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗油乳劑，由終濃度為0.01克/毫升的硬脂酸鋁和下述體積份數(shù)的組分組成:
[0007]油相:注射用白油94體積份司本6體積份
[0008]水相:梅花鹿粘膜病病毒液96體積份吐溫-80 4體積份
[0009]所述梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗為上述的疫苗。
[0010]本發(fā)明所提供的梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗的制備方法，是將接種牛病毒性腹瀉/粘膜病毒毒株的胎牛腎細胞培養(yǎng)增殖，進行電鏡觀察，挑選在培養(yǎng)72?144小時之間產(chǎn)生明顯病變的細胞，收集病毒液，在病毒液中加入甲醛滅活，之后將滅火后的病毒液與油劑相混合，得到梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗。
[0011]所述方法中，所述加入甲醛的終濃度為0.15% (體積百分比濃度)。
[0012]所述方法中，所述接種牛病毒性腹瀉/粘膜病毒毒株為CC-CRB01。
[0013]所述方法中，所述胎牛腎細胞為第3?6代，所述培養(yǎng)增殖方法為細胞增殖病毒，所述培養(yǎng)的溫度為37攝氏度。
[0014]本發(fā)明提供的梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗油乳劑的制備方法，包括下述步驟:
[0015]I)油相制備:取注射用白油94體積份，加司本-80 6體積份，混合后，加硬脂酸鋁至濃度為0.02克/毫升，混勻滅菌；
[0016]2)水相制備:取吐溫-804體積份，滅菌，加入權利要求5-8所述的方法獲得的梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗96體積份，振搖使吐溫-80完全溶解；
[0017]3)乳化:取步驟I)獲得的油相I與步驟2)獲得的水相按照1:1的體積份數(shù)比攪拌混勻，得到梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗油乳劑。
[0018]本發(fā)明的梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗可以直接對種鹿進行免疫，預防仔鹿的粘膜病。經(jīng)過鹿場安全試驗證實，此疫苗對種鹿是安全的，對產(chǎn)仔率、仔鹿成活率影響很小。該疫苗能使免疫鹿產(chǎn)生抵抗牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒的抗體效價水平。免疫母鹿產(chǎn)仔后代的成活率為78%?82% (用戶觀察統(tǒng)計)，其中的未成活數(shù)大都系自然淘汰數(shù)和非特異死亡數(shù)。本發(fā)明梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗油乳劑制備工藝獲得的油包水型油乳劑滅活苗乳化程序簡單、粘稠度適宜[用I毫升吸管(下口內(nèi)徑1.2毫米，上口內(nèi)徑2.7毫米)，吸取25攝氏度左右的疫苗I毫升，令其垂直自然流出，流出0.4毫升所需時間為6秒]。
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實例對本發(fā)明做詳細說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0020]實施例1、梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗及其制備方法
[0021]為了安全地特異性地預防梅花鹿粘膜病這種病毒性傳染病，研制了同源滅活疫苗。其制備方法如下所述:
[0022]一、梅花鹿粘膜病病毒液的制備
[0023]1、材料
[0024]梅花鹿源牛病毒性腹瀉毒株CC-CRBOl (吉林大學動物醫(yī)學學院傳染病實驗室分離鑒定)2代基礎毒種，病毒毒力為105_ 5TCID5tlA).1mL
[0025]CC-CRBOl株病毒含量測定
[0026]將病毒樣品作10倍倍比稀釋，分別接種到已長滿單層的MDBK細胞上，每稀釋度重復4孔，同時將直接加入維持液的孔作為空白對照，37°C ,5% CO2培養(yǎng)Ih后，加入維持液，100μ I/孔；然后37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)。逐日觀察記錄細胞病變情況，144h后判定最終結果。按Reed-Muench法計算TCID5tlt5 MDBK細胞:胎胎牛腎細胞，本實驗室保存。
[0027]2、生產(chǎn)用毒種的制備和鑒定
[0028]I)細胞培養(yǎng)
[0029]細胞凍存管從液氮中迅速取出，立即放入42°C水浴中，邊浸邊搖動，使細胞凍存液盡快融化，75%酒精消毒后，打開凍存管蓋，吸出細胞懸液，100rpmX 5min，吸棄凍存液，力口入細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，接入10ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，37°C，5% CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞基本長滿單層后進行傳代，方法是傾棄細胞舊液，用PBS液洗滌2 - 3次，加入0.25%的胰酶(以浸沒細胞單層為佳)進行消化，待細胞將要分離而呈圓粒時，加入新鮮細胞培養(yǎng)液終止消化，用吸管反復吹打細胞，直至細胞完全分散，100rpmX 5min離心后吸棄上清，再加新鮮培養(yǎng)液，重新懸浮細胞，按一傳二接入新的培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0030]2)病毒增殖
[0031]取長滿單層的細胞，傾棄舊液，用PBS液洗滌2 - 3次，接種病毒液(用維持液4倍稀釋)，37°C，5% CO2培養(yǎng)Ih后，再加維持液，置37°C，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)。當有75%以上細胞出現(xiàn)致細胞病變(CPE)現(xiàn)象時，收獲病毒。
[0032]3)毒種鑒定按基礎毒種鑒定項目(《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》2000年版:243~245頁)進行，合格即為生產(chǎn)用毒種。
[0033]生產(chǎn)用毒種制備及檢驗結果見表1，從表1可見,制備的生產(chǎn)用毒種符合基礎毒種的標準。
[0034]表1.生產(chǎn)用毒種制備及檢驗結果
[0035]
【權利要求】
1.梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗，所述的梅花鹿粘膜病同源滅活疫苗的其中的病毒液，是將MDBK (牛腎)細胞接種鹿源BVDV (牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒)，收獲病毒液滅活得到的。
2.根據(jù)I所述，梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗油乳劑，是由終濃度為0.01克/毫升的硬脂酸鋁和下述體積份數(shù)比的組分組成:
所述梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗為權利I要求中所述的疫苗。
3.梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗的制備方法，是將接種鹿源BVDV(牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒)，挑選在培養(yǎng)72~144小時之間發(fā)生細胞病變(CPE)的細胞，收集細胞液，在病毒液中加入甲醛滅活得到梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于:所述加入甲醛的終濃度為0.15% (體積百分比濃度)。
5.根據(jù)權利要求3中所述的方法，其特征在于:所述胎牛腎細胞為第3~6代，所述培養(yǎng)增殖方法為細胞增殖病毒，所述培養(yǎng)的溫度為37攝氏度。
6.權利要求2所述梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗油乳劑的制備方法，包括下述步驟: 1)油相制備:取注射用白油94體積份，加司本-806體積份，混合后，加硬脂酸鋁至濃度為0.02克/毫升，混勻滅菌； 2)水相制備:取吐溫-804體積份，滅菌，加入權利要求5~8所述的方法獲得的梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗96體積份，振搖使吐溫-80完全溶解； 3)乳化:取步驟I)獲得的油相與步驟2)獲得的水相按照1:1的體積份數(shù)比攪拌混勻，得到梅花鹿粘膜病病同源滅活疫苗油乳劑。
【文檔編號】A61K9/107GK104174017SQ201410401027
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月14日 優(yōu)先權日:2014年8月14日
【發(fā)明者】丁壯, 董航, 叢彥龍, 尹仁福, 母連志, 張曉東, 周玉龍, 穆昱 申請人:吉林大學